DeltaFosB- ը անուղղակիորեն կարգավորում է Cck- ի խթանող գործունեությունը (2010)

Brain Res. 2010 Մայիս 6; 1329- ը `10-20:

Հրատարակված է օնլայն 2010 Մարտի 11: doi: 10.1016 / j.brainres.2010.02.081

PMCID: PMC2876727

Ջոն Ֆ. Էնվայթ, III,¹ Մեգան Վոլդը,¹ Մեդիսոն Փադոկը,¹ Էլիզաբեթ Հոֆմանը,¹ Ռեյչլ Արի,² Սքոթ Էդվարդս,² Սադե Սպենսեր,² Էրիկ Ջ. Նեստլեր,³ և Կոլեն Ա. ՄկՔլունգ^{2, *}

Հեղինակային տեղեկություններ ► Հեղինակային իրավունքի եւ լիցենզիայի մասին տեղեկություններ

Այս հոդվածի հրատարակչի վերջնական խմբագրված տարբերակը հասանելի է Brain Res

Տեսեք նաեւ այլ հոդվածներ PMC- ում մեջբերում հրապարակված հոդվածը:

Վերացական

Չարաշահման թմրամիջոցների քրոնիկական ազդեցության հետեւանքով առաջացած որոշ կարեւոր կենսաքիմիական, կառուցվածքային եւ վարքային փոփոխությունները կարծես միջնորդվում են ΔFosB- ի բարձր կայուն transcriptional factor- ի կողմից: Նախորդ աշխատանքը ցույց է տվել, որ 2 շաբաթների համար մկների վրա ΔFosB overexpression առաջացնում է ստրիատում բազմաթիվ գեների արտահայտման ավելացում, որոնց մեծ մասը հետագայում նվազում է 8 շաբաթվա ընթացքում ΔFosB արտահայտության շնորհիվ: Հետաքրքիր է, որ այս գեների մեծ թվաքանակը նույնպես կարգավորվել է մկների վրա, գերազանցելով ճառագայթման գործոնը CREB- ը: Այս ուսումնասիրությունից պարզ չէ, սակայն, թե արդյոք կարճաժամկետ ΔFosB- ը կարգավորում է այդ գեները ՀԿՍ-ի միջոցով: Այստեղ մենք գտնում ենք, որ ΔFosB- ի գերբնակեցման 2 շաբաթը ավելացնում է CREB արտահայտությունը striatum- ում, այն ազդեցությունը, որը տարածվում է 8 շաբաթով. Նախկին զորակոչը կապված է աճող CREB- ի հետ, որն ուղեկցվում է այս գլխուղեղի որոշ գենային խթանողներին: Զարմանալիորեն, մեկ գեն, որը կասկածի տակ է առել նախորդ զեկույցների հիման վրա CREB թիրախը, քոլեջիստոկինին (Cck), չի վերահսկվում CREB- ի կողմից ստրիատում: Հետագայում հետաքննություն անցկացնելու համար Cck հետեւելով ΔFosB overexpression, մենք հաստատեցինք, որ կարճաժամկետ ΔFosB overexpression ավելացնում է Cck խթանող գործունեություն եւ գենային արտահայտություն: Այն նաեւ մեծացնում է պարտադիր գործունեությունը CREB- ի միացման վայրում (CRE) Cck խթանողը: Այնուամենայնիվ, CRE կայանը անհրաժեշտ է նորմալ բազալային արտահայտության համար Cck, այն չի պահանջվում ΔFosB ներդիրի համար Cck. Ընդհանուր առմամբ, այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ կարճաժամկետ ΔFosB ներադրումը մեծացնում է CREB- ի արտահայտությունը եւ որոշակի գենային խթանողներին ակտիվությունը, սա միակ մեխանիզմն է, որով գեները կարգավորվում են այդ պայմաններում:

Keywords: միջուկի ակունքները, արտագրումը, կախվածությունը

ՆԵՐԱԾՈՒԹՅՈՒՆ

Չարաշահման թմրամիջոցների քրոնիկ ազդեցությունը առաջացնում է կենսաքիմիական եւ կառուցվածքային փոփոխություններ մի քանի ուղեղի շրջաններում: Այս փոփոխությունները ենթադրում են, որ ներառում են փոփոխություններ գենային արտահայտման պրոֆիլների մեջ mesolimbic համակարգում: Այս համակարգը բաղկացած է դոպամիներգիկ նեյրոններից, որոնք նախագծում են ventral tegmental area- ից (VTA) միջուկում միջին ճնշված նեյրոնների միջուկի accumbens (NAc) (ventral striatum), ինչպես նաեւ մի շարք այլ ուղեղային շրջաններում: Երկու զննումային գործոնների, cAMP արձագանքի տարրերի պարտադիր սպիտակուցի (CREB) եւ ΔFosB- ի (Fos- ի ընտանեկան սպիտակուցի) գործունեության փոփոխությունները առաջարկվել են միջնորդել միջամտել կենսաքիմիական, կառուցվածքային եւ վարքային փոփոխությունների բազմաթիվ փոփոխությունների, վերանայվել է Nestler, 2005).

CREB- ը միանգամայն արտահայտված transcription գործոն է, որը անդամ է CREB / ATF ընտանիքում: CREB homodimers- ը կապում է բազմաթիվ գեների խթանողների մեջ հայտնաբերված CRE- ի հաջորդականության (կոնցեսուսի `TGACGTCA) տատանումները: CREB- ի ֆոսֆորլյացիան (հիմնականում սերիայի 133- ում, չնայած այլ վայրեր են հայտնաբերվել) կարող են խթանել մի քանի ազդանշանային ճառագայթներ, ներառյալ դոպամինային ընկալիչների ստորին հոսքը (Cole et al., 1995): CREIN 133- ի ֆոսֆորիալից հետո CREB- ը կստիպի ակտիվացնել CREB- ի միացման ակտիվացում (CBP) կամ հարակից սպիտակուցներ, որոնք հանգեցնում են աճող գենի արտահայտությանը Johannessen et al., 2004). Քրոնիկ վտանգը opiate կամ psychostimulant թմրամիջոցների չարաշահման ներթափանցում է անցումային ավելացում CREB գործունեության մեջ միջուկային accumbens (Barrot et al., 2002; Shaw-Lutchman եւ այլոք, 2002, 2003), հարմարվողական մոտեցումը, նվազեցնելով այդ դեղերի վարձատրվող հատկությունները եւ նպաստել թմրանյութերի հեռացման բացասական հուզական վիճակին (Nestler, 2005).

Lչարաշահումների թմրամիջոցների անխափան հարմարվողականությունը համարվում է միջնորդի կողմից ΔFosB- ի կողմից, որը FosB- ի բարձր կայուն փաթաթված տարբերակն է (Nestler եւ այլն, 1999; McClung et al., 2004; Nestler, 2008): Fos ընտանիքի անդամները dimerize Jun ընտանիքի անդամների հետ ստեղծել ակտիվացնող սպիտակուցի 1 (AP-1) համալիր: AP-1 փոխակերպման համալիրները կապում են AP-1 արձագանքի տարրի տատանումները (կոնցեսուսը `TGACTCA) Chinenov եւ Kerppola, 2001): Չնայած սեռական բռնության թմրանյութերի սուր ցավը հանգեցնում է Fos- ընտանիքի անդամների կարճատեւ ինդուկցիայի (ժամերի) (ինչպես նաեւ աճող CREB- ի ակտիվության), կրկնակի թմրանյութերի ազդեցությունը հանգեցնում է բարձր կայուն ΔFosB- ի (Հույս եւ այլն, 1994; Perrotti եւ այլոք, 2008), որի արտահայտությունը շարունակվում է շաբաթների ընթացքում:

Կենսատարածքային մկները չափազանց գերազանցապես ճնշելով կամ ΔFosB- ի կամ CREB- ի չափահաս ստիաթում ցուցադրվում են բազմաթիվ կենսաքիմիական եւ վարքային ֆենոտիպներ, որոնք տեսանելի են կենդանիների վրա, բազմիցս արտահայտվում են հոգեբանական խանգարումներ կամ չարաշահման այլ դեղեր: Աայս transgenic կենդանիների գեն արտահայտության փոփոխությունների նալիզը հայտնաբերել է մի շարք գեներ, որոնք վերափոխվում են ΔFosB- ի կարճատեւ (2 շաբաթ) overexpression- ի կողմից, կապված դեղի պարգեւի հետ համատեղ նվազեցման հետ: Գենային արտահայտման փոփոխությունները եւ կարճաժամկետ ΔFosB- ի վարքագծային արձագանքը չափազանց նման են այն մարդկանց, ովքեր տեսել են CREN- ի 2 կամ 8 շաբաթների ընթացքումMcClung եւ Nestler, 2003): Ընդհակառակը, ΔFosB- ի երկարատեւ գերբնակեցումը (8 շաբաթ) նվազեցրել է այդ նույն գեներից շատերի հայտնաբերումը եւ հանգեցնում է թմրանյութերի պարգեւի ավելացմանը (Kelz եւ այլն, 1999; McClung եւ Nestler, 2003).

Այս հետազոտություններում հայտնաբերված մեկ գեն է քոլեջիստոկինին (Cck), նեյրոպեպտիդ, որը արտադրվում է մի քանի ուղեղի շրջաններում, ներառյալ striatum (Hokfelt et al., 1980): CCK- ն կարող է կարգավորել դոպամիներգիկ հաղորդումը (Vaccarino, 1992), ներգրավված է դեղերի վարձատրության եւ ամրապնդման մեջ (Josselyn et al., 1996; Ջոսսելն եւ այլք, 1997; Hamilton, եւ այլն, 2000; Beinfeld et al., 2002; Ռոտցինգերը եւ այլք, 2002) եւ induced է striatum կողմից քրոնիկ կոկաինը (Ding եւ Mocchetti, 1992): Բացի այդ, Cck խթանողը ցուցադրվել է ինչպես CREB եւ AP-1 համալիրների (Haun եւ Դիքհոն, 1990; Deavall եւ այլն, 2000; Հանսեն, 2001): Քանի որ գեններից շատերը (այդ թվում Cck), որոնք ցույց տվեցին ավելացված արտահայտությունը, հետեւելով երկու CREB- ի, եւ կարճաժամկետ ΔFosB արտահայտությունը հայտնի էին կամ կասկածում էին CREB թիրախային գեների (McClung եւ Nestler, 2003), մենք ուզում էինք որոշել, թե կարճաժամկետ ΔFosB արտահայտությունը հանգեցնում է այդ գեների կարգավորմանը (ուշադրության կենտրոնում Cck(CREB) կարգավորմամբ կամ գեների կարգավորման ավելի բարդ մեխանիզմներով:

ԱՐԴՅՈՒՆՔՆԵՐ

ΔFosB overexpression անընդմեջ ավելացնում CREB մակարդակները

Մենք օգտագործեցինք Western blotting- ը, հետազոտելու համար, թե արդյոք ΔFosB գերբնակեցումը ավելացնում է CREB սպիտակուցի մակարդակը մկների ստրիաթում: Այս ուսումնասիրության համար օգտագործեցինք bi-transgenic mice (line 11A), որոնք իրականացնում են թե NSE-tTA տրանսգեն եւ TetOp-ΔFosB տրանսգեն: Doxycycline- ի բացակայության դեպքում այս մկները ցույց են տալիս ΔFosB արտահայտության ուժեղ աճը ստիատում դինորֆինի դրական նեյրոններում (Kelz եւ այլն, 1999): ΔFosB- ին գերազանցող ճնշման այս մեթոդը լայնորեն փաստագրված է եւ թույլ է տալիս տարածաշրջանային յուրահատուկ արտերկրում, որը զուգորդվում է կենդանիների տեսած ΔFosB ինդուկցիոնին, որը ենթարկվում է քրոնիկ կոկաինի (Հույս եւ այլն, 1994; Kelz եւ այլն, 1999): Մենք հայտնաբերեցինք, որ 11A մկների վրա ΔFosB- ին գերազանցող ճնշման արդյունքում CREN սպիտակուցի մակարդակը զգալիորեն upregulated է 2 շաբաթ արտահայտությունից հետո եւ այդ մակարդակները վերադառնում են բազային 8 շաբաթ արտահայտությունից հետոՆկար 1A, n = 8): Որպեսզի պարզենք, արդյոք կարճաժամկետ ΔFosB գերարտահայտմամբ CREB մակարդակի փոփոխությունները կարող են կրկնօրինակվել մեկ այլ համակարգում, մենք ժամանակավորապես գերարտահայտեցինք ΔFosB PC12 բջիջներում և պարզեցինք, որ CREB մակարդակները զգալիորեն աճել են (p <0.05), երբ համեմատվում են վերահսկիչների հետ (Նկար 1B, n = 4): Այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ կարճաժամկետ ΔFosB արտահայտությունը մեծացնում է CREB սպիտակուցների մակարդակը:

CREB մակարդակները ավելանում են ΔFosB գերբնակեցման հետ: Լիզաթների արեւմտյան բլոտային վերլուծությունը (A) 11A- ի մկնիկի հատվածները 2- ի կամ 8 շաբաթվա ընթացքում կամ Xx- ի համար (B) PC12 բջիջները, որոնք գերազանցում են ΔFosB- ին: Տվյալները A ցույց են տրված որպես տոկոսային փոխարժեքի փոփոխություն ...

Երկու ΔFosB- ը եւ CREB- ն կապում են հատուկ թիրախ գեների խթանողներին, որոնք կարճատեւ ΔFosB overexpression- ից հետո

Մենք օգտագործեցինք ChIP (chromatin immunoprecipitation) ստերիլալ հյուսվածքի փորձաքննությունը, որոշելու համար, թե արդյոք ΔFosB կամ CREB կապումը տեղի է ունեցել որոշակի թիրախային գենային խթանողների մոտ, եւ եթե այդ կապումը ավելացել է, կարճաժամկետ ΔFosB գերբնակեցման արդյունքում: Մենք վերլուծեցինք պարտադիր BDNF և Cck քանի որ երկու գեները նույնպես բարձր կարգավորվում են կարճաժամկետ ΔFosB overexpression, CREB overexpression կամ քրոնիկ կոկաինի բուժում (McClung եւ Nestler, 2003): Մենք նաեւ վերլուծեցինք պարտադիր CDK5 խթանող, քանի որ ΔFosB- ի հայտնի ուղղակի թիրախըChen եւ այլն, 2000; Bibb եւ այլն, 2001; Կումար եւ այլն, 2005): Վերջապես, մենք չափեցինք պարտադիր պրոդինորֆին խթանող, քանի որ նախորդ ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ այն կարող է պայմանավորված լինել ΔFosB- ի եւ CREB- ի կողմից տարբեր պայմաններովԱնդերսոն եւ այլք, 2001; Zachariou et al., 2006).

CHIP վերլուծությունը կատարվել է 11A մկների կողմից ΔFosB- ից 2 շաբաթվա ընթացքում ստիատորի վրա, օգտագործելով CREB կամ ΔFosB հակամարմինները: Նորմալ պայմաններում մենք գտանք, որ ΔFosB- ն կապում է CDK5 և պրոդինորֆին խթանողներ, մինչդեռ չկան հայտնաբերելի պարտավորվածություն BDNF or Cck խթանողներ (Աղյուսակ 1): Ավելին, ΔFosB գերբնակեցումը ավելացրեց ΔFosB- ի կապը CDK5 խթանող, բայց ոչ պրոդինորֆին խթանողը: Հաջորդը չափեցին CREB- ը `այդ խթանողներին եւ գտավ, որ CREB- ն կապում է CDK5, BDNF և պրոդինորֆին խթանողներ, բայց ոչ Cck խթանող, նորմալ ստիատում, եւ որ ΔFosB ավելցուկային արտահայտությունը 2 շաբաթվա ընթացքում ավելացնում է CREB կապումը BDNF և պրոդինորֆին խթանողներ, բայց ոչ CDK5 խթանողը: Հաշվի առնելով, որ այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ ΔFosB- ը եւ CREB- ը կարող են կապել որոշակի գենային խթանողներին, ինչպիսիք են պրոդինորֆին և CDK5, սակայն, CREB- ի հետ կապվածությունը հատուկ է այլ խթանողներին, ինչպիսիք են BDNF. Բացի այդ, ΔFosB գերբնակեցումը հանգեցնում է ΔFosB կապի ավելացմանը որոշակի խթանողներին, ինչպես ակնկալվում է, այլեւ CREB- ի հետ կապված կոնկրետ խթանողներին, որոնք համապատասխանում են այս ժամանակի կետում դիտարկված ΔFosB միջնորդավորված CREB- ի ներդիրին:

Աղյուսակ 1

Երկու շաբաթվա ընթացքում ΔFosB- ին գերազանցող ճնշումը մկների տարբեր պրոտոկրատորներին պնդելի կարգավորող սպիտակուցների պարտադրումը:

Նախորդ աշխատանքը ցույց է տվել, որ երկարատեւ ΔFosB overerexpression- ի կողմից առաջացող գենային արտահայտությունների փոփոխությունները կապված են քրոմատինի փոփոխությունների հետ, մասնավորապես `H3- ի հստակեցում, որոշակի գեոպրոպատորներիԿումար եւ այլն, 2005): Որոշելու համար, թե արդյոք դա կարող է հաշվի առնել գեն արտահայտության փոփոխությունների համար կարճաժամկետ ΔFosB overexpression- ի վրա, մենք չափեցինք acetylated histone H3- ի (տրանսքրաչափապես ակտիվ քրոմատինի հետ կապված հիստոնային փոփոխություն) կամ methylated histone H3- ի (Lys9, histone փոփոխության հետ կապված transcriptionally ակտիվ քրոմատին): Մենք հայտնաբերեցինք, որ ΔFosB- ի գերբնակեցումը 2 շաբաթվա ընթացքում հանգեցրեց ոչ մի փոփոխություն, որը սովորեցված գենային խթանողներից որեւէ մեկում acetylated H3- ի կապումԱղյուսակ 1): Մենք գտել ենք զգալի նվազում է methylated histone H3- ի կապակցությամբ պրոդինորֆին խթանող, բայց ոչ պարտադիր Cck խթանող եւ փոփոխության ենթակա որեւէ փոփոխություն CDK5 և BDNF խթանողներ, առաջարկելով, որ դա ընդհանուր մեխանիզմ չէ, որի միջոցով ΔFosB կարճաժամկետ կտրվածքով կարգավորում է գենային արտահայտությունը: Մենք զարմացած էինք եւ շահագրգռված էինք այն փաստով, որ մենք չփակեցինք CHIP- ի փորձությունների մեջ, որոնք կարող էին հաշվի առնել աճը Cck mRNA արտահայտությունը 11A մկների մեջ, 2 շաբաթվա ընթացքում ΔFosB արտահայտությամբ եւ որոշեց հետաքննել այս մեխանիզմը:

Կարճաժամկետ ԴՕՖ-ը մեծանում է Cck արտահայտությունը բազմակի համակարգերում

Bi-transgenic 11A մկների ճառագայթման ճառագայթման բնութագրումը ΔFosB- ի ստրիաթում հայտնաբերել է, Cck արտահայտման մակարդակները ավելանում են 2 շաբաթվա ընթացքում գերբնակեցվածից հետո եւ աստիճանաբար նվազում են ΔFosB արտահայտության ավելի երկար ժամանակահատվածներով (Նկար 2A, n = 3): Մենք այս ուժը հաստատեցինք Cck օգտագործելով իրական ժամանակի PCR կենդանիների առանձին խմբում 2- ում եւ 8 շաբաթում եւ երկու ժամային կետերում գտել են արդյունքներ, որոնք նման են միկրոավտոբուսային վերլուծությանը (տվյալները չեն ցուցադրվում):

ΔFosB- ի կարճաժամկետ արտահոսքը մեծանում է Cck գեն արտահայտությունը: (A) Cck mRNA արտահայտությունը striatum- ում, ΔFosB overexpression- ում 11A մկների համար 1, 2, 4 կամ 8 շաբաթների ընթացքում: Microarray վերլուծությունը կատարվել է ստերիլալ նմուշների եւ Cck մակարդակները ...

Հետագա ուսումնասիրելու համար ΔFosB- ի կարգավորումը Cck արտահայտությունը, օգտագործելով PC12 բջիջները, ժամանակավորապես փոխարկվելով a Cck-լյերիֆերազ թղթակից պլազմիդ եւ կամ ΔFosB արտահայտության պլազմիդ կամ հավասար քանակությամբ pCDNA: ΔFosB գերբնակեցման երկու նմուշները (n = 5-9) եւ երեք (n = 11-13) օրերը հանգեցրին Cck-լյերիֆերազ արտահայտությունը: Բացի դրանից, ΔFosB- ի գերբնակեցման երեք օրերի արդյունքում զգալիորեն ավելացել է Cck-լյերֆերազի ինդուկցիան, երբ գերազանցում է երկու օրվա ընթացքում (Նկար 2B): ΔFosB- ի գերազանց ցուցադրումը չի նպաստում promoterless luciferase կառուցվածքի արտահայտությանը (տվյալները չեն ցուցադրվում): Ոչ մի բուժման պայմաններում չի նվազում Cckակնհայտ է: Այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ կարճաժամկետ ΔFosB արտահայտությունը մեծացնում է գործը Cck խթանող եւ թողնում չհարգող մեխանիզմը, որով երկարաժամկետ ΔFosB գերբնակեցումը գերակշռում է Cck արտահայտությունը:

ΔFosB գերբնակեցումը մեծացնում է կապակցված CREB պարտադիր կայքէջում Cck խթանողին

Մեր վերլուծությունները պարզեցին Cck արտահայտությունը ավելանում է կարճաժամկետ ΔFosB արտահայտությունից հետո, սակայն մեր CHIP- ի փորձերը պարզել են, որ ոչ CREB, ոչ էլ ΔFosB- ն կապում են Cck խթանողը: Որոշելու համար, արդյոք առկա են սպիտակուցային կապում փոփոխություններ Cck ΔFosB overexpression- ից հետո, մենք օգտագործեցինք էլեկտրաֆորիկային շարժականության փոփոխման փորձարկումներ (EMSA) հետախուզման մեջ, որը պարունակում էր դյուրակիր CRE- Cck խթանողը: Օգտագործելով միջուկային քաղվածքներ 11A մկների ստերաթվով ΔFosB- ից 2 շաբաթվա ընթացքում, մենք հայտնաբերեցինք աճի կապակցությամբ CRE կայքին Cck խթանող (Նկար 3 A, C, n = 4): Հետաքրքիր է, 11A մկները գերազանցող ΔFosB- ի 8 շաբաթվա ընթացքում, ինչը ցույց է տալիս նվազում Cck արտահայտությունը, ինչպես նաեւ ցույց տվեց, որ աճում է այս կայքումՆկար 3B, C, n = 4): Համեմատության համար մենք ուսումնասիրեցինք CONNESSUS CRE- ի մակերեսը 2 շաբաթվա ընթացքում ΔFosB- ին գերազանցող ճառագայթման համար եւ գտել ամուր ձգվող CRE- ի շերտային քաղվածքների մեջ, սակայն ոչ մի աճ չստանալով հետեւյալ ΔFosB ներդիրով (Նկար 3F, n = 4): Այսպիսով, չնայած ΔFosB- ի աճին, այս պահին դիտարկված CREB մակարդակների ընդհանուր քանակի աճը համապատասխանում է մեր ՉԻՊ փորձերին, որոնք գտնում են, որ ΔFosB գերազանց հսկողության արդյունքում առաջացող խթանողներին CREB- ի հետ կապված աճը հատուկ է միայն որոշակի գեների եւ գլոբալ երեւույթ չէ . Որոշելու համար, արդյոք ՀՌՎ-ն պարտավորված է Cck մեր EMSA- ի վերլուծության մեջ խթանող, մենք կատարեցինք վերերկրյա փորձարկումներ CREB- ի հատուկ հակամարմին: Մեր ՉԻՊ-ի փորձերի համաձայն, մենք չկարողացանք որեւէ CRB- ի պարտադիր կապակցությամբ Cck հետազոտություն, որը պարունակում է կանխորոշիչ CRE կայքը EMSA- ի փորձարկումների ժամանակ, մինչդեռ CREB- ը զգալիորեն կապում եւ փոխում է կոնցեսուսը CRE site- ը (Նկար 3D, E, n = 4): ԴՆԹ-ի պարտադիր գործունեությունը Cck Աջակցողը նույնպես չի ազդել ΔFosB- ի (տվյալների ցուցադրման) հակամարմինից, մի քանի նախորդ ուսումնասիրություններում ցուցադրվող պայմանների համաձայն, ΔFosB- ի արգելափակման համար AP-1- ի ազնվական կայանքներին (Hope et al., 1994a, 1994b; Chen եւ այլն, 1995, Hiroi et al., 1998): Մենք նաեւ կատարեցինք CHIP- ի փորձարկումները 11A կենդանիների ստիատներում, 8 շաբաթվա ընթացքում ΔFosB արտահայտության մեջ եւ դեռեւս չենք գտնում CRB- ի կամ ΔFosB- ի կապը: Cck խթանող (տվյալները չեն ցուցադրվում): Այսպիսով, ΔFosB արտահայտությունը հանգեցնում է սպիտակուցի ամրացման աճին Cck խթանող `2 եւ 8 շաբաթ արտահայտությունից հետո, սակայն այդ գործոնների ինքնությունը անհայտ է:

Սպիտակուցը պարտադիր է Cck խթանողը: (Ա, Բ) Էլեկտրոֆորական շարժականության փոփոխման փորձաքննություն Cck CRE- նման վայր, կենդանիներից ստիատալ հյուսվածքով, ΔFosB- ից 2 շաբաթ (A) կամ 8 շաբաթ (B) գերազանցող ցրված կենդանիներ: (A) -ում, մրցակցությունն ավելորդ unlabeled մրցակիցի հետ ...

Հարկային CRE կայքը Cck խթանողը պատասխանատվություն չի կրում աճող խթանող գործունեության համար

Քանի որ մենք հայտնաբերել ենք սպիտակուցային կապի ավելացում, օգտագործելով այն հատվածը Cck խթանող, որը պարունակում է դոտացիայի CRE կայք, հետեւելով ΔFosB գերբնակեցմանը, մենք ուզում էինք որոշել, արդյոք այս կայքը անհրաժեշտ է աճելու համար Cck արտահայտությունը հետեւյալ ΔFosB overexpression. Այս հնարավորությունը փորձելու համար մենք փոխարինեցինք PC12 բջիջները a Cck-plusiferase պլազմիդը, որը պարունակում է իր անձեռնմխելի CRE-նման պոտենցիալ կայքը կամ մեկում մուտացիայի պարունակությունը, որը կվերացնի CREB- ի հետ փոխազդեցությունը: Հետաքրքիր է, որ CRE- ի նման վայրի մուտացիան նվազել է բազալ Cck խթանող գործունեությունը, 32% (Նկար 4A, n = 9), բայց չի ազդում Cck խթանողի առաջացումը ΔFosB գերարտահայտման միջոցով (Նկար 4B, n = 11-13): Սա ենթադրում է, որ թեեւ Cck խթանողը պահանջում է անառողջ CRE-նման վայր ամբողջական բազային գործունեության համար, ΔFosB overerexpression- ի կողմից աճող խթանող ակտիվությունը չի պահանջում CRE-ի նման հաջորդականությունը:

The Cck-Ինչպես պետք է CRE- ի նման վայր լինի Cck ինդուկցիան ΔFosB- ի կողմից: (A) Cck-լյերֆերազի ակտիվությունը գնահատվում է 2 օր անցնելուց հետո նորմալ Cck- լյուցիֆերազ կամ մեկը, որում CRE- ի նման տեղը մուտացիայի է ենթարկվել: * p <0.05 (B) Cck-լյերիֆերազ ...

cFos- ը կապում է Cck խթանողին

Նախորդ ուսումնասիրությունները պարզել են cFos mRNA- ն ավելանում է կարճաժամկետ ΔFosB արտահայտությամբ, սակայն երկարատեւ ΔFosB արտահայտությունից հետո կոկաինի բուժման կարողությունը նվազեցնում է cFos- ի ստրիատումMcClung եւ Nestler, 2003; Renthal et al., 2008): Հետեւաբար հնարավոր է, որ cFos- ը նպաստի աճին Cck արտահայտությունը, կարճաժամկետ ΔFosB արտահայտությունից հետո: Մենք կատարեցինք ChIP- ի անալիզներ, cFos- ի համար հատուկ հակամարմին, եւ cFos- ի չափման մեջ չափեց Cck խթանող եւ առանց կարճաժամկետ ΔFosB արտահայտություն: Մինչ մենք գտանք, որ cFos- ը կապում է Cck խթանող, այս կապողը զգալիորեն չի աճել, հետեւելով ΔFosB overexpression (Նկար 5, n = 5): Սա ենթադրում է, որ cFos- ը կապում է Cck խթանող, այն կարող է նպաստել ընդհանուր կանոնակարգին Cck արտահայտությունը, բայց, հավանաբար, չի ներգրավվում կարգավորման գործընթացում Cck խթանում է ΔFosB- ի կողմից:

cFos- ը կապում է Cck խթանողը: Chromatin- ի իմունոֆրիտուտավորման փորձերը կատարվել են cFos- ի հատուկ հակամարմինների միջոցով, ΔFosB- ից ստերիլալ հյուսվածքի օգտագործմամբ, ինչպես նաեւ dox- ում կամ 2 շաբաթից dox հեռացումից հետո: Իրական ժամանակի PCR վերլուծություն էր ...

ՔՆՆԱՐԿՈՒՄ

Այս ուսումնասիրությունը հաստատում եւ ընդլայնում է նախորդ բացահայտումները, ցույց տալով, որ ΔFosB կարգավորում է գենային արտահայտությունը ստրիատում, եւ մենք գտնում ենք, որ այն կարճաժամկետ արտահայտությունից հետո բազմաթիվ մեխանիզմների միջոցով է կատարվում: Մենք ցույց ենք տալիս, որ 2 շաբաթվա ընթացքում գերբնակեցման արդյունքում ΔFosB- ն անմիջապես կապվում է որոշ գեների առաջատարների հետ, ինչը հանգեցնում է արտահայտության փոփոխությունների (օրինակ, CDK5): Բացի այդ, այն աճում է CREB սպիտակուցի մակարդակները, ազդեցությունը դիտվում է մշակված բջիջներում, ինչպես նաեւ ստրիատում, ինչը հանգեցնում է CREB- ի աճեցման այլ գենային խթանողներին (այսինքն, դինորֆին և BDNF): Նախորդ ուսումնասիրության մեջ պարզվեց, որ ΔFosB- ի կարճաժամկետ արտահոսքը ստերիմատում հանգեցնում է այն նույն գենային արտահայտման բազմաթիվ փոփոխություններին, որոնք հայտնաբերվում են, երբ CREB- ը գերազանցում է, եւ հանգեցնում է նման վարքային պատասխանների `կոկաինի նախապատվությունների միջոցառումներում (McClung եւ Nestler, 2003): Այսպիսով, ներկա եզրակացությունը, որ ΔFosB- ը հանգեցնում է CREB- ի ինդուկցիայի, ինչպես նաեւ որոշ գենային խթանողներին CREB- ի կապը, օգնում է բացատրել, թե ինչու են այս երկու տառատեսակային գործոնները գենային արտահայտման փոփոխությունների շատերը կիսել:

ΔFosB- ի կողմից CREB- ի դրսեւորումը հետաքրքիր է, քանի որ ցույց է տրվել, որ չարաշահման թմրամիջոցները փոփոխում են սերունային 133- ֆոսֆորացված CREB մակարդակներում (Մաթսոն եւ այլք, 2005) եւ ավելացնելու CRE-mediated transcription (Barrot et al., 2002; Shaw-Lutchman եւ այլոք, 2002, 2003), առանց վերափոխելու CREB- ի ընդհանուր մակարդակները: Հնարավոր է, որ CREB մակարդակների փոփոխությունները կարող են անցողիկ լինել, եւ, հետեւաբար, հեշտությամբ բաց թողնված այլ ուսումնասիրություններում: Մեր ձեռքերում մենք ականատես եղանք CREB mRNA- ում կոկաինի ներուժի ավելացմանը, մասնավորապես, փորձերի, սակայն այդ ազդեցությունը շատ փոփոխական է (չհրատարակված դիտարկումը): Քանի որ 11A տրանսգենային մկները եւ PC-12 բջիջները ցույց են տալիս, որ կարճաժամկետ ΔFosB overexpression- ից հետո CREB- ի զորակոչը ցույց է տալիս, որ CREB- ը իսկապես ներգրավված է ΔFosB (կամ ΔFosB- ի թիրախ) կողմից, ապահովելով եւս մեկ մեխանիզմ `գենային արտահայտությունը:

Զարմանալիորեն, մենք հայտնաբերեցինք, որ ոչ CREB, ոչ էլ ΔFosB- ն կապում են Cck խթանողը, չնայած Cck արտահայտությունը հստակ կարգավորվում է կարճաժամկետ ΔFosB արտահայտությունից հետո: Cck- ն առատ նեուրոպեպտիդ է, որը արտահայտված է թե VTA եւ NAc- ում (Hokfelt et al., 1980) եւ, հավանաբար, ներգրավված է չարաշահման թմրանյութերի վարքագծային արձագանքներում (Josselyn et al., 1996; Ջոսսելն եւ այլք, 1997; Hamilton, եւ այլն, 2000; Beinfeld et al., 2002; Ռոտցինգերը եւ այլք, 2002): Բջջային մշակույթի փորձարկումներում Cck խթանողը լայնորեն բնութագրվել եւ ցուցադրվել է CREB եւ AP-1 ընտանիքի անդամների համար Հանսեն, 2001). Haun եւ Դիքհոն (1990) ցույց տվեց, որ AP-1 համալիրները կարող են կապվել Cck CRE-ի նման կայքը vitro, եւ այն ավելի ուշ ցույց է տրվել, օգտագործելով SK-N-MC neuroblastoma բջիջները, որ CRE- ի նման վայրի մուտացիան կրճատեց խթանող պատասխանատուն `cFos / cJunRourke et al., 1999): Անշուշտ, մենք նաեւ մեծանում ենք Cck խթանող գործունեություն (Նկար 2) եւ պարտադիր CRE կամ նման տարրըՆկար 3), մեկ այլ AP-1 ընտանիքի անդամի ΔFosB- ի գերբնակեցման վրա, բայց մենք չենք գտնում ΔFosB- ի ուղղակի կապը Cck խթանողին ի Վիվո or vitro, նույնիսկ նրա գերբնակեցման վրա:

Շատ աշխատանքը դեր է խաղում CREB- ի համար Cck խթանող գործունեություն: The Cck CRE-like կայքը պահպանում է ողնաշարավորների շրջանում (Հանսեն, 2001), եւ որոշ բջիջների մշակույթի փորձարկումներում CREB եւ AP-1 համալիրները կապում են այս կայքում եւ անհրաժեշտ են Cck խթանող գործունեություն (Haun եւ Դիքհոն, 1990; Deavall եւ այլն, 2000; Հանսեն, 2001): Բացի այդ, մի քանի հայտնի ակտիվացնողներ Cck արտահայտությունը (այդ թվում, bFGF- ի, PACAP- ի, peptones- ի եւ depolarization- ի) ցուցադրվել են CREB (Հանսեն եւ այլն, 1999; Deavall, եւ այլն, 2000; Բերնարդ, եւ այլն, 2001; Gevrey եւ այլն, 2002; Հանսեն եւ այլն, 2004): Մեր մասին Cck-լյերիֆերազի լրագրողի գենային տվյալները կարեւոր դեր են խաղում CRE-ի նման վայրի կարգավորման համար Cck խթանող գործունեությունը, քանի որ այս կայքի մուտացիան նվազեցնում է բազալը Cck խթանող գործունեություն եւ այլն Cck- VP16-CREB- ի կողմից CREB- ի կառուցվածքային ակտիվ ձեւով առաջացած բջիջների արտանետումը կորցնում է այն ժամանակ, երբ այս կայքը անջատված է (չհրապարակված դիտարկում): Այսպիսով, մենք զարմանում էինք, որ CREB- ը չի երեւում Cck խթանում է ստրիալալային քաղվածքների կամ բազային կամ կարճաժամկետ ΔFosB գերբնակեցման վրա, երբ CREB մակարդակը բարձրանում է: Սա փաստում է, որ CREB մակարդակները մեկ se այս կայքում պարտադիր չափի որոշման միակ գործոն չեն, եւ դա նպաստում է ուրիշների աշխատանքին (Cha-Molstad, եւ այլն, 2004): Քանի որ մյուսի խթանողները, նախկինում հայտնաբերված CREB թիրախային գեների, ինչպիսիք են BDNF և պրոդինորֆին, արեց CREB- ը, մենք վստահ ենք, որ մեր հայտնագործության մեջ, որ CREB- ը պարտադիր չէ Cck խթանողը ստերիլալ միջուկի քաղվածքների մեջ: Ավելին, CckΔFosB- ի բջիջների ակտիվությունը կախված չէ CRE-like պոտենցիալ վայրից, ենթադրելով, որ ΔFosB- ն չի կարգավորում Cck արտահայտությունը կարգավորելով CREB- ի ուղղակի կապը Cck խթանողը:

Մենք չկարողացանք հայտնաբերել CREB- ի հետ համագործակցելը Cck աջակցողն աջակցում է Renthal et al. (2009), որոնք օգտագործեցին CHIP-chip մոտեցում, տեսնելու ֆոսֆորացված CREB- ի (pCREB) գլոբալ փոփոխությունների եւ ΔFosB- ի կապը քրոնիկ կոկաինի ազդեցությունից հետո ստերիմատում: Այս փորձարկումներում ԴՆԹ-սպիտակուցային համալիրները եղել են ΔFosB կամ pCREB հակամարմինների հետ, իսկ մակնշման արդյունքում դառնացած DNA- ն հիբրիդացված է խթանող միկրոօրգանիզմով: Մինչդեռ, այս մոտեցմամբ (օրինակ, BDNF, prodynorphin), Cck չի հայտնաբերվել: Բացի դրանից, ցուցադրվել է, որ CREB- ի կոնցեսուսի CRE կայքին կապելը մեծապես տարբերվում է մշակված բջիջների գծերից (Cha-Molstad, եւ այլն, 2004): Նախորդ բոլոր ուսումնասիրությունները, որոնք հայտնաբերեցին CREB- ի հետ Cck խթանողը կատարվել է բջիջների մշակույթում (ոչ ուղեղ, որի մեր EMSA- ն եւ CHIP նմուշները ստացվել են) եւ օգտագործվել են գելային հերթափոխի փորձարկումներ `հետազոտելու սպիտակուցային-ԴՆԹ-ի փոխազդեցությունները: Չնայած EMSA- ն կարող է գնահատել մի գործոնի ներուժը, որը կապում է ԴՆԹ-ի հաջորդականության հետ, ChIP- ի փորձարկումները նոր շոշափում են այդ փոխազդեցությունները ի Վիվո. Բացի այդ, տվյալների մեծ մասը կամ դրսեւորումը ցույց է տալիս Cck խթանողին կամ CREB- ին պարտադիր Cck խթանում էին բջիջներից, որոնք խթանվում էին գործոններով, ինչպիսիք են peptones (Բեռնարդ եւ այլք, 2001), depolarization (Հանսեն եւ այլն, 2004), կամ ինտերեկուլյարային ազդանշանային կասկադների մի շարք ակտիվացնողներ, ներառյալ cAMP եւ ERK (Հանսենը եւ այլք, 1999): Մեր փորձերի մեջ օգտագործված միակ «խթանումը» ΔFosB- ի գերբնական արտահայտությունն էր, որը բավարար է դրդել Cck արտահայտությունը: Միասին վերցված, սա ենթադրում է, որ CREB- ի կարողությունը (եւ պոտենցիալ կարգավորումը) հնարավոր է Cck խթանողը խիստ կախված է բջջային տեսակի եւ որոշակի ազդանշանային ուղիների ակտիվացման վրա: Բացի այդ, Cck CRE- ի նման խթանող տարրը (առնվազն uninduced PC12 բջիջներում եւ մկնիկի ստիատումում) ուղղակի թիրախ չէ CREB- ի կամ ΔFosB- ի կողմից: Հետաքրքիր է, FosB CREB- ի արտահայտությունը նաեւ հատուկ է բջջային տեսակի եւ խթանման տեսակի: Անդերսսոնի ուսումնասիրությունը et al. հայտնաբերել է, որ CREB antisense oligonucleotides ներարկումը մկնիկի ստրիատում մասամբ խոչընդոտում է FosB կոկաինըԱնդերսոն եւ այլք, 2001): Այնուամենայնիվ, նրանք գտան, որ L-Dopa- ն կարող է դրդել FosB 6-OHDA-lesioned striatum- ում արտահայտությունը չի ազդել CREB հակասության oligonucleotides- ի առկայության վրա:

Քանի որ CREB- ը եւ ΔFosB- ը անուղղակիորեն կարգավորում են Cck խթանող եւ քրոմատինի կառուցվածքի փոփոխությունները փաստագրվել են ի պատասխան մի շարք խթանների, որոնք առաջացնում են ΔFosB (Tsankova et al., 2004; Կումար եւ այլն, 2005; Renthal et al., 2008), մենք հիմնավորեցինք, որ ΔFosB- ը կարող է անուղղակի ձեւափոխել խրախուսական գործունեությունը, փոխելով քրոմատինի կառուցվածքը: Այնուամենայնիվ, 2 շաբաթվա ընթացքում ΔFosB- ին գերազանցող ճնշումը մկաններում H3- ի ազնետիում հայտնաբերվել է փոփոխություն: Cck խթանող (Աղյուսակ 1): Սա աջակցում է ChIP-chip- ի տվյալները Renthal et al. (2009), որոնք հայտնաբերել են, որ AXET- ի կողմից ացետիլացված H3- ի ոչ մի փոփոխություն չկա Cck խթանում է մկների վրա `ենթարկվելով քրոնիկ կոկաինի: Քանի որ Cck Promoter ակտիվ է striatum, ոչ մի repressive methylated հիստոն H3 պարտադիր սպասվում կամ դիտարկվում. Հետաքրքիր է նաեւ, որ մենք չենք տեսել փոփոխություն, քանի որ ΔFosB գերբնակեցումը ացետիլացված H3 կապում է BDNF խթանողին (որը ցույց տվեց աճեցված CREB պարտադիր) կամ CDK5 և պրոդինորֆին խթանողներ (որոնք ցույց են տվել աճել ΔFosB պարտադիր): Քանի որ կան հիստոնային փոփոխություններ, որոնք կապված են խթանող գործունեության փոփոխությունների հետ (վերանայվել է Rando եւ Chang, 2009), հավանական է, այլ քրոմատինային փոփոխություններ, որոնք կապում են այդ գեների ներդիրը: Ցանկացած մեկ քրոմատինի փոփոխություն, սակայն հաճախ առաջխաղացնող խթանող գործունեության մակարդակը, չի կարող փոխվել որոշակի գենի ակտիվացման ընթացքում: Հետագա աշխատանքում հետաքրքիր կլիներ, եթե տեսնեին քրոմատինի կառուցվածքի մյուս պոտենցիալ փոփոխությունները Cck ΔFosB- ի գերբնակեցումից հետո: Հետաքրքիր է, քրոնիկ կոկաինը (հավանական է, միջոցով ΔFosB- ի ինդուկցիան) ցուցադրվեց սինթեզի 1 եւ 2- ի դասակարգման III դասի դեասետիլազների հայտնաբերման համար, որոնք հայտնաբերում են նեյրոնային ֆիզիոլոգիայի, ERK ազդանշանների եւ կոկաինի վարքագծային արձագանքներըRenthal et al., 2009): Հիստոնի դիազետիլազի ներդաշնակությունը կարող է միաժամանակ կարգավորել մեծ թվով գեների արտահայտությունը միջոցով գլոբալ փոփոխությունները քրոմատինի կառուցվածքում:

Ներկայացվող հնարավոր թեկնածուներից մեկը Cck ΔFosB գերբնակեցման արդյունքում կարգավորումը APF-1 ընտանիքի անդամն էր cFos: CFos- ի արտահայտումը կարգավորվում է CREB- ի կողմից (Շենգը եւ այլք, 1990; Impey et al., 2004), եւ cFos- ի գերբնակեցումը (համընկնում է իր պարտադիր գործընկեր CJun- ի արտացոլման հետ) աճում է Cck խթանող գործունեություն (Rourke et al., 1999): Հետեւաբար, կարճաժամկետ ΔFosB գերբնակեցման պատճառով աճող CREB մակարդակը կարող է մեծացնել cFos մակարդակը եւ հանգեցնելով աճող Cck CRE-ի նման կայքը: cfos mRNA- ն ներթափանցված է մկների մեջ ΔFosB overexpression- ի երկու շաբաթից հետո (McClung եւ Nestler, 2003) եւ կրճատվել է մկների վրա, որոնք ենթարկվում են քրոնիկ կոկաինի կամ երկարաժամկետ ΔFosB overexpression (Renthal et al., 2008): Այստեղ մենք գտնում ենք, որ cFos- ը կապում է ուղղակիորեն Cck խթանողը ստերիլալ հյուսվածքի մեջ, սակայն ΔFosB overexpression- ը նշանակալիորեն չի աճում: Սա ենթադրում է, որ cFos- ը կարող է կարգավորվել Cck արտահայտությունը, ընդհանրապես, cFos- ի կապի փոփոխությունը հավանական չէ, որ մեխանիզմը, որով ΔFosB կարգավորում է Cck արտահայտությունը: Հնարավոր է, սակայն, որ ΔFosB- ը կարող է կամ post-translational փոփոխություններ արել cFos- ում (օրինակ, փոխարկված ֆոսֆորլացիան) կամ առաջացնել պարտադիր գործընկերոջ (օրինակ, cJun) կամ համակցիչ ակտիվացնող սպիտակուցի արտահայտությունը: Այնուամենայնիվ, քանի որ անձեռնմխելի CRE-նման պոտենցիալ կայքը (որը նախկինում ներկայացվել է AP-1 համալիրների համար պարտադիր կայք, տես Haun եւ Դիքհոն, 1990) չի պահանջվում աճել Cck ΔFosB overexpression- ով (ինչպես գնահատվում է մեր զեկուցողի գենային փորձերի մեջ) դիտվող խթանող գործունեությունը, ենթադրում է, որ այլ փոխազդող գործոններ նույնպես կարգավորվում են ΔFosB- ի կողմից:

The Cck մեր luciferase զեկուցողի գենի փորձերի մեջ օգտագործվող խթանող բեկորները պարունակում են պահպանված Sp1 պարտադիր կայք եւ E-box (վերանայված Hansen, 2002): Մասնավորապես, E-box- ի հաջորդականությունը ցուցադրվել է բազմաթիվ transcriptional factors- ով (տես, Forrest եւ McNamara, 2004): Օգտագործելով PC12 բջիջները, մենք տեսանք, որ E-box- ի մուտացիան նվազում է Cck խթանող գործունեություն, բայց չի փոխում ակցիայի մասնակիցի պատասխանը ΔFosB- ին (տվյալները չեն ցուցադրվում): Հետաքրքիր է, ա CckCRE-site- ում եւ E-box- ում մուտացիաների պարունակող պարունակող զեկուցողը չունի հայտնաբերելի բազային գործունեություն եւ անպատասխանատու է ΔFosB overexpression- ին (չհրապարակված դիտարկում): ΔFosB գործողությունների մեկ այլ հնարավոր միջնորդը Cck խթանողը հանդիսանում են ATF- ները, որոնց որոշ ձեւեր են հայտնի ստրեատում քրոնիկական հոգեբանական ազդեցության հետեւանքով (Կանաչ եւ այլն, 2008): Այնուամենայնիվ, մենք ոչ մի ապացույց չենք գտել այդ ATF- ների FosB- ի զորակոչի համար (տվյալները չեն ցուցադրվում), եւ ATF- ն չէր ակնկալվում, որ կախված CREATE նման mutated site- ին Cck խթանողը:

Այս ուսումնասիրության մեկ նախազգուշացումն այն է, որ մենք օգտագործում ենք Bi-transgenic համակարգը ΔFosB- ին գերազանցելու համար եւ այդպիսով պետք է պահպանողական լինի այս զուգահեռների եւ քրոնիկ կոկաինի վարման միջեւ զուգահեռներ անցկացնելիս: Այնուամենայնիվ, 11A տրանսգենային մկները հնարավորություն են տալիս եզակի հնարավորություն դիտել ΔFosB- ի որոշակի ազդեցությունները striatum- ում, քանի որ գերբնակեցումը սահմանափակվում է այս ուղեղի տարածքով (Chen եւ այլն, 1998), մինչդեռ կոկաինը կառավարում է տարբեր ուղեղի այլ շրջաններում փոփոխություններ, որոնք կարող են անուղղակիորեն ազդել ստիաթում: Բացի այդ, մի քանի ուսումնասիրություններ ցույց են տվել 11A մկների նման վարքային եւ մոլեկուլային ֆենոտիպները, երբ համեմատում են քրոնիկ կոկաինըKelz եւ այլն, 1999; McClung եւ Nestler, 2003; Renthal et al., 2009): Բացի այդ, Բիբբ եւ այլն: (2001) հաղորդում է striatal- ի նմանատիպ մակարդակները Cdk5 mRNA եւ սպիտակուցի ներածություն այս նույն 11A լարվածության ժամանակ, երբ համեմատվում են կոկաինի բուժած, ոչ transgenic ծածկվածների հետ, ինչպես նաեւ նման փոփոխություններ CDK5 թիրախներում, p35 եւ DARPP-32:

Ի վերջո, մենք գտնում ենք, որ կարճաժամկետ ΔFosB արտահայտությունը տանում է գեների ներարկումը ստրիատում, բազմաթիվ մեխանիզմների միջոցով: Սրանք ընդգրկում են ուղիղ խթանող բջջային կապը, CREB սպիտակուցի եւ ակտիվության ներածումը, քրոմատինի փոփոխությունը, բացի որոշման ուղիներից:

ՓՈՐՁԱՐԿՄԱՆ ՊԱՅՄԱՆՆԵՐԸ

Կենդանիներ

Այս հետազոտության ընթացքում օգտագործվել են արական bi-transgenic 11A կենդանիները (NSE-tTA x TetOP-ΔFosB) եւ բնութագրվում են Kelz եւ այլն, 1999. ΔFosB- ին գերազանցելու համար մկները հանվել են դսցսիցիկլինից, 3- ի եւ 6 շաբաթվա միջեւ, իսկ մկների վերահսկումը պահպանվել է դոկիքսիքցլինի վրա: Բոլոր մկները խմբավորված էին եւ պահպանվում էին 12- ի վրա, 12 թեթեւ / մութ ցիկլով, լույսերը 7- ին եւ լույսերը 7 ժամում, ad lib հասանելիություն սննդի եւ ջրի համար: Բոլոր մկնիկի փորձերը համապատասխանում էին Դալասի Տեխասի հարավային բժշկական կենտրոնի կենդանիների խնամքի եւ օգտագործման կոմիտեի կողմից հաստատված արձանագրություններին:

Լրագրող եւ արտահայտման պլազմիդներ

Հատուկ տիպ (WT) Cck Պրոգրեսոր-լուզիֆերազ թղթակիցը պատրաստվել է մոտավորապես 200 bp PCR հատվածի մեջ pGL3-luc վեկտորի մեջ (Promega): Այս հատվածը ստացվել է մկնիկի գենոմիկական ԴՆԹ-ից (primers: 5 'TATCCTCATTCACTGGGACGC 3' վերեւում եւ 5 'TACCTTTGGATGGGGAAATCG 3' ներքեւի մասում) եւ նախապես տեղադրվել pGEM-T Easy վեկտորը (Promega, #A1360): Պրոգրեսորի մասնիկը, այնուհետեւ, կլոնավորված է pgL1-luc- ի Kpn1 / Xho3 սահմանափակումային ֆերմենտի վայրերում:

CRE կետի մուտացիայի մեջ Cck պրոմոուտեր, մուտագենային այբբենարան, որն ուղղված էր նախկինում հաղորդված CRE- ի նման վայրի դեմ , Սա փոխակերպում է հաղորդվող CRE- ի նման կայքը (ACTGCGTCAGC) ACTGAGCTCC- ի: Լրագրող բոլոր պլազմիդները հաստատվել են ԴՆԹ-ի հաջորդականությամբ: ΔFosB արտահայտման պլազմինը պարունակում է լրիվ երկարությամբ ΔFosB հաջորդականություն, որը տեղադրված է pCDNA 5- ի բազմակի կլոնավորման վայրում և նկարագրված է նախկինում (Ulery եւ Nestler, 2007).

Բջջային մշակույթը եւ ԴՆԹ-ի ինֆեկցիաները

Առնետի ֆեոխրոմոցիտոմայի (PC12) բջիջները պահպանվել են Dulbecco- ի փոփոխված Eagle- ի միջին F-12- ում, լրացված 10% ձիու շիճուկով, 5% պտղի եղջերավոր շիճուկով և 1% պենիցիլին / streptomycin 37 ° C և 5% CO₂, Բջիջները փոխներարկվել են էլեկտրոպորացիայի միջոցով `օգտագործելով BTX 360 էլեկտրոպորատոր (350 Վ, 0 օմ և 850 μF) 800 մկլտրոց Dulbecco- ի ֆոսֆատային բուֆերային լուծույթով 4 մմ բացվածքով ծածկոցներում` 10 մկգ ռեպորտաժով և 5 μg արտահայտության կառուցվածքով: ԴՆԹ-ի ընդհանուր քանակությունը նորմալացնելու համար օգտագործվել է դատարկ վեկտոր պլազմիդ (pCDNA): Տրանսֆեկցիայի ենթարկվելուց հետո նշված բջիջները աճեցվել են 35 մմ կոլագենով ծածկված ճաշատեսակների վրա:

Լյուցիֆերազի փորձարկումները

Տրանսֆեկցիայից երկու-երեք օր անց բջիջները լվացվեցին 3 անգամ Dulbecco- ի ֆոսֆատային բուֆերային լուծույթով, լիզացվեցին (օգտագործելով 25 մմ գլիցիլգլիցին, 15 մմ MgSO₄, 4 մմ EGTA, 1% Triton X-100, pH 7.8, 1 մմ DTT), հավաքված եւ մաքրված է ցենտրիֆուգացման միջոցով: 30 μL lizate- ը համակցված է 140 μL լյոսֆերազի փորձարկման բուֆերի հետ (25 մմ գլիկիլգլիցինի, 15 մմ MgSO₄, 4 մմ EGTA, 1 մմ DTT, 1 մմ ATP, 1 մմ կալիումի ֆոսֆատ, 1 մմ Coenzyme A, pH 7.8): Luminescence- ի գործունեությունը չափվել է FLX-800 մանրադիտակի ֆլուորեսցենտային ընթերցողի միջոցով, 40 μL 1 մմ լյուջիֆերինի ավտոմատացված ներարկումից հետո: Լյուցիֆերազիայի գործունեությունը կարգավորվել է ընդհանուր սպիտակուցի պարունակությանը, ինչպես սահմանված է BioRad սպիտակուցի փորձարկմամբ:

Էլեկտրոֆորեզի շարժականության փոփոխման փորձ

Միջուկային քաղվածքներ երկկողմանի 11A մկների երկայնքով շերտերի շերտերից (այն դեպքում, երբ 2- ի կամ 8 շաբաթվա ընթացքում դոքսիքսլինի վրա կամ անջատված է)McClung եւ Nestler, 2003) Huang եւ Walters (1996). ³²P-labeled երկկողմանի oligonucleotide զոնդերը պատրաստվել են Promega Gel Shift Assay համակարգի արձանագրության (#E3300) օգտագործմամբ եւ զոնդերը մաքրվել են Roche Quick Spin սյունակների միջոցով: Կոնցեսուսը CRE- ի եւ AP-1- ի հետախուզման հաջորդականությունները եղել են Promega- ից (համապատասխանաբար #E328A եւ E320B) եւ Cck CRE- ի հաջորդականությունը (Cck-CRE իմաստը `CTAGCGAGCTCTGGACTGCGTCAGCACTGGGTGCA, Cck-CRE antisense: CCCAGTGCTGACGCAGTCCAGAGCTCGCTAGCTTT):

Համակցման ռեակցիաները եւ էլեկտրոֆորեզը կատարվեցին օգտագործելով Promega Gel Shift Assay համակարգի կարգը (#E3300): 50,000 CPM պիտակավորված զոնդը համակցված է 10 μg ստիատալային միջուկի քաղվածքով: Սառը մրցակից ԴՆԹ-ն կամ հակամարմինները ավելացվեցին մինչեւ ռադիոլաբելացված զոնդերի ներդրումը: Վերականգնման փորձերի համար օգտագործվել է 2 μg CREB հակաբորբիա (Upstate Biotechnology # 06-083): Ռեակցիաները electrophoresed է 4% polyacrylamide gels, չորացրած եւ ենթարկվում ֆիլմի (օգտագործելով ինտենսիվ էկրաններ համար 1 ժամ է 2 օր):

Իմունոբլոտինգ

PC12 բջիջների համար, տրանսֆեկցիոն բջիջների 35 մմ ափսեները լվացվեցին ցրտահարված Dulbecco- ի ֆոսֆատով բուֆերացված աղի մեջ և լիզատները պատրաստվեցին սառույցով ցրված RIPA լիզ բուֆերում (50 մմ Tris pH 7.4, 5 մմ NaCl, 5 մմ EDTA, 1% դեզօքսիխոլատ, 1 % Triton X-100, 0.1% նատրիումի դոդեցիլ սուլֆատ) պարունակող պրոտեազի ինհիբիտորներ: Մոնուսացումից, քլիրինգից և Բրեդֆորդի սպիտակուցային վերլուծությունից հետո լիզատները ամբողջությամբ denatured են, և յուրաքանչյուր նմուշից 50 μg էլեկտրոֆորացվել է 10% SDS պոլիակրիլամիդային գելերի վրա: Սպիտակուցները տեղափոխվել են PVDF թաղանթ, 1 ժամով արգելափակվել 3% անյուղ չոր կաթում Tris- բուֆերացված աղի մեջ, որը պարունակում է 0.1% Tween-20 (TBS-T կաթ) և ամբողջ գիշեր զննում 4 ° C ջերմաստիճանում առաջնային հակամարմիններով (CREB- Վերին կենսատեխնոլոգիա # 06-083, օգտագործված 1: 1,000-ում; GAPDH- Սիգմա # G8795, օգտագործված 1: 80,000-ում) նոսրացված TBS-T կաթում: TBS-T- ում բազմակի լվացումներից հետո բլոտները զննում էին մեկ ժամ սենյակային ջերմաստիճանում `օգտագործելով ալկալային ֆոսֆատազով խառնած երկրորդական հակամարմիններ (Sigma)` TBS-T կաթում 1: 5,000 նոսրացված: Tris- բուֆերային լուծույթում բազմաթիվ լվացումներից հետո գունային ռեակցիան իրականացվել է BioRad (# 170-6432) ցուցումների համաձայն: Թաղանթները չորացրեցին մեկ գիշերվա ընթացքում, սկանավորեցին տափակ սկաների վրա և կատարեցին դենսիտոմետրիա ՝ օգտագործելով ImageJ (տես ստորև):

Ստերիլային հատվածների համար արեւմտյան բլոտի փորձերը կատարվել են նախկինում հրապարակված (Հույս եւ այլն, 1994): Հյուսվածքները հանվել են սառույցի վրա, տեղադրվել սառույցի վրա եւ հատվածել ուղեղի մատրիցով, 1 մմ հաստությամբ: Այնուհետեւ հյուսվածքային պատյանները վերցվում եւ սառեցվում են մինչեւ 80 ° C, մինչեւ օգտագործված: Հյուսվածքները սառույցի վրա sonicated է ձեւափոխված լվացքի վրա հիմնված բուֆեր պարունակող եւ ֆոսֆատազ եւ protease inhibitors (Roche, Sigma). Sonication- ից հետո, նմուշները ատամնավորված էին եռացող ջրի մեջ եւ 15,000xg- ում centrifuged է 15 րոպե: Հետագայում հավաքվել եւ վերամշակվել էր սուպերմատուն. սպիտակուցի համակենտրոնացման գումարները, այնուհետեւ, քանակական են, օգտագործելով Bradford հետազոտությունը (Bio-Rad): Նմուշները վարվել են 10% acrylamide / bisacrylamide գելում, փոխանցված PVDF թաղանթով, որը արգելափակված է 5% կաթով եւ ինկուբացված է առաջնային հակամարմիններով (Anti-CREB, Upstate, Lake Placid, NY): Բլոտները հետագայում արտացոլվեցին քիմիամիջոցի միջոցով (Pierce) օգտագործմամբ: Բոլոր նմուշները նորմալացվել են GAPDH- ում (Fitzgerald, Concord, MA): Ստանդարտ կորերը կատարվեցին, որպեսզի մենք ստուգման գծային տիրույթում լինենք:

Densitometry վերլուծություն

PC12- ի իմունոոբլոտների համար դենսիտոմետրերի վերլուծությունը կատարվել է ImageJ- ի միջոցով `rodbard calibration- ով: Միջին ֆոնի ազդանշանը վերացվել է յուրաքանչյուր չափման մեջ եւ յուրաքանչյուր նմուշի համար հաշվարկվել է CREB- ի GAPDH ազդանշանի հարաբերակցությունը: Striatal immunoblots- ի եւ EMSA վերլուծության համար Scion Image 1.62c- ը օգտագործվել է ֆոնային հանում:

Chromatin- ի իմունոպրոպիտացիա (CHIP)

CHIP- ի փորձարկումները կատարվել են ըստ մեթոդների Ցանկովան եւ ուրիշներ (2004) և Կումար եւ այլն: (2005), Կարճ ասած, դոքսիցիկլինի վրա կամ դրանից դուրս պահվող 11 Ա մկների երկկողմանի շտրիատ նմուշները խաչաձեւ կապվեցին 1% ֆորմալդեհիդի հետ և խաչաձեւ կապը մարվեց գլիցինով (վերջնական կոնցենտրացիան 0.125 Մ): Այս նմուշները ուղեղի ամբողջ շերտերից էին, որոնք վերցված էին կորիզի մակարդակի վրա ՝ հեռացված կեղևով: Քրոմատինը վերամշակման միջոցով կտրվում է մոտավորապես 0.2-ից 1 կբ բեկորների, մաքրվում է Protein G ուլունքներով (Thermo Scientific # 22852) և մուտքային նմուշները սառեցվում են -80 ° C ջերմաստիճանում: Յուրաքանչյուր տեղումների համար օգտագործվել է 60-ից 100 μg քրոմատին: Օգտագործվել է յուրաքանչյուր առաջնային հակամարմինից 5-10 մկգ (CREB: Upstate Biotechnology # 06-863, ΔFosB: Santa Cruz Biotechnology # SC-48x, acetylated H3: Upstate Biotechnology # 06-599, methylated H3 (LYS9): Բջջային ազդանշանային տեխնոլոգիա, cFos ՝ Santa Cruz Biotechnology # SC-7202x): Հակամարմին-քրոմատինային կոմպլեքսները իմունային նստել են G սպիտակուցի գումարած ուլունքներով `ըստ արտադրության ցուցումների (Thermo Scientific # 22852): Ներածման և տեղումներ պարունակող նմուշների հակադարձ խաչաձեւումից հետո յուրաքանչյուր նմուշ ենթարկվեց քանակական PCR (qPCR): ChIP- ի համար այս բոլոր հակամարմինների օգտագործումը լայնորեն հաստատված է (Tsankova et al., 2004; Կումար եւ այլն, 2005; Renthal et al., 2009).

Ցանկացած գեների խթանող սպիտակուցի սպիտակեցման մակարդակները որոշվել են qPCR- ի կողմից կիրառվող ԴՆԹ-ի չափը (Applied Biosystems (ABI) Prism 7700, Foster City, CA): Ներմուծումը կամ ընդհանուր ԴՆԹ-ն (ոչիմինոպրոպիտալիզացված) եւ իմունոֆրիտիտիտիդացված ԴՆԹ-ն եռակողմում ուժեղացվել են SYBR Green- ի (Applied Biosystems, CA) ներկայությամբ: Յուրաքանչյուր նմուշի Ct արժեքները ստացվեցին 1.1 Sequence Detector- ի կիրառմամբ: Կաղապար ԴՆԹ-ի հարաբերական քանակականացումը կատարվել է ΔΔCt մեթոդով (Tsankova et al., 2004): Primers օգտագործվում: BDNF խթանող 4: CTTCTGTGTGCGTGAATTTGCT; AGTCCAGGAGAGGGCTCCA CDK5 խթանող `GCTGAAGCTGTCAGGAGGTC; GTGCCCCGCTCTTGTTATTA Cck խթանող `CTTGGGCTAGCCTCATTCACTG; TTAAATAGCTCCTCCCGGTTCG Prodynorphin խթանողը `GGCTTCCTTGTGCTTCAGAC; GCGCTGTTTGTCACTTTCAA:

Վիճակագրական վերլուծություն

Բոլոր տվյալները ներկայացվում են որպես միջին ± միջին ստանդարտ սխալ: Վիճակագրական տարբերությունը որոշվեց Ուսանողի երկու պոչ-թեստով (p <0.05): Երբ կատարվել են բազմաթիվ համեմատություններ, p- արժեքները ճշգրտվել են ՝ օգտագործելով Bonferroni- ի ուղղումը:

Լրացուցիչ

Մենք կցանկանայինք շնորհակալություն հայտնել Will Renthal եւ Arvind Kumar- ին օգտակար քննարկումների համար: Մենք նաեւ կցանկանայինք շնորհակալություն հայտնել NIDA- ին այդ փորձերի ֆինանսավորման համար:

Հղումներ

Հրատարակչի հրաժարումը Սա հրատարակման համար ընդունված չհրապարակված ձեռագրի PDF ֆայլ է: Որպես ծառայություն մեր հաճախորդներին, մենք տրամադրում ենք ձեռագրի այս վաղ տարբերակը: Ձեռագիրը ենթարկվում է պատճենահանման, տպագրության եւ վերանայման արդյունքների, մինչեւ դրանց հրապարակման վերջնական ձեւը: Խնդրում ենք նկատի ունենալ, որ արտադրության ընթացքում հնարավոր է հայտնաբերել սխալներ, որոնք կարող են ազդել բովանդակության վրա, եւ բոլոր իրավական խոստումները, որոնք վերաբերում են ամսագրին:

Դասակարգում.

Բաժին: #1 Նյարդային համակարգերի բջջային եւ մոլեկուլային կենսաբանություն

Սայլակ

Անդերսոն Մ, Կոնրադի Կ., Կենսի Մ. cAMP արձագանքման տարրը պարտադիր սպիտակուցը պարտադիր է դոպամինային կախված գեների արտահայտման համար, սակայն ոչ թե դոպամինային-denervated striatum- ում: J Neurosci. 2001; 21: 9930-43: [PubMed]
Barrot M, Olivier JD, Perrotti LI, DiLeone RJ, Berton O, Eisch AJ, Impey S, Storm DR, Neve RL, Yin JC, Zachariou V, Nestler EJ: CREB- ի գործունեությունը միջուկում հագեցած շելլը վերահսկում է զգացմունքային խթանիչների վարքային արձագանքների դարպասը: Proc Natl Acad Sci ԱՄՆ Ա. 2002; 99: 11435-40: [PMC անվճար հոդվածը] [PubMed]
Beinfeld MC, Connolly KJ, Pierce RC- ն: Կոկինային բուժումը մեծացնում է արտազատվող քոլեջիստոկինինը (CCK) արթնացնող, ազատ շարժվող առնետների ճարպի միջուկում, այն էֆեկտը, որը ուժեղանում է առնետների վրա, որոնք վարակված են զգայուն կոկաինի համար: J Neurochem. 2002; 81: 1021-7: [PubMed]
Բերնարդ C, Sutter A, Vinson C, Ratineau C, Chayvialle J, Cordier-Bussat M. Peptones խթանում են աղիքային քոլեջիստոկինի գենային արտագրումը ցիկլային adenosine monophosphate արձագանքի տարրերի պարտադիր գործոններով: Էնդոկրինոլոգիա: 2001; 142: 721-9: [PubMed]
Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A, Snyder GL, Yan Z, Sagawa ZK, Ouimet CC, Nairn AC, Nestler EJ, Greengard P. Կոքինի խրոնիկ ազդեցության հետեւանքները կարգավորվում են Cdk5 նեյրոնային սպիտակուցներով: Բնություն: 2001; 410: 376-80: [PubMed]
Cha-Molstad H, Keller DM, Yochum GS, Impey S, Goodman RH- ն: Բջջային տիպի կոնստրուկտիվ գործակիցը CREB- ի cAMP-response տարրին: Proc Natl Acad Sci ԱՄՆ Ա. 2004; 101: 13572-7: [PMC անվճար հոդվածը] [PubMed]
Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Հույս BT, Nestler EJ: Դելտա FosB- ի եւ FosB նմանատիպ սպիտակուցների կարգավորումը էլեկտրոկոնվուլյացիայի բռնագրավման եւ կոկաինի բուժման միջոցով: Մոլ Pharmacol. 1995; 48: 880-9: [PubMed]
Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ: Տրանսգենային կենդանիներ, որոնք ուղեկցվում են ընկճված, նպատակային գենային արտահայտությամբ: Մոլ Pharmacol. 1998; 54: 495-503: [PubMed]
Chen J, Zhang Y, Kelz MB, Steffen C, Ang ES, Zeng L, Nestler EJ: Հիպոպպամպում ցիկլինային կախված kinase 5- ի ներածումը քրոնիկ էլեկտրոկոնվուլյոզային բռնկումների միջոցով. ΔFosB- ի դերը: J Neurosci. 2000; 20: 8965-71: [PubMed]
Չինենով Յ, Քերպոլա Թ. Շատ տեսակների մոտ հանդիպումներ. Ֆոս-Յունի փոխազդեցություններ, որոնք միջնորդում են արտագրության կարգավորիչ առանձնահատկությունը: Օնկոգենե: 2001; 20: 2438-52: [PubMed]
Cole RL, Konradi C, Douglass J, Hyman SE- ը: Նեյրոնային հարմարվողականություն ամֆետամինային եւ դոպամինով. Պրոթունորֆինի գենոմերիայի մոլեկուլային մեխանիզմները առնետների ստերիմատում: Նյարդոն: 1995; 14: 813-23: [PubMed]
Deavall DG, Raychowdhury R, Dockray GJ, Dimaline R. ՍՏԿ-1 բջիջներում PACAP- ի կողմից CCK գենի արտագրման վերահսկում: Am J Physiol- ի գաստրոտնտեսային լյարդի ֆիզիոլոգ: 2000; 279: G605-12: [PubMed]
Ding XZ, Mocchetti I. Կրծքավանդակի մեջ քոլեջիստոկինի մՌՆԱ-ի դոպինամիկ կարգավորումը: Brain Res Մոլ Brain Res. 1992; 12: 77-83: [PubMed]
Forrest S, McNamara C. Id ընտանիք transcription գործոնների եւ անոթային lesion ձեւավորման. Arterioscler Thromb Vasc Biol- ը: 2004; 24: 2014-20: [PubMed]
Gevrey JC, Cordier-Bussat M, Némoz-Gaillard E, Chayvialle JA, Abello J. Coil- ի պահանջը ցիկլային AMP- եւ կալցիումային կախված սպիտակուցային kinases- ից, քոլեջիստոկինինի գենի transcriptional ակտիվացման համար, սպիտակուցի հիդրոգլիացիների կողմից: Ջ Բիոլ Քեմ: 2002; 277: 22407-13: [PubMed]
Green TA, Alibhai ԻՆ, Unterberg S, Neve RL, Ghose S, Tamminga CA, Nestler EJ: ATF2- ի, ATF3- ի եւ ATF4- ի ակտիվացման տառատեսակային գործոնները (ATF- ներ) միջուկը եւ նրանց հուզական վարքագծի կարգավորումը: J Neurosci. 2008; 28: 2025-32: [PubMed]
Hamilton ME, Redondo JL, Freeman Ա.Ս. Դոպամինի եւ քոլեիստիստոկինի արտահոսքը սնուցող միջուկի հոդի մեջ `ի պատասխան սուր դեղերի վարման: Synapse- ը: 2000; 38: 238-42: [PubMed]
Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC: Միտոգենով ակտիվացված սպիտակուցային կինազա և սպիտակուցային կինազ Ա ազդանշանային ուղիները խթանում են խոլեցիստոկինինի արտագրումը ցիկլային ադենոզին 3 ′, 5′-մոնոֆոսֆատային արձագանքման տարրին կապող սպիտակուցի ակտիվացման միջոցով: Մոլ էնդոկրինոլ: 1999; 13: 466–75: [PubMed]
Hansen TV, Nielsen FC- ը: Նեյրոնալ քոլեջիստոկինի գենային արտագրման կարգավորում: Scand J Clin Lab Invest հավելվածը 2001; 234: 61-7: [PubMed]
Hansen TV- ն: Քոլեջիստոկինինի գենային տառատեսակը. Խթանող տարրեր, տրանսգատորային գործոններ եւ ազդանշանային ուղիները: Պեպտիդներ: 2001; 22: 1201-11: [PubMed]
Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC- ը: KCl- ը եւ forskolin- ը սիներգիստիկ կերպով կարգավորում են CREB- ի կոորդինատիկ ակտիվացման եւ կոոպերատիվ CBP- ի միջոցով քոլեջիստոկինինի գեն արտահայտությունը: J Neurochem. 2004; 89: 15-23: [PubMed]
Haun RS, Դիքսոն Ջ. Սրտի քոլեջիստոկինինի գենի արտահայտման համար անհրաժեշտ արտագրման ուժեղացուցիչը պարունակում է մարդկային c-fos գենի -296 տարրերի նույնական հաջորդականությունը: Ջ Բիոլ Քեմ: 1990; 265: 15455-63: [PubMed]
Հիրոյ Ն, Մարեկ Գ.Ջ., Բրաուն Ջ.Ռ., Հ.Հ., Սուդուդ Ֆ, Վաիդյա Վ.Ա., Դուման Ռ.Ս., Գրինբերգ Մ.Է., Նեստլեր Է.Ջ. Ֆոսբ գենի հիմնական դերը քրոնիկ էլեկտրոկոնվուլյացիայի բռնկումների մոլեկուլային, բջջային եւ վարքային գործողություններում: J Neurosci 1998. 1998; 18: 6952-62: [PubMed]
Hokfelt T, Rehfeld JF, Skirboll L, Ivemark B, Goldstein M, Markey K. Դոֆամինի եւ CCK- ի համոզիոն-լիմբիկ նեյրոնների համադրման համար: Բնություն: 1980; 285: 476-8: [PubMed]
Հույսը BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ: Քրոնիկ electroconvulsive seizure (ECS) բուժումը հանգեցնում է երկարատեւ AP-1 համալիրի ուղեղի փոփոխված կազմի եւ բնութագրերի արտահայտմանը: J Neurosci. 1994; 14: 4318-28: [PubMed]
Հույսը BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ: Անցում երկարատեւ AP-1 համալիրը բաղկացած փոփոխված Fos- նման սպիտակուցներ ուղեղի քրոնիկ կոկաին եւ այլ քրոնիկ բուժում. Նյարդոն: 1994; 13: 1235-44: [PubMed]
Huang KX, Walters JR: AP-1 փոխպատվաստման գործոնի դոպինամիկ կարգավորումը ԴՆԹ-ի պարտադիր ակտիվությունը առնետի ստերիմատում: Neuroscience. 1996; 75: 757-75: [PubMed]
Էմեյ Ս, McCorkle SR, Cha-Molstad H, Dwyer JM, Yochum GS, Boss JM, McWeeney S, Dunn JJ, Mandel G, Goodman RH: CREB կարգավորումը `գենոմի լայնածավալ վերլուծություն transcription factor- ի կարգավորող շրջաններում: Բջիջ: 2004; 119: 1041-54: [PubMed]
Johannessen M, Delghandi պատգամավոր, Moens U. Ինչ է դառնում CREB վրա? Բջջային ազդանշան: 2004; 16: 1211-27: [PubMed]
Josselyn SA, Vaccarino FJ- ն: Հակադարձող կողմերի ազդեցությունը CCK (A) եւ CCK (B) antagonists- ի առնետների պայմանավորված գործունեության զարգացման վրա: Behav ֆարմակոլ. 1996; 7: 505-512: [PubMed]
Josselyn SA, De Christoparo A, Vaccarino FJ- ն: Ապացույցներ, CCK- ի (A) բաղադրիչի ներգրավվածությունը առնետների մեջ կոկաինի արտադրած պայմանավորված գործունեության ձեռքբերման մեջ: Brain Res. 1997; 763: 93-102: [PubMed]
Կալց Մբ, Քեն Ջ, Կառլիզոն Վ.Ա., Ջր., Ուիսլեր Ք, Գիլդեն Լ, Բեքման ԱՄ, Սթեֆեն Ս, Ժանգ Յ.Ջ., Մարոտտի Լ, Ինքն DW, Թքատ Թ, Բարանաուսկաս Գ, Սուրմեիր DJ, Նեւե ՌԼ, Դուման Ռ.Ս., Պիկոտո Մ.Ռ. , Nestler EJ- ն: ԴելտաՖոսԲ-ի փոխանցման գործոնը արտահայտելը ուղեղի վերահսկում է զգայունությունը կոկաինի նկատմամբ: Բնություն: 1999; 401: 272-6: [PubMed]
Կումար Ա, Չոյի Ք, Ռենտալ Վ, Ցանկովա Ն.Մ., Theobald DE, Truong HT, Russo SJ, Laplant Q, Sasaki TS, Whistler KN, Neve RL, Self DW, Nestler EJ: Chromatin- ի վերափոխումը կոտրատորի մեջ կոկաինը ներգործող պլաստիկության հիմքում ընկած հիմնական մեխանիզմն է: Նյարդոն: 2005; 48: 303-14: [PubMed]
Մաթսոն Բ.Ջ., Բոսսերտ Ջ.Մ., Սիմոնս Դ.Է., Նոզակի Ն, Նագարկար Դ, Քրուուտեր Ջ.Դ., Հույս Բ.Տ. Կոկինային ներգրավված CREB ֆոսֆորալացումը կոկաինի զգայուն առնետների ճառագայթների ակեմբենսներում թույլ է տալիս ակտիվացնել արտերկուլյարային ազդանշանի հետ կապված kinase- ի ակտիվացումը, այլ ոչ թե սպիտակուցային kinase A. J Neurochem: 2005; 95: 1481-94: [PubMed]
McClung CA, Nestler EJ- ն: CREB եւ DeltaFosB- ի կողմից գենային արտահայտման եւ կոկաինի պարգեւի կարգավորումը: Nat Neurosci. 2003; 6: 1208-15: [PubMed]
McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ: DeltaFosB- ը ուղեղի երկարաժամկետ հարմարվողության համար մոլեկուլային անջատիչ է: Brain Res Մոլ Brain Res. 2004; 132: 146-54: [PubMed]
Nestler EJ, Kelz MB, Chen JS- ն: ΔFosB: երկարատեւ նյարդային եւ վարքային պլաստիկության մոլեկուլային միջնորդ: Brain Res. 1999; 835: 10-17: [PubMed]
Nestler EJ- ն: Կախվածության համար ընդհանուր մոլեկուլային ճանապարհ կա: Nat Neurosci. 2005; 8: 1445-9: [PubMed]
Nestler EJ- ն: ԴՆԹ-ի դերակատարումը. Philos Trans R Soc Lond Բ Բոլ Սի. 2008; 363: 3245-55: [PMC անվճար հոդվածը] [PubMed]
Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ: DeltaFosB- ի ուղեղի հագեցված տարբերակները չարաշահման թմրամիջոցներով: Synapse- ը: 2008; 62: 358-69: [PMC անվճար հոդվածը] [PubMed]
Rando OJ, Chang HY: Genom- ի լայն տեսարաններ քրոմատինի կառուցվածքի մեջ: Annu Rev Biochem. 2009; 78: 245-71: [PMC անվճար հոդվածը] [PubMed]
Ռինթալ Վ., Կառլե Տլ, Լազե I, Կովմանթոն Հ., 3rd., Truong HT, Alibhai I, Kumar A, Montgomery RL, Olson EN, Nestler EJ: Delta FosB- ն միջնորդում է քրոնիկ ամֆետամինի ազդեցությունից հետո c-fos գենի epigenetic desensitization: J Neurosci. 2008; 28: 7344-9: [PMC անվճար հոդվածը] [PubMed]
Ռայնալ Վ., Կումար Ա, Սյաո Գ, Վիլկինոն Մ, Քովինգոնթ Հ., 3rd, Maze I, Sikder D, Robison AJ, LaPlant Q, Dietz DM, Russo SJ, Vialou V, Chakravarty S, Kodadek TJ, Stack A, Kabbaj M, Nestler EJ- ն: Կոկաինի կողմից քրոմատինի կարգավորման գենոմային լայն վերլուծությունը բացահայտում է դեր կեղծիքների համար: Նյարդոն: 2009; 62: 335-48: [PMC անվճար հոդվածը] [PubMed]
Ռոտցինգեր Ս, Բաշ Դե Դե Դե, Vaccarino FJ: Mesolimbic dopamine ֆունկցիայի քոլեջիստոկինի մոդուլացումը. Մոտիվացված վարքի կարգավորում: Ֆարմոլոլ Թոքսիկոլ: 2002; 91: 404-13: [PubMed]
Ռուրկե IJ, Hansen TV, Nerlov C, Rehfeld JF, Nielsen FC- ը: Բացասական կոոպերատիվություն, քաղցկեղի քաղցկեղի գեն առաջխաղացման մեջ առաջադրված E-box- ի եւ cAMP / TPA- ի պատասխանատու տարրերի միջեւ: FEBS Lett. 1999; 448: 15-8: [PubMed]
Շոու-Լութթման Թ.Զ., Բարրոտր Մ, Ուոլաս Թ, Գիլդեն Լ, Զաչարիու Վ, Իմպեյ Ս, Դուման Ռ.Ս., Փոթոր Դ, Նեստլեր Է.Ջ. Naltrexone-precipitated morphine- ի արտահոսքի ժամանակ CRE-mediated transcription- ի տարածաշրջանային եւ բջջային քարտեզագրումը: J Neurosci. 2002; 22: 3663-3672: [PubMed]
Շաու-Լութթման TZ, Impey S, Storm D, Nestler EJ: Ամպեթամինի միջոցով մկնիկի ուղեղի CRE-mediated transcription- ի կարգավորումը: Synapse- ը: 2003; 48: 10-7: [PubMed]
Շենգ Մ, McFadden G, Greenberg ME. Մեմբրանի depolarization- ը եւ կալցիումը CREB- ի transcriptional factor- ի ֆոսֆորալացման միջոցով առաջացնում են c-fos transcription: Նյարդոն: 1990; 4: 571-82: [PubMed]
Ցանկովա Ն.Մ., Կումար Ա, Նեստլեր Է.Ջ. Հիտեոնային փոփոխությունները գենային խթանող շրջաններում `սուր ու հիպոկամպում, սուր եւ քրոնիկ electroconvulsive seizures- ից հետո: J Neurosci. 2004; 24: 5603-10: [PubMed]
Ulery PG, Nestler EJ: DeltaFosB- ի transcriptional activity- ի կանոնակարգումը Ser27- ի ֆոսֆորման կողմից: Eur J Neurosci: 2007; 25: 224-30: [PubMed]
Vaccarino FJ- ն: Nucleus accumbens dopamine-CCK փոխազդեցությունները հոգեբանական խթանման եւ կապված վարքագծի մասին: Neurosci Biobehav Rev. 1992; 18: 207-14: [PubMed]
Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ: ΔFosB: Մորֆինային գործողության մեջ էական դեր ΔFosB- ի համար: Բնություն Նյարդաբան: 2006; 9: 205-11: [PubMed]