Վերացական
Nucleus accumbens- ում (NAcc) dopaminoceptive նեյրոնների վրա դենդրիտիկ ողնուղեղների հոգեկան արատավոր փոփոխությունները ենթադրվում են որպես ադապտիվ նեյրոնային արձագանք, որը կապված է երկարատեւ addictive վարքագծի հետ: NAcc- ը հիմնականում բաղկացած է միջին չափի բորբոքային նեյրոնների երկու հստակ ենթահամակարգերից, որոնք արտահայտում են կամ dopamine D1 կամ D2 ընկալիչների բարձր մակարդակները: Սույն ուսումնասիրության մեջ մենք վերլուծեցինք քաղցկեղի քրոնիկ խանգարումներից հետո դենդրիտային ողնաշարի խտությունը, որոշակի D1- ի կամ D2- ի բաղադրիչով պարունակող միջուկային նեյտրոններ: Այս ուսումնասիրությունները օգտագործեցին transgenic mice- ից, որոնք արտահայտեցին EGFP- ի կամ D1- ի կամ D2 ընդունիչի խթանողին (Drd1-EGFP կամ Drd2-EGFP) հսկողության ներքո: 28 օր կոկաինի բուժման եւ 2 օրից դուրս գալու ժամանակ ողնաշարի խտությունը ավելացավ ինչպես Drd1-EGFP- ի, այնպես էլ Drd2-EGFP- ի դրական նեյրոններում: Այնուամենայնիվ, ողնաշարի խտության աճը պահպանվել է միայն Drd1-EGFP- ի դրական նեյրոնների մեջ, որը տուբերկուլյոզի արդյունքում 30 օր անց: Հատկանշական է, որ ΔFosB արտահայտությունը նույնպես նկատվել է Drd1-EGFP- եւ Drd2-EGFP- դրական նեյրոնների մեջ, 2 օրվա ընթացքում թմրանյութերի հեռացման դեպքում, սակայն միայն Drd1-EGFP- ի դրական նեյրոններում, 30 օրվա ընթացքում թմրամիջոցների դուրսբերման ժամանակ: Այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ քրոնիկ կոկաինի բուժման արդյունքում նկատված աճող ողնաշարի խտությունը կայուն է միայն D1-receptor պարունակող նեյրոնների մեջ եւ ΔFosB արտահայտությունը կապված է D1- ի դենդրիտիկ ողնաշարի ձեւավորման եւ / կամ պահպանման հետ, ինչպես նաեւ D2- ի ընկալիչ պարունակող նեյրոնների ԱՀՀ-ում:
The mesolimbic dopaminergic ուղին բաղկացած նեյրոններից է ventral tegmental տարածքում, որը innervate միջուկը accumbens (NAcc), խոզաբույր tubercle, prefrontal ծառի կեղեվ եւ amygdala (1), մինչդեռ nigrostriatal dopaminergic neurons է substantia nigra (pars compacta) ապահովում է աճող կանխատեսում դեպի dorsal striatum (2): Psychostimulants- ն բարձրացնում է NAcc- ի դոպամինի սինաբետիկ կոնցենտրացիաները `կոկային, դոպամինի սինթետիկ ճեղքման եւ ամֆետամինի արգելափակումով, նպաստելով նյարդային տերմինալներից դոպամինային հեռացմանը3-5): Կրկնվող, ընդմիջվող հոգեբանական խանգարումներն առաջացնում են այդ դեղերի սուր խրախուսման հետեւանքների ավելացում վարքային արձագանքների (sensitization)6-8): Վկայությունների մեծամասնությունը ենթադրում են, որ վրացական երկխոսության տարածքում հարմարվողական փոփոխություններ են առաջանում `NAcc dopaminergic համակարգը կենտրոնանում է փորձի կախվածության պլաստիկության մեջ փոփոխությունների վրա, որը հիմնվում է թմրանյութերի ներգործության վրա:
Բացի դոպամինից, գլյուտամատը պահանջվում է հոգեբանական խթանիչների մշակման համար վարքագծային սենսիտիզացիայի զարգացման համար (9, 10): Միջին չափի բորբոքումային նեյրոնները (MSNs) վենտրալ ստրիատում ստանում են prefrontal cortex- ից ստացված արգասիքային glutamatergic կանխատեսումները, որոնք synapse վրա dendritic spines. MSN- ն նաեւ դոպամիներգիկ axons- ի հիմնական թիրախն են, որոնք ազդում են ողնաշարի վզին (1, 11, 12): Հետեւաբար, MSN- ի դենդրիտիկ ողնաշարերը ներկայացնում են բջջային խցիկը, որտեղ դոպինամիկ եւ glutamatergic հաղորդումը նախապես ինտեգրվում են:
Dopamine- ն գործում է երկու խոշոր վերգետնյա ենթապայմանների, D1 subfamily- ի (D1 եւ D5 ենթահամակարգերի) եւ D2 subfamily- ի (D2, D3 եւ D4 ենթահամակարգերը) (13): Դորալիստիկական ստերիմատում անատոմիական ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ ստրիատոնիգարական MSN- ն պարունակում է D1 ընդունիչների բարձր մակարդակ (P- ի եւ դինորֆինի հետ միասին), մինչդեռ striatopallidal MSN- ները հիմնականում արտահայտում են D2 ընդունիչները (enkephalin- ի հետ միասին)14-17): NAcc- ի կանխատեսումները ավելի բարդ են, քան դորալիստական ստիաթում, ԱՀՀ-ի վահանակն ու հիմնական մասերը, որոնք նախագծում են ventral pallidum- ի հստակ ենթատարածաշրջանները եւ վրացական հանքավայրի եւ հիմնական nigra- ի (18): Քանի որ D2 ընդունիչները եւ enkephalin բարձր արտահայտված են ventral pallidum- ում, D1 ընդունիչները եւ P նյութը հավասարապես տարածված են վրացական pallidum եւ ventral tegmental area- ներին (19): D1- ի կամ D2- ի ընկալիչների համար ընտրող agonists- ի եւ antagonists- ի ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ ինչպես D1- ը, այնպես էլ D2- ը, անհրաժեշտ է հոգեբանական խթանող վարքային փոփոխությունների համար20-25): Սակայն այդ ընկալիչների դերերը տարբեր են: Օրինակ, D1 ընդունիչների խթանումը խթանում է կոկաինը, որը կոչվում է կոկաինի ներարկման ներարկումներ եւ կոկաինի հետ կապված շրջակա միջավայրի պահպանում, իսկ D2 ընդունիչի խթանումը նպաստում է կոկաինի ներգործության վերականգնմանը (26-28).
Հոգեբուժական կախվածության հետ կապված վարքային աննորմալությունները չափազանց երկարատեւ են: Հետեւաբար, զգալի հետաքրքրություն առաջացրեց դոպամինային եւ գլուտամատով կարգավորվող նեյրոնային սխեմաների մոլեկուլային եւ կառուցվածքային մակարդակներում թմրամիջոցների երկարատեւ փոփոխությունների հայտնաբերման համար29-32): Հատկանշական է, որ կոկաինի կամ ամֆետամինի երկարատեւ ազդեցությունը հայտնաբերվել է NAcc- ում MSN- ի դենդրիտիկական մասնիկների եւ կծկումների քանակի ավելացման համար:33-35): Այս կառուցվածքային փոփոխությունները ցույց են տվել, որ վերջին թմրանյութերի ազդեցությունից մինչեւ ≈ 1-3.5 ամիս առաջ30, 35) եւ առաջարկվել է հիմք ունենալ երկարատեւ փոփոխություններ սինթաստիկ պլաստիկության մեջ `կապված հոգեբանական ազդեցության հետ:
Սույն ուսումնասիրության նպատակն էր ուսումնասիրել կոկաինի կողմից ստացված կառուցվածքային փոփոխությունները dendritic spines- ի ճշգրիտ MSN- ների subpopulations- ում, որոնք արտահայտում են D1 կամ D2 ընդունիչները: Այս հետազոտություններում մենք օգտագործել ենք բակտերիալ արհեստական քրոմոսոմ (BAC) տրանսգենային մկաններ, որոնք արտահայտում են EGFP- ի կամ D1- ի (Drd1-EGFP) կամ D2 (Drd2-EGFP) դոպամինային ընդունիչի խթանման հսկողության տակ36): Արդյունքները ցույց են տալիս, որ չնայած աճող ողնաշարի խտությունը սկզբնապես տեղի է ունենում D1- ի վերափոխիչ պարունակող MSN- ների եւ D2- ի վերափոխիչ պարունակող MSN- ների համար, փոփոխված ողնաշարի խտությունը կայուն է միայն D1- ի վերափոխիչ պարունակող նեյրոնների մեջ: Ավելին, մենք հայտնաբերում ենք նման փոփոխություններ ΔFosB- ի transcriptional factor- ի արտահայտության մեջ, որը ենթադրում է, որ ΔFosB- ը կարող է ներգրավվել D1- ում dendritic spines ձեւավորման եւ / կամ պահպանման մեջ, ինչպես նաեւ NAX- ում D2- ի բաղադրիչ պարունակող նեյրոններ:
Արդյունքներ
Drd1-EGFP- ի եւ Drd2-EGFP BAC- ի Transgenic Mice- ի MSN- ի վերլուծությունը:
Drd1-EGFP- ի կամ Drd2-EGFP BAC- ի տրանսգենային մկների խորքային եւ վրացական ստերիմատից MSN- ների նախագծման նախագիծը բնութագրվել է GFP արտահայտության վերլուծության միջոցով (36): GFP- ի dorsal striatum- ի MSN- ների դիֆերենցիալ արտահայտությունը ընդհանուր առմամբ համապատասխանում է endogenous D1 կամ D2 ընդունիչներին համապատասխանաբար (36): Մենք շարունակեցինք վերլուծել GFP- ի տարբերակման արտահայտությունը NAcc- ում Drd1-EGFP կամ Drd2-EGFP մկների (Նկ. 1a և b): Չնայած NAcc- ի նեյրոնների ≈ 58% -ը GFP- ին արտահայտում է Drd1-EGFP մկների (Նկ. 1a), NAcc- ի նեյրոնների ≈ 48% -ը GFP- ին արտահայտում է Drd-2-EGFP մկների (Նկ. 1b): MSN- ն ներկայացնում է NAcc- ի բոլոր նեյրոնների 90-95% -ը12, 37): D1 ընդունիչները արտահայտվում են միայն MSN- ներում, եւ D2- ի ընկալիչները արտահայտվում են MSN- ների եւ cholinergic interneurons- ում, որոնք ներկայացնում են 1-3% striatal neurons (37): Այս գործոնները հաշվի առնելով, արդյունքները ցույց են տալիս, որ նվազագույնը, α10-15% MSN- ում NAcc- ում, ամենայն հավանականությամբ, պետք է արտահայտի ինչպես D1, այնպես էլ D2 ընդունիչները:
Drd1-EGFP- ի եւ Drd2-EGFP մկների մեջ Dendritic Spines- ի վերլուծությունը:
Drd1-EGFP- ի եւ Drd2-EGFP- ի մկների մեջ GFP- ի արտահայտությունը օգտակար է եղել նեյրոնային բջիջների բծերը տարածելու համար: Այնուամենայնիվ, Dendrites- ի եւ dendritic spines- ի GFP- ի ազդանշանը չափազանց թույլ էր, թույլ տալով վերլուծել հակա-GFP հակամարմինները: Վերջերս օգտագործվել է լյումինեսցենտային ներկերի մասնիկային բալիստիկ առաքումը վերջերս օգտագործվել է նեյրոնային բնակչությանը արագ եւ արդյունավետ կերպով պիտակավորելու համար (38): Բոլոր նեյրոնները կարող են պիտակավորված լինել այս մեթոդով, եւ մեթոդը կարծես համեմատելի է Գոլգի-Քոքսի գույնի հետ: NAcc- ի նեյրոնների դենդրիտիկական մորֆոլոգիան վերլուծելու նպատակով ամրագրված շեղբայրավոր շերտերը պիտակավորվել են գենային ատրճանակի օգտագործմամբ `1,1'-diotadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine porchlorate (DiI) շրթունքների լիպոֆիլիկ ֆլուորեսցենտային նմուշով: Ցույց է տրվում DiI-lined MSN- ի օրինակ Նկ. 1c. Օգտագործված պայմանների համաձայն, մենք ընդհանուր առմամբ դիտում էինք նեյրոններ պիտակավորված, առանց որեւէ մեկի համընկնող dendrites այլ պիտակավորված նեյրոններից: Բարձր խոշորացումով կարելի է դիտարկել մանրամասն դենդրիտիկական մորֆոլոգիա, ներառյալ դենդրիտիկ ողնաշարերը (Նկ. 1d).
Այնուհետեւ մենք օգտագործեցինք GI- ի համար DiI մակնշման եւ իմունոգոստոկիմիայի համադրություն կամ Drd1-EGFP կամ Drd2-EGFP տրանսգենային մկների մեջ, որը հնարավոր եղավ օգտագործել հյուսվածքի ներթափանցման համար լվացքի ցածր կոնցենտրացիան Մեթոդներ): DiI- ի եւ GFP- ի MSN- ի բջջային մարմիններում մանրակրկիտ համեմատելով, մենք կարողացանք բացահայտել DiI- եւ GFP- ի դրական կամ DiI-positive- ի եւ GFP- բացասական նեյրոնների Drd1-EGFP- ում (Նկ. 2a) կամ Drd2-EGFP (Նկ. 2b) մկները: Հետեւյալ ուսումնասիրությունների համար մենք ուսումնասիրեցինք dendritic morphology- ը միայն DiI- ի եւ GFP- ի դրական նեյրոնների Drd1-EGFP կամ Drd2-EGFP մկների կողմից:
Քրոնիկ կոկաինի բուժման արդյունքներն աճող ողնաշարի խտության մեջ են հայտնվել Accumbal MSN- ում, որոնք ներկայացնում են Drd1-EGFP կամ Drd2-EGFP:
Drd1-EGFP կամ Drd2-EGFP մկները միանգամից չորս հաջորդական շաբաթներ ներարկվել են կոկաինի (30 մգ / կգ) կամ աղի միջոցով Մեթոդներ): Երկրորդ օր (2WD) կամ 30 օր (30WD) վերջին թմրամիջոցների բուժումից հետո, ուղեղները մշակվել են DiI մակնշման եւ իմունոգեւոր քիմիայի համար, ինչպես նկարագրված է վերը: Նախորդ հետազոտության համաձայն, ամֆետամինի հետ քրոնիկական բուժումը ավելացել է ողնաշարի խտության վրա, այն դեպքում, երբ NAcc- ում MSN- ի հեռավոր, բայց ոչ proximal dendrites35): Հետեւաբար, մեր վերլուծությունը սահմանափակվում էր հեռավոր դենդրիտից (այսինքն, երկրորդ կամ երրորդ կարգի ճյուղերով), ներառյալ տերմինալային շրջանները: 2WD- ի վերլուծության ժամանակ ողնաշարի խտությունը հայտնաբերվել է Drd1-EGFP- ի դրական MSN- ների մեջ (128% saline group) (Նկ. 3a և c) եւ ավելի ցածր աստիճանի Drd2-EGFP- ի դրական նեյրոնների մեջ (115% saline group) (Նկ. 3 b և d): 30WD- ից հետո աճող ողնաշարի խտությունը պահպանվել է Drd1-EGFP- ի դրական նեյրոնների մեջ (118% saline control) (Նկ. 3 a և c), բայց ոչ Drd2-EGFP- ի դրական նեյրոնների (Նկ. 3 b և d).
Դենդրիտային հոդերի մորֆոլոգիան փոփոխական է նրանց երկարությամբ եւ ողնաշարի գլուխների լայնությամբ: Հետեւաբար մենք դասակարգեցինք dendritic ելքները չորս ողնաշարի դասերի (stubby, սունկ, բարակ եւ filopodia) 2WD է կոկաինը (տվյալները չեն ցուցադրվում). Սնկային տեսակի խտությունը (119.7 ± 4.0%, P <0.01) և բարակ փուշերը (120.0 ± 3.4%, P <0.01) ավելացել է կոկայինի միջոցով Drd1-EGFP դրական MSN- ներում, մինչդեռ կոճղի խտությունը (182.4 ± 21.6%, P <0.05) և սնկային փուշեր (122.5 ± 5.0%, P <0.01) ավելացել է Drd2-EGFP դրական MSN- ներում: Drd1-EGFP դրական նեյրոնների կամ բարակ ողնաշարի Drd2-EGFP դրական նեյրոնների կոճղի ողնաշարի զգալի աճ չի եղել:
Քրոնիկ կոկաինը ներարկում է ΔFosB արտահայտությունը Drcc1-EGFP- ում կամ Drd2-EGFP- ի դրական MSN- ներում NAcc- ում:
ΔFosB- ն Fos- ի ընտանիքի անդամն է transcription- ի գործոնների համար: Մինչդեռ կոկաինի սուր վարումը առաջացնում է մի քանի Fos isoforms- ի արագ եւ անցումային ներադրություն NAcc- ում, կրկնակի ազդեցությունը կոկաինը բարձրացնում է ΔFosB մակարդակը: Ավելին, ΔFosB արտահայտության աճը պահպանվում է NAcc- ում, թմրամիջոցների հայտնաբերման դադարեցումից հետո շաբաթների եւ ամիսների ընթացքում, եւ առաջարկվել է ներգրավվել գենային արտահայտման երկարատեւ կարգավորմամբ, անգամ թմրամիջոցների դադարեցումից հետո (29, 39, 40).
Քոքսի բուժման արդյունքում ΔFosB- ի ինդուկցիան Drd1-EGFP- ից կամ Drd2-EGFP մկնիկից սկսած Ncc- ում հայտնաբերվելուց հետո մենք վերլուծեցինք FosB- ի եւ GFP- ի արտահայտությունը կրկնակի պիտակավորմամբ (Նկ. 4 և Աղյուսակ 1) Anti-FosB հակամարմինը ճանաչում է FosB- ի բոլոր ձեւերը, սակայն ենթադրվում է, որ աճող իմունոստայնը ներկայացնում է ΔFosB (տես Մեթոդներ հետագա քննարկման համար): Աղիով բուժած մկների մեջ Drd16-EGFP- ի դրական նեյրոնների 1% -ը եւ Drd15-EGFP- ի դրական նեյրոնների 2% -ը արտահայտել են FosB immunoreactivity համեմատաբար թույլ ինտենսիվության (Նկ. 4 a և b և Աղյուսակ 1): Կրկնակված կոկաինը, որը հետեւում էր 2WD- ին, հանգեցրեց Drd1-EGFP- ի դրական նեյրոնների քանակի զգալի աճի, որը համընկավ ΔFosB (55% GFP- դրական նեյրոնների) (Նկ. 4c և Աղյուսակ 1): Drd2-EGFP- ի դրական նեյրոններում (GNPX-դրական նեյրոնների 25%) (եւ XNUMX%) հայտնաբերվել է ΔFosB արտահայտության փոքր, բայց զգալի աճՆկ. 4d և Աղյուսակ 1): ≥FosB- ի աճի արտահայտությունը պահպանվել է Drd1-EGFP- ի դրական նեյրոնների մեջ (46% GFP- ի դրական նեյրոնների), բայց ոչ Drd2-EGFP- ի դրական նեյրոնների (15% -ից GFP- դրական նեյրոններ) հետո 30WD (Նկ. 4 e և f և Աղյուսակ 1): Նշենք, որ աճող ΔFosB արտահայտությունը դիտվում է Նկ. 4f ներկա է Drd2-EGFP- բացասական նեյրոնների մեջ:
Քննարկում
Դոպամիներգիկ նյարդոտայնացման մեջ երկարատեւ հարմարվողականությունը ենթադրվում է, որ հոգեբանական դեղորայքի հետ կապված կախվածություն ունեցող վարքագծի հիմքում ընկած է: Մասնավորապես, NACC- ում MSN- ների դենդրիտային ողնաշարի խտության աճը հոգեբանական խթանման պատճառ դարձավ `կապված սինապտիկ կապի վերակազմավորման հետ (30): The NAcc- ը հիմնականում բաղկացած է MSN- ի երկու հստակ ենթահաշիվներից, որոնք արտահայտում են D1 կամ D2 դոպամինային ընկալիչների բարձր մակարդակ: Սույն ուսումնասիրության մեջ մենք վերլուծել ենք ողնաշարի խտությունը քաղցկեղի քրոնիկ բուժումից հետո NAcc- ում հայտնաբերված D1- ի կամ D2- ի ընկալիչ պարունակող MSN- ների մեջ: Ստացված արդյունքները ցույց են տալիս, որ չնայած աճող ողնաշարի խտությունը սկզբնապես տեղի է ունենում D1- ի վերափոխիչ պարունակող MSN- ների եւ D2- ի վերափոխիչ պարունակող MSN- ների, փոփոխվող ողնաշարի խտությունը կայուն է միայն D1- ի բաղադրիչ պարունակող նեյրոնների մեջ: Ավելին, մենք գտնում ենք D1- ի եւ D2- ի վերափոխիչ պարունակող MSN- ների փոխանցման գործակից ΔFosB- ի արտահայտման փոփոխությունների նմանատիպ օրինակ:
Այս ուսումնասիրությունները օգտագործեցին BAC- ի տրանսգենային մկների օգտագործումը, որոնք արտահայտում են GFP- ի MSN- ների հատուկ ենթահամակարգերում կամ D1- ի կամ D2 ընդունիչի խթանողին վերահսկողության ներքո: Ավելին, մենք մշակեցինք կրկնակի պիտակավորման մեթոդ, որը համադրեց իմպլեմոլոգիական քիմիական ֆունկցիայի համար իմպլանտոլոգիան `DiI օգտագործելով նեյրոնների բալիստիկական պիտակավորմամբ: Նախորդ ուսումնասիրությունները օգտագործեցին Գոլգի-Քոքսի մեթոդը, վերլուծելու հոգեբանական խթանման ազդեցությունը ողնաշարի խտության վրա (34), եւ այստեղ օգտագործվող DiI մեթոդը տվեց արդյունքներ, որոնք քանակական համեմատելի էին: Մենք մշակել ենք կրկնակի պիտակավորման մեթոդը, քանի որ Գոլգիի գունանյութը չի համապատասխանում իմունոգոստոկիմիայի հետ: Immunostaining- ը սովորաբար պահանջում է հյուսվածքների permeabilization հետ լվացող միջոցների, մի գործընթաց, որը սովորաբար հանգեցնում է լուծույթի lipophilic ներկերի ից թաղանթ (38): Այնուամենայնիվ, մեր ընթացիկ ուսումնասիրություններում GFP immunostaining- ը չի պահանջում լվացքի ներթափանցման համար խտանյութի բարձր կոնցենտրացիան եւ դրանով կարող է օգտագործվել lipophilic dye մակնշման հետ: Մեր կրկնակի պիտակավորման մեթոդը պետք է ընդհանուր առմամբ օգտակար լինի դենդրիտային ողնաշարի կառուցվածքային փոփոխությունների ուսումնասիրության համար, օրինակ, երբ BAC- ի տրանսգենային մկների գծերի վերլուծության համար օգտագործվում է այն դեպքում, երբ GFP- ն արտահայտված է բջիջներում նեյրոնների կոնկրետ պոպուլյացիաներում36).
Չնայած դեռեւս որոշ հակասական են, կարծում են, որ D1 եւ D2 ընդունիչները հիմնականում անատոմիկ կերպով առանձնացված են ուղղակի (striatonigral) եւ անուղղակի (striatopallidal) ստիատալային կանխատեսման նեյրոններ (համապատասխանաբար,17, 41): Drd1-EGFP- ի եւ Drd2-EGFP- ի մկների մեջ GFP- ի տեղայնացման սկզբնական բնութագիրը համահունչ էր այս եզրակացությանը (36): Բացի այդ, Ncc- ում NAX- ի Drd1-EGFP- ից եւ Drd2-EGFP- ի մկների կողմից մեր GFP- դրական նեյրոնների քանակի մեր վերլուծությունը համապատասխանում է եզրակացության, որ MSN- ի 50% -ը արտահայտում է միայն D1 ընդունիչները, որ ≈ 35-40% -ը արտահայտում է միայն D2 ընդունիչները, եւ որ ≈10-15% coexpress- ը եւ D1- ը եւ D2 ընդունիչները: Coexpression- ի այս արժեքը նման է այն բանի, որ դորալային ստիատորի ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ RT-PCR մեթոդներով միասնական ստիատալային նեյրոնների կափարիչ-փաթաթել վերլուծություն, մեկուսացնելու եւ ուժեղացնելու համար mRNA- ները (≈ 17% coexpression enkephalin- ը եւ P- ը)42): Պետք է նշել, որ մեր ընթացիկ ուսումնասիրությունները չեն լուծում D3- ի, D4- ի եւ D5- ի ընկալիչների արտահայտման հարցը, ոչ էլ նրանք անդրադառնում են MSN- ների D1- ի ընկալիչների ցածր մակարդակի արտահայտման խնդրին, արտահայտելով բարձր մակարդակ D2 ընկալիչների կամ հակառակը:
Մի քանի նախորդ ուսումնասիրությունները ուսումնասիրել են psychostimulant-induced Fos- ի արտահայտությունը եւ D1- ի եւ D2- ի ընկալիչների դերը (նեյրոնային տեղայնացումը)43-45): Այդ ուսումնասիրությունները հաստատեցին այն եզրակացությունը, որ Fos- ը եւ ΔFosB induction- ը միջնորդավորված են D1 ընդունիչների ակտիվացման միջոցով: Այնուամենայնիվ, Fos- ի արտահայտության բջջային տեղայնացումը ազդում է շրջակա միջավայրի համատեքստում, որտեղ կիրառվում են հոգեբանական դեղեր:46, 47): Օրինակ, տնային վանդակում տրված ամֆետամինը կամ կոկաինը անհապաղ վաղ գեներին (ներառյալ Fos) առաջացնում են P- դրական բջիջներում, որոնք coexpress D1 ընդունիչները: Ի հակադրություն, այս դեղամիջոցները կարող են առաջացնել Fos արտահայտությունը, այնպես էլ D1- ի եւ D2- ի ընկալիչների պարունակող MSN- ների մեջ, երբ դրանք կիրառվում են նոր միջավայրում: Մեր ընթացիկ հետազոտություններում օգտագործված արձանագրությունը չի ներառում զուգավորում թմրամիջոցների ներարկումը `նոր միջավայրի ազդեցության տակ: Այնուամենայնիվ, մենք չենք կարող բացառել մի տեսակ համատեքստի վրա հիմնված սթրես, որը պատասխանատու է D2- ի վերափոխիչ պարունակող MSN- ների վրա ΔFosB արտահայտության համար:
Ներկայիս արդյունքների զգալի առանձնահատկությունն այն էր, որ ողնուղեղի խտության աճը եւ ΔFosB արտահայտությունը զուգահեռ ձեւ էին: Ավելի մեծ ողնաշարի խտություն եւ ΔFosB արտահայտությունը ի սկզբանե տեղի ունեցան MSN- ում, որոնք արտահայտում էին Drd1-EGFP եւ Drd2-EGFP: Այնուամենայնիվ, այդ փոփոխությունները կայուն էին միայն D1- ի վերափոխիչ պարունակող նեյրոնների մեջ: Դիտման համար հնարավոր բացատրությունը, որը աճել է ողնաշարի խտության եւ ΔFosB արտահայտությունը, D2- ի ընկալիչ պարունակող նեյրոնների ժամանակ անցնում է այն, որ սա տեղի է ունեցել MSNs- ի փոքր խմբում, որոնք համակցում են եւ D1- ի եւ D2- ի դոպամին ընկալիչների: Այսպիսով, այդ աճի անցողիկ բնույթը կարող է կապված լինել D2- ի կախվածության ազդանշանային ուղիների վրա48): Հետաքրքրական է, որ ողնուղեղի խտության եւ ΔFosB արտահայտության փոփոխությունները շրջադարձային էին, ինչը կարող է արտացոլել D2- ի ընկալիչի կախված ազդանշանային ուղիների ΔFosB- ի կայունության վրա ազդելու ունակությունը:
Դիտարկումն այն մասին, որ ΔFosB- ի եւ ողնաշարի խտության արտահայտության մեջ զուգահեռ փոփոխություններ են կատարվում, այն է, որ ΔFosB- ն ներգրավված է NAX- ում D1- ի վերափոխիչ պարունակող նեյրոնների մեջ դենդրիտիկ ողնաշարների նախնական ձեւավորման եւ հետագա պահպանման մեջ: ΔFosB- ի արտահայտումը վերահսկվում է MSN- ի D1 / DARPP-32 / PP1- ի կախված ազդանշանային ուղին:49): Մի շարք ուսումնասիրություններ ցույց են տվել, որ ΔFosB- ն կարեւոր դեր է խաղում հոգեբանական խթանիչների (հատկապես հոգեբանական)39), հավանաբար, ազդեցության ենթարկելով բազմակի գեների արտահայտությունը, որոնք ներառում են նյարդային հաղորդիչ ընդունողներ, ազդանշանային սպիտակուցներ եւ նեյրոնային մորֆոլոգիայի կարգավորման մեջ ներգրավված սպիտակուցներ50): Այնուամենայնիվ, հայտնի չէ, որ քրոնիկ կոկաինի ենթարկված ողնաշարի ձեւավորման մեջ ներգրավված հատուկ մոլեկուլային մեխանիզմները դեռեւս հայտնի չեն: Մեր նախորդ ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ Cdk5 inhibitor roscovitine- ի intraaccumbal infusion- ն նյարդայնացնում է ողնաշարի խտության (51): Ավելին, Cdk5- ը ΔFosB- ի համար գլխուղեղի գետն է եւ ենթարկվել է քրոնիկ կոկաինի բուժման հետ կապված փոխհատուցման հարմարվողական փոփոխությունների (52): Հետեւաբար, Cdk5- ի կախված ֆոսֆորալացիայի փոփոխումը կոկաինի ներածված ողնաշարի ձեւավորման եւ / կամ ողնաշարի կայունության հիմքում ընկած մի մեխանիզմ է: PAK (53), β-catenin (54), PSD-95 (55) եւ սպինոֆիլին (56) են subdrates համար Cdk5 եւ բոլորը ներգրավված են կարգավորելու ողնաշարի morphogenesis (57-60): Այս եւ այլ Cdk5 նյութերի հետագա բնութագրումը հույս է ներշնչում, որ հույսը լույս է սփռում հոգեբանամանկավարժների կողմից ողնաշարի ձեւավորման գործում ներգրավված մեխանիզմների վրա:
Մեթոդներ
Կենդանիներ:
DHNUMX կամ D1 դոպամինային ընկալիչների վերահսկողության տակ գտնվող EGFP տրանսգեն տանող մկները գեներացվել են Gensat BAC տրանսգենային նախագիծ (36): Այս հետազոտության մեջ օգտագործված transgenic mice- ն 4-5 շաբաթական էր եւ գտնվում էին շվեյցարական-Webster ֆոնի վրա: Մկնիկները պահպանվել են 12- ի մեջ `12-h թեթեւ / մութ ցիկլով եւ տեղակայված 2-5- ի խմբերով, սննդով եւ ջրի մատչելիությամբ: Բոլոր կենդանական արձանագրությունները համապատասխանում էին Լաբորատոր կենդանիների խնամքի եւ օգտագործման առողջապահական ուղեցույցի ազգային ինստիտուտներին եւ հաստատվել են Ռոքիֆելլեր համալսարանի ինստիտուցիոնալ կենդանիների խնամքի եւ օգտագործման կոմիտեի կողմից:
Թմրամիջոցների բուժում:
Քրոնիկ քաղցկեղի բուժումը (30 մգ / կգ օրական) հաղորդում է, որ MSN- ի ողնաշարի խտության ուժեղ աճը բերում է NAcc- ի միջուկը եւ շվաբրերից, սակայն ավելի ցածր դոզան (15 մգ / կգ) ավելացրել է ողնաշարի խտությունը միայն շերտը (61): Հետեւաբար, մենք օգտագործում էինք կոկաինի ավելի բարձր դոզան, որպեսզի NAcc- ի երկու մասերում կառուցվածքային փոփոխություններ առաջացնեին: Մկնիկները 30 օրացուցային օրով ստացան օրական 5 մգ / կգ կոկաին-HCl (կամ աղցան) մեկ ներարկիչ (ip), որին հաջորդում է 2 ներարկման օրերը, եւ այս ընթացքը կրկնվեց 4 հաջորդ շաբաթվա ընթացքում: Ներարկումները կատարվեցին տան վանդակում: 2WD կամ 30WD, մկնիկի ուղեղները մշակվել են DiI մակնշման եւ / կամ իմունոգոստոկիմիայի համար:
Բալիստիկ պիտակավորում `լյումինեսցենտ Dye DiI- ի հետ:
Մկները անզգայացվում էին 80 մգ / կգ նատրիումի pentobarbital հետ եւ transcardially հետ 5 մլ PBS- ով, այնուհետեւ 40 մլ 4% paraformaldehyde է արագ օջախը PBS (20 մլ / րոպե). Հենրիկները արագ հեռացվեցին գանգից եւ դրվեցին 4% paraformaldehyde- ում 10 րոպե: Ուղեղի շերտերը (100 μմ) պիտակավորվել են ֆլուորեսցենտ ներկ DiI (Molecular Probes) բալիստիկ առաքմամբ, ինչպես նկարագրված է սույնով: 38. Համակցված DiI մակնշման-իմունոհիստոքիմիայի մեթոդը մշակվել է լվացքի ցածր կոնցենտրացիան: DiI-labeled բաժինները permeabilized են 0.01% Triton X-100 է PBS համար 15 րոպե եւ հետո ինկուբացված է 0.01% Triton X-100 եւ 10% նորմալ այծի շիճուկ է PBS համար 1 ժամը նվազագույնի հասցնել անհատական պիտակավորման. Հյուսվածքային հատվածները ներծծվում էին 1% նորմալ այծի շիճուկով / 0.01% Triton X-100 եւ հակա-GFP հակամարմին (Abcam, Քեմբրիջ, MA) 2- ի համար սենյակային ջերմաստիճանում, լվացվում եւ inkubated է 1: 1,000 dilution of FITC- համակցված երկրորդական հակամարմին (Molecular Probes): Բաժինները տեղադրվեցին մանրադիտակի սլայդների վրա եւ տեղադրվեցին մոնտաժային միջավայրում: Բալիստիկական պիտակավորման մեթոդը թույլ է տալիս մանրամասն ուսումնասիրել dendritic ողնաշարի կառուցվածքը, եւ արդյունքում ստացված արդյունքները որակական եւ քանակական համեմատելի էին նախորդ ուսումնասիրությունների հետ, օգտագործելով Գողգի-Քոքս նյարդայնացման մեթոդը առնետի ուղեղի շերտերում34): Այնուամենայնիվ, նախորդ հետազոտությունների համեմատ, մենք հազվադեպ նկատեցինք երկի գլուխները, DiI- գունավոր նեյրոնների մեջ: Այս տարբերությունը կարող է պայմանավորված լինել ստեյի մեթոդների զգայունության կամ մկնիկի փոփոխության (այս ուսումնասիրության) եւ առնետի հյուսվածքի (34).
Իմունխիստոկիմիա:
Կենդանիները անզգայացվում էին եւ perfused, ինչպես նկարագրված վերը: Մեղրերը հանվել եւ պահվել են գիշերում 4% paraformaldehyde- ին, 4 ° C- ում: Բջիջները պաշտպանվել են PBS լուծույթի 30% sucrose- ով: Կոռոնալ հատվածները (12 μմ) կտրված էին սառեցման microtome (Leica) վրա, այնուհետեւ մշակվում է իմունոգոստոկիմիայի համար: Այնուհետեւ ուղեղի հատվածները թույլատրվում էին 0.3% Triton X-100- ով PBS- ին 15 րոպեով եւ PBS- ով երկու անգամ լվացվեց: Բաժնետոմսերը նախընտրվել են PBS- ի 10% նորմալ այծի շիճուկում, 1- ի համար 37 ° C- ի վրա, որը ենթարկվում է առաջնային հակամարմիններին (PBS- ում 1% օրգանական այծի շիճուկով զտված) գիշերում 4 ° C- ում, այնուհետեւ լվացվում է PBS- ով եւ ինկուբացված է միջնակարգով 1 ժամվա ընթացքում 37 ° C- ի համար հակամարմիններ: Հետեւյալ հակամարմինները օգտագործվել են `rabbit anti-pan-FosB (SC-48, 1: 500, Santa Cruz Biotechnology), մկնիկի հակահայկական նեյն (քիմիկոն), նապաստակի հակա-GFP, FITC-կոնգուգված հակահայկական նապաստակ IgG եւ ռոդամին- համակցված հակամարմին IgG (Molecular Probes): Երեքը պիտակավորելու համար (ΔFosB, NeuN եւ GFP) ուղեղի բաժինները առաջինն էին իմունասացան հակաբորբոքային FosB հակամարմինների եւ հակա-նեու հակամարմինների հետ եւ հետո ինկուբացված են երկրորդական հակամարմիններով (ռոդամին-կոնգուգված հակաբիլբոնային IgG եւ ցիանային համակցված հակա-մկնիկ IgG ): Կրկնակի գունավոր ուղեղի հատվածները հետագայում վերամշակվել են GFP- ի իմունոստայնացման համար `օգտագործելով Zenon մակնշման տեխնոլոգիան (Zenon Alexa Fluor 488, Molecular Probes): Anti-pan-FosB հակամարմինը բարձրացվել է FosB- ի N տերմինով եւ ճանաչում է ΔFosB- ի եւ լիարժեք FosB- ի (62): Նախորդ ուսումնասիրությունների հիման վրա, որոնք ցույց են տվել, որ ΔFosB, բայց ոչ FosB- ն կամ Fos- ի հետ կապված հակաթույնները կայուն կերպով արտահայտված են քրոնիկ կոկաինի բուժումից հետո, ենթադրենք, որ իմուներմակտիկության երկարատեւ աճը ներկայացնում է ΔFosB- ի կայուն արտահայտությունը: Այնուամենայնիվ, սինթեզված մկների մեջ դիտարկվող իմունորակտիվ FosB ազդանշանի ինքնությունը անհայտ է: Վիճակագրական վերլուծություն Աղյուսակ 1 օգտագործեց ուսանողի t փորձարկում.
Դենդրիկ ողնաշարի վերլուծություն:
Անհատական MSN- ները ԱԱԱ-ում ընտրվել են ողնաշարի վերլուծության հիման վրա `որոշ չափանիշներով: (i) Կա կարճ կամ չհամապատասխանեցված այլ պիտակավորված բջիջների հետ, որպեսզի տարբեր բջիջներից գործընթացները շփոթվեին: (ii) Առնվազն երեք հիմնական դենդրիտները պետք է տեսանելի լինեն, որպեսզի բջիջները օգտագործվեն վերլուծության համար: (III) Ուսումնասիրվել են հեռավոր դենդրիտները (տերմինալային դենդրիտներ կամ տերմինալային դենդրիտին մոտ): Վերլուծվել են ինչպես NAN- ի միջուկում, այնպես էլ MSN- ի դենդրիտները: Չնայած մենք նկատեցինք նոսր պտտվող MSN (փշոտ տիպ II), մենք վերլուծեցինք միայն խիտ ողնաշարի MSN (փշոտ տիպ I): Ողնաշարի խտությունը հաշվարկելու համար հայտնաբերվել է դենդրիտի երկարությունը (> 20 մկմ երկարություն) `օգտագործելով կոնֆոկալ մանրադիտակը (Zeiss LSM 510) յուղով ընկղմվող ոսպնյակի միջոցով (× 40): Դենդրիտների բոլոր պատկերները տարբեր կերպ են արվել z մակարդակներում (0.5-1 μմ խորության պարբերականությամբ) ուսումնասիրելու համար dendritic spines- ի մորֆոլոգիան: Բոլոր չափումները կատարվել են մետամորֆ պատկերների վերլուծության ծրագրով (Universal Imaging, Downingtown, PA): Վիճակագրական վերլուծությունը օգտագործեց Կոլմոգորով-Սմիրնովի թեստը:
Dendrites- ից ստացվում են չորս տեսակներ, որոնց հիման վրա նկարագրված են սեղաններում: 63 և 64, 1-ին դասի ելուստները, որոնք կոչվում են նաև համառ ելուստներ, ունեն <0.5 մկմ երկարություն, չունեին ողնաշարի մեծ գլուխ և կարծես պարանոց չունեին. 2-րդ դասի կամ սնկաձև փուշերը ունեին 0.5-ից 1.25 մկմ երկարություն և բնութագրվում էին կարճ պարանոցով և ողնաշարի մեծ գլխով. 3-րդ դասի կամ բարակ ողնաշարի տատանվում էր 1.25-ից 3.0 մկմ-ի սահմաններում և ուներ ողնաշարի երկարավուն պարանոցներ ՝ փոքր գլխիկներով. 4-րդ դասը կամ ֆիլոպոդիալ երկարացումները երկար թելանման ելուստներ էին, որոնց պակասում էր ողնաշարի գլուխը:
Acknowledgments
Այս աշխատանքը ֆինանսավորվել է Միացյալ Նահանգների Առողջապահության ծառայության Գրանտ DA10044- ի (PG եւ ACN) եւ Սիմոնսի հիմնադրամի, Պիտեր Ջի Sharp հիմնադրամի, Picower Foundation- ի եւ FM Kirby հիմնադրամի կողմից:
Հապավումներ
- NAcc
- միջուկային հեծանիվներ
- MSN
- միջին չափի ցողունային նեյրոն
- BAC
- բակտերիալ արհեստական քրոմոսոմ
- Drd1- ը
- DPAMIN- ի ընդունիչ D1 պրոտոկոլով
- Drd2- ը
- DPAMIN- ի ընդունիչ D2 պրոտոկոլով
- DiI- ը
- 1,1'-diotadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate
- 2WD
- Վերջին օրվանից անցել է 2 օր
- 30WD
- Վերջին օրվանից անցել է 30 օր:
Սայլակ
;