Proc Natl Acad Sci ԱՄՆ Ա. 2005 Փետրվար 1; 102(5): 1737-1742.
Վերացական
Կոկաինը, չարաշահման թմրամիջոցը, մեծացնում է դինամիկ դոպամինի մակարդակը striatum- ում, դոպամինի վերաբաշխումը արգելափակում է միկոն տերմինալներում: Cyclin- կախված kinase 5- ը (Cdk5) եւ նրա ակտիվացնող p35- ը, postmitotic neurons- ներում ենթածրերի ֆոսֆորման մեջ ներգրավված սպիտակուցներ, հայտնաբերվել են կոկաինի քրոնիկ ազդեցության ենթարկվելուց հետո: Հետագայում Cdk5- ի եւ p35- ի ինդուկցիաների ազդեցությունը ստերիալալ դոպամինային ազդանշանների վրա, մենք ստեղծեցինք երկու անկախ տրանսգենային մկնիկի գծեր, որոնցում Cdk5- ը կամ p35- ը գերազանցել են նեյրոնների մեջ: Մենք զեկուցում ենք այստեղ, որ Cdk5- ի աճը p35- ի արդյունքում, բայց ոչ Cdk5- ի գերբնակեցման արդյունքում հանգեցնում է կոկաինի միջնորդավորված դոպամինային ազդանշանների ձուլմանը: Thr-5- ում Dopamine- ի եւ cAMP- կարգավորվող ֆոսֆոպրոտինի, մոլեկուլային զանգվածի 32 kDa- ի (DARPP-32) Cdk75- ի միջնորդավորված ֆոսֆորալումը ուղեկցվել է Thr-32- ում DARPP-34- ի ֆոսֆլորիման նվազեցմամբ: Thr-5- ում արտաճանաչված ազդանշանային կարգավորվող kinase kinase 1- ի Cdk286- ի միջնորդավորված ֆոսֆորալումը ուղեկցվում է արտազատված ազդանշանային կարգավորվող kinase 1 / 2- ի ակտիվացումով: Այս ազդեցությունները նպաստեցին CAMP արձագանքի տարրերի կապող սպիտակուցի կոկաինի ներածված ֆոսֆորլյացիայի նոսրացմանը, ինչպես նաեւ ստիատում ավելի ցածր ներգրավումը c-fos- ի: Այս արդյունքները նպաստում են այն մտքին, որ Cdk5- ի գործունեությունը ներգրավված է փոփոխվող գեների արտահայտության մեջ կոկային քրոնիկական ազդեցության հետեւանքով եւ դրանով ազդում է կոկաինի կախվածության մեջ գտնվող նեյրոնային ֆունկցիայի երկարատեւ փոփոխությունների վրա:
Կոկաինը մեծացնում է սինապտիկ դոպամինի մակարդակը striatum- ում եւ փոխում է գեների արտահայտումը դոպամինոպրեսիվ նեյրոնների մեջ, ակտիվացնելով միջուկային ուղիները, որոնք տարածում են դոպամին D1 ընդունիչից մինչեւ միջուկը1): Կոկինի քրոնիկ ազդեցությունը կարգավորվում է մի շարք transcriptional factors- ի հետեւանքով, որի արդյունքում երկարատեւ փոփոխություններ են տեղի ունենում գենային արտահայտության մեջ, որոնք ենթադրվում են հիմնվելով նոկաուտային ներդաշնակություն կոկաինի կախվածության մեջ (2): ΔFosB- ը, որը հայտնաբերվել է որպես այդպիսի արտագրման գործոն (3), ցուցադրվել է բարձրացնել կենդանիների վարքագծային արձագանքը կոկային (4, 5): Հետեւաբար, ΔFosB ներդիրով կարգավորվող թիրախ գեների հայտնաբերումը նպաստում է կոկաինի կախվածության մոլեկուլային մեխանիզմի ավելի լայն ընկալմանը: Վերջերս կոկաինի հետ կենդանիների քրոնիկ վերաբերմունքը ցույց է տվել, որ կարգավորվում է ցիկլինին կցվող kinase 5 (Cdk5) եւ դրա ակտիվացնող p35 արտահայտությունը striatum- ի միջոցով ΔFosB (6, 7).
Cdk5- ը հանդիսանում է սինթիդ / տրեոնին kinase- ի Cdk ընտանիքի անդամ: Ի տարբերություն այլ Cdks- ների, որոնք բջջային ցիկլի առաջընթացի խոշոր կարգավորողներն են, Cdk5- ը հիմնականում ներգրավված է postmitotic neurons- ի ենթածրագրերի ֆոսֆորման մեջ (8): Cdk5- ի գործունեության նեյրոնային առանձնահատկությունը ձեռք է բերվում իր ակտիվացնողների հետ, կամ p35 կամ p39, որոնք հիմնականում արտահայտված են postmitotic neurons (8): Ի հավելումն Cdk5- ի էական դերը ուղեղի զարգացման մեջ (9, 10), it- ը նույնպես ենթարկվել է հետնամասի ուղեղում դոպինամիկ հաղորդման մեջ (11, 12): Cdk5- ի գործունեության արգելումը ստիատում ավելացված dopamine- ի թողարկման արդյունք է, որը ցույց է տալիս Cdk5- ի presynaptic ֆունկցիան որպես դոպամինի թողարկման բացասական կարգավորիչ (11): Բացի այդ, Cdk5- ը մոդուլացնում է postsinaptic dopamine- ի ազդանշանների արդյունավետությունը `Dopamine- եւ cAMP- կարգավորվող ֆոսֆոպրոտինի, Thr-32- ի մոլեկուլային զանգվածի 32 kDa- ի (DARPP-75) ֆոսֆորիլացմամբ, որը DARPP-32- ը նորոգում է cAMP- կախված kinase- ի (PKA) (12).
Այս դիտարկումները ենթադրում են, որ Cdk5- ը եւ p35- ը կոկաինի եւ այսպիսով կոկաինի կախվածության հետեւանքով դոպամինային ազդանշանների երկարատեւ ակտիվացման ստորգետնյա կարգավորիչներն են: Հետագայում Cdk5- ի դերը ստերիալալ դոպամինային ազդանշման դերի վրա մենք ստեղծեցինք երկու տրանսգենկային մկնիկի գծեր, որոնցում կամ Cdk5- ը կամ p35- ը գերակշռում էին հատուկ նեյտրոններում, p35- ի հսկիչի վերահսկողության ներքո: Մեր հետազոտության արդյունքները ցույց են տվել, որ Cdk5- ի գործունեությունը կարգավորվել է p35 սպիտակուցի բարձր մակարդակով, բայց ոչ Cdk5 սպիտակուցը `առաջարկելով, որ p35 սպիտակուցի մակարդակը Cdk5- ի գործունեության սահմանափակումն է: Մենք տրամադրում ենք այստեղ ի Վիվո ապացուցում է, որ Cdk5- ի ակտիվացումը, որը p35 գերբնակեցման արդյունքում հանգեցնում է կոկաինի միջնորդավորված դոպամինային ազդանշանների կորիզին, PKA- ի եւ արտազատվող ազդանշանային կարգավորված kinase- ի (ERK) կասկադների արգելման միջոցով:
Նյութեր եւ մեթոդներ
Հակամարմիններ: Santa Cruz Biotechnology- ից ձեռք են բերվել Cdk5 (C-8) եւ p35 (C-19) պոլիկլոնալ հակամարմինները: ERK kinase (MEK) 1 / 2- ի, ERK1 / 2- ի եւ cAMP- արձագանքի տարրերի պարտադիր սպիտակուցը (CREB) ֆոսֆորիիլային-կախված եւ անջատված հակամարմինները ստացվել են Cell Signaling Technology- ից (Beverly, MA): Ֆոսֆո-Thr-34 DARPP 32- ի հակամարմինները (13), ֆոսֆո-Thr-75 DARPP-32 (12), ընդհանուր DARPP-32 (12) եւ c-fos (14) օգտագործվել են որպես նկարագրված: Սիգմայից ձեռք է բերվել ակտին մի հակամարմին:
Փորձարարական կենդանիներ: Մենք շտկեցինք մկնիկը p35 գենը Cdk5r1, որը պարունակում է p35 սպիտակուցը եւ բնութագրում է իր գենոմիկ կառուցվածքը (15): Գեներացնող transgenic մկնիկը, որն ունի p35 (Tgp35) նեյրոնային overexpression- ը, 6-kb- ը ԷկոRI-ԷկոRI- ի հատվածը, որը պարունակում է 1.2-kb խթանող տարածաշրջանը, subcloned into a pGEM9Z (-) պլազմիդ, եւ SV45- ից ստացված 40-bp տեքստը տեղադրվել է KpnI կայքից ներքեւի պոլիի (A+) ազդանշան (Նկ. 1A): Թեման պարունակում էր SpeԵս վայրի կենդանիների գենոտիպավորման համար: The 6-kb հատվածը հեռացվել է պլազմիդից եւ մաքրվել, այնուհետեւ transgene- ի միջուկային ներարկումը `տրանսգենի մկների առաջացման համար: 1.2-kb p35 խթանողին կարգավորիչ հսկողության ներքո տրանսգենի արտահայտության պրոֆիլը ուսումնասիրելու համար ի Վիվո, երկակի transgenic մկնիկը (Tgp35; p35 - / -), հետագա գեներացվել է, օգտագործելով երկու քայլ սերմնաբուծության ռազմավարություն, որով Tgp35 մկնիկը վերականգնվել է էնդոգեն p35-առանձին ֆոնին: Այս հետազոտության մեջ օգտագործված մյուս մկնիկները ներառում էին p35 +/-, p35- / -, Cdk5 +/- եւ Cdk5- ի (TgCdk5) նեյրոնային գերբնակեցման հետ transgenic մկնիկը9, 16, 17): Այս մկների գենոտիպերը որոշվում էին պոչի կենսպսաններից մեկուսացած գենոմային ԴՆԹ-ի կամ Southern Blot վերլուծության կամ PCR- ի կատարմամբ: Մկնիկները տեղադրվեցին 12-h լույսի ներքո / 12-h մութ ցիկլով: Բոլոր խնամքը տրվել է Առողջապահության ազգային ինստիտուտներին համապատասխան լաբորատոր եւ փորձարարական կենդանիների խնամքի եւ օգտագործման ուղեցույցների համաձայն:
Southern Blot վերլուծություն: Պոչի բիոպսիաների արդյունահանված գենոմիկային ԴՆԹ-ն մարսվել է ԷկոRI եւ SpeI, electrophoresed է 0.9% agarose գել, եւ փոխանցվել է նեյլոնե թաղանթ. Մեմբրանը հիբրիդացված էր պատահականորեն հարստացված 32P- պիտակավորված զոնդը 42 ° C գիշերում: 485-BP- ի p35 նոկաուտի (p35 / /) եւ Tgp35 մկների գենոտիպավորման համար գեներացվել է PCR- ի կողմից `օգտագործելով հետեւյալ պրեմիերաները` 5'-ACATCCTGCTGCCACGGTGAC-3 'եւ 5'-CCACTGTAAAAGCAACAAGA-3': Հիբրիդացված մեմբրանը երկու անգամ 2 × SSC / 0.1% SDS- ով 42 սմ է 10 րոպեում եւ երկու անգամ 0.1 × SSC / 0.1% SDS- ով 65 ° C- ում 20 րոպեով լվացվեց եւ ռենտգենային ֆիլմի ենթարկվեց:
Թմրամիջոցների բուժում: Կոկաինը (Սիգմա) լուծարվել է ստերիլ աղի միջոցով: Կենդանիները հայտնաբերվելուց հետո տարբեր ժամանակային կետերում (15, 3, 15, եւ 30 րոպե) կոտրատվելով կոկայի հետ (60 մգ / կգ) կամ հավասար քանակությամբ աղցանի մեջ 120 ամսվա ընթացքում սպանվել է: Անբավարարները արագ հեռացան եւ սառեցրեցին սառնարանային PBS- ով: Այնուհետեւ շերտերը բաժանվեցին եւ ենթարկվեցին հյուսիսային կամ արեւմտյան բլոտի վերլուծությանը: Իմունխիստոկիմիական անալիզի համար ստիատալային հատվածները ստացվում են 2- ի մկների ներարկումից հետո:
Հյուսիսային բլոտի վերլուծություն: Total RNA- ը ստացվել է TRIzol ռեագենտով (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) եւ ենթարկվել է Հյուսիսային բլոտի վերլուծությանը, ինչպես նկարագրված է (18): C-fos mRNA- ի հայտնաբերման համար օգտագործվել է որպես C-fos cDNA- ի 189-bp- ի բեկոր, որպես նկարագրված (19): C-fos mRNA- ի մակարդակները քանակական են `որոշակի գծի օպտիկական խտության չափման միջոցով` Image 1.62- ի հետ պատկերների վերլուծության համակարգի միջոցով:
Western Blot վերլուծություն: Striatal հյուսվածքները sonicated են 1% SDS եւ խաշած համար 10 րոպե: Յուրաքանչյուր նմուշի սպիտակուցի կոնցենտրացիան որոշվել է BCA սպիտակուցի անալիզով (Pierce): Սպիտակուցի հավասար քանակները բաժանվել են SDS / PAGE- ից, նախքան նիտրոելլուլոզային մեմբրան տեղափոխելը: Մեմբրանները արգելափակվել են 1 × PBS- ով, որը պարունակում է 5% քաշի կաթ եւ 0.05% Tween 20 եւ ինկուբացված առաջնային հակատիտով գիշերում `4 ° C- ում: Ինկուբացիան `պերոքսիդազով համակցված հակա-մկնիկի կամ նապաստակ IgG (Sigma) ինկուբացիան կատարվել է սենյակային ջերմաստիճանում` 60 րոպե: Մի ուժեղ քիմիումումենսենսի (Pierce) կողմից հայտնաբերվեց ազդանշան, եւ խտությունների օպտիկական խտությունը թվագրված էր վերը նկարագրված:
Cdk5 Kinase քննություն: Striatal lizates- ը պատրաստվել է 50 մմ Tris HCl, pH 7.4 / 50 mM NaCl / 5 մմ EDTA / 1% Triton X-100 / 1mMDTT / 1 մմ phenylmethylsulfonyl fluoride / 1 μg / ml aprotinin / 1 μg / ml leupeptin / phosphatase inhibitors (ֆոսֆատազի խառնուրդ I եւ II, Sigma): The lizates էին իմունոպրեսիպային կամ հակա-Cdk5 (C-8) կամ հակահայկական p35 (C-19) հակամարմինները: The Cdk5 իմունոպրեսիպիտիտները պատրաստվել են 300 μL lizate (համապատասխան 300 μg սպիտակուցի) հակա-Cdk5 հակամարմինների (3 μg) ինկուբակցիայի միջոցով 4 ° C գիշերում, այնուհետեւ 25 μL Protein A-agarose beads (50 սուլարի լիզինգի բուֆերներում, Santa Cruz Biotechnology) 3 ժամը, 4 ° C- ում: P35- ի իմունոպրեսիպիտիտների պատրաստման համար, 500 μL է լիզատը (համապատասխան 1 մգ սպիտակուցը) ներարկվել է վերը նկարագրված հակա-p35 հակամարմիններով (3 μg): Իմունոպրեսիպիտատները երկու անգամ լվացման բուֆերով եւ երկու անգամ քնազի բուֆերով լվացվեց 50 մմ Tris HCl, pH 7.4 / 5 մմ MgCl2/ 1 մմ EDTA / 1 մմ EGTA / 1 մմ DTT, որը վերանվանել է 60 μl kinase բուֆերի մեջ: Kinase- ի գործունեությունը չափվել է որպես հիստոնի H1 որպես substrate (18).
Իմունխիստոկիմիա: Մկրատները անեսթեզի մեջ են հայտնաբերվել անթվինի (250 մգ / կգ, Fluka) ներարկումներով եւ transcardially է 0.1 M նատրիումի ֆոսֆատ բուֆերի, pH 7.4- ի հետ, որին հետեւում են Streck Tissue Fixative- ը (Streck Laboratories- ը, La Vista, NE): Դիսցենենտ ուղեղները հետագայում ամրագրվեցին 37 ° C- ի մեկ գիշերում: Այնուհետեւ, ուղեղները ներկված էին պարաֆինում, կտրում էին 5- μմ-հաստ փորիկային հատվածներ եւ ենթարկվում էին իմունոհանդոկիմիա, օգտագործելով avidin-biotin-peroxidase համալիր տեխնիկան (վեկտորային լաբորատորիաները) որպես diaminobenzidine որպես substrate: Բաժինները ներկրել են հարբածությամբ մաքրված պոլիկլոնային հակամարմին `c-fos գիշերում` 4 ° C- ում: Ստենինի առանձնահատկությունը գնահատվել է առաջնային հակաբորբի բացակայությամբ:
Արդյունքներ
P35- ի նեյրոնային գերբնակեցման հետ տրանսգենային մկների առաջացում: The transgene օգտագործվում է հասնել աճել է neuronal արտահայտությունը p35 կազմված է 6-kb հատվածը cloned մկնիկի p35 գենի պարունակող 1.2-kb խթանողին եւ ամբողջ կոդավորման հաջորդականությունը p35 (Նկ. 1 A): Մկների գենոտիպերը որոշվել են Southern blot վերլուծության միջոցով, օգտագործելով զոնդ, որը նախատեսված է տարբերակել p35- / - եւ Tgp35 մկների վայրի տիպի մկների (Նկ. 1 A և B). 1.2-kb p35 խթանողին վերահսկողության տակ գտնվող տրանսգենային արտահայտությունը ուսումնասիրելու համար մենք ստեղծել ենք կրկնակի տրանսգենկային մկաններ (Tgp35, p35 - / -), որի մեջ p35 արտահայտությունը առաջացել է միայն տրանսգենից: The p35 արտահայտությունը Tgp35- ում, p35- / - մկները դիտվել են միայն ուղեղում (Նկ. 1C), որտեղ տարածական արտահայտման ձեւը նման էր վայրի բնության մկների (Նկ. 1D): P35- ի պակասը ցույց է տրվել, որ հանգեցնում է անոթային շերտերի կառուցվածքը, ուղեղի կորտեքսում եւ մկների հիպոկամպում10): Այնուամենայնիվ, Tgp35; p35 - / - մկները ցույց տվեցին p35 - / - ուղեղի ֆենոտիպի ամբողջական փրկարարություն (Նկ. 1E): Այս տվյալները ցույց են տվել, որ 1.2-kb p35 խթանողը վերահսկում է տրանսգենի արտահայտությունը նմանատիպ արտահայտության պրոֆիլով p35- ի էնդոգեն p35 գենի միջոցով:
The p35 սպիտակուցի մակարդակը Cdk5- ի ակտիվության բարձրացման համար սահմանափակում է: Մենք ուսումնասիրեցինք p35- ի եւ Cdk5- ի գինների գենային դոզանների ազդեցությունները 35 ամսվա տարիքում p35- / -, p35 +/-, վայրի տիպի, Tgp5, Cdk5 +/- եւ TgCdk3 մկների ստրիատիկական քաղվածքների սպիտակուցային արտահայտության վրա: P35- ի եւ Cdk5 սպիտակուցի մակարդակները համապատասխանաբար համապատասխանաբար գենային դոզանների հետ փոխկապակցված են (Նկ. 2 A և B): Tgp35 մկները ցույց են տվել, որ p1.6 սպիտակուցի մակարդակը ≈ 35 անգամ ավելացում է վայրի տիպի մկների համեմատ, մինչդեռ Cdk5 սպիտակուցի մակարդակը անփոփոխ է p35 սպիտակուցի տարբեր մակարդակներով: TgCdk5 մկները ցույց են տվել, որ Cdk1.9 սպիտակուցի մակարդակն աճում է վայրի տիպի մկների համեմատ, մինչդեռ p5 սպիտակուցի մակարդակը չի ազդել Cdk35 սպիտակուցի տարբեր մակարդակներով: Քննարկելու տարբեր քանակությամբ p5 սպիտակուցի ազդեցությունները Cdk35 գործունեության վրա, Cdk5- ը iminoprecipitated է striatal հատվածների հետ հակա-Cdk5 հակամարմին եւ kinase գործունեության չափված. Նմանապես, Cdk5 սպիտակուցի տարբեր քանակությունների ազդեցությունը քնազազային ակտիվության վրա ուսումնասիրելու համար p5- ը հակամանրէային p35 հակամարմիններով ստիատալային քաղվածքներից իմունոպրեսվել է եւ չափվել է kinase ակտիվություն: Cdk35- ի ակտիվությունը շաղախված է p5 սպիտակուցի մակարդակի հետ, բայց ոչ Cdk35 սպիտակուցի մակարդակից (Նկ. 2 C և D): Այս արդյունքները ցույց են տվել, որ p35 սպիտակուցի գումարը Cdk5- ի գործունեության համար սահմանափակումային գործոն է: Հետեւաբար, մենք օգտագործեցինք Tgp35 մկնիկները, որպեսզի ուսումնասիրենք ստրիատալ դոպամինային ազդանշանների վրա ավելացված Cdk5 ակտիվության հետեւանքները:
Thr-32- ի DARPP-34- ի կոկաինը ենթարկեցված ֆոսֆլորիլացիան հավասարվել է Tgp35 մկների մեջ: DARPP-32- ի ֆունկցիան կախված է բազմաթիվ ֆոտոֆլիլների վիճակից20): PKA ֆոսֆորիլները DARPP-32- ը Thr-34- ում, մինչդեռ Cdk5 ֆոսֆորիլները DARPP-32- ը Thr-75- ում: Այսպիսով, մենք ուսումնասիրեցինք DARPP-32- ի ֆոսֆորացված վիճակի ստերիլալ քաղվածքների մեջ վայրի տեսակը եւ Tgp35 մկների կողմից: Ֆոսֆո-Thr-75 DARPP-32 մակարդակը բարձր էր Tgp35 մկների (Նկ. 3AԲ) 1.6 ± 0.2 անգամ ավելի բարձր վայրի տիպի մկների արժեքը): Հետագայում գնահատեցինք Cdk5- ի ավելացված ակտիվության հետեւանքները ստիատալալ դոպամինային ազդանշանների վրա: Մենք ուսումնասիրեցինք կոկաինի ներածված PKA- ի ակտիվացումը Tgp35 մկների մեջ `վերլուծելով DARPP-32- ի Thr-34- ի ֆոսֆորման վիճակի վերլուծությունը: Ֆոսֆո-Thr-34 DARPP-32- ի մակարդակը կոկայի ներարկումից հետո ավելացել է վայրի տիպի մկների մեջ 15 րոպե (Նկ. 3BԲ) 1.8 ± 0.2 անգամ բացի բազալից մակարդակից): Այնուամենայնիվ, DKPP-34- ի Thr-32 ֆոսֆորալացման վրա կոկաինի ազդեցությունը նվազեցվել է Tgp35 մկների մեջ (1.2 ± 0.3 անգամ բացի բազալից մակարդակից): Այս արդյունքները ցույց են տվել, որ Cdk5- ի ակտիվության աճը խթանեց կոկաինը-իջեցված PKA ակտիվացումը, հավանաբար Thr-32- ի DARPP-75 ֆոսֆորալով6, 12): Հնարավոր է նաեւ, որ կանխարգելիչ Cdk5- ի ակտիվացումը հանգեցնում է դոպամինի նվազեցմանը, ինչը նպաստում է կոկաինի նվազեցմանը: Հատկանշական է, որ կոկաինի մեկ ներարկումը չի ազդել p35 եւ Cdk5 սպիտակուցների մակարդակներին, ինչպես նաեւ kinase- ի ակտիվությանը (Նկ. 3 C և D): Սա հակադրվում է նախորդ ուսումնասիրությանը, որի ժամանակ կոկաինը քրոնիկական ազդեցություն է ցուցաբերել p35- ի եւ Cdk5- ի (6).
Cdk5- ի ակտիվացումն ընդլայնում է կոկային-իջեցված ERK1 / 2 ակտիվացումը: Վերջին փաստերը ցույց են տալիս, որ ստիատում դոպամինային ընդունիչի ակտիվացումը եւս ակտիվացնում է այլ ազդանշանային կասկադներ, այդ թվում `ERK ուղին (21, 22), որը կարեւոր դեր ունի կոկաինի վարքագծային արձագանքում (23): Հետեւաբար մենք ուսումնասիրեցինք, թե արդյոք Cdk5- ի գործունեությունը կարող է ազդել ERK ուղիների կոկաինով պայմանավորված ակտիվացման վրա: ERK ուղիների ակտիվացումը դիտվել է կոկային ներարկումից հետո, վայրի բնության մկների կողմից ստիատալային էքստրակտներում, ինչպես ակնհայտ է MEK1 / 2- ի ֆերոֆորիալացմանը, Ser-217- ում եւ Ser-221- ով (1.5 ± 0.2 անգամ, բազալից բարձր) եւ ERK1- ի / 2- ը Thr-202- ում եւ Tyr-204- ով (ERK2 ֆոսֆորալիա `1.5 ± 0.2 անգամ բացի բազալից մակարդակից) (Նկ. 4 A և B): Այնուամենայնիվ, Tgp1 մկների մեջ նվազեցվել է MEK2 / 1.2 (0.2 ± 1- ի բազալային մակարդակից բարձր) եւ ERK2 / 2 (ERK1.2 ֆոսֆորալացում `0.2 ± 35 անգամ ավելի բարձր) կոկաինը-իոնային ակտիվացումՆկ. 4 A և B): Բացի այդ, ֆոսֆո-ERK1 / 2- ի բազալային մակարդակը ցածր է Tgp35 մկների մեջ (0.8 ± 0.2 անգամ `վայրի տիպի մկների արժեքից ցածր), մինչդեռ այս միտումը վիճակագրորեն նշանակալի չէր: Այս վերջին արդյունքը կարող է վերագրվել MX5- ի Cdk1- ի կախված ֆոսֆորալից Thr-286- ում, ինչը հանգեցնում է կատալիտիկ ակտիվության նվազմանը (24): Այս հնարավորությունը գնահատելու համար մենք ուսումնասիրեցինք MX1- ի ֆոսֆորիալային վիճակը Thr-286- ում եւ պարզեցինք, որ Tgp286 մկների կողմից ստիատալային հատվածներում առկա են ֆոսֆո-Thr-1 MEK35- ի ավելի բարձր մակարդակներըՆկ. 4CԲ) 1.3 ± 0.1 անգամ ավելի բարձր վայրի տիպի մկների արժեքը): Բացի այդ, MEK1- ի Thr-286- ի ֆոսֆորման վիճակը չի փոխվել կոկաինի մեկ ներարկման միջոցով, այնինչ, որ Cdk5- ի գործունեությունը չի ազդել բուժման (Նկ. 3D).
Դոպամինային ազդանշանի տարածումը միջուկին հասցվում է աճող Cdk5 ակտիվությամբ: PKA- ի եւ ERK- ի ներգրավված բազմակի ազդանշանային կասկադների կոկաինի ակտիվացումն առաջացնում է սերբի մեջ CREB- ի արտագրման գործոնի հետագա ակտիվացմանը `Ser-133- ի ֆոսֆլորացման միջոցով22, 25): Հետազոտելու համար, թե արդյոք PKD- ի եւ ERK- ի ակտիվացման կասկադների վրա Cdk5- ի միջամտության հետեւանքները կարող են միանալ միջուկում CREB- ի ֆոսֆորալացմանը, մենք ուսումնասիրեցինք սերբ-սերնդի ֆրոնֆլայանսային վիճակի մասին, Ser-133- ում, ստիատալային քաղվածքներում վայրի տիպի եւ Tgp35 մկների կողմից: Ֆոսֆո-CREB- ի բազալային մակարդակը ցածր է Tgp35 մկների մեջ (վայրի տիպի մկների արժեքից 0.7 ± 0.1-անգամ) (Նկ. 5): Կոկեինի ներարկմանը ի պատասխան ֆոսֆո-CREB մակարդակը աճեցրեց վայրի տիպի մկների շերտում (1.5 ± 0.1 անգամ `բազալից ավելի բարձր), սակայն այս պատասխանը կոգեկին թուլացրեց Tgp35 մկների մեջ (1.2 ± 0.1- բացի բազալից մակարդակից) (Նկ. 5).
SER-133- ի CREB- ի ֆոսֆորումը ավելացնում է իր transcriptional activity- ը որոշակի գեների խթանող տարածաշրջանում cAMP արձագանքման տարրով, ներառյալ c-fos գենը (26): Հետեւաբար, մենք հետազոտեցինք c-fos- ի ինդուկցիան վայրի տիպի եւ Tgp35 մկների striatum- ում կոկաինի ներարկումից հետո: Wild-type մկների մեջ c-fos mRNA- ի մակարդակը բարձրացել է մինչեւ գագաթնակետային արժեք (1.8 ± 0.2 անգամ, բազային մակարդակից ավելի բարձր) 30 րոպե կոկաինը ներարկվելուց հետո եւ հետագայում վերածվել է բազային մակարդակի `ներարկումից հետո 120 րոպե (Նկ. 6 A և B): Այնուամենայնիվ, c-fos mRNA- ի մակարդակը Tgp30 մկների մեջ ≈ 35% ցածր էր, քան վայրի տիպի մկների քանակը, մինչեւ ներարկումից հետո 30 րոպե (Նկ. 6 A և B): Tgp35 մկների մեջ c-fos- ի ավելի փոքր ներարկումը հետագայում հաստատվել է իմունոգոստոկիմիայի (Նկ. 6 C-F): Կոկինյան վարչակազմը բարձրացրել է իմունային անոթային ակտիվությունը, ուժեղորեն striatum- ի dorsomedial-dorsocentral մասերում եւ թույլ կողմերում, ինչպես վայրի տիպի, այնպես էլ Tgp35 մկների մեջ: Սակայն, c-fos-immunopositive բջիջների քանակի կոկաինը իդեալական աճը զգալիորեն զսպեց Tgp35 մկների ստերիմատումՆկ. 6G): Միասին, այդ արդյունքները ցույց տվեցին, որ Tgp35 մկների մեջ արգելված է ստիատալային դոպամինային ազդանշանների կոկաինը միջնորդավորված ուժեղացումը կանխարգելել է Cdk5- ի աճի հավանական արդյունքը:
Քննարկում
Cdk5- ը եւ նրա ակտիվացնող p35- ը հայտնաբերվել են որպես թիրախ գեներ, որոնք կարգավորվում են կոկաինի քրոնիկ ազդեցության պատճառով: (6). Մենք զեկուցում ենք այստեղ ապացուցելու, որ Cdk5- ի աճը բարձրացնում է p35- ի կանոնակարգումը, այլ ոչ թե Cdk5- ի կարգավորումը, ինչը հանգեցնում է կոտրատված նեյրոնների կոկաինի միջնորդավորված դոպամինային ազդանշանների նսեմացմանը: Քննարկելու Cdk5- ի կամ p35- ի վերակարգավորվող արտահայտության հետեւանքները ստիատալալ դոպամինային ազդանշանների վրա, վերլուծվել են երկու տրանսգենային մկնիկի տողեր, TgCdk5 եւ Tgp35 մկները: Մենք հայտնաբերեցինք, որ Cdk5- ի գործունեությունը կարգավորվել է p35 սպիտակուցի բարձր մակարդակի համամասնությամբ, սակայն չի ազդել Cdk5 սպիտակուցի բարձր մակարդակի վրա: Մեր նախորդ զեկույցը նաեւ ցույց է տվել, որ Cdk5- ի գործունեությունը TgCdk5 մկնիկի ուղեղում ցածր է, քան վայրի տեսակի մկնիկի ուղեղը, երբ գործունեությունը չափվել է Cdk5- ի իմունոպրպրեսիտիտների միջոցով (17, ինչը ենթադրում է, որ Cdk5 գերբնակեցումը գերազանցում է մոնոմերային Cdk5 մակարդակը, եթե p35 մակարդակը չի ավելանում: Այս արդյունքները ցույց տվեցին, որ p35 սպիտակուցի մակարդակը Cdk5- ի գործունեության համար սահմանաչափի սահմանափակում է:
Tgp35 մկները ցուցադրեցին կոկաինի սուր ներարկման արդյունքում STB ֆոսֆորիալների եւ c-fos- ի ցածր ինդուկցիա `ենթադրելով, որ կոկաինը ստիատալային արձագանքը արգելակվել է Cdk5- ի աճով: Tgp35 մկների մեջ կոկաինի միջնորդավորված դոպամինային ազդանշանների թուլացումը, ամենայն հավանականությամբ, ձեռք է բերվել Cdk5 միջնորդավորված արգելակման միջոցով, DARPP-32- ի, PKA- ի եւ ERK- ի բազմաթիվ ազդանշանային կասկադների միջոցով: Կոկինյան վարչակազմը DARPP-32- ի PKA- ի ֆոսֆորլը բարձրացրեց Thr-34- ում վայրի տիպի մկների մեջ, մինչդեռ այս արձագանքը թուլացվել է Tgp35 մկների մեջ: DARPP-32- ի PKA ֆոսֆորալացումը Thr-34- ում ցուցադրվել է կանխարգելելու սպիտակուցային ֆոսֆատազի 1- ի (PP1) ակտիվությունը, որը հանդիսանում է CREB- ի Ser-133- ի դեֆոսֆորիալացման պատասխանատուն27): Այսպիսով, PP1- ի գործունեությունը չի կարող հակադրվել Tgp32 մկների DARPP-1 / PP35 ուղիով:
ERK1 / 2- ի կոկաինը ենթարկեցրած ակտիվացումը նույնպես նվազեցվեց Tgp35 մկների մեջ: Կան մի քանի հստակ մեխանիզմներ, որոնց միջոցով Cdk5- ը կարող է արգելակել ERK1 / 2- ի կոկաինով պայմանավորված ակտիվացումը: Նախ, Thr-5- ի DARPP-32- ի Cdk75- կախված ֆոսֆորալը կարող է արգելակել PKA- ն, ինչը հանգեցնում է PKK- ի միջնորդավորված MEK1 / 2 ակտիվացման հետագա արգելմանը, որը պահանջվում է ERK1 / 2 ակտիվացման համար: Վերջերս ուսումնասիրության արդյունքում պարզվել է, որ DARPP-32- ի Thr-34- ի ֆոսֆլորիլացումը պահանջվում է ERK1 / 2- ի կոկաինի միջնորդավորված ակտիվացման համար, միկրոկլիտների միջոցով, որոնք ներառում են MEK ակտիվացման անուղղակի կարգավորումը, ինչպես նաեւ ներգրավված ստիատալով հարստացված ֆոսֆատազի, թիրոսինի ֆոսֆատազ, որն անմիջականորեն գործում է ERK1 / 2 (28): Այս հնարավորության օժանդակությունը ներկայացվում է այն հանգամանքով, որ MK1 / 2- ի կոկաինը ենթադրած ֆոսֆորալացումը Ser-217- ում եւ Ser-221- ում վերացվել է Tgp35 մկների մեջ: Մեկ այլ հավանական ուղի է MX5- ի Cdk1- կախված ֆոսֆորալով Thr-286- ում, ինչը հանգեցնում է նրա կատալիտիկ ակտիվության նվազմանը եւ հանգեցնում է ERK1 / 2 ակտիվության արգելմանը (24).
Cdk5- ի գործունեության արգելումը ստրիատում ցուցադրվել է կենդանիների քրոնիկ կոկային բուժման վարքային ազդեցությունները6): Հիփոթեքին, որ Cdk5- ի գործունեության վերագնահատումը կարող է նպաստել նեյրոնային ադապտացմանը, կրկնակի կոկաինի վարման հետեւանքներին հակազդելու համար (6), պարզեցինք, որ DARPP-5- ի եւ MEK32- ի Cdk1- ի միջնորդավորված ֆոսֆորումը նպաստել է ERK1 / 2- ի կոկաինով պայմանավորված ակտիվացմանը, ինչը հանգեցնում է CREB ֆոսֆորման եւ c-fos- ի ստերիատում ավելի քիչ ներադրմանը: Մեր հետազոտության արդյունքները նպաստում են Cdk5- ի ակտիվության բարձրացմանը, որի արդյունքում p35- ի վերափոխումը կարող է փոխել գենային արտահայտությունը ստիաթում քրոնիկ վտանգից հետո կոկաինը: Դա կարող է տեղի ունենալ, օրինակ, CREB- ի եւ c-fos- ի գործառույթների փոփոխությունների միջոցով: Այսպիսով, Cdk5- ի ակտիվացուցիչ p35- ը, Cdk5- ի ակտիվության վրա սահմանափակումային ազդեցությունների շնորհիվ կարող է նպաստել կոկաինի կախվածության մեջ գտնվող նեյրոնային ֆունկցիայի երկարատեւ փոփոխություններին:.
Acknowledgments
Մենք շնորհակալ ենք Drs- ին: Մարի Ջոն Դանտոնը, Ֆիլիպ Գրանթը եւ Սաշի Քեսավապանը ձեռագիր կարդալով: Այս աշխատանքը ֆինանսավորվել է Առողջապահության ազգային ինստիտուտների դրամաշնորհի Z01DE00664-05 (ABK), ԱՄՆ առողջապահական ծառայության Grant DA10044 եւ Սիմոնս Հիմնադրամի, Peter J. Sharp հիմնադրամի եւ Picower Foundation- ի (PG) կողմից:
Notes
Կրճատումներ. Cdk5, cyclin- կախված kinase 5; ERK, արտազատվող ազդանշանային կարգավորվող kinase; DARPP-32, դոպամին եւ cAMP- կարգավորվող ֆոսֆոպրոտոտին, մոլեկուլային զանգված 32 kDa; PKA, cAMP- կախված kinase; ՄԵԿ, ERK kinase; CREB, cAMP- արձագանքի տարրը պարտադիր սպիտակուցը:
Սայլակ
;