Am J Physiol Regul интегрі Comp Physiol. 2011 Сәуір; 300 (4): R876-R884.
2011 ақпанында жарияланған 9. doi: 10.1152 / ajpregu.00655.2010
PMCID: PMC3075076
дерексіз
Біз бұрын инсулиннің гипоталамустың аргиват ядросына енгізілгенін егеуқұйрықтарда өзін-өзі басқару міндеті арқылы бағаланған сахарозды ынталандыруды азайтқанын хабарлады. Сахарозаның өзін-өзі басқаруымен бірге орталық жүйке жүйесінің (CNS) белсенділігінің бағаланбағандықтан, осы зерттеуде c-Fos-тың экспрессиясын нейрондық активация индексі ретінде өлшедік. Біз егеуқұйрықтарды S-Fos иммунореактивтілігінің CNS-да анықталған коэффициентіне (FR) немесе прогрессивтік қатынастағы (PR) кестеге сәйкес сахарозаға арналған препаратты, сондай-ақ өңделген басқарудағы c-Fos өрнегімен салыстырғанда үйреттік. PR-ның басталуына байланысты, орта гипоталамуста (арвиат, паравенциклы, ретроциазматикалық, дорсомедицина және вентромедицина ядролары) c-Fos бірегей экспрессиясын байқадық, сондай-ақ бүйірлік гипоталамуста c-Fos және төсек ядросының FR-ның жұмысының басталуына байланысты стрии терминалының c-Fos экспрессиясы FR және PR егеуқұйрықтарының екеуінің де ядросы акументінде жоғарылады. Зерттеу барысында азық-түлік сыйақы тапсырмасының орындалуында гипоталамикалық энергияның гомеостаздық схемалары мен лимбиялық схемалардың маңыздылығына баса назар аударылады. Энергия теңгерімін реттеуге медиальдық гипоталамустың рөлін ескере отырып, біздің зерттеуіміз бұл схема энергетикалық гомеостаздың үлкен контекстінде реттелуді реттеуге ықпал етуі мүмкін.
мезолимбикалық допаминергиялық (DA) схемасы, оның ішінде вентальдік тикеальдық аймақ (VTA) және стретатикалық және кортикальды учаскелерге арналған болжамдар болжанатын немесе марапатталған есірткінің көптеген сыныптарында маңызды рөл атқарады13, 22-24, 26, 48). Біздің зертханамыздан және басқалардан алынған соңғы зерттеулер осы схема тағамның ынталандыратын немесе пайдалы аспектілерінде маңызды рөл атқаратындығын көрсетеді. Энергия гомеостазын реттейтін схемамен функционалдық және анатомиялық өзара әрекеттесу жануарлардың тағамдық күйі бойынша азық-түлік сыйақыларын модуляциялау туралы есептермен ұсынылады (10, 14, 16, 43). Науқастық немесе метаболикалық жағдайға байланысты тағамдық сыйақыны қоса алғанда, марапаттаудың модуляциясы нейрондық және эндокриндік сигналдардан, соның ішінде инсулиннен (15), лептин (11, 18, 21, 30, 32), грелин (35), меланин-концентрацияланған гормон (MCH) (45) және орексин (5, 7): орталық жүйке жүйесінде (CNS) рецепторлардың болуы, биохимиялық және жасушалық тиімділігі, сондай-ақ in vivo немесе мінез-құлқының тиімділігі соңғы жылдары айқын көрінді.
Сонымен қатар, ұзартылған лимбиялық схемалар азық-түлік және азық-түлік сыйлықтарында маңызды рөл атқарады2, 19, 28). Дегенмен, қосымша CNS сайттары бар. Айта кетейік, бүйір гипоталамус (LH) бұрыннан бері азықтандыру және өздігінен ынталандыру әрекеттері (4, 31). LH-дегі циркулярлы нейрондар мен лептиннің сигналдары азық-түлік және тағамдық сыйақылар үшін маңызды деп танылды (5, 29, 30). Жақында үшінші церебральды қарыншаға немесе гипоталамустың (ARC) аркават ядросына енгізілген инсулиннің сахарозаның өзін-өзі басқаруын азайтуы мүмкін екендігін байқадық, бірақ VTA-ға инсулин енгізу немесе ядро акументінің бұл ерекше сыйақы парадигмасына (15). Осылайша, көптеген гипоталамикалық учаскелер дәлелденген азық-түлікті іздестіруде және сатып алуда маңызды рөл атқара алады және осыған сәйкес, гипоталамикалық аймақтардың азық-түлікпен өзін-өзі басқарумен байланысты іс жүзінде активтендірілген деп болжауға болады. Осы гипотезаны тексеруді бастау үшін біз сахароза өзін-өзі басқару парадигмасында оқытылған егеуқұйрықтардың СНС-да c-Fos өрнегін тіркелген қатынастардан (FR) кейін немесе прогрессивті қатынастар (PR) жаттығуларынан кейін қаттырақ тапсырма жасадық ынталандыруды бағалау үшін (20).
МАТЕРИАЛДАР МЕН ТӘСІЛДЕР
Тақырыптар.
Симонсеннің (Гилрой, Калифорния) альбино егеуқұйрықтары (325-425 г) болды. Егеуқұйрықтар chow ad libitum-да ұсталды. Олар 12: 12-сағ жарық-қараңғы циклде жарық 6-да жанып тұрды және тамақтанудан кейінгі және сіңіргеннен кейінгі жағдайда таңғы 7-ден түске дейін оқытылды және сыналды. Егеуқұйрықтарда жүргізілген барлық процедуралар Ұлттық денсаулық сақтау институтының жануарларды күту жөніндегі нұсқауларына сәйкес келді және VA Puget Sound Денсаулық сақтау жүйесі жанындағы Ғылыми-зерттеу комитетінің Жануарларды күту және пайдалану кіші комитетімен мақұлданды.
Сахарозаның өзін-өзі басқару.
Процедуралар жарияланған әдістемеге негізделді (15) және егеуқұйрықтардан өткізілді. Эксперимент үш фазаны қамтыды: Ричардсон мен Робертстың PR алгоритмін қолдану арқылы тренингтерді, FR тренингтерін және прогрессивті қатынасын (PR) оқытуды бастау38). PR алгоритмі 1, 2, 4, 6, 9, 12, 16, 20, 28, 36, 48, 63, 83, 110, 145, 191, 251, 331, 437, 575 т.б.) сеанстың ішіндегі сыйақылардың сәтті өтуіне арналған тұтқалар38). Саңылаулар сұйықтық тамшыларға салынған 5% sucrose (0.5 мл сыйақы) өзін-өзі басқаруға үйретілді. Med Associates (Грузия, VT) жүйесімен басқарылатын оперативті жәшіктерде екі тетік болған, бірақ тек бір тұтқаны (белсенді, тартылатын тұтқыш) инфузиялық сорғыны белсендірді. Басқа тұтқаны (белсенді емес, стационарлық тұтқаны) басып шығарылған. Бұрын байқағанымыздай, белсенді емес тетігіндегі баспасөз саны өте төмен (10 пресс / сессиядан кем). Сахароза ерітіндіі ауызды тұтыну үшін сұйықтық тамшылардың рецепторына жеткізілді (Med Associates, St. Albans, VT). Алғашқы жаттығулар 1-с сессияларында тұрақты аралықты жоспарлау кезінде өткізілді (FR1: әрбір тұтқаны басу күшейтілді). Әрбір сеанс белсенді сөренің және жарықтың ақ үй жарықтандырылуының басталуымен басталды, ол барлық сессияда қалды. 5 дыбыс сигналы (2900 Гц, фондықтан 20 дБ) және жеңіл (белсенді тұтқыш үстінен 7.5 Вт ақ жарық) дискретті қосылыс белгісі әрбір сыйақының жеткізілуімен, сахароза жеткізілімінен басталатын 20-ның уақытымен бірге жүреді. FR оқыту 10 күн бойы өткізілді; тұрақты жауап беру бесінші сессиясы арқылы жүзеге асырылады. 3 күн үшін ең көп мүмкін 10 сағ / күн үшін PR оқыту жүргізілді. PR сеанстары 30 минуттан кейін аяқталды, белсенді емес тұтқаны басудан бас тартылды, сол кезде үйдегі жарық автоматты түрде сөнеді және белсенді тұтқаны алып тастады; егеуқұйрықтар камералардан шығарылып, үй тораптарына оралды. «Уақытты тоқтату» деп хабарлады Кесте 2 жүйе өшірілген уақытты білдіреді; сондықтан соңғы белсенді тұтқышты басу тоқтату уақытына дейін 30 мин кетеді. Жүріс туралы деректер (Кесте 2) орташа мәндерін білдіреді 6 сессиясы-10 FR үшін оқыту, және 1 сессиясы-9 PR оқытуына арналған. Бақыланатын егеуқұйрықтар тұрғын үй бөлмесінен алынып, егеуқұйрықтардың өзін-өзі басқаратын сахарозаның егеуқұйрықтарын өңдеу және бөлмедегі тәжірибелерін модельдеу үшін, 60 мин ішінде үйдің жарығы бар таза жұмыс камерасына орналастырылды. Оператордың жәшіктерінде болғанда оларға ештеңе ішуге немесе ішуге ештеңе берілмеді, және олар тетіктерге қол жеткізе алмады.
Соңғы күні егеуқұйрықтар жаттығу күндеріне сәйкес камераларға орналастырылды және 90 минут бойы камераларда ұсталды, содан кейін оларды алып тастады, анестезия, перфузия және кейінгі иммуногистохимия үшін. Сондай-ақ, бақылау егеуқұйрықтары процедуралық бөлмеге әкелініп, жаттығу күндері бойынша 90 минут ішінде таза оператикалық камерада ұсталды, содан кейін олар жансыздандырылды және перфузиядан өтті. Осы 90 минуттық сессиядан кейін бірден егеуқұйрықтар изофлуран ингаляциясымен терең анестезирленіп, 0.9% NaCl-мен перфузияланды, содан кейін салқын 4% параформальдегид ерітіндісімен. Анестезияға және эвтаназияға уақыт с-фос ақуызының экспрессиясының белгілі уақыт ағымына негізделген, бұл оқиғадан кейін 90–120 мин. Осылайша, c-Fos өрнегі жануарлардың тапсырманы сезінуінің және сахарозаны қабылдаудың нәтижесі емес, мінез-құлық міндеті басталған кезде ОЖЖ-нің белсендірілуін көрсетеді. Параформальдегидке бірнеше күн бойы ми алынып, постфикс жасалды; содан кейін олар кейіннен 20% сахароза-PBS-ке орналастырылды, содан кейін олар 30% сахароза-PBS ерітіндісіне орналастырылды. Иммуногистохимия үшін миды криостатқа (Leica CM 3050S криостат) бөлді.
c-Fos иммуногистохимиясы және сандық анықтау.
Ми бөлімдерінде иммунореактивті c-Fos протеинін сандық анықтауға арналған әдістемемізді қолдандық (12). C-Fos сөзі үшін мидың бастапқы сапалы экраны өткізілді. 12-μm тұтас мидың корональдық бөліктері слайдқа орнатылған PBS (Oxoid, Hampshire, Ұлыбритания) ішінде 3 рет жуылады. Содан кейін бөлімдер 1% қалыпты ешкі немесе эшек сарысуы бар PBS бөлме температурасында 5 сағ үшін блокталды. Содан кейін бөлімдер бірнеше рет PBS-де жуылады және PBS-де жасалған бастапқы антиденелердегі ерітінділерде түні бойы 4 ° C кезінде инкубацияланды. Бөлімдер PBS-те үш рет жуып, содан кейін бөлме температурасында қараңғыда инкубирленген, 1 сағ үшін PBS-де жасалған екінші антидене ерітіндісінде. Содан кейін бөлімшелер PBS-де қайтадан жуылып, Vectashield-дің қатты жинақтағыш қондырғысына (Векторлық зертханалар, Бурлингам, Калифорния) монтаждау ортасына қонды. Бөлімдердің сандық кескіндері Optiphot камерасына қосылған Nikon Eclipse E-800 флуоресценттік микроскопының көмегімен және Image Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) бағдарламалық жасақтамасын пайдалану арқылы сатып алынды.
Кейіннен, біз шарттардың арасындағы айырмашылықты, квантумалау және нейрондық фенотиптіліктерді көрсететін шектеулі аудандарға назар аудардық. Атап айтқанда, ядро accumbens ядросының және қабықтың (NAc) шоғырланған; стрии терминалының алдыңғы және артқы қабатының ядросы (aBNST, pBNST); medial hypothalamic regions [ventromedial nucleus (VMH), dorsomedial hypothalamus (DMH), paraventricular nucleus (PVN), retrochiasmatic area (RCh) және ARC]; бүйірлік гипоталамус (LH), оның ішінде доральді және вентальдық аймақтар мен периджикалық (PEF) аймақ; VTA; ми таяқшасы [жартылай зәйтүн, гипоглозальды (nXII) ядролардың ядросы, бүйірлік ретикулярлық ядро және C1 / A1 адреналині / noradrenalin ядралары]. Атласқа сәйкес келетін 12-μm секциялары Paxinos және Watson атластарына негізделген сәйкестендірілген бөлімдерде және аймақтарда өңделетін c-Fos өрнектері мен квантиялары үшін бағаланды (34). Қараңызшы Кесте 1 нақты стереотаксикалық координаттар үшін. Талдаудың негізгі фокусы әрбір мінез-құлық тапсырмасын тиісті бақылаумен салыстыру болды (PR және PRC, FR және FRC). Басқару жағдайларына байланысты мінез-құлыққа негізделген ықтимал айырмашылықтарды оңтайландыру үшін талдау үшін PR және FR топтарының ең жоғары орындаушылары таңдалды. Осылайша, егеуқұйрықтардың 4 / 12 PR және 3 / 12 FR егеуқұйрықтары талданды: Бұл егеуқұйрықтарда тиісті мінез-құлық тобы үшін ортадан жоғары стандартты ауытқудан жоғары болатын белсенді тұтқышты баспасөз саны (негізгі мінез-құлық нүктесі) болды. Сондай-ақ, бақылау егеуқұйрықтарының субокодтары (PRN және 5 FRC егеуқұйрықтары, FR немесе PR егеуқұйрықтарымен бірдей уақытта процедуралық бөлмеде). ЕР ілінісудің қосымша үдерісі PR рәсімінің қосымша ұзақтығына ұқсас (яғни, PR егеуқұйрықтары FR арқылы, содан кейін PR) ретінде PR-рі рәсімінің ұзартылуын (мысалы, жалпы 3 күн үшін) FR FR мен PR арасындағы айырмашылықтар мінез-құлық тапсырмасына немесе рәсімнің ұзақтығына байланысты болды. FRext миы талданады және жүйелі түрде тексерілмеді, бірақ нақты қызығушылықтың ерекше аймақтарын салыстырмалы сандық анықтауға мүмкіндік беру үшін басқа төрт топпен талданды.
Кванттау үшін (40 × ұлғайту кезінде) атласқа сәйкес аймақтар таңдалды. ImagePro Plus бағдарламалық жасақтамасы (Media Cybernetics) қажетті аймақтың суретін түсіру үшін қолданылды. Аудан есепке алу үшін бөлінді және оң клеткалық есептердің шегі белгіленді. Бірдей аймақ пен фондық (шекті) тиісті эксперименталдық топтардан алынған бөлімдер үшін пайдаланылды және оң эквиваленттің бағдарламалық жасақтамасын санау (сандық анықтау) фондық режимде сеанстық өзгерулердің алдын-алу үшін барлық эксперименталдық топтар үшін сол сессияда өткізілді. Статистикалық талдау үшін, жеке егеуқұйрықтан тек әрбір учаске бойынша тиісті немесе толық секциялар (егер Кесте 1) қол жетімді болды; осы аймақ үшін толық емес екіжақты өкілдігі болған жағдайда, белгілі бір аймаққа арналған деректер егеуқұйрықтан алынбады.
Сапалы қос таңбаланған иммунофлуоресцентті талдау.
С-Фос мөлшері анықталған егеуқұйрықтардан ми бөлімдері иммуногистохимияға қосарланған белгілер алынды. Біз жануарлардың мінез-құлқына кедергі жасағымыз келмегендіктен, оларды пептидті нейротрансмиттерлерді визуалдауды оңтайландыру үшін оларды колхицинмен алдын-ала өңдемеді. Сондықтан өзін-өзі басқару міндетімен бірге белсендірілген нейрондық фенотиптердің визуализациясы шектеулі болды. Алайда, бірқатар ОЖЖ-де белсенді нейрондардың фенотиптерін бағалауды бастау үшін сандық кескіндер (жоғарыда көрсетілгендей алынған) 20 ×, 40 × немесе 60 × (сурет аңыздарында көрсетілгендей) үлкейту кезінде алынды. . Глутамат декарбоксилаза (GAD), тирозин гидроксилазасы (TH), CRF, Y нейропептиді (NPY), Agouti-мен байланысты пептид (AgRP) және триптофан гидроксилазының екі бояу процедурасы c-Fos-иммунореактивтіліктің талдауларымен салыстырылды. меншікті, тек c-Fos-Ab қоспасы және басқа антиденелердің бірі 4 ° C температурасында түнде инкубациялау үшін қолданылған; сол сияқты, екіншілік антиденелер де бір ерітіндіде болды және бөлме температурасында қараңғы жерде 1 сағ инкубацияланды. Блоктау сатысына дейін 20 минуттық этанолды 50 минуттық жуу орексинді талдау үшін қолданылды. Бастапқы антиденелердің тиісті сұйылтуын анықтау үшін алғашқы оңтайландыру талдаулары жүргізілді. Алғашқы антиденелер қоянға қарсы c-Fos (1: 500) (sc-52) және тышқанға қарсы c-Fos (1: 800) болды (екеуі де Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); тышқан анти-ГАД (1: 1,000), тышқан тирозинге қарсы гидроксилаза (1: 500) және қой антитриптофан гидроксилаза (барлығы Химикон, Темекула, Калифорниядан); қоянға қарсы CRF (1: 500) (доктор Уайли Вейлдің сыйлығы, Салк Институты, Калифорния); қоянға қарсы NPY (1: 1,000), қоянға қарсы AGRP (1: 1,000) және ешкіге қарсы орексин А (1: 5,000) - барлығы Phoenix Pharmaceutical компаниясынан (Сент-Джозеф, MO). Екінші антиденелер Cy3-біріктірілген ешкі қоянға қарсы немесе тышқанға қарсы (Jackson Immunoresearch; West Grove, PA), Alexa Fluor 488 ешкіге қарсы тышқан немесе қоянға немесе есекке қарсы қой IgG (Molecular Probes, Eugene, OR) ; барлық екінші антиденелер 1: 500-де сұйылтылған. c-Fos / MCH қос иммунды бояуы сериялы түрде талданды; біріншіден, Alexa-1-ешкі қоянға қарсы (2,500: 488) екінші антиденесі бар MCH үшін (1: 500 бастапқы антидене, Миллипоре). Слайдтар 5% қалыпты ешкі сарысуымен қайта блокталды және анти-анти-антидене ретінде анти-с-Фосқа (1: 500) және cy3 ешкіге қарсы қоянға боялды. MCH талдауы үшін бұғаттау сатысына дейін 20 минуттық 50% этанолды жуу қолданылды.
Статистикалық талдау.
Топтық деректер мәтінде, кестелерде және сандарда ± SE деп көрсетілген. Айырмашылық ретінде анықталады P ≤ 0.05. Статистикалық салыстырулар эксперименттік топтар арасында (FR-ге қарсы PR) немесе эксперименттік топтар мен сәйкес басқару элементтері арасында (PR-ға қарсы PRC; FR-ге қарсы FRC) жұпталмаған студенттердің көмегімен жасалады. t-тест. Әр түрлі ми аймақтарындағы белсенді рычагтық престер мен с-Fos экспрессиясының арасындағы Pearson корреляция коэффициенттері, сондай-ақ бірдей эксперименттік жағдайларда әр түрлі ми аймақтары арасындағы c-Fos экспрессиясының корреляциясы StatPlus: mac LE статистикалық талдау бағдарламасы арқылы Mac OS нұсқасына есептелген 2009 ж. AnalystSoft. Біз сызықтық корреляцияны тексердік (Pearson's) R статистика) C-Fos өрнегі арасындағы түрлі CNS аймақтарында. Біз сондай-ақ әртүрлі белсендірілген CNS аймақтарында және мінез-құлықтағы c-Fos өрнегі арасындағы корреляцияны қарастырдық. Бұл корреляция үшін FR-дің және С-Фос сандық квантумациясы жүргізілген егеуқұйрықтардың ПР деректері пайдаланылды.
НӘТИЖЕЛЕРІ
c-Fos сандық анықтауы.
Бұрын байқағанымыздай, PR және FR көрсеткіштері бойынша белсенді тұтқышты басу саны айтарлықтай жоғары болды (Кесте 2), сондай-ақ сахароза сыйақыларының саны FR өнімділігі кезінде көп болды. PR егеуқұйрықтарының ұзақтығы 90 мин (тоқтау уақыты - 30) болды. Кесте 3 c-Fos иммунореактивтік ұяшықтарды сандық бағалау жүргізілген барлық ЦНС аймақтарында санайды. FR және PR егеуқұйрықтары үшін c-Fos өрнегінің үлгісі келтірілген Інжір. 1. Медиаль гипоталамустың айтарлықтай белсенділігі байқалды (MHTOT, сахароза үшін PR тұтқышын басатын егеуқұйрықтарды, бірақ сахарозға арналған FR тұтқасын басатын егеуқұйрықтардың жалпы белсенділігін, сәйкес бақылаулармен салыстырғанда, ARC, PVN, RCh, DMH және VMH композиттері. PR егеуқұйрықтарының медиальдық гипоталамусында бұл активация PVN, ARC және VMHІнжір. 2). FR тұтқаны басу, бірақ PR тұтқасын басу емес, LH ішіндегі айтарлықтай белсендіруге байланысты болды (көбінесе периеричальдық аймақтағы жандандыруға негізделген). Екі белсенді тұтқышты және гипоталамус c-Fos эквиваленті FRext және FR топтары арасында салыстырмалы (MHTOT, 946 ± 26 және 911 ± 118; ARC, 176 ± 18 және 186 ± 10; LHTOT, 468 ± 79 және 378 ± 34; LHpeF, 200 ± 31 және 173 ± 15), FR және PR топтары арасындағы өрнек үлгісінің айырмашылығы оқу / тәжірибе ұзақтығына емес, аспаптық тапсырманың сипатына қатысты. FR тобында BNST-да c-Fos өрнегінің айтарлықтай өсуі байқалды, ол bothBNST және pBNST ретінде байқалды. FR және PR тұтқасын басып шығару NAc қабығындағы c-Fos-immunopositive нейрондарымен байланысты болды; c-Fos санауыштары NAc ядросында FR тұтқышын басумен айналысатын егеуқұйрықтардан едәуір жоғарылайды, бұл ретте PR тұтқышын басумен айналысатын егеуқұйрықтардағы c-Fos өрнегін ұлғайту үрдісі айқын емес. c-Fos ПР тапсырмасымен VTA-да көбейтілген жоқ, дегенмен, FR тапсырмасында өсуге қатысты елеусіз үрдіс байқалды. Ақырында, c-Fos PR үшін үйренген егеуқұйрықтардың бас миының гипоглозалды (миокард нерві XII) ядросында айтарлықтай өсті, бірақ FR үшін емес.
c-Fos өрнегі басқа CNS аймақтарында байқалды, оның ішінде амигдала және ми қыртысы (Інжір. 3). Дегенмен, өрнек бақылау жағдайында, сондай-ақ PR және FR тапсырмалары бойынша байқалды, бұл процедураның нақты емес аспектілері (өңдеу, процедуралық бөлмеге өту) осы активтендіруге әкелуі мүмкін дегенді білдіреді. Бұл аймақтардағы квадратизация орындалмады. Сонымен қатар, nXII-ден басқа ми жасушаларының аймағында активтендіру байқалды, бірақ бақылау және тапсырмаға байланысты жағдайлармен бірге орын алды, сондай-ақ, нонфигурациялаудың немесе мінез-құлықты жандандырудағы рөлді ұсынды.
Біз әр түрлі CNS аймақтарындағы c-Fos экспрессиясы арасындағы корреляцияны тексердік. Иінтіректі басатын топтардың мәліметтерін біріктіре отырып, біз LH мен VMH ішіндегі c-Fos өрнегі арасындағы теріс корреляцияны таптық; осылайша VMH активациясы LH белсенділігінің төмендеуімен байланысты болды (Pearson's) R, -0.7986; t = -3.7534; P = 0.0056). Сондай-ақ, біз LH және VTA (Pearson's) перифорниялық аймағында c-Fos экспрессиясының арасындағы айтарлықтай оң корреляцияны байқадық. R, 0.7772; t = 3.493; P = 0.0082), осы екі аймақ арасындағы белгілі моносинаптическом байланыспен сәйкес келеді (Ref. 2 және 13). Біз VTA-да NAc-қабықшаға қарсы с-Fos өрнегі арасындағы айтарлықтай теріс корреляцияны таптық, FR өнімділігі үшін бөлек тексерілген бе (Pearson's) R, -0.9262; t = -4.9125; P = 0.008) немесе PR өнімділігі үшін (Pearson's) R, -0.9897; t = -9.7624; P = 0.0103), стриатальды аймақтардан негізгі NIGRA мен VTA арасындағы өзара кері кіруге2, 13). Біз сондай-ақ әр түрлі CNS аймақтарындағы c-Fos өрнегі мен мінез-құлық арасындағы корреляцияны тексердік. Тұтқаны басатын топтардың деректерін біріктіре отырып, біз ARC-дағы c-Fos пен белсенді рычагтық престер арасында айтарлықтай оң корреляцияны байқадық (Пирсон's) R, 0.8208; t = 3.8017; P = 0.0067).
Сахарозды қабылдау және активті сахарозаға ынталандыру арқылы белсендірілген нейронды анықтау.
Си-Фос-позитивті нейрондар ми бағанында TH үшін оң эпинефрин мен norepinephrine (және допамин) үшін жылдамдықты шектейтін ферменттер үшін оң иммунды көрсетпеді; Осылайша, катехоламинергиялық нейрондар FR немесе PR тапсырмалары арқылы белсендірілмеген. Дегенмен, кейбір c-Fos-позитивті нейрондар трифтофан гидроксилазасы үшін оң серпін көрсетіп, серотонин нейрондарының пациенттері белсендірілгенін көрсетті. Көрсетілгендей Інжір. 4, ARC-де c-Fos-оң клеткалық телімдер AGRP-талшықтары қоршалған және NPY талшығының / c-Fos иммундауының ұқсас үлгісі байқалды (көрсетілген емес). PVN-де, c-Fos-позитивті нейрондар CRF-позитивті нейрондарды қоршап тұрды, бірақ ешқандай колокализация байқалмады (деректер көрсетілмеді). Інжір. 5 LH-дегі орексин мен МСГ үшін иммундық ауруды көрсетеді. Orexin нейрондары dLH және peLH-те табылған. ПХЛ-дағы MCH-позитивті нейронды байқағанымызға қарамастан, LH-ның сол аймағында c-Fos-мен колокализация жоқ еді. Дегенмен, біз peLH ішіндегі орексин позитивті нейрондарда c-Fos колокализациясын байқадық (Інжір. 6, TOP), және өте шектеулі c-Fos колокализациясы vLH (MCH)Інжір. 6, түп). C-Fos-мен локализациялау және колокализация, CRH сияқты пептидтік нейротрансмиттерлер үшін бағаланбауы керек, себебі егеуқұйрықтар колхицинмен алдын ала емделмеген. Соңында, ядродағы акумент негізіндегі және қабығыныңІнжір. 7), FR және PR егеуқұйрықтары үшін, GAB-мен синтетикалық ферменттер, GABA нейротрансмиттері үшін байқалды. VTA ішінде TH үшін сенімді бояу болған; алайда c-Fos-позитивті нейрондар сирек байқалды және TH-мен ғана колокализа болған жоқ.
ТАЛҚЫЛАУ
Ағымдағы зерттеуде сахарозаның өзін-өзі басқару тұтқышын басу әрекеті басталуымен байланысты өткір CNS активтендіру әдісін бағалау үшін, тікелей салыстырмалы түрде анықталмаған міндет (FR) ретінде немесе ерте геннің, c-Fos сахароза тәрізді сыйақы іздестіруді көрсетуді және лимбиялық схеманы қатаң түрде қамтуды көрсететін мақсатты ойды біртіндеп арттырады22, 24, 49) (PR). Активтердің гипоталамикалық үлгілері екі тапсырма арасында айырмашылықтар болды, ал LR / limbic белсендіру FR тапсырмасында басым және PR-тапсырмада басым басым медитиалық гипоталамус / лимбикалық активтендіру (бұр. Інжір. 1). Бұл үшін бірнеше ықтимал себептер бар. Біріншіден, бұл парадигмалар CNS жүйесінде сапалы әртүрлі тәжірибелер ретінде «картаға» ие болуы мүмкін. FR рейтингісінде оқыған егеуқұйрықтар қарапайым, жоғары награциялық белсенділік күтеді. Тамаша тағамды күтіп алу FR егеуқұйрықтарында байқалған c-Fos үлгісіне қатты әсер етуі керек. Қосылу үлгісіндегі айқын сапалық айырмашылық, PR жануарларының тапсырма бойынша көп тәжірибеге ие екендігін, бұл ықтималдығы аз екенін көрсетеді және бұл 20 FR сессияларын алған егеуқұйрықтардың гипоталамусындағы c-Fos өлшеуі арқылы қолдады , PR тобына емес, FR тобына ұқсас қызметті көрсетті. Осы мүмкіндіктердің екеуі де FR-дің тренингтеріндегі қиындықтарды жүйелі түрде арттыру және CNS-ны белсендірудегі өзгерістерді бағалау арқылы тестілеуден өтуі мүмкін, бұл жағдайда активациялаудың сапалы өзгерісін болжауға болады. Дегенмен, жаттығу тәжірибесінің саны CNS белсендіру үлгісін есепке алмағанда, сессиядағы сакроза сыйақыларының орташа саны болуы мүмкін: PR тапсырмасы жай ғана «кем емес марапаттау» тәжірибесі ретінде үйрене алады және бұл функционалды түрде LH белсендірудің болмауы. Осылайша, сеанстың басында CNS белсендіру үлгісі шартты орын парадигмасы сияқты интероцептивалық жағдайды көрсете алады: лимбиялық схемадағы активтендірудің күші оқу мен мотивацияға байланысты. Біз ФРЖ жануарларының орта гипоталамусында c-Fos өрнегінің өзгермелілігін байқадық. Атап айтқанда, PVN ішіндегі бұл өзгермелілігі FR егеуқұйрықтарында белсенділікті маскирлеуі мүмкін, олар үшін c-Fos және FRC егеуқұйрықтарының көбею үрдісі байқалды (Кесте 3). Дегенмен, жалпы медитық гипоталамикалық белсендіру FR және FRC жануарлар арасында айырмашылықтар жоқ.
Айта кету керек, біздің мақсатымыз - мінез-құлықтың басталуына ықпал ететін CNS сайттарын анықтау болғанымен, уақытша шешім қарастыру болып табылады. Төменде талқыланғандай, енді аспаптық немесе операциялық әрекеттердің әр түрлі қосалқы компоненттері нейрондық әртүрлі популяциялардың13, 23, 33, 49). Белсенділікті жоюға тікелей әсер ететіндіктен, активтендіру әдістеріне біршама үлес қосуы мүмкін. Біздің нәтижелеріміз әртүрлі аспектілерде немесе өзін-өзі басқару тапсырмаларының құрамдас бөліктерінде нақты CNS сайттарының рөлін әрі қарай зерттеу үшін негіз болып табылады және осындай зерттеулер үшін әртүрлі «on» және «off» timecures36) өте пайдалы болады.
Әртүрлі ми аймақтарындағы c-Fos өрнегінде табылған корреляциялар, LH мен VMH арасында, сондай-ақ, LH және VTA-дегі дефинальды аймақ арасында арнайы сыйақы тапсырмасына арналған гипоталамус және бастапқы лимбиялық аймақтардың функционалды байланысын қолдайды. (бұр. 2 және 13). Біз сондай-ақ әр түрлі белсендірілген аймақтардағы c-Fos өрнегі мен мінез-құлық арасындағы корреляцияны қарастырдық. ARC-дегі c-Fos және белсенді тұтқышты басу арасындағы корреляция тағамдық тұтынудағы ARC белсенділігінің анықталған рөліне сәйкес келеді (1); бұрынғы бақылауларымызда, инсулин инъекциясын АРС-ға арнайы енгізу сахарозаның өзін-өзі басқаруын азайтты (15); КОА-ның маңызды ролі туралы және оның эндорфинергиялық нейрондары туралы кокаинді өзін-өзі басқару40-42); және ARC-дан NAc-ге дейін анықталған болжамдармен (17). Мәселен, АРК, мүмкін, азық-түлікті қоса алғанда, бірақ онымен шектелмей, көптеген ынталандырушы ынталандыру түрлерін іздестіру және алу үшін дәлелді мінез-құлықта шешуші рөл атқарады. Соңында, біз PR сукрозды іздестірудің басталуымен PVN және VMH-нің маңызды белсендірілуін байқадық. Бұл медицинадағы гипоталамикалық ядролардың тағамдық тұтынуды реттеуге, ARC-мен тікелей синаптическом байланысына және лимбиялық схемамен байланыстарды анықтаған рөлдеріне сәйкес келеді (1, 27, 37).
Біз FR немесе PR өнімділігі үшін тестіленді ме, NAc-қабығымен салыстырғанда VTA-да c-Fos өрнегі арасында маңызды теріс корреляцияны таптық. PR немесе FR сахарозасының өзін-өзі басқаруымен (сәйкесінше басқарулармен) байланысты VTA белсенділігін күшейту байқалмады. Мүмкін, бұл зерттеу біздің өлшеу уақытын көрсетіп, мүмкін болатын CNS тораптарына назар аударып, бұл жануарлар жақсы дайындалған. Бұл Шульцтің бақылауымен және тезистерімен44), бұл допаминді нейрональды активтендіру күтпеген ынталандырғыш немесе марапаттар маркері ретінде қызмет етеді, және бұл активтендіру оқытуға байланысты төмендейді. Дегенмен, дайындалған жануарлардың сахарозды қабылдау кезінде стриатальді допаминді босату өте дәл және уақытша дискретті оқиға ретінде (мысалы,39). Осылайша, біз байқаған үрдістер үлкен зерттеу тобымен (яғни, статистикалық қуаттылықпен) маңызды болады. Біз NA және FR препаратының сахарозды қабылдауының басталуымен қатар NAc активациясын байқадық. NAc нейрондарының активтендіруі мен ингибирленгендігі аспаптық марапаттардың орындалуымен байланысты болды және активация / белсенділіктің үлгісі оқыту мен қоршаған ортаға тәуелді және мінез-құлықтың әртүрлі компоненттерімен (мысалы, бағдарлау, тәсіл, қабылдау) байланысты6, 33, 50). Жоғарыда талқыланғандай, c-Fos өлшемі осындай ерекше әрекетті қолдамайды. Карлосон «сыйақылар» көбінесе NAc нейрондарының белсенділігінің төмендеуімен байланысты, яғни орта шырышты нейрондардың3). Бұл біздің бақылауларымызға сәйкес келмейді, яғни, Nc c-Fos-ді өңдеуді бақылаумен салыстырғанда және C-Fos-позитивті нейрондармен ортақ шпиндестік нейрондарды (GABAergic) белсендіруге сәйкес GAD-мен колокализацияланған нейрондармен салыстырғанда, бірақ біз несептегі нейрондық «ингибицияны нақты бағалай алмадық «. NAc активтендіруі және ингибиторлары анатомиялық және уақытша ерекшеліктермен аспаптық тапсырмалар кезінде орын алуы мүмкін. Зерттеу тұрғысынан, ААЖ аспаптық сахароза алудың басталуына қатысады деп есептелуі мүмкін, бұл қозғалтқышты активтендіруге және NAc қабығына ықпал ететін NAc ядросы міндеттің моторлы және мотивациялық аспектілеріне ықпал етеді.
Сондай-ақ, FR егеуқұйрықтарында BNST (алдыңғы және артқы) негізгі аймақтарының белсенділігін байқадық. BNST қайталама ынталандыру тәжірибесіне нейроэндокриндік жауаптарды модуляциялайтын лимбиялық схеманың бөлігі болып табылады (8, 9), және одан да көп мағынада қайталанатын ынталандыру туралы біліммен байланысты. Оның рөлі қайталанған стресстік тәжірибелерге қатысты барынша жан-жақты түсіндірілгеніне қарамастан, біздің зерттеуіміз BNST үшін кеңірек рөлді ұсынады: BNST оң, теріс немесе стресс болатын ынталандыруларға арналған CNS жауаптарын модуляциялауы мүмкін. Біз FR-ның басталуында бұл белсендіруді байқадық, бірақ PR-ны орындамағандықтан, BNST-ны іріктеу FR тренингтерінің сахароза жетістіктерінің өсуіне байланысты болуы мүмкін. CRF нейрондарының тікелей белсендірілмегені туралы біздің байқауымызда сахароза үшін аспаптық жауап маңызды стресстор емес екенін көрсетеді; алайда, басқа PVN нейрондарындағы c-Fos өрнегі кернеу схемасын модуляциясымен (46). Шындығында, Ульрих-Лай және әріптестер басқа диета / азықтандыру парадигмасын қолданып, сукрозды қабылдау PVN функциясын47). Ақыр соңында, гипоглозалық нервтің ядросы PR-мен бірге емес, FR-ның нәтижесі емес. Мұның маңыздылығы тек қана болжамды болуы мүмкін; Сахарозадағы сахароза мөлшерін азайтатын егеуқұйрықтардағы сахароза дәмінің релестілігі жоғары болуы мүмкін.
Сахарозды іздестіру және сахарозды қабылдау уақыттың қарқындылығы мультимодальды тәжірибе ретінде қарастырылуы керек, себебі сіңіру сахароздың калориялық құрамына байланысты перифериялық сигналдарға, сондай-ақ әдеттер мен әшекейлі аллестезияға (25). Біздің зерттеулеріміз азық-түлік сыйақысын модуляциялау үшін перифериялық эндокриндік сигналдардың, яғни инсулиннің және лептиннің әсеріне бағдарланғанымен, олардың әсері өз кезегінде қысқа немесе ұзақ мерзімді кезеңде рөл атқаратын таратқыштар мен нейропептидтердің орталықтандырылған түрде болуы мүмкін азық-түлік немесе азық-түлік сыйлығы (бұр. 14). Ағымдағы зерттеуде бұл туралы кейбір түсінік бар; біз MCH немесе Orexin, нейропептидтер болып табылатын нейропептидтерді білдіретін нейрондық кейбір белсендіруін байқадық. Бұл нәтижелер, шын мәнінде, тағамдық сыйақыларда MCH немесе орексиннің рөлін төмендетуі мүмкін, өйткені колхицинмен өңделген егеуқұйрықтардағы иммуноцитохимия бұл нейропептидтердің екеуінің де визуализациясын шектейді. LH активтендірілген орексин нейрондарын сәйкестендіру азық-түліктегі нейрондық нейрондарды, азық-түлік сыйақыларын және жалпыланған ынталандыру сыйлығын (мысалы, 5, 7, 29) байланыстыратын көптеген зерттеулермен сәйкес келеді. Біз peFLH orexin нейрондарының белсендірілуін байқадық. Астон-Джонс және әріптестер (5) LH orexin нейрондарының әртүрлі популяциясының рөлін марапаттау тәртібінде бөлді және сыйақының айырмашылығына қарамастан, peFLH orexin нейрондарын әсер етті. Осылайша, біздің табылғанымыз LH орексиннің пайда болуына әсер етеді, және, мүмкін, сахароза алу үшін белсенді тетікке немесе бағдарға бағыттау.
Болашақ қарастырудың лайықтысы - сахароздың бірегейлігі немесе жалпылануы - бұл марапатталатын ынталандыру. Біз осы жерде ұсынылған ерте CNS-нің белсенділігін қалыптастырудың үлгісі тағамға ерекше ынталандырушы бола ма, әлде басқа марапаттайтын ынталандыруларға жалпыланады ма, анықталу керек. Жоғарыда айтылғандай, әсіресе FR тапсырмасы бойынша, бірқатар сахароза сыйақыларының жұтылуы гормондардың босатылуын (мысалы, холецистокинин, грелин, инсулин) модуляциямен және перифериялық және CNS жүйке активациясының өзгеруімен метаболические салдары болуы күтіледі. Бұл өзгерістер біз өлшеген CNS белсенділігінің алғашқы үлгілерінде тікелей рөл атқармайды, бірақ оқыту кезінде сахароза сыйақысын үйренуде маңызды рөл атқаруы мүмкін. Тағы да орексин секілді нейропептидтер сыни түрде қолданылуы мүмкін.
Біздің зерттеуімізге сүйене отырып, біз өзіміздің білімімізге сукроздың өзін-өзі басқарудың басталуында арнайы медиальдық гипоталамикалық ядролардың белсендіруін көрсететін бірінші көрсетілімді, соның ішінде гомеостазға және стресстік жауаптылығына қатысы бар ПВН және энергетикалық homeostasis үшін өте маңызды болып табылатын ARC, қоректік зондтау, тамақ қабылдауды реттеу. Ең бастысы, медиоктік гипоталамустың және PR-ның басталуымен бірге нукованың белсенділігін байқадық, бұл гомеостатикалық және кейбір лимбические учаскелері сахарозаның өзін-өзі басқаруды бастау кезінде маңызды рөл атқарады деп болжады. Қосымша лимбиялық схемалық тораптар тапсырмадағы кейінгі уақыт кезіндегі жұмысқа қабылдануы мүмкін.
Перспективалар мен маңыздылық
Дегенмен тарихи тұрғыда мотивациялық және марапат мінез-құлықтарын зерттеу CNS лимбическалық схемасын ең қатаң түрде айқындаған еді, алайда лимбикалық және энергетикалық гомеостаз схемалары арасындағы сын функционалдық өзара әрекеттесуді баса көрсететін үлкен дәлел жинағы бар. Қазіргі зерттеу қазіргі уақытта сахароза үшін дәлелді жұмысында ерекше медиальдық гипоталамикалық ядролардың маңыздылығын көрсетеді. Зерттеу нәтижесіндегі экстраполяция болашақ зерттеулер медиальдық гипоталамустың рөлі қаншалықты қажет екенін және оның активациялауы басқа теріс нәтижеге қол жеткізуді көздейді ме, жоқ па деген сұраққа жауап бере алады. Сонымен қатар, осы зерттеудің нәтижелері, семіздік секілді өзгертілген медиальдық гипоталамикалық физиологиямен бірге жағдайлардағы дәлелді мінез-құлықтың өзгеруін зерттеуді негіздейді.
ГРАНТТАР
Бұл зерттеуді денсаулық сақтаудың ұлттық институты Грант DK40963 қолдады. Дайан Фиглувич Латтеманн - Вашингтон, Сиетл, АҚШ-та Veteran Affairs Puget Sound денсаулық сақтау жүйесі департаментінің аға ғылыми қызметкері, биомедициналық зертханалық зерттеулер бағдарламасы. Доктор Сиполс Латвияның Ғылыми Кеңесінің Grant 04.1116 қолдауымен.
АНЫҚТАМАЛАР
Авторлар ешқандай мүдделер қақтығысы, қаржылық немесе өзге де тәсілдер туралы мәлімдеме жасай алмайды.
ЕСКЕРТУЛЕР
Доктор Х. Йавин Шахам, Стивен Бенуа, Кристин Тюрниус және Ю.Е. Блевинс кеңес және пайдалы талқылаулар үшін.
СІЛТЕМЕЛЕР