D1 및 D2 도파민 수용체를 함유 한 중추 신경계의 중추 신경계 (2006)에서의 코카인 유도 돌기 형성

Proc Natl Acad Sci US A. Feb 28, 2006; 103 (9) : 3399–3404입니다.
2 월 21, 2006 온라인 게시 도이 :  10.1073 / pnas.0511244103
PMCID : PMC1413917
신경 과학
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추상

핵 accumbens (NAcc)에서 dopaminoceptive 신경 세포에 수지상 쪽이 정신 자극제 유도 변경 오래 지속되는 중독성 행동에 연결 된 적응성 신경 반응으로 가정되었습니다. NAcc는 주로 높은 수준의 도파민 D1 또는 D2 수용체를 발현하는 중간 크기의 가시 뉴런의 2 개의 별개의 하위 집단으로 구성된다. 현재의 연구에서 우리는 독특 한 D1 또는 D2 수용 체를 포함하는 NAcc에서 중형 가시 신경 세포에서 만성 코카인 치료 후 수지상 척추 밀도를 분석했다. 이들 연구는 D1 또는 D2 수용체 프로모터 (Drd1-EGFP 또는 Drd2-EGFP)의 제어하에 EGFP를 발현하는 형질 전환 마우스를 사용 하였다. 코카인 치료의 28 일 및 철수의 2 일 후, 척추 밀도는 Drd1-EGFP- 및 Drd2-EGFP- 양성 뉴런 둘 다에서 증가 하였다. 그러나, 약물 제거 후 1 일에 Drd30-EGFP 양성 뉴런에서만 척추 밀도의 증가가 유지되었다. 특히, 1 일의 약물 철수 후 Drd2-EGFP- 및 Drd2-EGFP 양성 뉴런에서 증가 된 ΔFosB 발현이 관찰되었지만, 1 일 약물 투약 후 Drd30-EGFP 양성 뉴런에서만 관찰되었다. 이 결과 만성 코카인 치료 후 관찰 된 증가 된 척추 밀도 D1 수용 체 포함 신경 세포에서만 안정 하 고 ΔFosB 식 D1뿐만 아니라 D2 수용 체 포함 신경 세포에서 수지상 척추의 형성 및 / 또는 유지와 관련 된 것이 좋습니다 NAcc.

mesolimbic dopaminergic 통로는 핵 축적 (NAcc), 후각 결핵, 전전두엽 피질 및 편도선을 자극하는 복부 부위의 뉴런으로 구성됩니다 (1), 실질 nigra (pars compacta)의 nigrostriatal dopaminergic neurons는 등쪽 선조에 오름차순 투영을 제공하지만 (2). 정신 자극제는 NAcc에서 도파민의 시냅스 농도를 상승시킵니다 : 코카인, 시냅스 틈새에서 도파민 섭취를 차단하여 암페타민, 신경 말단에서 도파민 방출을 촉진하여3-5). 정신 자극제의 반복적이고 간헐적 인 투여는 이러한 약물의 급성 자극 효과에 대한 행동 반응 (민감도)을 증가시킵니다 (6-8). 대부분의 증거는 복부 부위 -NAcc dopaminergic 시스템의 적응 형 변화가 약물에 의해 유발되는 행동의 기초가되는 경험에 의존하는 가소성 변화의 중심임을 암시합니다.

도파민 외에도 정신 자극제에 대한 반응 감작의 발달에는 글루타메이트가 필요합니다 (9, 10). 복부 선조체의 중간 크기의 가시 뉴런 (MSN)은 수지상 척추의 머리에 시냅스하는 전전두엽 피질로부터 흥분성 글루타메이트 성 돌기를받습니다. MSN은 또한 척추 목에 시냅스를 일으키는 도파민 성 축삭의 주요 목표입니다 (1, 11, 12). 따라서, MSN의 수지상 척추는 도파민 및 글루타메이트 전달이 초기에 통합 된 세포 구획을 나타낸다.

도파민은 D1 서브 패밀리 (D1 및 D5 서브 타입)와 D2 서브 패밀리 (D2, D3 및 D4 서브 타입)의 두 가지 주요 수용체 서브 패밀리에 작용합니다 (13). 등쪽 선조에서 해부학 적 연구에 따르면 선조체 MSN은 높은 수준의 D1 수용체 (물질 P 및 dynorphin과 함께)를 포함하는 반면, striatopallidal MSN은 주로 D2 수용체 (엔케팔린과 함께)를 발현합니다.14-17). NAcc의 예측은 등쪽 선조보다 더 복잡하며, NAcc의 껍질과 핵심 부분은 복강의 뚜렷한 하위 영역과 복부 Tegmental Area 및 Substantia Nigra에 투영됩니다 (18). D2 수용체와 엔케팔린은 복부 두개에 대한 투영에서 높게 표현되는 반면, D1 수용체와 물질 P는 복지 수두와 배측에 대한 분포에서 동일하게 분포되어 있습니다.19). D1 또는 D2 수용체에 대해 선택적인 작용제 및 길항제의 연구에 따르면 D1 및 D2 수용체는 정신 자극제 의존적 행동 변화에 필요합니다 (20-25). 그러나, 이들 수용체의 역할은 다른 것으로 보인다. 예를 들어, D1 수용체의 자극은 코카인 프라이밍 주사 및 코카인 관련 환경 단서에 의해 유도 된 코카인 탐색을 약화시키는 반면, D2 수용체의 자극은 코카인 유도 회복을 촉진합니다 (26-28).

정신 자극제 중독과 관련된 행동 이상은 매우 오래 지속됩니다. 따라서, 도파민 및 글루타메이트에 의해 조절되는 뉴런 회로에서 분자 및 구조적 수준에서 오래 지속되는 약물-유도 변화를 확인하는 데 상당한 관심이 있었다 (29-32). 특히, 코카인 또는 암페타민에 장기간 노출되면 NAcc에서 MSN의 수지상 가지 지점 및 척추 수가 증가하는 것으로 나타났습니다.33-35). 이러한 구조적 변화는 마지막 약물 노출 후 최대 ≈1–3.5 개월 동안 지속되는 것으로 나타났습니다 (30, 35) 및 정신 자극 노출과 관련된 시냅스 가소성의 오래 지속되는 변경의 기초가되는 것으로 제안되었다.

이 연구의 목표는 D1 또는 D2 수용 체를 표현하는 accumbal MSN의 소집단에서 수지상 척추의 코카인 유발 구조적 변경을 조사했다. 이 연구에서, 우리는 D1 (Drd1-EGFP) 또는 D2 (Drd2-EGFP) 도파민 수용체 프로모터의 제어하에 EGFP를 발현하는 박테리아 인공 염색체 (BAC) 유전자 변형 마우스를 사용했습니다 (36). 결과는 비록 척추 밀도가 D1 수용체 함유 MSN 및 D2 수용체 함유 MSN에서 초기에 발생하지만, 변경된 척추 밀도는 D1 수용체 함유 뉴런에서만 안정하다는 것을 나타낸다. 또한, 본 발명자들은 전사 인자 ΔFosB의 발현에서 유사한 변화를 발견하는데, 이는 ΔFosB가 D1에서 수지상 척추의 형성 및 / 또는 유지 및 NAcc에서의 D2 수용체-함유 뉴런에 관여 할 수 있음을 시사한다.

결과

Drd1-EGFP 및 Drd2-EGFP BAC 유전자 변형 생쥐의 MSN 분석

Drd1-EGFP 또는 Drd2-EGFP BAC 트랜스 제닉 마우스에서 등 및 배쪽 선조체에서 MSN의 투영 패턴은 GFP 발현의 분석을 통해 특성화되었습니다 (36). 등쪽 선조의 MSN에서 GFP의 차등 발현은 일반적으로 각각 내인성 D1 또는 D2 수용체의 GFP에 상응합니다 (36). 추가로 Drd1-EGFP 또는 Drd2-EGFP 마우스에서 NAcc에서 GFP의 차등 발현을 분석했습니다 (Fig. 1a 및 b). NAcc에서 뉴런의 ≈58 %가 Drd1-EGFP 마우스에서 GFP를 발현했지만 (Fig. 1a), NAcc에서 뉴런의 ≈48 %는 Drd-2-EGFP 마우스에서 GFP를 발현 하였다 (Fig. 1b). MSN은 NAcc에있는 모든 뉴런의 90–95 %를 나타냅니다 (12, 37). D1 수용체는 MSN에서만 발현되며 D2 수용체는 MSN 및 콜린성 뉴런에서 발현되며, 이는 선조 뉴런의 1–3 %를 나타냅니다 (37). 이러한 요소를 고려하면 NAcc에서 MSN의 MSN10–15 %가 D1와 D2 수용체를 모두 발현 할 가능성이 최소로 나타납니다.

그림. 1. 

Drd1-EGFP 및 Drd2-EGFP 마우스의 MSN 분석 (a 및 b) Drd1-EGFP의 NAcc에서 고정 뇌 조각 (a) 또는 Drd2-EGFP (b) BAC 트랜스 제닉 마우스를 GFP 및 NeuN (일반 뉴런 마커로서)에 대해 면역 염색 하였다. 병합 된 이미지는 코 로컬라이제이션이 노란색으로 표시됩니다 ...

Drd1-EGFP 및 Drd2-EGFP 마우스의 수지상 척추 분석.

Drd1-EGFP 및 Drd2-EGFP 마우스에서 GFP 발현은 신경 세포체를 염색하는데 유용 하였다. 그러나, 수상 돌기 및 수상 돌기의 GFP 신호는 너무 약하여 항 -GFP 항체로 면역 염색 된 후 분석하기에 너무 약했다. 형광 염료의 입자 매개 탄도 전달은 최근에 신속하고 효율적인 방식으로 뉴런 집단을 표시하는 데 사용되었습니다.38). 이 기술을 사용하여 전체 뉴런에 라벨을 붙일 수 있으며,이 방법은 Golgi-Cox 염색과 비슷한 것으로 보입니다. NAcc에서 뉴런의 수지상 형태를 분석하기 위해, 고정 된 누적 슬라이스를 친 유성 형광 염료 1,1'- 디 오타 데실 -3,3,3 ', 3'- 테트라 메틸 인도 카르 보시 아닌 퍼클로레이트 (DiI)로 유전자 총을 사용하여 표지 하였다. DiI 스테인드 MSN의 예는 다음과 같습니다. Fig. 1c. 사용 된 조건 하에서, 본 발명자들은 일반적으로 다른 표지 된 뉴런으로부터 중복 된 수상 돌기없이 표지 된 뉴런을 관찰 하였다. 더 높은 배율에서, 수지상 척추를 포함한 상세한 수지상 형태가 관찰 될 수있었습니다 (Fig. 1d).

그런 다음 Drd1-EGFP 또는 Drd2-EGFP 유전자 변형 생쥐에서 GFP에 DiI 라벨링과 면역 조직 화학의 조합을 사용했는데, 이는 조직 투과성에 낮은 농도의 세제를 사용하여 가능했습니다. 행동 양식). MSN의 세포체에서 DiI 얼룩과 GFP 발현을주의 깊게 비교함으로써 Drd1-EGFP에서 DiI 및 GFP 양성 또는 DiI 양성 및 GFP 음성 뉴런을 확인할 수있었습니다.Fig. 2a) 또는 Drd2-EGFP (Fig. 2b) 마우스. 다음 연구에 대 한 Drd1-EGFP 또는 Drd2-EGFP 마우스에서 DiI 및 GFP 양성 뉴런의 수지상 형태를 분석했습니다.

그림. 2. 

Drd1-EGFP 및 Drd2-EGFP 마우스의 수지상 척추 분석. Drd1-EGFP 마우스 중 NAcc의 뉴런 (a) 또는 Drd2-EGFP 마우스 (b)를 먼저 DiI (적색)로 표지 한 다음, 항 -GFP 항체 (EGFP, 녹색)를 사용하여 면역 조직 화학을 실시 하였다. 만 ...

만성 코카인 처리는 Drd1-EGFP 또는 Drd2-EGFP를 나타내는 Accumbal MSN의 척추 밀도 증가를 초래합니다.

Drd1-EGFP 또는 Drd2-EGFP 마우스에 연속 4 주 동안 코카인 (30 mg / kg) 또는 식염수를 반복적으로 주사했습니다 (참조 행동 양식). 마지막 약물 치료 후 2 일 (2WD) 또는 30 일 (30WD), 뇌는 상기 기재된 바와 같이 DiI 표지 및 면역 조직 화학을 위해 처리되었다. 이전 연구에 따르면 암페타민을 이용한 만성 치료는 NAcc에서 MSN의 원위이지만 근위 수상 돌기의 척추 밀도가 증가한 것으로보고되었습니다.35). 따라서 우리는 분석을 말단 영역을 포함하여 원위 수상 돌기 (즉, 2 차 또는 3 차 가지를 가진 것)로 제한했습니다. 2WD에서 분석 한 결과 Drd1-EGFP 양성 MSN (식염수 그룹의 128 %)에서 척추 밀도가 증가한 것으로 나타났습니다 (Fig. 3a 및 c) 및 Drd2-EGFP 양성 뉴런 (식염수 그룹의 115 %)에서Fig. 3 b 및 d). 30WD 후, 증가 된 척추 밀도는 Drd1-EGFP 양성 뉴런 (식염수 제어의 118 %)에서 유지되었다 (Fig. 3 a 및 c)이지만 Drd2-EGFP 양성 뉴런에는 없습니다 (Fig. 3 b 및 d).

그림. 3. 

NAcc의 Drd1-EGFP- 또는 Drd2-EGFP 양성 MSN에서 척추 코카인으로 인한 척추 밀도 증가. (a 및 b) Drd1-EGFP (a) 또는 Drd2-EGFP (b) 마우스를 30 주 동안 식염수 (Sal) 또는 코카인 (Coc, 4 mg / kg)으로 처리 하였다. 마우스 뇌 2WD 또는 30WD가 처리되었습니다 ...

수지상 척추의 형태는 길이와 척추 머리의 폭에 따라 다양합니다. 따라서 우리는 수지상 돌기들을 코카인으로부터 2WD에서 4 가지 척추 클래스들 (stubby, mushroom, thin, filopodia)로 분류 하였다 (데이터는 나타내지 않음). 버섯 형 밀도 (119.7 ± 4.0 %, P <0.01) 및 얇은 가시 (120.0 ± 3.4 %, P <0.01)은 Drd1-EGFP 양성 MSN에서 코카인 처리에 의해 증가한 반면, 뭉툭한 밀도 (182.4 ± 21.6 %, P <0.05) 및 버섯 가시 (122.5 ± 5.0 %, P <0.01) Drd2-EGFP 양성 MSN에서 증가했습니다. Drd1-EGFP- 양성 뉴런의 뭉툭한 가시나 Drd2-EGFP- 양성 뉴런의 얇은 가시의 유의 한 증가는 없었습니다.

만성 코카인은 NAcc에서 Drd1-EGFP- 또는 Drd2-EGFP- 양성 MSN에서 ΔFosB 발현을 유도합니다.

ΔFosB는 Fos 전사 인자 패밀리의 구성원이다. 코카인의 급성 투여는 NAcc에서 여러 Fos 이소 형의 신속하고 일시적인 유도를 유도하는 반면, 코카인에 반복 노출되면 ΔFosB의 수준이 증가합니다. 또한, ΔFosB 발현의 증가는 약물 노출 중단 후 수 주에서 수개월 동안 NAcc에서 지속되며 약물 복용이 중단 된 후에도 유전자 발현의 오래 지속되는 조절에 관여하는 것으로 제안되었다 (29, 39, 40).

코카인 처리 후 Drd1-EGFP 또는 Drd2-EGFP 마우스에서 NAcc에서 ΔFosB의 유도를 조사하기 위해, 이중 표지에 의해 FosB 및 GFP 발현을 분석 하였다 (Fig. 4 및 표 1) 항 -FosB 항체는 모든 형태의 FosB를 인식하지만, 증가 된 면역 염색은 ΔFosB를 나타낸다고 가정합니다 (참조 행동 양식 추가 논의를 위해). 식염수 처리 된 마우스에서, Drd16-EGFP 양성 뉴런의 1 % 및 Drd15-EGFP 양성 뉴런의 2 %는 상대적으로 약한 강도로 FosB 면역 반응성을 나타냈다 (Fig. 4 a 및 b 및 표 1). 반복 된 코카인 치료 후 2WD는 ΔFosB (GFP- 양성 뉴런의 1 %)를 공 발현 한 Drd55-EGFP- 양성 뉴런의 수를 크게 증가 시켰습니다 (Fig. 4c 및 표 1). Drd2-EGFP 양성 뉴런 (GFP 양성 뉴런의 25 %)에서 ΔFosB 발현의 작지만 여전히 유의 한 증가가 발견되었습니다.Fig. 4d 및 표 1). 척추 밀도의 변화와 마찬가지로, ΔFosB의 증가 된 발현은 Drd1-EGFP 양성 뉴런 (GFP 양성 뉴런의 46 %)에서는 유지되었지만 Drd2-EGFP 양성 뉴런 (GFP 양성 뉴런의 15 %)에서는 유지되지 않았습니다. 30WD (Fig. 4 e 및 f 및 표 1). 증가 된 ΔFosB 발현은 Fig. 4f Drd2-EGFP 음성 뉴런에 존재합니다.

그림. 4. 

만성 코카인은 NAcc에서 Drd1-EGFP- 또는 Drd2-EGFP 양성 MSN에서 ΔFosB 발현을 유도합니다. Drd1-EGFP (a, c및 e) 또는 Drd2-EGFP (b, d및 f) 마우스를 식염수 또는 만성 코카인으로 처리 한 Fig. 3. 2WD (c 및 d) 또는 30WD (e 및 ...
테이블 1. 

Δ를 발현하는 EGFP- 양성 뉴런의 정량FosB

토론

도파민 성 신경 전달에서의 오래 지속되는 적응은 정신 자극 약물과 관련된 중독성 행동의 기초가되는 것으로 여겨진다. 특히, NAcc에서 MSN의 수지상 척추 밀도의 정신 자극제-유도 증가는 시냅스 연결성의 재구성과 관련이 있다고 가정되었다 (30). NAcc는 크게 D1 또는 D2 도파민 수용체 중 하나를 발현하는 MSN의 2 개의 별개의 하위 집단으로 구성됩니다. 현재의 연구에서 만성 코카인 치료 후 NAcc에서 고유 한 D1 또는 D2 수용 체 함유 MSN에서 척추 밀도를 분석했습니다. 얻어진 결과, 비록 D1 수용체-함유 MSN 및 D2 수용체-함유 MSN에서 증가 된 척추 밀도가 발생하지만, 변경된 척추 밀도는 D1- 수용체-함유 뉴런에서만 안정하다는 것을 보여준다. 또한, 우리는 D1 및 D2 수용 체 함유 MSN에서 녹음 방송 요인 ΔFosB의 식 변화의 비슷한 패턴을 찾을 수 있습니다.

이들 연구는 D1 또는 D2 수용체 프로모터의 제어하에 MSN의 특정 소집단에서 GFP를 발현하는 BAC 트랜스 제닉 마우스를 사용 하였다. 또한, 우리는 DiI를 사용하여 뉴런의 탄도 라벨링과 GFP에 대한 immunohistochemistry를 결합한 이중 라벨링 방법을 개발했습니다. 이전의 연구는 골지-콕스 방법을 사용하여 정신 밀도가 척추 밀도에 미치는 영향을 분석했습니다 (34) 및 여기에 사용 된 DiI 방법은 정량적으로 비교 가능한 결과를 제공 하였다. 골지 염색은 면역 조직 화학과 호환되지 않기 때문에 이중-표지법을 개발 하였다. 면역 염색은 일반적으로 막으로부터 친 유성 염료를 용해시키는 과정 인 세제를 사용한 조직 투과가 필요합니다.38). 그러나, 현재의 연구에서, GFP 면역 염색은 조직 투과를 위해 고농도의 세제를 필요로하지 않았으므로 친 유성 염료 표지와 함께 사용될 수있다. 우리의 이중 표지 방법은 GFP가 피질의 특정 뉴런 집단에서 발현되는 BAC 유전자 변형 생쥐 라인의 분석에 사용될 때 수지상 척추의 구조적 변화에 대한 연구에 일반적으로 유용해야합니다 (36).

여전히 다소 논란의 여지가 있지만 D1 및 D2 수용체는 각각 직접 (striatonigral) 및 간접 (striatopallidal) striatal projection neuron으로 크게 해부학 적으로 분리되어 있다고 생각됩니다.17, 41). Drd1-EGFP 및 Drd2-EGFP 마우스에서 GFP의 국소화의 초기 특성은이 결론과 일치했습니다 (36). 또한 Drd1-EGFP 및 Drd2-EGFP 마우스의 NAcc에있는 GFP 양성 뉴런의 수에 대한 분석은 MSN의 ≈50 %가 D1 수용체 만 발현한다는 결론과 일치합니다. ≈35–40 %는 D2와 D10 수용체를 동시에 발현합니다. 공 발현의이 값은 단일 선조 뉴런의 패치-클램프 분석을 RT-PCR 기술과 결합하여 mRNA를 단리하고 증폭시키는 등의 선조 연구에 의해 암시 된 것과 유사하다 (엔케팔린과 물질 P의 NUM15 % 공 발현)42). 우리의 현재 연구는 D3, D4 및 D5 수용체의 발현 문제를 다루지 않으며, 높은 수준의 D1 수용체를 발현하는 MSN에서 D2 수용체의 낮은 발현 수준의 문제 또는 그 반대의 문제도 다루지 않습니다.

이전의 몇몇 연구는 정신 자극제-유도 Fos 발현의 뉴런 국소화 및 D1 및 D2 수용체의 역할을 조사 하였다 (43-45). 이러한 연구는 Fos 및 ΔFosB 유도가 D1 수용체의 활성화에 의해 매개된다는 결론을지지했다. 그러나, Fos 발현의 세포 위치는 정신 자극 약물이 투여되는 환경 적 맥락에 영향을 받는다 (46, 47). 예를 들어, 홈 케이지에 제공된 암페타민 또는 코카인은 D1 수용체를 공 발현하는 물질 P- 양성 세포에서 우선적으로 초기 유전자 (Fos 포함)를 유도한다. 대조적으로, 이들 약물은 새로운 환경에서 투여 될 때 D1 및 D2 수용체-함유 MSN 모두에서 Fos 발현을 유도 할 수있다. 우리의 현재 연구에 사용 된 프로토콜은 새로운 환경에 노출 된 약물 주입과 짝을 이루지 않았다. 그러나 D2 수용체가 포함 된 MSN에서 ΔFosB 발현을 담당하는 상황에 따른 스트레스를 배제 할 수는 없습니다.

본 결과의 주목할만한 특징은 증가 된 척추 밀도 및 ΔFosB 발현의 평행 패턴이었다. Drd1-EGFP 및 Drd2-EGFP를 발현하는 MSN에서 초기에 척추 밀도와 ΔFosB 발현이 증가했습니다. 그러나, 이러한 변화는 D1 수용체-함유 뉴런에서만 안정적이었다. D2 수용체-함유 뉴런에서 증가 된 척추 밀도 및 ΔFosB 발현이 일시적으로 발견되었다는 관찰에 대한 하나의 가능한 설명은 이것이 D1 및 D2 도파민 수용체 모두를 공동 발현하는 소량의 MSN에서 발생했다는 것이다. 따라서, 이러한 증가의 일시적 특성은 D2 의존적 신호 전달 경로에 대한 D1 수용체 활성화의 길항 효과와 관련 될 수있다 (48). 척추 밀도 및 ΔFosB 발현의 변화가 가역적이며, 이는 △ FosB의 안정성에 영향을 미치는 D2 수용체-의존적 신호 전달 경로의 능력을 반영 할 수 있다는 것이 흥미 롭다.

ΔFosB 및 척추 밀도의 발현에 평행 한 변화가 있다는 관찰은 ΔFosB가 NAcc에서 D1 수용체-함유 뉴런에서 수지상 척추의 초기 형성 및 후속 유지에 관여한다는 생각과 일치한다. ΔFosB의 발현은 MSN에서 D1 / DARPP-32 / PP1 의존적 신호 경로에 의해 제어됩니다.49). 여러 연구에 따르면 ΔFosB는 정신 자극제의 보람 및 운동 활성화 작용에서 중요한 역할을합니다 (39), 신경 전달 물질 수용체, 신호 전달 단백질 및 신경 형태의 조절에 관여하는 단백질을 포함하는 다수의 유전자의 발현에 영향을 미침50). 그러나, 만성 코카인 유발 척추 형성에 관여하는 특정 분자 메커니즘은 현재 알려져 있지 않다. 우리의 이전 연구는 Cdk5 억제제 roscovitine의 intraaccumbal 주입이 척추 밀도의 코카인 유발 증가를 약화시키는 것으로 나타났습니다.51). 또한, Cdk5는 ΔFosB에 대한 다운 스트림 표적 유전자이며, 만성 코카인 치료와 관련된 보상 적 적응성 변화와 관련이있다 (52). 따라서, Cdk5- 의존적 인산화에서의 변경은 코카인-유도 된 척추 형성 및 / 또는 척추 안정성의 근본 원인이되는 메커니즘이다. PAK (53), β- 카테닌 (54), PSD-95 (55) 및 스피노 필린 (56)은 Cdk5의 기질이며 모두 척추 형태 형성의 조절에 관여합니다 (57-60). 척추에서 이들 및 다른 Cdk5 기질의 추가 특성화는 정신 자극제에 의한 척추 형성의 조절과 관련된 메카니즘에 대한 희망을 밝힐 것이다.

행동 양식

동물.

D1 또는 D2 도파민 수용체의 제어하에 EGFP 트랜스 진을 운반하는 마우스는 Gensat BAC 트랜스 제닉 프로젝트에 의해 생성되었다 (36). 이 연구에 사용 된 트랜스 제닉 마우스는 4-5 주령이었고 스위스-웹스터 배경에있었습니다. 마우스를 12 : 12-h 명 / 암 주기로 유지하고 임의로 음식 및 물을 이용할 수있는 2-5 그룹에 수용 하였다. 모든 동물 프로토콜은 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 국립 보건원 (National Institutes of Health) 가이드에 따르고 록펠러 대학교 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다.

약물 치료.

만성 코카인 치료 (30 mg / kg, 매일)는 쥐의 NAcc 코어와 껍질 모두에서 MSN의 척추 밀도가 강력하게 증가하는 것으로보고되었지만, 저용량 (15 mg / kg)은 척추 밀도 만 증가 시켰습니다. 껍질 (61). 따라서 우리는 더 많은 양의 코카인을 사용하여 NAcc의 두 부분 모두에서 구조적 변형을 유도했습니다. 마우스는 30 연속 일 동안 매일 5 mg / kg 코카인 -HCl (또는 식염수)의 1 회 주사 (ip)를받은 후, 2 주사없는 날이 이어졌으며,이 절차는 4 연속 주 동안 반복되었다. 주사는 가정 케이지에서 수행되었다. 2WD 또는 30WD, 마우스 뇌는 DiI 표지 및 / 또는 면역 조직 화학을 위해 처리되었다.

형광 염료 DiI를 사용한 탄도 라벨링.

마우스를 80 mg / kg 나트륨 펜토 바르 비탈로 마취시키고 5 ml의 PBS로 심근 관류 한 후, PBS 중 40 % 파라 포름 알데히드의 4 ml로 빠른 관류 (20 ml / 분) 하였다. 뇌에서 뇌를 신속하게 제거하고 4 분 동안 10 % 파라 포름 알데히드에 후 고정시켰다. 뇌 절편 (100 μm)은 참고 문헌에 기재된 형광 염료 DiI (Molecular Probes)의 탄도 전달에 의해 표지되었다. 38. 낮은 농도의 세제로 결합 된 DiI 라벨링-면역 조직 화학 법이 개발되었습니다. DiI- 표지 된 절편을 0.01 분 동안 PBS에서 100 % Triton X-15로 투과시킨 후 0.01 h 동안 PBS에서 100 % Triton X-10 및 1 % 정상 염소 혈청에서 배양하여 비특이적 표지를 최소화 하였다. 이어서, 조직 섹션을 1 % 정상 염소 혈청 / 0.01 % Triton X-100 및 항 -GFP 항체 (Abcam, Cambridge, MA)와 함께 2 h 동안 실온에서 인큐베이션하고, 세척하고, FITC-의 1 : 1,000 희석액에서 인큐베이션 하였다. 접합 된 ​​이차 항체 (Molecular Probes). 섹션을 현미경 슬라이드에 놓고 장착 매체로 커버 슬립 핑 하였다. 탄도 라벨링 방법으로 수지상 척추 구조를 상세하게 분석 할 수 있었으며, 얻은 결과는 쥐 뇌 조각에서 골지-콕스 함 침법을 사용한 이전 연구와 질적 및 양적으로 비교할 수있었습니다.34). 그러나, 이전 연구와 달리, 우리는 DiI- 염색 된 뉴런에서 양두 가시를 거의 관찰하지 않았다. 이 차이는 염색 방법의 민감성 또는 생쥐 (본 연구) 대 쥐 조직의 다양성 (34).

면역 조직 화학.

상기 기재된 바와 같이 동물을 마취시키고 관류시켰다. 뇌를 제거하고 4 ℃에서 4 % 파라 포름 알데히드에 밤새 저장 하였다. 동결 보호를 위해 뇌를 PBS 용액 중 30 % 수 크로스로 옮겼다. 코로 날 섹션 (12 μm)을 동결 마이크로톰 (Leica)에서 절단 한 후 면역 조직 화학을 위해 처리 하였다. 이어서 뇌 섹션을 0.3 분 동안 PBS 중의 100 % 트리톤 X-15에서 투과 화시키고 PBS에서 2 회 헹구었다. 섹션을 10 ° C에서 1h 동안 PNUM 중 37 % 정상 염소 혈청에서 예비 배양하고, 1 ° C에서 밤새 일차 항체 (PBS에서 4 % 정상 염소 혈청에 희석 됨)에 노출시킨 다음 PBS에서 헹구고 이차와 함께 배양 하였다 1 ° C에서 37 h에 대한 항체. 토끼 항 -pan-FosB (SC-48, 1 : 500; 산타 크루즈 바이오 테크놀로지), 마우스 항 -NeuN (Chemicon), 토끼 항 -GFP, FITC- 접합 된 항-토끼 IgG 및 로다 민- 접합 된 ​​항-마우스 IgG (Molecular Probes). 삼중 표지 (ΔFosB, NeuN 및 GFP)를 위해, 뇌 절편을 먼저 항-팬 FosB 항체 및 항 -NeuN 항체로 면역 염색 한 후 이차 항체 (로다 민-접합 된 항-토끼 IgG 및 시안-접합 된 항-마우스 IgG)와 함께 인큐베이션 하였다. ). Zenon 표지 기술 (Zenon Alexa Fluor 488, Molecular Probes)을 사용하여 GFP 면역 염색을 위해 이중 염색 된 뇌 섹션을 추가로 처리 하였다. 항 -pan-FosB 항체를 FosB의 N 말단으로 올리고 ΔFosB 및 전장 FosB (62). 만성 코카인 치료 후 ΔFosB가 아닌 FosB 또는 다른 Fos 관련 항원이 안정적으로 발현되지 않았 음을 보여주는 이전의 연구에 근거하여, 본 발명자들은 면역 반응성에서 장기간 지속되는 증가가 ΔFosB의 안정한 발현을 나타낸다고 가정한다. 그러나, 식염수 처리 된 생쥐에서 관찰 된 면역 반응성 FosB 신호의 정체는 알려져 있지 않다. 통계 분석 표 1 학생의 t 테스트.

수지상 척추 분석.

NAcc의 개별 MSN은 여러 기준에 따라 척추 분석을 위해 선택되었습니다. (i) 다른 세포로부터의 공정이 혼동되지 않도록하기 위해 다른 표지 된 세포와 최소한의 중첩이 없었다. (ii) 분석을 위해 세포를 사용하기 위해서는 최소한 3 개의 1 차 수상 돌기가 보일 필요가있다. (III) 말단 수상 돌기 (말단 수상 돌기 또는 말단 수상 돌기 근처)를 검사했습니다. NAcc의 코어와 쉘에있는 두 MSN의 수상 돌기를 분석했습니다. 드물게 스핀 된 MSN (스파 이니 타입 II)을 관찰했지만, 밀집된 MSN (스파 이니 타입 I) 만 분석했습니다. 척추 밀도를 계산하기 위해 오일 침지 렌즈 (x20)가있는 공 초점 현미경 (Zeiss LSM 510)을 사용하여 수상 돌기의 길이 (> 40μm 길이)를 추적했습니다. 수상 돌기의 모든 이미지는 서로 다른 z 수지상 척추의 형태를 검사하기 위해 레벨 (0.5-1 μm 깊이 간격). 모든 측정은 변성 이미지 분석 소프트웨어 (Universal Imaging, Downingtown, PA)로 수행되었다. 통계 분석은 Kolmogorov–Smirnov 검정을 사용했습니다.

수상 돌기로부터의 돌출은 참고 문헌에 기술 된 바와 같이 길이에 기초하여 4 가지 유형으로 분류되었다. 63 및 64. 뭉툭한 돌기라고도하는 클래스 1 돌출부는 길이가 0.5 μm 미만이고 큰 척추 머리가없고 목이없는 것처럼 보였습니다. 클래스 2 또는 버섯 모양의 가시는 길이가 0.5 ~ 1.25 μm이고 짧은 목과 큰 척추 머리가 특징입니다. 클래스 3 또는 얇은 가시, 범위는 1.25 ~ 3.0 μm이고 작은 머리를 가진 가늘고 긴 척추 목을 가지고 있습니다. 클래스 4 또는 유족 확장은 식별 가능한 척추 머리가없는 긴 사상 형 돌출부였습니다.

감사의

이 작업은 미국 공중 보건 서비스 보조금 DA10044 (PG 및 ACN)와 Simons Foundation, Peter J. Sharp Foundation, Picower Foundation 및 FM Kirby Foundation의 지원을 받았습니다.

약어

  • NAcc
  • 측쇄 핵
  • MSN
  • 중형 가시 뉴런
  • BAC
  • 세균성 인공 염색체
  • Drd1
  • 도파민 수용체 D1 프로모터 구동
  • Drd2
  • 도파민 수용체 D2 프로모터 구동
  • DiI
  • 1,1'- 디 오타 데실 -3,3,3 ', 3'- 테트라 메틸 인도 카르 보시 아닌 퍼클로레이트
  • 2WD
  • 마지막 약물 치료 후 2 일
  • 30WD
  • 마지막 약물 치료 후 30 일.

각주

 

이해 충돌 선언 : 충돌이 선언되지 않았습니다.

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