orbitofrontal cortex의 DeltaFosB 유도는 코카인으로 인한인지 기능 장애를 약화 시키지만 운동 촉진제를 강화시킵니다. (2009)

2.1. 주제

275-300 g, Charles River, Kingston, RI)를 기후 조절 식민지 방에서 역전주기 (21.00-09.00에서 켜짐) 하에서 쌍으로 수용했다. 행동 실험에서의 동물들 (n= 84)는 자유 섭식 체중의 85 %로 제한된 식품이었고 하루에 14 g의 쥐를 섭취 하였다. 물 공급 가능 광고 무제한. 행동 테스트는 09.00와 19.00 사이에서 일주일에 5 일 동안 이루어졌습니다. qPCR 실험을 위해 뇌 조직을 생성하는 데 사용 된 동물은 음식과 물 모두에 자유롭게 접근 할 수있었습니다 (n= 16). 이 동물들은 음식과 물을 자유롭게 섭취 할 수있었습니다.

2.2. 외과

랫트는 표준 stereotaxic 기법을 사용하여 AAV-GFP, AAV-ΔFosB 또는 AAV-ΔJunD의 OFC 내 주사를Winstanley 등, 2007). 랫트를 ketamine (Ketaset, 100 mg / kg 근육 내 (im) 주사) 및 xylazine (10 mg / kg im, Henry Schein, Melville, NY의 두 약물)으로 마취시켰다. AAVs는 폴리에틸렌 튜빙 (Instech Solomon, Pennsylvania, USA)에 의해 Hamilton microinfusion 펌프에 부착 된 31 게이지 스테인리스 인젝터 (Small Parts, Florida, USA)를 사용하여 OFC에 주입되었습니다. 바이러스 성 벡터를 정위 방사선 아틀라스 (stereotaxic atlas)로부터 취한 다음 좌표에 따라 0.1 μl / 분의 속도로 주입 하였다Paxinos와 Watson, 1998) 사이트 1 AP + 4.0, L ± 0.8, DV -3.4, 0.4 μl 사이트 2 AP + 3.7, L ± 2.0, DV -3.6, 0.6 μl 사이트 3 AP ± 3.2, L ± 2.6, DV -4.4, 0.6 μl ((Hommel 등, 2003) AAV 준비에 대한 자세한 내용은. AP (전후방) 좌표는 bregma, 정중선에서 L (lateral) 좌표, 그리고 dura에서 DV (dorsoventral) 좌표를 취했다. 어떤 행동 검사 (실험 1) 또는 약물 투여 (실험 2)가 시작되기 전에 동물을 수술로부터 회복 시키는데 1 주일이 걸렸다.

2.3. 실험적 설계

운동 민감성 데이터는 만성 약물 노출의인지 후유증을 측정하기 위해 일련의 행동 테스트를 거친 동물로부터 얻어졌으며, 이들 데이터는 이전에 공개되었다 (Winstanley 등, 2007). 요컨대, 쥐는 5CSRT 또는 지연 할인 작업을 수행하도록 훈련 받았습니다. 그런 다음 기준선 성과에 맞는 세 그룹으로 나뉘었다. ΔFosB를 과발현하는 아데노 - 관련 바이러스 (AAV2) (Zachariou 등, 2006)은 표준 stereotaxic surgical technique (아래 참조)을 사용하여 한 그룹의 OFC로 선택적으로 주입되어 만성 코카인 투여로이 단백질의 유도를 모방했다. 두 번째 그룹은 AAV-ΔJunD의 OFC 내 주입을 받았다. AAV-GFP (녹색 형광 단백질)를 대조군으로 사용 하였다. 일단 안정적인 수술 후 기준선이 확립되면, 급성 코카인 (0, 5, 10, 20 mg / kg ip)의 효과가 작업시 결정됩니다. 코카인의 만성 투여가 급성 코카인 노출의인지 효과를 변화시키는지를 평가하기 위해, 동물들은 수술 그룹 내에서 그리고 수술 그룹들 사이에서 두 개의 동일한 세트로 일치되었다. 한 그룹은 식염수로 만성적으로, 다른 그룹은 2 일 동안 코카인 (15 × 21 mg / kg)으로 처리되었다. 만성 약물 치료가 중단 된 지 2 주 후, 급성 코카인 챌린지가 반복적으로 수행되었다. 일주일 후, 코카인에 대한 운동 반응이 평가되었다.

2.4. 코카인에 대한 Locomotor 반응

운동 활성은 photobeam activity system (PAS : San Diego Instruments, San Diego, CA)을 사용하여 개별 케이지 (25 cm x 45 cm x 21 cm)에서 평가되었습니다. 각 케이지의 활동은 새장의 너비, 7 cm 간격 및 새장 바닥에서 6 cm 교차하는 3 photobeams에 의해 측정되었습니다. 데이터는 PAS 소프트웨어 (버전 5, San Diego Instruments, San Diego, CA)를 사용하여 2 최소 빈을 통해 대조되었다. 30 분 후에, 동물에게 코카인 (15 mg / kg ip)을 주사하고 운동 활성을 추가 60 분 동안 모니터 하였다.

2.5. mRNA의 정량화

쥐에게 AAV-GFP 또는 AAV-ΔFosB의 OFC 내 주사를 투여 한 다음, 행동 실험에 대해 기술 된 것과 똑같이 매일 21 식염수 또는 코카인 주사를 두 번 받았다. 마지막 생리 식염수 또는 코카인 주입 후 동물을 24 h로 사용 하였다. 쥐들은 목이 잘랐다. 두뇌를 신속하게 추출하고 양측의 1 mm 두께의 12 게이지 펀치를 획득하고 즉시 얼려서 RNA 분리까지 -80 ° C에 보관했다. OFC에서 펀치는 또한이 지역에서 성공적인 바이러스 성 매개 유전자 전달을 확인한 DNA microarray에 의한 분석을 위해 제거되었습니다 (Winstanley 등, 2007자세한 내용은을 참조하십시오). 제조사의 지시에 따라 RNA Stat-60 시약 (Teltest, Houston, TX)을 사용하여 NAc 샘플로부터 RNA를 추출 하였다. DNase 처리 (DNA-Free, 카탈로그 # 1906, Ambion, Austin TX)로 오염 된 DNA를 제거 하였다. 정제 된 RNA를 cDNA로 역전사시켰다 (Superscript First Strand Synthesis, 카탈로그 # 12371-019, Invitrogen). Stratagene (La Jolla, CA) Mx5000p 96-well thermocycler에서 실시간 qPCR (SYBR Green, Applied Biosystems, Foster City, CA)을 사용하여 관심있는 유전자에 대한 성적서를 정량화했습니다. 모든 프라이머는 Operon (Huntsville, AL; 표 1 서열에 대해), 실험 전에 선형성 및 특이성을 검증 하였다. 모든 PCR 데이터는 글리세린 알데하이드 -3- 포스페이트 탈수소 효소 (GAPDH) 수준으로 정상화되었으며, 코카인 치료에 의해 변화되지 않았다.C_t =C_t(관심 유전자) - C_t (GAPDH). 코카인을 투여 한 AAV-ΔFosB 및 AAV-GFP 래트 및 만성 염수를 투여 한 AAV-ΔFosB 래트에 대한 조절 된 발현 수준을 다음과 같이 대조군 (AAV-GFP 군에서 만성 염수를 투여)과 비교하여 계산 하였다 : ΔΔC_t = ΔC_t - ΔC_t (대조군). 현장에서 권장되는 연습을 유지하면서 (Livak and Schmittgen, 2001), 대조군에 대한 발현 수준을 다음 식을 사용하여 계산 하였다 : 2^-ΔΔCt.

  

표 1

실시간 PCR을 통해 cDNA 수준을 정량화하는 데 사용되는 일련의 프라이머.

2.6. 약제

코카인 HCl (Sigma, St. Louis, MO)을 0.9 % 식염수에 1 ml / kg의 양으로 용해시키고, i.p. 복용량은 소금으로 계산되었습니다.

실험 2

만성 코카인 투여는 NAc에서 유전자 발현을 조절한다

NAc의 특정 분자가 AAV-ΔFosB 염수로 처리 된 그룹에서 보이는 사전 민감화 된 반응에 기여했다면, AAV-GFP 및 동물 모두에서 동물과 비교했을 때 이들 동물에서 유사한 생화학 적 반응을 볼 것으로 기대할 수있다 AAV-ΔFosB 그룹은 코카인으로 만성적으로 치료 받았다. 또한 식염수로 치료 한 AAV-GFP 그룹의 동물은 코카인에 민감하지 않으므로이 반응을 나타내지 않아야한다. 이 패턴의 결과는 중요한 독립적 인 표본에 의해 뒷받침되는 중요한 약물 × 수술 상호 작용에 반영 될 것입니다 tAAV-GFP 및 AAV-ΔFosB 생리 식염수 처리 된 그룹과 AAV-ΔFosB 및 AAV-GFP 코카인으로 처리 된 그룹의 평균을 비교하는 테스트. 약물 치료 또는 수술의 주요 효과는 OFC에서 만성 코카인 또는 ΔFosB의 과다 발현이 NAc의 표적 분자를 조절할 수 있다는 것을 확인 하였지만,이 관찰은 AAV-ΔFosB 식염수 투여군에서 관찰 된 민감화 된 운동 반응을 설명하기에는 불충분하다 . AAV-GFP와 반복 된 코카인 주입의 OFC 내 주입을받은 한 동물의 조직은 비정상적으로 낮은 RNA 수율로 인해 분석 할 수 없었다. 이 실험에서, 우리는 코카인에 대한 운동 촉진에 연루된 여러 유전자에 중점을 두었다 (토론 참조).

3.1. ΔFosB / FosB

NAc에서 FosB mRNA의 수준은 만성 약물 치료 (2A, 마약 : F_1,14 = 1.179, ns) 또는 OFC에서 ΔFosB의 발현 (수술 : F_{1, 14} = 0.235, ns). 그러나, ΔFosB의 수준은 이전보고에 따라 만성적으로 코카인으로 처리 된 동물에서 유의하게 더 높았다 (Chen 등, 1997); 그림 2B, 마약 : F_1,14 = 7.140, p0.022 미만). 흥미롭게도 식염수 처리 된 동물의 NAc에서 ΔFosB mRNA의 양은이 전사 인자가 OFC에서 과발현 된 동물에서 더 낮았습니다 (약물 : F_1,14 = 9.362, p<0.011). 그러나 약물 × 수술 상호 작용의 부재는 만성 코카인 치료가 AAV-GFP 및 AAV-ΔFosB 치료 그룹 모두에서 동일한 효과를 나타내며 비례 적으로 ΔFosB 수준을 비슷한 수준으로 상승 시켰음을 나타냅니다 (약물 × 수술 : F_{1, 14} = 0.302, ns).

  

Fig. 2

OFC에서 GFP 또는 ΔFosB를 과발현하는 동물의 NAc 내 mRNA 변화 및 식염수 또는 코카인으로 만성적으로 치료. 데이터는 대조 수치의 비율로서 표현의 선형 배 변화를 나타냅니다. 표시된 데이터는 (더…)

3.2. 아크 / CREB / PSD95

마지막 약물 노출 후 Arc (활동 관련 세포 골격 관련 단백질) 발현 24 h가 증가한 증거가 없었으며 NAC에서 Arc mRNA의 OFC 변화 수준에서 ΔFosB를 증가 시키지도 않았다2C, 마약 : F_1.14 = 1.416, ns; 외과: F_1,14 = 1.304, ns). 유사하게, CREB (cAMP 반응 요소 결합 단백질) 발현에서 어떠한 변화도 관찰되지 않았다 (2D, 마약 : F_1,14 = 0.004, ns; 외과: F_1,14 = 0.053, ns). 그러나 코카인의 만성 투여는 PSD95 (95 kD의 postsynaptic density protein)에 대한 mRNA 수준을 유의하게 증가시켰다 (2E, 마약 : F_1,14 = 11.275, p <0.006), 그러나이 증가는 AAV-GFP 및 AAV-ΔFosB 그룹 모두에서 유사했습니다 (수술 : F_{1, 14} = 0.680, ns; 약물 × 수술 : F_1,14 = 0.094, ns).