약물 경험은 epigenetically RN (lateral nucleus accumbens)에서 Fosb 유전자 inducibility를 주성분으로한다 (2012)

추상

개요

약물 중독은 심각한 부작용에도 불구하고 강박적으로 약물을 찾고 복용하는 것이 특징입니다(Kalivas 외, 2005; 하이 먼 (Hyman) 등, 2006). 만성 약물 노출은 복부 선조체(또는 측좌핵; NAc) 및 등쪽 선조체(또는 미상 조가비; CPu), 약물 보상 및 중독에 연루된 선조체 구조에서 유전자 발현의 지속적인 변화를 일으킵니다. (프리먼 (Freeman) 등, 2001; 로빈슨과 콜브, 2004; 샤넘과 희망, 2005; 메이즈와 네슬러, 2011). Immediate-Early 유전자에 의해 코딩되는 절단되고 안정한 단백질인 ΔFosB, 포스브, 거의 모든 남용 약물에 대한 만성 노출에 의해 NAc 및 CPu에서 유도되는 잘 특성화 된 전사 인자이며 반복 약물 투여에 대한 민감한 행동 반응을 중재합니다. (네슬러, 2008). 그러나 남용 약물에 대한 이전의 만성 노출이 이후의 ΔFosB 유도를 변경하는지 여부는 아직 알려지지 않았습니다.

우리는 최근에 만성 약물 노출에 대한 반응으로 염색질 변형이 표적 뇌 영역에서 특정 유전자의 유도성을 변화시킬 수 있다는 가설을 세웠습니다.로비슨 앤 네슬러, 2011). 증가하는 증거는 만성 투여 후 약물 남용이 인산화, 아세틸화 및 히스톤 꼬리의 메틸화를 비롯한 다양한 유형의 변형을 통해 염색질의 구조 및 전사 접근성을 변경한다는 것을 보여줍니다. 세포 배양 시스템에서의 보다 최근의 작업은 RNA 폴리머라제 II(Pol II)가 발현되기 전에 "유도성" 유전자의 프로모터에 모집하는 데 초점을 맞추고 있으며, Pol II는 근위 프로모터 영역과 전사 시작 사이트(TSS) 주변에 지속적으로 결합합니다. ) "정지" 상태(코어와 리스, 2008; 네차예프와 아델만, 2008). 정지된 Pol II의 활성화는 프로모터와 TSS 영역으로부터의 탈출과 이러한 "프라이밍된" 유전자의 전사에 책임이 있는 것으로 생각됩니다.자이틀링거 등, 2007; 사하 외, 2011; 바타이유 외, 2012).

여기에서 우리는 이전에 코카인에 만성적으로 노출된 후 금단 기간이 연장되면 포스브 NAc는 유도를 위해 준비되는 반면 CPu는 그렇지 않은 후속 코카인 투여에 대한 유전자. 그런 다음 포스브 NAc 및 CPu의 유전자 프로모터는 이러한 비정상적인 유도성과 관련이 있습니다. 포스브 정지된 Pol II 모집을 포함한 유전자 포스브 NAc의 근위 프로모터뿐만 아니라 두 뇌 영역의 여러 활성화 또는 억제 히스톤 변형의 변화. 이러한 결과는 염색질 역학에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다. 포스브 유전자 촉진제 및 Pol II 프라임의 실속 메커니즘을 처음으로 나타냅니다. 포스브 코카인에 다시 노출될 때 NAc에서 더 큰 활성화를 위해.

재료 및 방법

결과

그레이터 코카인 경험 쥐의 NAc에서 Fosb 유도성(CPu는 아님)

코카인의 이전 만성 과정과 장기간의 금단 기간이 코카인의 유도성에 미치는 영향을 조사하기 위해 포스브 후속 코카인 공격에 대한 반응으로 유전자를 분석하기 위해 이전에 식염수 또는 코카인(15mg/kg)을 10일 동안 하루에 두 번 ip 주사한 쥐에게 중단 28일 후에 약물의 도전 용량을 투여했습니다.Fig 1A). 우리는 먼저 약물 투여의 예상되는 지속적인 결과인 이전 코카인 노출에 의한 운동 감작의 유도를 확인하기 위해 한 그룹의 동물에서 운동 반응을 측정했습니다. 코카인 경험이 있는 쥐와 순진한 쥐는 동등한 기본 운동 활동을 보였으며, 약물을 복용하지 않은 동물에게 코카인을 투여하면 운동이 증가했습니다.무화과 1B. 반복 측정 양방향 ANOVA, 처리: F_1,66 =30.42, p<0.0001; 코카인 챌린지: F_2,66=58.39, p<0.0001; 치료 x 코카인 챌린지: F_2,66=8.56, p=0.0005, Bonferroni 사후 테스트 ^{^}p<0.001). 이 코카인 챌린지는 코카인 경험이 있는 쥐(Bonferroni post-tests *p<0.001)에서 현저하게 더 큰 운동 활동, 즉 감작을 유도했습니다.

  

그림 1

이전의 만성 코카인 노출이 운동 활동에 미치는 영향 및 포스브 약물에 재노출 시 NAc 및 CPu 유도

NAc 및 CPu에서 ΔFosB 발현에 대한 이 코카인 전처리 요법의 효과를 평가하기 위해 코카인 경험이 없고 코카인 경험이 있는 동물을 매일 24, 0, 1 또는 3회 코카인 챌린지로 처리한 후 면역조직화학적 방법으로 ΔFosB 단백질을 측정했습니다. 주사(6mg/kg; 참조) Fig 1A). 이전에 설정한 대로(Nye 등, 1995), 3회의 코카인 주사는 약물을 투여하지 않은 동물의 NAc 및 CPu에서 ΔFosB 단백질을 유의하게 유도하기에 충분했고 그 축적은 코카인 주사 6일 후에도 유의미하게 유지되었습니다(무화과 1C. 반복 측정 양방향 ANOVA, NAc 코어, 처리: F_1,28=23.5, p<0.0001; 코카인 챌린지: F_3,28=49.16, p<0.0001; 치료 x 코카인 챌린지: F_3,28=6.83, p=0.0014; NAc 쉘, 처리: F_1,28=18.69, p<0.0001; 코카인 챌린지: F_3,28=31.52, p<0.0001; 치료 x 코카인 챌린지: F_3,28=3.21, p<0.05; CPu, 치료: F_1,28=9.47, p<0.001; 코카인 챌린지: F_3,28=19.74, p<0.0001; 치료 x 코카인 챌린지: F_3,28=0.94, p>0.05. NAc 코어, 셸 및 CPu에서 Bonferroni 사후 테스트 ^{^}p<0.05). 코카인을 경험한 동물에서, 중단 28일 후에 NAc 또는 CPu에서 ΔFosB 유도가 지속된다는 증거는 없었으며, 이는 ΔFosB 신호가 이 시점까지 완전히 소멸된다는 이전 보고와 일치합니다.Nye 등, 1995), 이 시점이 본 연구에서 사용된 이유. 그러나 놀랍게도 3~6회 코카인 주사를 맞은 코카인 경험이 있는 쥐는 NAc에서 현저하게 더 큰 ΔFosB 단백질 유도를 보였고, 이러한 효과는 코어 및 쉘 하위 영역 모두에서 명백했습니다.무화과 1C. Bonferroni 사후 테스트 *p<0.05). 대조적으로, ΔFosB 단백질의 그러한 더 큰 유도는 CPu에서 관찰되지 않았다; 대신, 코카인 경험이 없고 코카인 경험이 없는 쥐에게 코카인 주사 3일 또는 6일 후에 이 영역에서 동등한 ΔFosB 유도가 나타났습니다.무화과 1C).

코카인 챌린지에 대한 반응으로 NAc 및 CPu에서 발생하는 전사 변경에 대한 통찰력을 얻기 위해 단일 코카인 또는 식염수 주입 시 ΔFosB 및 FosB mRNA 전사 유도성의 시간 경과(45, 90 및 180분)를 연구했습니다. 코카인을 사용하지 않고 경험이 있는 쥐에게 28일의 금단 후(참조 Fig 1A). 식염수 투여에 비해 코카인 투여는 코카인을 섭취하지 않은 동물의 NAc와 CPu 모두에서 세 시점 모두에서 ΔFosB 및 FosB mRNA 수준의 급격한 증가를 유도했습니다.무화과 1D. 반복 측정은 시점당 단방향 ANOVA입니다. Bonferroni 사후 테스트 ^{^}p<0.05). NAc에서 우리는 코카인 챌린지 후 코카인 경험이 없는 동물에 비해 코카인 경험이 있는 동물에서 더 큰 ΔFosB 및 FosB mRNA 유도를 관찰했습니다. 코카인 경험이 있는 동물에서 감소(무화과 1D. Bonferroni 사후 테스트 ^%p=0.08, *p<0.05).

코카인 경험 쥐의 NAc 및 CPu에서 상류 신호 전달 경로의 특성

의 변경된 유도성에 대한 한 가지 가능한 설명 포스브 코카인의 이전 만성 경과 후 NAc 및 CPu의 유전자는 코카인 노출의 원격 이력이 상류 신호 경로의 지속적인 변화를 유발할 수 있다는 것입니다. 포스브 코카인 챌린지가 유전자를 비정상적인 정도로 유도하는 유전자 유도. 이 가설을 연구하기 위해 우리는 최근 이러한 뇌 영역에서 ΔFosB의 코카인 유도에 필요한 것으로 밝혀진 두 가지 전사 인자인 SRF와 CREB를 분석했습니다.Vialou 등, 2012) 업스트림 단백질 키나제인 ERK 및 AKT와 함께 코카인 작용과 관련이 있습니다.Valjent 등, 2000; Lu 등, 2006; Boudreau 등, 2009). 우리는 변화된 유도성을 설명할 수 있는 이러한 다양한 단백질의 전체 또는 인산화 수준의 변화를 감지하지 못했습니다. 포스브 SRF, CREB 또는 AKT의 변화 없음을 포함하여 관찰됨(그림 2B, C). 코카인에 대한 반응으로 NAc에서 pSRF와 pCREB의 변화가 없는 것은 만성 코카인에 의해서만 유의하게 유도된다는 최근 보고서와 일치합니다.Vialou 등, 2012).

  

그림 2

NAc 및 CPu의 상류 분자 신호 캐스케이드에 대한 이전 만성 코카인 노출의 영향

약물 무경험 동물의 NAc 및 CPu에서, 초기 약물 노출 후 20분(Fig 2A), 단일 코카인 챌린지는 pERK42/44 수준을 감소시켰습니다(그림 2B, C. 양측 스튜던트 t-테스트: *p<0.05). 급성 코카인 투여 후 이들 지역에서 pERK 수치가 증가했다는 이전 보고가 있습니다.Valjent 등, 2000). 이것은 반복적인 코카인 주사를 중단하는 동안 NAc에서 ERK 인산화를 조사하는 다른 논문과 비교하기 어렵습니다.Boudreau 등, 2007; Shen 등, 2009), 우리 연구에서 pERK는 철수 28일 후와 코카인 또는 식염수 챌린지 후에 정량화되었습니다. 처음으로 코카인을 경험한 약물에 노출되지 않은 동물에 비해, 코카인을 경험한 쥐의 코카인 재노출은 중단 28일 후 CPu의 pERK42/44 수준이 크게 증가했습니다.그림 2B, C. 양측 스튜던트 t-테스트: *p<0.05).

염색질 풍경 코카인 경험 쥐의 NAc 및 CPu에서 Fosb 유전자 프로모터

다음으로 변경 여부를 조사했습니다. 포스브 유전자 유도성은 염색질 구조의 변경과 관련이 있습니다. 유전자 활성화와 관련된 히스톤 H4(H3K3me4)의 Lys3의 트리메틸화, 및 유전자 억제와 관련된 H3K27me3 및 H3K9me2의 세 가지 잘 특성화된 형태의 히스톤 변형에 대한 항체를 사용하여 NAc 및 CPu에서 ChIP를 수행했습니다. 우리는 코카인을 투여하지 않거나 코카인 주사를 투여한 후 28일 후 코카인 경험이 없고 코카인 경험이 없는 쥐를 분석했습니다. 동물은 1시간 후에 검사했습니다.Fig 3A). NAc에서 우리는 이 세 가지 히스톤 변형 중 하나가 포스브 H3K9me2의 수준이 감소하는 경향이 있었지만 코카인 공격이 없는 경우 유전자 프로모터(그림 3B-D. 양측 스튜던트 t-테스트. ^#각각의 약물 나이브 대조군과 비교하여 p=0.2). 이 효과는 코카인 챌린지 후에 중요해졌으며 유전자의 근위 프로모터 영역에 특이적이었습니다.무화과 3C. *p<0.05). 일부 유전자에서는 H3K9me2 수준이 매우 낮지만 포스브 유전자 프로모터는 통제 조건 하에서 NAc에서 상당한 수준의 이 마크를 보여줍니다.Maze 등, 2010, 데이터는 표시되지 않음). 대조적으로 CPu에서는 H3K4me3 결합이 작지만 유의하게 감소하고 H3K27me3 결합이 증가하는 것을 발견했습니다. 포스브 코카인 챌린지가 없는 경우 프로모터, 챌린지 후 효과 손실(무화과 3D. *p<0.05).

  

그림 3

이전의 만성 코카인 노출이 후생유전학적 프라이밍에 미치는 영향 포스브 NAc와 CPu의 유전자

다음으로 Pol II 바인딩을 조사했습니다. 포스브 CTD 반복 영역의 Ser 5에서 인산화를 특징으로 하는 TSS에서 Pol II의 지연이 유전자의 프라이밍과 관련되어 있다는 세포 배양에서의 최근 연구 결과에 근거한 유전자입니다(서론 참조). 따라서 우리는 Pol II-pSer5 결합을 분석했습니다. 포스브 유전자의 네 가지 별개의 영역(무화과 3B). 이 분석은 Pol II-pSer5가 포스브 대조군과 비교하여 코카인 챌린지가 없는 상태에서 장기간 중단한 후 코카인을 경험한 동물의 NAc에서 근위 프로모터 영역과 TSS 주변의 유전자무화과 3E. *p<0.05). 이 농축은 다음의 두 유전자 본체 영역에서 명백하지 않았습니다 포스브, 더 간단한 실험 시스템에서 설명한 Pol II 실속과 일치합니다. 흥미롭게도, 코카인 챌린지 후에도 Pol II-pSer5 결합은 더 이상 유의미하지는 않지만 여전히 농축의 징후를 보여주었습니다. 포스브 근위 프로모터 영역(무화과 3E. ^%p=0.1), TSS에서 제어 수준으로 돌아갔습니다. CPu의 결과는 Pol II-pSer5 결합의 명확한 패턴이 관찰되지 않아 더 가변적이었습니다.

토론

본 연구는 지속적인 규제에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다. 포스브 코카인에 반복적으로 노출된 지 몇 주 후. 우리는 이전의 만성 코카인 투여가 포스브 유전자가 NAc에서 더 많이 유도되어 약물에 다시 노출되면 ΔFosB가 더 빨리 축적됩니다. NAc에서 ΔFosB 유도가 코카인에 대한 민감한 행동 반응을 매개한다는 증거가 우세하다는 점을 감안할 때(네슬러, 2008), 우리의 연구 결과는 장기간의 철수 후 그러한 민감한 반응을 보다 빠르게 회복시키는 새로운 메커니즘을 보여줍니다.

우리는 NAc에서 ΔFosB의 향상된 유도가 포스브 더 큰 유도를 위해 프라이밍할 것으로 예상되는 유전자. 따라서, 우리는 이전의 만성 코카인 투여로부터 4주간의 중단 후에 존재하는 유전자의 근위 프로모터 및 TSS 영역에 대한 증가된 Pol II 결합을 보여준다. TSS에서의 이러한 Pol II 농축은 코카인 챌린지 시 빠르게 손실되며 포스브 Pol II를 정지시킨 세포 배양 모델과 일치하는 유도는 유전자 활성화 시 TSS에서 방출됩니다(소개 참조). 코카인 챌린지는 또한 유전자 억제 표시인 H3K9me2와 포스브 발기인. 대조적으로, 우리는 매개하는 것으로 알려진 여러 전사 인자 또는 그들의 업스트림 키나아제의 지속적인 유도를 감지하지 못했습니다. 포스브 코카인에 의한 유도. 이러한 결과는 NAc에서 ΔFosB의 강화된 유도가 포스브 업스트림 이벤트의 상향 조절을 통하지 않는 유전자.

CPu에 대해 매우 다른 결과가 얻어졌습니다. Pol II가 지연되었다는 증거는 없었습니다. 포스브 코카인 챌린지 전에 코카인 경험 쥐에서 유전자 억제와 일치하는 작지만 중요한 히스톤 변형이 있었지만 H3K27me3 결합 증가 및 H3K4me3 결합 감소. 감소와 일치하는 업스트림 전사 인자 또는 키나아제의 변화도 없었습니다. 포스브 유도. 이러한 결과는 만성 코카인 투여 후 후생적 변형이 포스브 NAc에서 보이는 프라이밍과 대조적으로 CPu의 유전자 유도성. 그러나 이러한 효과는 코카인에 다시 노출될 때 ΔFosB mRNA 유도를 억제하지만 ΔFosB 단백질 축적에는 손실이 없습니다. 이 역설의 기본 메커니즘은 이제 추가 조사가 필요합니다.

보다 일반적으로, 우리의 결과는 만성 코카인 투여에 대한 반응으로 특정 유전자에서 염색질 환경의 변경이 약물에 다시 노출될 때 후속 유도를 위해 해당 유전자를 프라이밍하거나 둔화시키는 역할을 하는 모델을 지원합니다. "후생유전학적 흉터"로 볼 수 있는 이러한 염색질 변화는 유전자의 정상 상태 mRNA 수준 분석에서 놓칠 수 있습니다. 이러한 방식으로 중독의 후성유전체의 특성화는 새로운 치료법 개발을 위해 채굴할 수 있는 장애의 분자 병인에 대한 새로운 정보를 밝힐 것을 약속합니다.

감사의 글

참고자료