opioid와 cannabinoid receptor-mediated signaling에 대한 ΔFosB 과발현이 중추 신경계 (2011)에 미치는 영향

신경 약리학. 2011 Dec;61(8):1470-6. doi: 10.1016/j.neuropharm.2011.08.046.

심 셀리 LJ, 캐시디 MP, 스파르타 A, 자카리 우 V, 네슬러 EJ, 셀리 DE.

출처

버지니아 커먼 웰스 대학교 의과 대학 약리학 및 독성 연구 연구소, 미국 버지니아 리치몬드 리치몬드

추상

안정한 전사 인자 ΔFosB는 여러 가지 약물 남용에 만성적으로 노출 됨으로써 핵 축적 (NAc)에서 유도되며, 선조체에서 ΔFosB의 유전자 도입 발현은 모르핀과 코카인의 보전 특성을 향상시킵니다이자형. 그러나 이러한 관찰의 메커니즘 적 근거는 불완전하게 이해됩니다. 우리는 ΔFosB의 유도 식으로 bitransgenic 마우스 모델을 사용 도파민 NAc에서 오피오이드 및 카나비노이드 수용체 신호 전달에 대한 ΔFosB 발현의 효과를 결정하기위한 D (1) 수용체 / 디노 르핀-함유 선조 뉴런. 결과는 뮤 오피오이드-매개 G- 단백질 활성 및 아데 닐릴 시클 라제의 억제가 ΔFosB를 발현하는 마우스의 NAc에서 향상되었음을 보여 주었다. 유사하게, 아데 닐릴 시클 라제의 카파 오피오이드 억제는 ΔFosB 발현 마우스에서 강화되었다. 대조적으로, 칸 나비 노이드 수용체-매개 신호 전달은 ΔFosB를 과발현하는 마우스와 대조군 마우스간에 차이가 없었다. These 연구 결과 opioid 및 cannabinoid 수용 체 신호 ΔFosB의 식에 의해 차등 적으로 변조 하 고 ΔFosB 식 NAc에서 향상 된 mu 및 kappa opioid 수용 체 신호를 통해 그 효과 중 일부를 생성 할 수 있습니다 나타냅니다.

키워드 : G- 단백질, 아데 닐릴 시클 라제, 선조
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1. 소개

오피오이드 수용체 및 칸 나비 노이드 CB1 수용체 (CB)1R)은 모르핀, 헤로인 및 처방약 오피오이드 및 마리화나 (Δ)를 포함하여 널리 사용되는 2 가지 약물 종류에 대한 신경 생물학적 목표입니다.9-테트라 하이드로 칸 나비 놀 (THC)). 오피오이드 및 카나비노이드의 급성 효과는 주로 G를 활성화시키는 G- 단백질-커플 링 된 수용체에 의해 매개된다내가 / O를 단백질 및 아데 닐릴 시클 라제 억제와 같은 다운 스트림 이펙터 반응을 생성 함 (차일드, 1991, Childers 등 1992, Howlett 등, 2002). Δ의 운동, 기억 장애 및 정신 활동 효과9-THC는 CB에서 생산1R (Huestis 등 2001, 짐머 등 1999), 뇌에 널리 분포되어 있으며, 기저핵, 해마 및 소뇌에 높은 수준 (Herkenham 등, 1991). 대부분 임상 적으로 관련되고 남용 된 오피오이드 약물의 진통제 및 보람 효과는 주로 mu opioid receptors (MOR)에 의해 매개됩니다 (Matthes 등 1996), 변연계 및 뇌간이 풍부합니다 (만수르 등 1994). 복부 Tegmental Area (VTA)에서 Nucumus accumbens (NAc)까지 도파민 성 돌기로 구성된 mesolimbic system은 오피오이드와 칸 나비 노이드의 보상 효과에 중요한 역할을합니다.Bozarth와 현명한, 1984, Vaccarino 등, 1985, Zangen 등 2006) 및 기타 남용 약물 (Koob 및 Volkow, 2010). 또한 내인성 오피오이드 및 카나비노이드 시스템은 여러 종류의 정신 활성 약물의 보람 효과에 관여합니다 (말도 나도 등 2006, Trigo 등 2010). 따라서 오피오이드와 CB가 작용하는 메커니즘을 설명하는 것이 중요합니다1R 신호는 NAc에서 조절된다.

약물 남용 분야에서 중심적인 질문은 정신 활성 약물의 급성에서 장기 효과로의 전이를 매개하는 단백질을 확인하는 것이었다. AP-1 전사 인자 ΔFosB는 특히이 물질의 안정적인 절단 된 스플 라이스 변이체이기 때문에 흥미 롭습니다. fosb 약물 남용이나 자연적인 보상에 반복적으로 노출 될 때 축적되는 유전자 (McClung 등, 2004, 네슬러, 2008, Nestler 등 1999). 우리는 ΔFosB가 모르핀, Δ에 반복적으로 노출 된 후 뇌에서 유도됨을 발견했습니다9-THC, 코카인 또는 에탄올, 각 약물은 ΔFosB 발현의 독특한 국소 패턴 (Perrotti 등 2008). 약물에 대한 일관된 발견은 ΔFosB가 선조체에서 고도로 유도되었으며, 여기서 4 가지 약물 모두 NAc 코어에서 ΔFosB를 유발하고 Δ를 제외한 모두9-THC는 NAc 껍질 및 꼬리-푸 타멘에서 발현을 유의하게 유도 하였다.

약리학 연구에 따르면 도파민 D의 공동 투여는1 수용체 (D1R) 길항제 SCH 23390는 간헐적 코카인 또는 모르핀 투여 후 NAc 및 caudate-putamen에서 ΔFosB 유도를 차단하여 D의 잠재적 중요성을 시사1R- 발현 뉴런 (뮬러와 언터 발트, 2005, Nye 등 1995). 약물-매개 행동에 대한 ΔFosB 유도의 효과는 NAc 및 등쪽 선조체의 특정 뉴런 집단에서 ΔFosB를 발현하는 이중 형질 전환 마우스를 사용하여 조사되었다 (첸 등 1998). 다이 노르 핀 / D에서 ΔFosB를 발현하는 마우스1NAc 및 등쪽 선조 (선 11A)의 R 양성 뉴런은 남용 약물에 대한 변경된 반응, 특히 코카인 또는 모르핀의 보람 효과에 대한 민감성 향상을 보여줍니다.Colby 등 2003, Kelz 등, 1999, Zachariou 등 2006). 이러한 변경은 MOR 또는 다양한 G- 단백질 서브 유닛의 수준에 변화가없는 경우에 발생 하였다. 그러나, 다이 노르 핀 mRNA 수준은 ΔFosB 발현 마우스의 NAc에서 감소 하였다 (Zachariou 등 2006), ΔFosB의 하나의 표적이 내인성 오피오이드 펩티드를 암호화하는 유전자임을 시사한다. ΔFosB 유도는 NAc에서 수용체 신호 전달을 조절함으로써 행동 변화를 생성 할 수 있지만, 이러한 가능성은 조사되지 않았다. 따라서, 본 연구는 이중 형질 전환 마우스 모델을 사용하여 dynorphin / D에서 ΔFosB의 과발현 여부를 결정 하였다1선조 뉴런을 함유하는 R은 NAc에서 MOR- 매개 G- 단백질 활성 및 MOR- 및 KOR- 매개 아데 닐릴 시클 라제 억제를 변경시킨다. CB에 대한 ΔFosB의 효과1R- 매개 G- 단백질 활성도 Δ9-THC 투여는 NAc에서 ΔFosB를 유도한다 (Perrotti 등 2008) 및 엔도 카나비노이드 시스템은 뇌 보상 회로를 조절하는 것으로 알려져 있습니다 (가드너, 2005, 말도 나도 등 2006), 엔도 카나비노이드 시스템에 대한 ΔFosB의 효과는 조사되지 않았다.

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2. 재료 및 방법

2.1. 시약

[35S] GTPγS (1250 Ci / mmol), [α-32P] ATP (800 Ci / mmol) 및 [3H] cAMP (26.4 Ci / mmol)는 PerkinElmer (Shelton, CT)로부터 구입 하였다. ATP, GTP, GDP, cAMP, 소 혈청 알부민, 크레아틴 포스 포 키나제, 파파 베린, 이미 다졸 및 WIN-55212-2는 Sigma Aldrich (미국 미주리 주 세인트 루이스)에서 구입 하였다. GTPγS는 Roche Diagnostic Corporation (Chicago, IL)에서 구입 하였다. DAMGO는 미국 약물 남용 연구소 (Rockville, MD)의 약물 공급 프로그램에 의해 제공되었습니다. Econo-1 섬광 유체는 Fisher Scientific (Norcross, GA)으로부터 입수 하였다. 이코 라이트 섬광 유체는 ICN (Costa Mesa, CA)으로부터 얻었다. 다른 모든 화학 물질은 Sigma Aldrich 또는 Fisher Scientific에서 구입했습니다.

2.2. 쥐

NSE-tTA (라인 A) × TetOp-ΔFosB (라인 11)로부터 유래 된 수컷 이중 형질 전환 마우스를 Kelz et al. (Kelz 등, 1999). 트랜스 유전자 발현을 억제하기 위해 독소시 클린 (식수 중 100 ㎍)에서 이중 형질 전환 마우스를 고안하고 성장시켰다. 8 주령에, 독소시 클린은 생쥐의 절반 동안 물에서 생략되어 트랜스 진 발현이 가능하고, 나머지 생쥐는 독시사이클린에서 유지되어 트랜스 진이 억제되었다. 8 주 후에 뇌를 수집하여 ΔFosB의 전사 효과가 최대 인 시간 (McClung과 Nestler, 2003). c-Jun의 주요 음성 길항제 인 Δc-Jun이 D로 표현되는 제 2 트랜스 제닉 마우스 라인을 사용 하였다.1R / 디노 르핀 및 D2선조체, 해마 및 정수리 피질의 R / 엔케팔린 세포 (Peakman 등 2003). C-Jun 및 관련 Jun 패밀리 단백질은 Fos 패밀리 단백질과 이량 체화되고 전사를 조절하기 위해 표적 유전자의 AP-1 부위에 결합한다. 그러나, c-Jun (Δc-Jun)의 N- 말단의 절단은 복합체가 전사적으로 불활성이되고 활성 AP-1 복합체의 DNA 결합을 방해 할 수있게한다. NSE-tTA (라인 A) × TetOp-FLAG-Δc-Jun (라인 E)에서 유래 된 수컷 이중 형질 전환 마우스를 Peakman et al. (Peakman 등 2003). 트랜스 유전자 발현을 억제하기 위해 독소시 클린 (식수 중 100 ㎍)에서 이중 형질 전환 마우스를 고안하고 성장시켰다. 강아지는 3 주에 이유가되고, 유전자형이되고, 그룹으로 분리되었으며, 절반은 독시사이클린-함유 수에서 유지되고 절반은 정규 식수에서 유지되어 FLAG-Δc-Jun 발현을 유도 하였다. 6 주 후 뇌를 수집하여 FLAG-Δc-Jun의 최대 수준을 측정 한 시간 (Peakman 등 2003). 모든 동물 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 국립 보건원 (National Institutes of Health) 가이드에 따라 수행되었습니다.

2.3. 막 준비

분석 일까지 뇌를 -80 ℃에 보관 하였다. 분석하기 전에, 각각의 뇌를 해동시키고, NAc를 얼음에서 해부시켰다. 각각의 샘플은 50 mM Tris-HCl, 3 mM MgCl에서 균질화되었다2, 1 mM EGTA, 7.4 ℃에서 유리 균질화 기로부터 20 스트로크를 갖는 pH 4 (막 완충액). 균질 물을 48,000 ×에서 원심 분리 하였다 g 4 ° C에서 10 분 동안, 막 완충액에 재현 탁시키고, 48,000에서 다시 원심 분리 함 × g 4 ° C에서 10 분 동안 그리고 50 mM Tris-HCl, 3 mM MgCl에 재현 탁됨2, 0.2 mM EGTA, 100 mM NaCl, pH 7.4 (검정 완충액). 단백질 수준은 Bradford (브래드 포드, 1976) 표준으로 소 혈청 알부민 (BSA)을 사용함.

2.4. 작용제 자극 [35S] GTPγS 결합

분석 완충액에서 막을 아데노신 데 아미나 제 (10 mU / ml)와 함께 30 ℃에서 3 분 동안 사전 배양 하였다. 이어서 막 (5-10 ㎍ 단백질)을 2 % (w / v) BSA, 30 nM [0.1 % (w / v)]을 함유하는 분석 완충액에서 0.1 ° C에서 XNUMX 시간 동안 배양 하였다 [35적절한 농도의 DAMGO 또는 WIN30-3가 있거나없는 S] GTPγS, 55,212 μM GDP 및 아데노신 데 아미나 제 (2 mU / ml). 비특이적 결합을 20 μM GTPγS로 측정 하였다. 배양은 GF / B 유리 섬유 필터를 통한 여과에 의해 종결되고,이어서 3 ml 빙냉 3 mM Tris-HCl, pH 50로 7.4 세척된다. Econo-1 섬광 유체에서 필터를 밤새 추출한 후 액체 섬광 분광 광도법에 의해 결합 방사능을 측정 하였다.

2.5. 아데 닐릴 시클 라제 분석

막 (5-25 ㎍ 단백질)을 상기 기재된 바와 같이 아데노신 데 아미나 제와 함께 예비 배양 한 후, XAMX 포스 콜린의 존재 또는 부재하에 15μM에서 스 콜린의 존재 또는 부재하에 30 분 동안 1 분 동안 항온 처리 하였다 (DAMGO, U50,488H 또는 WIN55,212-2 포함, 또는 완충 완충액 함유) 50 µM ​​ATP, [α-32P] ATP (1.5 µCi), 0.2 mM DTT, 0.1 % (w / v) BSA, 50 µM ​​사이 클릭 AMP, 50 µM ​​GTP, 0.2 mM papaverine, 5 mM phosphocreatine, 20 단위 / ml creatine phosphokinase 및 adenXine deaminase 3 µl의 최종 부피에서 / ml). 이러한 조건에서 총 [α-32회수 된 P] cAMP는 일반적으로 첨가 된 [α-의 총량의 1 % 미만이었다32각 샘플에서 P] ATP. 3 분 동안 비등하여 반응을 종결시키고 [32P] 사이 클릭 AMP는 Salomon의 이중 컬럼 (Dowex 및 알루미나) 방법으로 분리되었습니다.살로몬, 1979). [3H] cAMP (10,000 dpm)를 내부 표준으로서 컬럼 크로마토 그래피 전에 각 튜브에 첨가 하였다. 액체 섬광 분광 광도계 (45 % 효율)에 의해 방사능을 측정 하였다 3H) 4.5 ml의 용출액을 14.5 ml의 Ecolite 섬광 유체에 용해시켰다.

2.6. 데이터 분석

달리 지시되지 않는 한, 데이터는 4-8 개별 실험의 평균값 ± SE로보고되며, 각각은 3 회 수행되었다. 그물 자극 [35S] GTPγS 결합은 작용제-자극 결합-기초 결합으로 계산된다. 순 포스 콜린-자극 아데 닐릴 시클 라제 활성은 포스 콜린-자극 활성-기본 활성 (pmol / mg / min)으로 정의된다. 포스 콜린-자극 된 아데 닐릴 시클 라제 활성의 억제 백분율은 (작용제 부재 하에서의 순 포스 콜린-자극 활성 – 작용제 부재 하에서 작용제 / 넷 포스 콜린-자극 활성의 존재 하에서 넷 포스 콜린-자극 활성) × 100로 정의된다. 모든 곡선 맞춤 및 통계 분석은 Prism 4.0c (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA)를 사용하여 수행되었다. EC를 얻기 위해 반복적 인 비선형 회귀에 의해 농도-효과 곡선을 분석 하였다50 및 E최대 가치. 농도-효과 데이터의 통계적 유의성은 작용제 용량 및 유전자 유도 (온 또는 오프)를 주요 인자로 사용하여 양방향 분산 (ANOVA) 분석에 의해 결정되었다. 곡선 맞춤 값의 통계적 유의성 (E최대 또는 EC50)는 EC에서 불균등 분산 (F- 검정으로 감지)을 수정하는 데 필요한 경우 Welch의 수정 또는 데이터의 제곱근 변환을 사용하여 쌍이없는 양측 스튜던트 t- 검정에 의해 결정되었습니다.50 values.

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3. 결과

3.1. 오피오이드 및 칸 나비 노이드 수용체-매개 G- 단백질 활성화에 대한 ΔFosB 발현의 효과

MOR 또는 CB 여부를 확인하려면1R- 매개 G- 단백질 활성화는 작용제-자극 된 NAc에서 ΔFosB의 유도 성 트랜스 제닉 발현에 의해 변경되었다 [35S] GTPγS 결합은 ΔFosB 전이 유전자를 조건 적으로 발현 (ΔFosB on) 또는 발현하지 않는 (ΔFosB off)이 트랜스 제닉 마우스 영역으로부터 제조 된 분리 된 막에서 검사 하였다. MOR- 선택적 엔케팔린 유사체 DAMGO를 사용하여 MOR을 활성화시키고 카나비노이드 아미노 알킬 인돌 WIN55,212-2를 사용하여 CB를 활성화시켰다1R. 이들 리간드는 이전에 MOR 및 CB에서 완전한 작용제 인 것으로 나타났다1각각 RBreivogel 등, 1998, Selley 등 1997). 설치류 뇌에서 신호가 너무 낮기 때문에 KOR- 매개 G- 단백질 활성을 검사하는 것은 실현 가능하지 않았다 (Childers 등 1998). 결과는 생쥐에서 ΔFosB off 및 ΔFosB로부터 NAc에서 DAMGO 및 WIN55,122-2 둘 다에 의한 G- 단백질 활성의 농도 의존적 ​​자극을 보여 주었다그림 1). DAMGO 자극 활동 (그림 1A), 농도-효과 데이터의 양방향 ANOVA는 ΔFosB 상태 (p <0.0001, F = 22.12, df = 1) 및 DAMGO 농도 ​​(p <0.0001, F = 29.65, df = 5)의 유의 한 주 효과를 나타 냈습니다. 유의 한 상호 작용 (p = 0.857, F = 0.387, df = 5). 농도-효과 곡선의 비선형 회귀 분석은 훨씬 더 큰 DAMGO E를 나타 냈습니다.최대 마우스의 ΔFosB 값 (E최대 ΔFosB 오프 마우스에 대한 = 73 ± 5.2 % 자극 (E)최대 = 56 ± 4.1 % 자극; 스튜던트 t- 테스트에 의해 마우스의 ΔFosB와 다른 p <0.05). DAMGO EC50 값은 ΔFosB on 및 ΔFosB off 마우스간에 상이하지 않았다 (각각 302 ± 72 nM 대 212 ± 56 nM, p = 0.346).

그림 1 

작용제-자극에 대한 ΔFosB 발현의 효과 [35NAc에서의 S] GTPγS 결합. ΔFosB- 발현 (ΔFosB on) 또는 대조군 (ΔFosB off) 마우스로부터의 막을 다양한 농도를 사용하는 방법에 기재된 바와 같이 분석 하였다 ...

MOR 작용제 DAMGO로 얻은 결과와 대조적으로, 칸 나비 노이드 작용제 WIN55,212-2 (GX- 단백질 활성화에서 ΔFosB 상태-의존적 차이는 관찰되지 않았다 (그림 1B). WIN55,212-2 농도-효과 데이터의 양방향 ANOVA는 WIN55,212-2 농도 (p <0.0001, F = 112.4, df = 7)의 중요한 주 효과를 나타내지 만 ΔFosB 상태 (p = 0.172)는 아닙니다. , F = 1.90, df = 1) 상호 작용이 없었고 (p = 0.930, F = 0.346, df = 7). 마찬가지로, WIN55,212-2 E에 대한 ΔFosB 상태의 영향이 없었습니다.최대 값 (103 ± 6 % 대 108 ± 8 % 자극 ΔFosB on 및 off 마우스에서 각각, p = 학생의 t- 검정에 의해 0.813) 또는 EC50 값 (각각 ΔFosB on 및 off 마우스에서 103 ± 20 nM 대 170 ± 23 nM, p = 0.123).

곡선의 모양과 이전 연구에서 뇌의 2 상 WIN55,212-2 농도-효과 곡선을 보여준 사실을 바탕으로Breivogel 등, 1999, Breivogel 등, 1998)에서, WIN55,212-2 곡선은 또한 2- 사이트 모델을 사용하여 분석되었다. 평균 데이터를 분석 한 결과 2- 사이트 모델 (R)을 사용하여 적합도가 약간 향상되었습니다.2 단일 사이트 모델 (R)과 비교 한 = 0.933 및 0.914, 제곱의 합 = 각각 ΔFosB on 및 off 마우스의 3644 및 54632 = 0.891 및 0.879, 제곱의 합 = ΔFosB on 및 off 마우스에서 각각 6561 및 6628). 그러나, E에서 어느 하나의 마우스에서 ΔFosB 온 및 오프 마우스간에 유의 한 차이가 발견되지 않았다.최대 또는 EC50 높거나 낮은 역가의 값 (보조 표 1), 더 낮은 EC를 향한 추세가 있었음50 ΔFosB가 활성화 된 마우스에서 고 효능 부위에서의 가치50높은 = 28.0 ± 10.6 nM)과 ΔFosB가 꺼져있는 것과 비교 (EC50높은 = 71.5 ± 20.2 nM; p = 0.094). 또한, ΔFosB 상태가 기저에 미치는 영향은 없었다 [35NAc 막에서의 S] GTPγS 결합 (각각, ΔFosB 온 및 오프 마우스에서 253 ± 14 대 226 ± 14 fmol / mg, p = 0.188). 이러한 데이터는 마우스의 NAc에서 ΔFosB의 유도 성 형질 전환 발현이 CB에 유의하게 영향을 미치지 않으면 서 MOR- 매개 G- 단백질 활성화를 증가 시켰음을 나타낸다1R- 매개 또는 기본 G- 단백질 활성.

3.2. 아데 닐릴 사이 클라 제의 오피오이드 및 칸 나비 노이드 수용체 매개 억제에 대한 ΔFosB의 효과

MOR 및 CB에 의한 다운 스트림 이펙터 활성의 조절에 대한 ΔFosB의 유도 성 트랜스 제닉 발현의 효과를 평가하기 위해1R, NSK 막에서 스 콜린-자극 된 아데 닐릴 시클 라제 활성에 대한 1 μM의 억제를 조사 하였다. MOR- 및 CB 외에1아데 닐릴 시클 라제 활성의 R- 매개 억제, KOR 활성의 효과는 또한 KOR- 선택적 완전 효능 제 U50,488 (Zhu 등 1997), 이전 결과는 다이 노르 핀 mRNA가 이중 형질 전환 모델에서 ΔFosB의 표적임을 보여 주었기 때문에 (Zachariou 등 2006). 결과는 DAMGO, U50,488 및 WIN55,212-2가 각각 마우스의 ΔFosB off 및 ΔFosB 둘 다에서 아데 닐릴 시클 라제 활성의 농도 의존적 ​​억제를 생성 함을 보여 주었다 (그림 2). DAMGO 농도-효과 데이터의 양방향 분석그림 2A) ΔFosB 상태 (p = 0.0012, F = 11.34, df = 1) 및 DAMGO 농도 ​​(p <0.0001, F = 29.61, df = 6)의 유의 한 주 효과가 나타 났지만 유의 한 상호 작용은 없었습니다 (p = 0.441, F = 0.986). , df = 6). DAMGO 농도-효과 곡선의 비선형 회귀 분석에서 DAMGO EC가 현저히 낮음50 마우스의 ΔFosB 값 (101 ± 11 nM)과 비교 한 마우스의 ΔFosB 값 (510 ± 182 nM, 학생 t- 테스트에 의해 p <0.05). 그러나 DAMGO E에는 큰 차이가 없었습니다.최대 값 (20.9 ± 1.26 % 대 19.8 ± 1.27 % 억제, ΔFosB on 및 off 마우스 각각, p = 0.534).

그림 2 

NAc에서 아데 닐릴 시클 라제 활성의 억제에 대한 ΔFosB 발현의 효과. ΔFosB- 발현 (ΔFosB on) 또는 대조군 (ΔFosB off) 마우스로부터의 막을 1 μM의 존재 하의 방법에 기재된 바와 같이 분석 하였다 ...

KOR- 매개 아데 닐릴 시클 라제 억제는 또한 ΔFosB의 유도 성 트랜스 제닉 발현의 함수로서 상이 하였다 (그림 2B). U50,488 농도-효과 데이터의 양방향 ANOVA는 ΔFosB 상태 (p = 0.0006, F = 14.53, df = 1) 및 U50,488 농도 (p <0.0001, F = 26.48, df = 3)의 중요한 주 효과를 보여주었습니다. , 유의 한 상호 작용 없음 (p = 0.833, F = 0.289, df = 3). 농도-효과 곡선의 비선형 회귀 분석 결과 U50,488 E최대 마우스의 ΔFosB 값 (18.3 ± 1.14 % 억제)과 비교 한 마우스의 ΔFosB 값 (12.5 ± 2.03 % 억제, 스튜던트 t- 테스트에 의한 ΔFosB와 p <0.05 다름), U50,488 EC에서 유의 한 차이 없음50 값 (각각 ΔFosB on 및 off 마우스에서 310 ± 172 nM 대 225 ± 48 nM, p = 0.324).

MOR 및 KOR에서 관찰 된 효과와 대조적으로, 칸 나비 노이드 작용제 WIN55212-2에 의한 아데 닐릴 사이 클라 제의 억제에 대한 유도 성 형질 전환 ΔFosB 발현의 유의 한 영향은 없었다 (그림 2C). WIN55,212-2 농도 효과 데이터의 양방향 ANOVA는 약물 농도 (p <0.0001, F = 23.6, df = 2)에 유의 한 영향을 보였지만 ΔFosB 상태 (p = 0.735, F = 0.118, df)에는 영향을 미치지 않았습니다. = 1) 유의 한 상호 작용도 없었습니다 (p = 0.714, F = 0.343, df = 2). 더욱이, 어떠한 작용 제가없는 경우 기저 또는 포스 콜린 자극 아데 닐릴 사이 클라 제 활성에 대한 ΔFosB 상태의 영향은 없었다. 기저 아데 닐릴 사이 클라 제 활성은 마우스에서 ΔFosB에서 491 ± 35 pmol / mg / min이었고, 마우스에서 ΔFosB에서 546 ± 44였다 (스튜던트 t- 테스트에 의해 p = 0.346). 마찬가지로, 1μM 포스 콜린의 존재하에 아데 닐릴 사이 클라 제 활성은 마우스에서 ΔFosB에서 2244 ± 163 pmol / mg / min이었고, 마우스에서 ΔFosB에서 2372 ± 138 pmol / mg / min이었다 (p = 0.555).

3.3. 아데 닐릴 시클 라제의 오피오이드 및 카나비노이드 수용체-매개 억제에 대한 ΔcJun의 효과

ΔFosB의 유도 성 형질 전환 발현은 NOR에서 MOR 및 KOR로부터 아데 닐릴 시클 라 제로의 억제 신호 전달을 향상 시켰기 때문에, ΔFosB- 매개 전사의 지배적 음성 억제제가 오피오이드 수용체 신호 전달을 반대 방식으로 조절할 것인지를 결정하는 것이 흥미로웠다. 이 질문을 해결하기 위해, 조건부로 ΔcJun을 발현하는 이종 이식 마우스의 NAc로부터 제조 된 막에서 DAMGO 및 U50,488에 의한 포스 콜린-자극 된 아데 닐릴 시클 라제 활성의 억제를 조사 하였다. 결과는 MOR 또는 KOR에 의한 아데 닐릴 시클 라제 활성의 억제에 대한 ΔcJun 발현의 유의 한 영향을 나타내지 않았다 (그림 3). DAMGO 농도-효과 곡선의 양방향 ANOVA는 DAMGO 농도 ​​(p <0.0001, F = 20.26, df = 6)의 유의 한 주 효과를 보였지만 ΔcJun 상태 (p = 0.840, F = 0.041, df = 1)는 아닙니다. 유의 한 상호 작용은 없었습니다 (p = 0.982, F = 0.176, df = 6). 마찬가지로 E에는 유의 한 차이가 없었습니다.최대 또는 EC50 ΔcJun이 켜진 마우스 간 값 (E최대 = 23.6 ± 2.6 %; EC50 = 304 ± 43 nM) 또는 Δc 준 꺼짐 (E최대 = 26.1 ± 2.5 %, p = 0.508; EC50 = 611 ± 176 nM, p = 0.129). 유사한 결과가 U50,488에서 나타 났으며, 농도-효과 곡선의 양방향 ANOVA는 농도의 유의 한 효과 (p <0.0001, F = 11.94, df = 6)를 보였지만 ΔcJun 상태 (p = 0.127)는 아닙니다. , F = 2.391, df = 1) 유의 한 상호 작용이 없었으며 (p = 0.978, F = 0.190, df = 6). 마찬가지로 E에는 큰 차이가 없었습니다.최대 또는 EC50 ΔcJun이 켜진 마우스 간 값 (E최대 = 14.8 ± 2.9 %; EC50 = 211 ± 81 nM) 또는 꺼짐 (E최대 = 16.7 ± 1.8 %, p = 0.597; EC50 = 360 ± 151 nM, p = 0.411).

그림 3 

NAc에서 아데 닐릴 시클 라제 활성의 억제에 대한 ΔcJun 발현의 효과. ΔcJun- 발현 (ΔcJun on) 또는 대조군 (ΔcJun off) 마우스로부터의 막을 DAMGO (A), U50,488H (B) 또는 WIN55,212-2의 존재 하에서 배양 하였다 ...

ΔcJun 발현은 또한 칸 나비 노이드 작용제에 의한 NAc에서 아데 닐릴 사이 클라 제의 억제에 유의 한 영향을 미치지 않았다. WIN55,212-2 농도 효과 곡선의 양방향 ANOVA는 WIN55,212-2 농도 (p <0.0001, F = 15.53, df = 6)의 유의 한 주 효과를 보였지만 유전자형 (p = 0.066, F = 3.472, df = 1) 유의 한 상호 작용이 없었으며 (p = 0.973, F = 0.208, df = 6). 마찬가지로 WIN55,212-2 E에서도 큰 차이가 없었습니다.최대 값 (각각 p = 13.0에서 마우스에 대한 ΔcJun에서의 2.3 ± 13.6 % 및 0.9 ± 0.821 % 억제) 및 EC50 값 (각각, 마우스 = ΔcJun에서 208 ± 120 nM 및 417 ± 130 nM, p = 0.270). 따라서, ΔcJun을 발현하는 마우스에서 WIN55,212-2의 효능이 감소하는 경향이 약간 있었지만, 트랜스 진은 아데 닐릴 시클 라제의 칸 나비 노이드 억제를 유의하게 변화시키지 않았다. 또한, 기초 또는 포스 콜린-자극 아데 닐릴 시클 라제 활성에 대한 ΔcJun 상태의 영향은 없었다. 기본 아데 닐릴 시클 라제 활성은 각각 ΔcJun이 온 또는 오프 된 마우스에서 1095 ± 71 pmol / mg / min 및 1007 ± 77 pmol / mg / min (p = 0.403)이었다. 1 μM 포스 콜린에 의해 자극 된 아데 닐릴 사이 클라 제 활성은 각각 ΔcJun이 온 또는 오프 된 마우스에서 4185 ± 293 pmol / mg / min 대 4032 ± 273 pmol / mg / min (p = 0.706)이었다.

3.4. 토론

이 연구 결과 다이 노르 핀 / D에서 ΔFosB의 유도 성 유전자 도입 발현을 갖는 마우스의 NAc에서 향상된 MOR- 매개 G- 단백질 활성화 및 아데 닐릴 시클 라제의 억제가 밝혀졌다1R 함유 뉴런. 아데 닐릴 시클 라제 활성의 KOR- 매개 억제는 또한 ΔFosB 발현 마우스의 NAc에서 향상되었으며, 이는 ΔFosB가 NAc에서 내인성 오피오이드 시스템을 조절 함을 시사한다. 담고 E최대 MOR 자극에 대한 가치가 더 높음 [35S] GTPγS 결합 및 그의 EC50 대조군 마우스와 비교하여 ΔFosB 과발현 마우스에서 아데 닐릴 시클 라제 억제에 대한 값이 더 낮았다. 이러한 결과는 시험 된 분석 조건 하에서 이펙터 조절을위한 수용체 예비가 가능하지만 G- 단백질 활성화가 아닌 가능성을 시사한다. KOR 작용제에 의한 아데 닐릴 시클 라제의 최대 억제가 ΔFosB 발현에 의해 영향을 받았다는 발견은 마우스 뇌에서 KOR 결합 부위의 낮은 수준과 일치하는 KOR- 매개 반응에 대한 낮은 수용체 비축을 시사한다 (Unterwald 외, 1991). 대조적으로 CB1R- 매개 G- 단백질 활성 및 아데 닐릴 시클 라제의 억제는 ΔFosB 발현에 의해 영향을받지 않았다, 오피오이드 및 카나비노이드 시스템은 이들 NAc 뉴런에서 ΔFosB에 대한 반응이 상이하다는 것을 시사한다.

오피오이드 수용체-매개 신호 전달에 대한 ΔFosB의 효과는 선조에서의 ΔFosB 발현이 모르핀의 급성 및 만성 효과를 변경한다는 이전의 보고서와 일치한다 (Zachariou 등 2006). 그 연구의 하나의 발견은 다이 노르 핀 / D에서 ΔFosB의 유전자 이식 발현을 갖는 마우스였다1R 선조체 뉴런은 대조군보다 위치 조절 조건에서 모르핀에 더 민감 하였다. 또한, NAc 로의 부위-특이 적 주사에 의해 ΔFosB의 바이러스 매개 발현에 의해이 효과가 모방되었다. 이러한 관찰은 NAc에서 향상된 MOR 신호 전달을 나타내는 현재 결과와 일치한다.

우리는 이전에 유전자 인코딩을 확인했습니다 dynorphin은 ΔFosB의 표적으로서, 감소 된 dynorphin은 ΔFosB bitransgenic 생쥐에서 모르핀의 강화 된 보전 특성과 일치 할 것이라고 제안했다 (Zachariou 등 2006). 본 결과는 NAc에서 아데 닐릴 시클 라제의 KOR- 매개 억제가 ΔFosB 발현 마우스에서 향상되며, 이는 감소 된 디노 르핀 후 KOR 감도의 보상 적 증가를 반영 할 수 있음을 보여준다. 이전 연구는 KOR이 NAc를 포함하여 프로디 노르 핀 녹아웃 마우스의 특정 뇌 영역에서 상향 조절되었음을 보여 주었다 (Clarke 등 2003).

ΔFosB와 대조적으로, ΔFosB 결합 파트너 cJun의 주요 음성 절단 된 돌연변이 체인 ΔcJun의 유도 성 형질 전환 발현은 MOR 또는 KOR 작용제에 의한 아데 닐릴 사이 클라 제 억제를 변경시키지 않았다. 이러한 결과는 상대적으로 낮은 ΔFosB 발현의 기저 수준이 NAc에서이 수준의 신호 전달 수준에서 오피오이드 수용체 신호 전달을 유지하는데 중요한 역할을하지 않음을 시사한다. 이전 연구에서 모르핀의 조절 된 보람 효과가 ΔcJun 발현에 의해 감소했다는 사실은Zachariou 등 2006)은 컨디셔닝 절차 동안 ΔFosB의 모르핀 유도가 약물에 대한 행동 반응을 조절하는데 중요하거나, 아편 유사 수용체에 의한 근위 신호에 영향을 미치는 것 이외의 ΔFosB의 전사 효과가 오피오이드 보상에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. 어쨌든 본 연구의 결과는 △ FosB 발현이 선조체 디노 르핀 / D에서 기초 수준 이상으로 상승하는 경우1R- 발현 뉴런에서, NAc에서 아데 닐릴 시클 라제의 억제에 대한 MOR 및 KOR의 커플 링의 강력한 증가가 존재한다.

MOR- 및 KOR- 매개 신호 전달이 ΔFosB 과발현에 의해 강화되는 메카니즘은 명확하지 않지만, 이전에 [3H] 날록손 결합은 마우스에 비해 ΔFosB의 NAc가 다르지 않다 (Zachariou 등 2006). 같은 연구에서 Gα가i1 및 2 단백질 수준은 ΔFosB 발현에 의해이 영역에서 영향을받지 않았다. 그러나, 이전 유전자 발현 어레이 분석은 Gαo mRNA는 마우스에서 ΔFosB의 NAc에서 상향 조절되었다 (McClung과 Nestler, 2003). 많은 G- 단백질 조절 단백질의 발현뿐만 아니라 단백질 수준에서 G- 단백질 서브 유닛 발현에 대한 형질 전환 ΔFosB 발현의 효과를 포괄적으로 조사하기위한 미래의 연구에 관심이있을 것이다.

ΔFosB 발현이 CB를 향상시키지 않았다는 것이 흥미 롭다1NAc에서의 R- 매개 신호 전달. CB의 변경 가능성1R 신호 전달은 전체 NAc 제제에서 가려진 개별 뉴런 집단에서 발생한다. 예를 들어, Δ 투여9– THC는 NAc의 코어에서 ΔFosB를 유의하게 유도하지만 셸은 아닙니다 (Perrotti 등 2008). 나는실제로, Δ에 대한 도전이 밝혀졌다9Δ 반복 투여 후 -THC9-THC는 NAc 코어에서 도파민 방출을 증가 시켰지만, 쉘에서 방출을 감소시켰다 (카 도니 (Cadoni) 등 2008). 이중 형질 전환 마우스의 11A 계열은 dynorphin / D에서만 ΔFosB를 발현한다는 점에 유의해야합니다.1선조체의 R 양성 중간 가시 뉴런, 그러나 CB1R은 디노 르핀 / D로 표현된다1R과 엔케팔린 / D2R 양수성 뉴런 (Hohmann and Herkenham, 2000)뿐만 아니라 피질 구심 성의 터미널 (Robbe 등, 2001). ΔcJun은 D 둘 다에서 유도 적으로 발현되지만, ΔFosB- 매개 전사, ΔcJun의 지배적 음성 조절 인자의 발현은 또한 칸 나비 노이드 수용체 신호 전달에 유의 한 영향을 미치지 않았다.1 와 D2이 생쥐에서 중간 가시 뉴런의 포함 집단 (Peakman 등 2003). 그러나, MOR 및 KOR의 결과에 의해 제안 된 바와 같이, ΔcJun이 수용체 신호 전달에 영향을 미치지 않을 정도로 기본 ΔFosB 발현이 충분히 낮을 수있다. CB도 가능합니다1R 신호 전달은 기저 ΔFosB 발현에 의해 적당히 향상되어, ΔFosB 발현을 추가로 증가 시키거나 ΔcJun으로 그의 작용을 차단하는 것은 통계적 유의 수준에 도달하지 않는 약간의 효과만을 가졌다. WIN55,212-2 EC를 비교하여이 해석에 대한 간접 지원을 볼 수 있습니다50 ΔcJun 대 ΔFosB를 발현하는 마우스 사이의 값. WIN55,212-2 EC의 비율50 EC에 대한 ΔcJun의 발현이 발현 된 마우스에서 아데 닐릴 시클 라제 억제에 대한 값50 ΔFosB의 유도 된 발현을 갖는 마우스에서 G- 단백질 활성화에 대한 값은 4.0 인 반면, 트랜스 진을 유도하지 않은 마우스에서 동일한 비율은 1.2였다.

대안 적으로, 칸 나비 노이드는 CB에 직접적인 영향없이 ΔFosB 발현을 유도 할 수있다1R 신호. 이 시나리오에서, 칸 나비 노이드는 ΔFosB- 매개 전사 조절을 통해 다른 약물의 정신 활성 효과에 대한 반응성을 조절할 수있다. 나는n 사실, Δ 투여9-THC는 오피오이드 및 암페타민에 대한 교차 감작을 생성합니다 (카 도니 (Cadoni) 등 2001, 라마르크 (Lamarque) 등, 2001),이 가설과 일치합니다. 또한, 칸 나비 노이드 작용제 CP55,940의 반복 투여는 본 연구에서 ΔFosB를 유도 적으로 발현하는 마우스와 유사하게 NAc에서 MOR- 매개 G- 단백질 활성화를 증가시키는 것으로보고되었다 (Vigano 등 2005). Δ에 대한 ΔFosB 발현의 영향9-THC- 매개 행동은 평가되지 않았지만, 현재 결과는 상호 작용을 배제하지 않습니다. 이것과 우리의 이전 연구 결과 (Zachariou 등 2006)는 선조체에서 MOR 및 KOR / 디노 르핀에서 ΔFosB- 유도 된 변화를 보여준다. Δ의 보상 효과9장소 선호도에 의해 측정 된 -THC는 MOR 널 마우스에서 폐지되는 반면, KOR의 결실은 Δ 약화되었다9-THC 장소 혐오 및 공개 Δ9-THC 장소 환경 설정 (고즐 랜드 (Ghozland) 등의 2002). 마찬가지로 조건부 혐오를 Δ로 회피9-THC는 야생형 마우스와 비교하여 프로디 노르 핀 녹아웃에 존재하지 않는다 (짐머 등 2001). 이 데이터는 Δ9-THC는 ΔFosB 유도 및 결과적으로 다이 노르 핀 발현의 감소로 MOR 신호 전달의 유도 후 더 보람이있을 수있다.

요약하자면y,이 연구의 결과는 D에서 ΔFosB의 발현을 보여 주었다1R / dynorphin 양성 striatal 뉴런은 NAc에서 아데 닐릴 시클 라제 활성의 G- 단백질 매개 된 억제 수준에서 MOR- 및 KOR- 매개 신호 전달을 향상시켰다. 이 발견은 보상에서 내인성 오피오이드 시스템의 역할을 입증 한 연구와 일치합니다.Trigo 등 2010) 및 보상에 대한 ΔFosB 매개 효과에 대한 잠재적 메커니즘 제공. 대조적으로 CB1NAc에서의 R- 매개 신호 전달은 시험 된 조건 하에서 선조체 ΔFosB 발현에 의해 크게 영향을받지 않았지만, 엔도 카나비노이드 시스템에 대한 ΔFosB 유도의 효과를 결정하기위한 추가 연구가 필요하다.

연구 하이라이트

  • MOR 신호 전달은 ΔFosB를 발현하는 마우스의 핵 축적에서 향상된다
  • ΔFosB를 발현하는 마우스에서 아데 닐릴 시클 라제의 KOR 억제가 또한 향상된다
  • ΔFosB의 발현은 CB를 변화시키지 않는다1핵 축적에서 R 신호
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감사의 글

저자들은 Hengjun He, Jordan Cox 및 Aaron Tomarchio에게 [35S] GTPγS 결합 분석. 이 연구는 USPHS Grants DA014277 (LJS), DA10770 (DES) 및 P01 DA08227 (EJN)에 의해 지원되었습니다.

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각주

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