PMCID : PMC2820240
NIHMSID : NIHMS174679
추상
유전자 발현의 코카인-유도 변형은 코카인 중독의 기초가 될 수있는 뉴런 형태 및 행동의 변화를 야기한다. 우리는 히스톤 3 라이신 9 (H3K9) 디메틸 화와 코카인 유발 구조 및 행동 가소성에서 라이신 디메틸 트랜스퍼 라제 G9a의 필수 역할을 확인했습니다. 반복 된 코카인 투여는 핵 축적에서 H3K9 디메틸 화의 글로벌 수준을 감소시켰다. 티히스톤 메틸화의 그의 감소는이 뇌 영역에서 G9a의 억제를 통해 매개되었으며, 이는 코카인-유도 전사 인자 ΔFosB에 의해 조절되었다. 조건부 mutagenesis 및 바이러스 성 유전자 전송을 사용 하여 우리 G9a downregulation 핵 accumbens 뉴런의 수지상 척추 소성을 증가 하 고 코카인에 대 한 선호도 향상, 따라서 코카인의 장기 행동에 히스톤 메틸화에 대 한 중요 한 역할을 설립 발견.
개요
반복 된 코카인 노출은 뇌의 보상 회로의 핵심 구성 요소 인 핵 축적 (NAc) 내에서 유전자 발현의 변화와 신경 형태의 변화를 특징으로한다 (1-2). 크로 마틴 리모델링은 코카인 중독의 기초가 될 수있는이 뇌 영역의 비정상적인 전사 변화에 중요합니다 (3-9). NAc에서 염색질 구조의 코카인 조절은 부분적으로 염색질 효소기구의 직접 코카인 유도 변형으로 인해 히스톤 아세틸 화 및 인산화의 변화를 일으킨다 (4, 7-9); 그러나, 히스톤 메틸화를 제어하는 효소의 역할은 아직 조사되지 않았다.
Microarrays (ChIP-Chip)에 결합 된 염색질 면역 침전 법을 사용한 최근의 게놈 전체 프로모터 분석은 반복 코카인 처리 후 NAc의 특정 유전자 프로모터에서 억제 히스톤 H3 리신 9 (H3K9) 및 27 (H3K27) 메틸화의 변경된 패턴을 확인했습니다.6). 따라서, 본 발명자들은 H3K9 또는 H3K27 메틸화를 제어하는 것으로 알려진 수많은 리신 메틸 트랜스퍼 라제 (KMT) 및 탈 메틸 라제 (KDM)를 프로파일 링 하였다 (1A). 두 유전자의 발현이 유의하게 하향 조절 된 경우, 두 효소 인 G9a 및 GLP만이 반복 된 코카인 투여 후 24 시간 동안 지속적인 전사 조절을 나타냈다.. G9a 및 GLP는 H3K9 (H3K9me2)의 디메틸 화를 구체적으로 촉매 화하기 때문에 코카인에 의한 하향 조절은이 시점에서 관찰되는 전체적인 변색 성 H3K9me2 수준 감소와 일치합니다 (그림 1B). 대조적으로, 이종 변색 H3K27 메틸화의 글로벌 수준은 반복 된 코카인 노출에 의해 변경되지 않은 채로 남아있었습니다 (온라인 자료 지원의 S1). 높은 수준의 촉매 활성으로 인해 체외에서 및 생체내에서 (10), 우리는 NAc에서 반복 된 코카인 노출 후 G9a 억제의 기능적 중요성을 추가로 조사하기 시작했다. mRNA 수준과 같은 G9a 단백질 수준은 반복 코카인 투여 후 24 시간이 크게 감소했습니다.무화과 S2). 비록 NAX에서 G9a mRNA 발현이 35 %만큼 감소되었지만, 면역 조직 화학 분석은 반복 코카인 투여 후 H15K9me21에서 관찰 된 3 % 감소와 일치하는 G9a 단백질 수준에서보다 완만 한 2 % 감소를 나타냈다 (그림 1B). G9a mRNA 발현은 또한 코카인의 반복 된 자기-투여 후이 뇌 영역에서 20 %만큼 하향 조절되었다 (무화과 S3).
변색 성 H3K9me2의 변화가 NAc에서 유전자 발현의 게놈 전체 변경과 상관되는지 여부를 확인하기 위해, 우리는 마이크로 어레이 분석을 사용하여 사전 코카인 노출 이력이 있거나없는 동물에서 코카인의 챌린지 용량으로 유도 된 유전자 발현 프로파일을 조사했다 (보충 참조). 유전자 목록 테이블 S1–S3). 반복적 인 코카인을받은 동물은 급성 치료 된 동물과 비교하여 코카인 챌린지 후 1 시간에 유전자 발현이 극적으로 증가한 것으로 나타났습니다 (1C). 이 증가 된 유전자 발현은 반복 된 코카인으로부터 1 주 철수 후 주어진 코카인 도전에 대한 반응으로 여전히 발생 하였다. 이전 보고서와 일치하게, 소량의 유전자 (~ 10 %)가 반복 된 코카인 투여 후 민감하지 않은 전사 반응을 나타 냈습니다 (1C; 만나다 테이블 S1()5). 반복 된 코카인 후 관찰 된 강화 된 유전자 발현에서 G9a 하향 조절의 역할을 직접 조사하기 위해, 마우스는 GFP 또는 G9a를 발현하는 단순 포진 바이러스 (HSV) 벡터의 NNA 주사를 받고 식염수 또는 반복 된 코카인으로 처리하여 G9a 과발현 여부를 결정 하였다 유전자 발현의 반복 된 코카인-유도 강화를 차단하기에 충분 하였다. 반복 된 코카인에 이어 발현 수준을 높이는 12 무작위로 선택된 유전자 세트에서, 우리는 G9a가 이들 유전자의 50 %의 강화 된 발현을 현저하게 감소시키는 것을 관찰했다 (테이블 S4).
G9a 식의 반복 된 코카인 유발 억제를 중재하는 업스트림 녹음 방송 이벤트를 식별하기 위해, 우리는 즉시 초기 유전자의 매우 안정적인 결합 제품 ΔFosB에 대 한 가능한 역할을 조사 fosB. ΔFosB는 코카인에 반복적으로 노출 된 후 NAc에 축적되며, 코카인 보상 증가와 관련이 있습니다.11). ΔFosB는 관련된 표적 유전자에 따라 전사 활성화 제 또는 억제제로서 작용할 수있다 (3, 5, 6, 12). 이중 유전자 변형 NSE- 사용tTA × tetOP-ΔFosB ΔFosB 발현이 성체 동물의 NAc 및 등쪽 선조에서 선택적으로 유도 될 수있는 마우스 (13), NAc에서 H3K9me2 및 KMT의 코카인 조절에 대한 ΔFosB 발현의 영향을 조사 하였다. ΔFosB 과발현은 H3K9me2 (1D) 및 G9a 표현식 (1E)에 의해 반복되는 코카인의 효과를 모방. 대조적으로, ΔFosB는이 뇌 영역에서 GLP 발현을 감소시키지 않았으며, 각각 H39K1 및 H2K3에 대한 주요 트리메틸 화 효소 인 SUV9H3 및 EZH27에는 영향을 미치지 않았습니다 (무화과 S4). 독립적 인 ΔFosB 과발현 시스템을 사용하여 이들 데이터를 확인하기 위해, 야생형 성인 마우스는 GFP 또는 ΔFosB를 발현하는 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터의 양 -NAC 주사를 받았다. ΔFosB의 바이러스-매개 과발현은이 뇌 영역에서 G9a 발현 수준을 감소시켰다 (1E).
G9a의 이러한 뚜렷하고 구체적인 조절은 NAc 뉴런에서 G9a 발현을 변경하는 것이 코카인에 대한 행동 반응을 조절하는지 여부를 조사하도록 촉구했다. 야생형 마우스는 GFP 또는 G9a를 발현하는 HSV 벡터의 NNA 내 주사를받은 후, 약물 보상의 간접적 인 측정을 제공하는 편견없는 코카인 조건부 선호도 패러다임을 사용하여 분석 하였다. NAc 뉴런에서 G9a의 바이러스 과발현은 행동 시험 후 확인되었다 (2A). G9a 과발현은 GFP를 과발현하는 동물과 비교하여 코카인에 대한 선호도를 현저히 감소시켰다 (그림 2B), NAc에서 H3K9me2 수준 증가 (2C). G9a (G9aH1093K)의 촉매 적으로 죽은 돌연변이 체의 과발현 (14)는 코카인 선호도에 영향을 미치지 않았습니다 (그림 2B)이 뇌 영역에서 H3K9me2 수준에 영향을 미치지 않았습니다 (2C).
코카인의 행동 효과에서 G9a의 역할을 더 연구하고,보다 구체적으로 NAc, 성인 G9a에서 G9a 발현의 반복 된 코카인 유발 억제를 모방하기 위해fl / fl 쥐 (14)는 대조군으로서 Cre 재조합 효소 또는 GFP를 발현하는 AAV 벡터의 NA 내 주사를 받았다. NAc에서 G9a의 AAV-Cre 넉다운은 면역 조직 화학적으로 확인되었다 (무화과 S5), 장소 컨디셔닝 실험에서 코카인의 효과가 크게 증가하고 NAc에서 H3K9me2 수준이 감소했습니다 (그림 2D, E). G9a 및 GLP, BIX01294의 시판되는 약리학 적 억제제 (15-16)를 사용하여 효소 억제가 코카인에 대한 행동 반응에 유사하게 영향을 미치는지 확인 하였다. 실제로, G9a 및 GLP의 약리학 적 억제는 코카인에 대한 선호도를 유의하게 증가시키고 NAc에서 H3K9me2를 감소시켰다 (그림 2F, G).
코카인의 반복 된 투여는 NAc 중간 가시 뉴런에서 수지상 척추의 밀도를 증가시킨다 (17), 이러한 뉴런에 흥분성 글루타메이트 성 시냅스에서의 기능적 변화와 관련된 과정 (18-19) 및 약물에 대한 민감한 행동 반응 (17, 20). 따라서 우리는 반복 된 코카인에 의해 NAc에서 G9a 활성의 하향 조절이 NAc 뉴런의 수지상 척추 밀도를 조절하는 코카인의 능력을 매개 할 수 있다는 가설을 세웠다. 항 -G9a 항체와 함께 Chromatin immunoprecipitation (ChIP)을 사용하여 NAc에서 여러 추정 G9a 유전자 표적을 확인했습니다. 이들 각각은 이전에 코카인으로 유도 된 수지상 가소성에 관련이있었습니다.3A()20-26). 우리는 반복 된 코카인 투여가 이들 유전자 프로모터에서 G9a 결합뿐만 아니라 H3K9me2의 수준을 유의하게 감소 시켰음을 발견 하였다 (그림 3B). 대조적으로, 급성 코카인 투여는 급성 동일한 코카인 투여 후 NAc 9 시간에서 관찰 된 증가 된 G9a 발현과 일치하여, 동일한 유전자 프로모터 중 일부에 G1a를 신속하게 모집 하였다 (무화과 S6). 특정 유전자 프로모터에서의 G9a 결합은 그 발현의 변화와 상관 관계가 있지만, NAc에서 변경된 글로벌 수준의 G9a에 의해 및 / 또는 급성 후 G9a 모집에서의 차이에 의해 이러한 사건이 매개되는지에 대해서는 확실하지 않다. 대 반복 코카인 투여.
NAc에서 수많은 소성 관련 유전자의 G9a의 규제에 따라 반복 코카인 처리 후이 뇌 영역에서 G9a 식의 유지 보수 코카인 유발 수지상 척추 형성을 차단하는 데 충분 한 여부를 직접 조사했다. NAc에서 수지상 척추 유도를 촉진하기 위해 이전에 입증 된 코카인 치료 프로토콜을 사용하여20), HSV-GFP 또는 HSV-G9a를 주사 한 동물에서 척추 밀도를 조사 하였다. 이전의 발견과 일치하여, 우리는 코카인 처리 후 NAc에서 수지상 척추 밀도의 유의 한 증가, G9a 과발현에 의해 완전히 차단 된 효과가 관찰되었다 (3C). G9a 과발현 단독으로는 코카인이 없을 때 NAc 수지상 척추 밀도를 감소시키기에 충분하지 않았다. 이러한 데이터를 보완하기 위해 G9afl / fl 마우스는 HSV-Cre의 NA 내 주사를 받고 척추 밀도를 정량하고 코카인이없는 경우 HSV-GFP를받는 동물과 비교 하였다. G9a 발현의 녹다운은 NAc 중간 가시 뉴런에서 척추 밀도를 유의하게 증가시켰다 (3C).
반복 코카인 후 NAc에서 G9a downregulation이 ΔFosB에 의해 매개된다는 증거를 감안할 때, 우리는이 전사 인자가 마찬가지로 NAc 수지상 돌기의 조절에 관여하는지 여부를 조사했다.. 비록 ΔFosB가 이전에 그러한 수지상 소성에 인과 적으로 연결되지 않았지만, Cdk5 및 NFκB 서브 유닛을 포함하는 몇몇 표적이 그렇게 연루되어있다 (20-23), NAc 뉴런에서의 ΔFosB의 지속적인 발현은 반복 된 코카인 처리 후 증가 된 수지상 척추 밀도와 상관 관계가있다 (27). 먼저, 본 발명자들은 G9a 및 H3K9me2 발현을 하향 조절 한 코카인의 부재 하에서 이종 이식 마우스에서 ΔFosB의 유도를 발견 하였다 (그림 1D, E), 수많은 가소성 관련 유전자에 대한 G9a 결합 감소, 그 중 다수는 또한 ΔFosB 자체의 직접적인 표적 인 것으로 나타났다 (3D()3, 6). 우리는 다음 NAc에서 ΔFosB의 바이러스 성 overexpression 기저 조건에서 수지상 척추 밀도를 크게 증가 보여 반복 된 코카인 투여 후 관찰 된 것과 유사3E). 반대로, ΔFosB 전사 활성을 길항하는 지배적 음성 돌연변이 단백질 인 ΔJunD의 NAc에서의 과발현은 NAc에서 수지상 척추 형성을 증가시키는 반복 된 코카인의 능력을 차단 하였다 (3C).
ΔFosB가 NAc에서 G9a 발현을 조절하고, ΔFosB와 G9a가 동일한 표적 유전자 중 일부를 조절한다는 우리의 관찰은 ΔFosB와 G9a 사이의 다른 상호 작용을 조사하도록 이끌었다. 급성 코카인 후, G9a 수준이 증가했을 때, G9a의 결합은 fosB 코카인을 반복 한 후 G9a 발현이 억제되면 G9a가 fosB 유전자가 감소했다3A). 반복 된 코카인 후 이러한 감소 된 G9a 결합은 관찰되지 않았다. c-fos, 반복 코카인에 의해 G9a 결합이 증가하는 곳 (무화과 S7). 이것은 사실과 달리 fosB, c-fos 만성 정신 자극제 노출에 의해 유발되지 않고 억압됩니다.5). 이중 형질 전환 마우스에서 ΔFosB 과발현은 G9a 결합을 유의하게 감소시키기에 충분 하였다. fosb 유전자 (3D). 또한, G9a 과발현은 반복 된 코카인 투여 후 증가 된 ΔFosB 발현을 감소시키기에 충분 하였다 (테이블 S4). 이들 데이터는 G9a가 초기에 급성 코카인 투여에 의해 ΔFosB의 유도를 제한하는 자동 조절 루프를 제안한다. 그러나, 약물 노출이 반복되면서 ΔFosB가 축적됨에 따라, G9a를 억제하여 그 자체의 추가 유도를 강화시킨다.
결론적으로, 본 발명자들은 NAc에서의 히스톤 리신 메틸화가 코카인에 대한 반응으로 뉴런 유전자 발현 조절에 결정적으로 관여한다는 것을 입증 하였다. 반복 된 코카인 투여 후 G9a 및 H3K9me2의 억제는 비정상적인 수지상 가소성을 조절하는 것으로 알려진 수많은 유전자의 전사 활성화를 통해 부분적으로 코카인 선호를 촉진한다. 이러한 메커니즘을 통해 조절되는 유전자에 대한 이해를 높이면 약물 중독의 복잡한 생물학적 기초에 대한 지식이 향상되고 중독성 장애의보다 효과적인 치료법 개발에 도움이 될 수 있습니다.
재료 및 방법
동물과 치료
달리 언급되지 않는 한, 마우스는 일정한 온도 (12 ° C)에서 7 시간 명 / 암주기 (00 : 7 AM에서 00 : 23 PM까지 점등)를 갖는 콜로니에 케이지 당 4-5 마리를 수용 하였다. 광고 무제한 물과 음식에 대한 접근. 모든 동물 프로토콜은 UT Southwestern Medical Center와 Mount Sinai School of Medicine에서 IACUC의 승인을 받았습니다.
코카인 실험 [면역 조직학, 웨스턴 블 롯팅, 정량적 PCR (qPCR), 마이크로 어레이 분석 및 크로 마틴 면역 침전 (ChIP)]을 위해, 8 내지 10 주령 수컷 C57BL / 6J 마우스를 사용 하였다. 동물에게 매일 식염수 (7 치료 식염수, ip), '급성'코카인 (6 치료 식염수 + 1 회 치료 20 mg / kg 코카인 -HCl, ip) 또는 '반복 된'코카인 (7 치료 20 mg / kg)을 매일 주사 코카인 -HCl, ip). 최종 처리 후 1 시간 또는 24 시간에 마우스를 희생시켰다. 마이크로 어레이 연구의 경우, 동물을 매일 식염수 (15 처리 식염수, ip), '급성'코카인 (14 처리 식염수 + 1 처리 20 mg / kg 코카인 -HCl, ip), '반복 + 급성'코카인 (일일 처리)으로 처리했습니다. 7 치료 식염수 + 8 치료 20 mg / kg 코카인 -HCl, ip) 또는 '반복되는 금단 + 급성'코카인 (7 치료 20 mg / kg 코카인 -HCl + 7 치료 식염수 + 1 챌린지 치료 20 mg / kg 코카인 -HCl, ip) 및 최종 처리 후 1 시간을 희생시켰다. 행동 실험에서, 마우스를 수술 후 단독으로 수용하고하기에 기재된 바와 같이 10 mg / kg 코카인 -HCl, ip로 처리 하였다. HSV-GFP 및 HSV-G9a-GFP 감염 후 수지상 척추 분석 및 마이크로 어레이 검증을 위해, 마우스를 '식염수'(5 처리 식염수, ip) 또는 '반복 코카인'(5 처리 20 mg / kg 코카인 -HCl, ip ) 3 일 동안,이 주사 프로토콜은 이전에 단순 포진 바이러스 (HSV) 전이 유전자 발현의 기간 내에 핵 축적 (NAc) 뉴런에 대한 척추 밀도를 증가시키는 것으로 입증 되었기 때문에보충 심판 S1). 수지상 척추 분석에 사용 된 마우스를 마지막 처리 후 4 시간 동안 희생시켰다.
NAc 뉴런으로 제한되는 G9a 전 사체의 국소 결실을 유도하기 위해, 본 발명자들은 다른 곳에서 상세하게 기술 된 플록스 G9a 대립 유전자에 대해 돌연변이 마우스 동형 접합체를 사용 하였다 (S2). Cre- 유도 된 재조합은 엑손 22 대 25- 프레임 외 스 플라이 싱을 생성하여 돌연변이 된 전 사체의 넌센스-매개 붕괴를 초래한다. 우리는 C9BL / 57J 마우스에 완전히 역 교배 된 G6a floxed 마우스를 사용했습니다. 2와 7 주 사이에 GFP 또는 Cre-GFP를 발현하는 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터 (혈청 형 10)를 사용하여 마우스를 NAc에 입체 주사 주사 하였다. Cre- 매개 재조합의 효율성을 검증하기 위해 면역 조직 화학적 분석을 사용 하였다 (참조) 보충 그림 S5). G21a floxed 생쥐의 재조합이이 시점에서 안정적이면서 최대 였기 때문에 수술 후 9 일에 AAV 주사 동물을 사용했습니다.S3-S4). G9a 및 ΔJunD 과발현 실험은 GFP, 야생형 G9a-GFP, 촉매 적으로 죽은 G9aH1093K-GFP 또는 ΔJunD-GFP를 발현하는 HSV 바이러스 벡터를 사용하여 유사하게 수행되었다 (참조 S2 G9a 구조의 개발에 관한 자세한 내용은). 면역 조직 화학을 통해 관찰 된 바와 같이, 과발현은이 시점에서 최대이기 때문에 수술 후 3 일에 HSV 과발현 마우스를 사용 하였다. HSV 발현의 일시적 성질 및 AAV 발현의 상당히 더 안정한 성질로 인해, HSV 벡터는 빠른 단기간 트랜스 진 발현을 요구하는 실험에 사용 된 반면, AAV 벡터는 연장 된 기간의 트랜스 진 발현을 요구하는 실험에 사용되었다. 광범위한 선행 연구에서, 두 벡터는 구 심성 또는 구 심성 뉴런의 감염없이 주입 된 뇌 영역 내의 뉴런 세포체만을 감염시키는 것으로 나타났다.
약리학 적 G9a / GLP 억제제, BIX01294 (25 ng / μl)를 사용한 행동 실험을 위해, 마우스에 양측 가이드 캐뉼라뿐만 아니라 2 개의 피하 미니 펌프가 NAc에 입체적으로 이식되었다. 미니 펌프는 12 시간 동안 비히클 (0.25 하이드 록시 프로필 β- 사이클로 덱스트린) 또는 약물의 연속 전달 (5 μl / 시간)을 개시하기 전에 14 시간 동안 활성화되었고,이 시간 동안 행동 평가가 수행되었다.
ΔFosB 과발현 실험 [서부 블로 팅, qPCR 및 ChIP]의 경우, 남성 이중 형질 전환 NSE-tTA × tetOP-ΔFosB 테트라 사이클린 유도체 독시사이클린 (독시사이클린에서 10 주 꺼짐)이 없을 때, 마우스를 사용하여 (8 주령), 동물은 ΔFosB의 강력한 선조체 제한적 구성 발현을 나타냈다 (S5). 이들 마우스에서 ΔFosB 과발현은 qPCR을 통해 확인되었다. NSE-를 사용하여 결과를 확인하려면tTA × tetOP-ΔFosB 마우스, 야생형 8- 주령 C57BL / 6J 수컷 마우스는 GFP 또는 ΔFosB-GFP를 발현하는 AAV 벡터를 사용하여 입체 주사 주사 된 NAC에 주사되었다. 이 경우, 수술 후 8 주에 최대 ΔFosB 발현을 보장하기 위해 AAV 벡터를 사용하여 바이러스 감염 및 이종 이식 ΔFosB 과발현 마우스 간의 직접적인 비교를 허용 하였다. 바이러스 과발현은 수술 후 8 주에 qPCR을 사용하여 확인되었다 (15- 게이지 NAc 펀치는 주사 부위에서 해부 됨). qPCR에 사용되지 않은 AAV-GFP 및 AAV-ΔFosB-GFP 과발현 마우스를 14 주 후 14 주부터 식염수 (30 처리 식염수, ip) 또는 반복 코카인 (6 처리 4 mg / kg 코카인 -HCl, ip)으로 처리 하였다. 외과. 최종 치료 후 4 일에, 뇌를 XNUMX % 파라 포름 알데히드로 고정시키고, 비 브라 톰으로 절단하고 수지상 척추 분석에 사용 하였다.
웨스턴 블롯 분석
14- 게이지 NAc 펀치를 스테인레스 스틸 마우스 뇌 매트릭스를 사용하여 얻은 1 mm 코로 날 섹션으로부터 취하여 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 함유하는 1 M HEPES 용해 완충액 (1 % SDS)에서 초음파 처리 하였다. 10-총 단백질의 30 μg 샘플을 18 % SDS 겔에서 전기 영동시켰다. 단백질을 PVDF 막으로 옮기고 항 -H3K9me2 (마우스 모노클로 날, 1 : 500), 항 -β- 튜 불린 (마우스 모노클로 날, 1 : 60,000), 항-총 히스톤 H3 (토끼 다 클론, 1 : 5,000), 항 -GFP (천공 조직에서 동일한 바이러스 발현을 확인하기 위해 사용됨) (토끼 다 클론, 1 : 1000), 항 -H3K27me3 (토끼 다 클론, 1 : 500) 또는 항-액틴 항체 (마우스 단일 클론, 1 : 60,000) 4 ℃ (모든 막은 5 % 우유 또는 5 % 소 혈청 알부민으로 차단됨). 이어서 막을 퍼 옥시 다제-표지 된 이차 항체 (1 : 15,000)와 함께 배양 하였다-사용 된 1 차 항체에 따라 1 : 60,000) 및 밴드를 SuperSignal West Dura 기질을 사용하여 시각화 하였다. 밴드를 NIH Image J 소프트웨어로 정량하고 H3K9me2 밴드를 액틴 또는 β- 튜 불린 및 정규 히스톤 H3로 정규화하여 동일한 로딩을 제어 하였다. 반복 된 코카인은 액틴 수준에 영향을 미치지 않았습니다 (무화과 S8) 또는 총 히스톤 3 (무화과 S1)에서 NAc. 또한, HSV-G9a-GFP 및 HSV-G9aH1093K-GFP 감염은 NAc에서 β- 튜 불린의 총 수준에 영향을 미치지 않았다 (무화과 S8).
면역 조직 화학
마우스를 치사량의 염소 수화물로 진정시키고 4 % 파라 포름 알데히드로 관류시키기 전에 상기 기재된 단일 또는 이중 면역 조직 화학 법에 의해 분석 하였다 (S6). 간단히 말해서, 고정 후 뇌를 30 % 수 크로스에서 밤새 실온에서 밤새 인큐베이션 한 후 35 μm로 절단 하였다 (수지 척추 분석에 사용 된 뇌를 100 % 수 크로스가없는 상태에서 30 μm 섹션에서 비 브라 톰으로 절단 함). 부유 부유 NAc 섹션을 1X PBS로 세척하고, 차단하고 (3 % 정상 당나귀 혈청, 0.1 % tritonX, 1X PBS) 나중에 anti-GFP (chicken polyclonal, 1 : 8000) 및 / 또는 anti-G9a (토끼 다 클론)와 배양 차단 용액 중의 1 : 500) 항체. 수지상 척추에 대해 분석 된 섹션을 1 : 200에서 토끼 폴리 클로 날 항 -GFP 항체와 함께 배양 하였다. 밤새 인큐베이션 후, NAc 섹션을 3X PBS로 10 분 동안 1 시간 동안 헹구고,이어서 2 시간 동안 3X PBS 차단 용액에서 Cy1 및 / 또는 Cy2 형광-결합 된 이차 항체와 인큐베이션 하였다. 형태 연구에 사용 된 섹션을 2 차 항체에서 밤새 실온에서 인큐베이션 하였다. 핵 공동 염색은 1 분 동안 DAPI (1 : 50,000)를 포함하는 10X PBS에서 섹션을 배양함으로써 달성되었습니다. 섹션을 다시 한번 세척 한 후, 에탄올 탈수 및 DPX로 장착 하였다. 공 초점 현미경을 사용하여 모든 섹션을 영상화 하였다.
RNA 분리 및 qPCR
양측 14 게이지 NAc 펀치를 Trizol에서 균질화하고 제조업체의 지침에 따라 처리했습니다. RNA는 RNAesy Micro 컬럼으로 정제되었으며 분광법은 RNA 260/280 및 260/230 비율이> 1.8임을 확인했습니다. RNA는 Bio-Rad iScript Kit를 사용하여 역전사되었습니다. cDNA는 SYBR Green을 사용하여 qPCR로 정량화되었습니다. 각 반응은 이중 또는 삼중으로 실행되었고 정규화 대조군으로 글리 세르 알데히드 -3- 포스페이트 탈수소 효소 (GAPDH)를 사용하여 이전에 설명한대로 ΔΔCt 방법에 따라 분석되었습니다 (S7). 만나다 보충 테이블 S5 mRNA 프라이머 서열에 대해.
DNA 마이크로 어레이 분석
4 개의 그룹 (그룹당 3 독립적 인 생물학적 복제물)을 총 12 마이크로 어레이에 대해 마이크로 어레이 연구에 사용 하였다. 마지막 코카인 주사 후 1 시간에, 동물을 신속하게 탈락시키고 뇌를 제거하여 얼음 위에 놓았다. 15- 게이지 니들 펀치를 사용하여 NAc의 해부를 취하고 RNA가 추출 될 때까지 드라이 아이스에서 빠르게 냉동시켰다. 쌍방 펀치는 복제 당 4 마리 동물로부터 풀링되었고, 그룹당 총 12 마우스. RNA 분리, 마이크로 어레이 처리 및 데이터 분석은 앞에서 설명한대로 수행되었습니다 (S8). 간단히 말해, RNA는 위에서 설명한대로 분리 및 정제되었으며 Agilent의 Bioanalyzer를 사용하여 품질을 확인했습니다. Illumina MouseWG-6 v2.0 어레이에 대한 역전사, 증폭, 라벨링 및 혼성화는 UT Southwestern의 마이크로 어레이 코어에 의한 표준 절차를 사용하여 수행되었습니다. 원시 데이터는 배경을 빼고 Beadstudio 소프트웨어를 사용하여 분위수 정규화했습니다. GeneSpring 소프트웨어를 사용하여 정규화 된 데이터를 분석하고 p <1.3의 비 엄격한 p- 값 컷오프와 결합 된 0.05 배 변경 컷오프의 유의성 기준을 사용하여 유전자 목록을 생성했습니다.
우리는 여러 가지 이유로 이러한 데이터에 대해 높은 신뢰를 유지합니다. 첫째, 모든 동물을 같은 조건에서 동시에 처리하고 처리하고 죽였습니다. 또한, 모든 RNA 및 어레이 처리가 동시에 수행되었다. 둘째, 배열 표본 당 3 배 배열과 풀 동물을 풀링하여 개별 변동성으로 인한 차이를 최소화하고 통계 력을 높였습니다 (S9). 셋째,이 연구에 사용 된 데이터 분석 기준은 MicroArray 품질 관리 프로젝트에서 권장합니다. 이러한 기준은 높은 수준의 사이트 간 재현성과 플랫폼 간 및 플랫폼 내 재현성을 제공하도록 검증 되었기 때문에 (S10-S11).
바이러스 성 벡터의 구축
바이러스 성 벡터 삽입 크기 제한으로 인해, 야생형 G9a (G9a) 또는 촉매 적으로 죽은 G9a (G9aH1093K)에 대한 코딩 서열을 인간 즉시 초기 거대 세포 바이러스 프로모터 (CMVa) (CMXa)의 제어하에 GFP를 발현하는 비 시스 트로닉 p1005 + HSV 플라스미드에 서브 클로닝 하였다 (G9a). 삽입 크기는 ~ 3.96 kb로 AAV-2 벡터의 최대 삽입 크기를 초과합니다). IE4 / 5 프로모터는 G9a 표현식을 구동합니다. EcoRI 소화 후 Klenow 처리 된 PmeI 및 EcoRI 소화 된 G1005a (pcDNA9) 및 CIP 처리 된 p3.1 +를 사용한 무딘 말단 결찰을 통해 단편을 비 시스 트로닉 p1005 + HSV 플라스미드로 단편을 서브 클로닝 하였다. HSV-ΔJunD-GFP의 생산을 위해, EcoRI 제한 부위에 의해 플 랭킹 된 ΔJunD의 코딩 서열을 EcoRI 부위를 함유하는 프라이머 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 PCR에 의해 생성 하였다. 이어서 PCR 생성물을 p1005 + 벡터의 EcoRI 부위에 결찰시켰다. NAc 뉴런에서 Cre 재조합 효소의 국소 발현은 기술 된 바와 같이 AAV 벡터를 사용하여 바이러스-매개 유전자 전달에 의해 달성되었다 (S12). GFP 또는 Cre에 대한 GFP의 N- 말단 융합은 스플 라이스 공여자 수용체 서열 및 폴리아 데 닐화 신호를 갖는 CMV 프로모터를 함유하는 재조합 AAV-2 벡터로 서브 클로닝되었다. 디데 옥시-시퀀싱에 의해 모든 벡터 삽입을 확인 하였다. 바이러스 벡터는 이전에 설명 된 것처럼 3 중 형질 감염, 무 헬퍼 방법을 사용하여 생성되었습니다 (S13). 정제 된 바이러스를 -80 ℃에 저장 하였다. 바이러스 성 품질은 HEK293 세포에서 평가 된 감염성 역가에 의해 평가되었다. AAV-ΔFosB-GFP 바이러스는 유사하게 제조되었다. HSV-Cre의 경우, Cre 발현을 최소화하고 신경 독성을 방지하기 위해 IE4 / 5 프로모터와 달리 IRES 프로모터에 의해 Cre 발현을 유도 하였다 (참조 S14 바이러스 성 구축). 모든 경우에 바이러스 과발현이 모두 검증되었습니다 체외에서 및 생체 내 qPCR을 통해, 바이러스는 면역 조직 화학적으로 수술 후 NAc- 제한된 발현을 나타내는 것으로 확인되었다.
입체 외과 수술
케타민 (100 mg / kg) / 자일 라진 (10 mg / kg) 마취하에, 마우스를 소 동물 입체 세기구에 위치시키고 두개골 표면을 노출시켰다. 33 개의 게이지 주사기 바늘을 사용하여 0.5 μl의 바이러스를 10 ° 각도 (AP + 1.6; ML + 1.5; DV-4.4)로 0.1 μl / 분의 속도로 NAc에 양으로 주입 하였다. HSV 주사를받은 동물은 수술 후 2 일 동안 회복 될 수있는 반면, AAV 벡터를받는 행동 시험에 사용 된 마우스는 장소 컨디셔닝되기 전에 20 일 동안 회복 될 수 있었다. 이 시간은 두 벡터에 대한 최대 바이러스 매개 전이 유전자 발현 기간과 일치한다. BIX01294 주입의 경우, 두 개의 미니 펌프 각각이 마우스의 등에 피하로 배치되었습니다. 캐뉼라 배치는 NAc 위에 2 개의 작은 두개골 구멍을 뚫고 브레 그마로부터 캐뉼라를 전달함으로써 달성되었다 (AP + 1.5; ML + 1.0; DV-5.4). 하기 설명 된 바와 같이 장소 컨디셔닝 절차를 시작하기 전에 마우스를 4 내지 5 일 동안 수술로부터 회복시켰다.
조건부 환경 설정
장소 컨디셔닝 절차는 다음과 같이 수정하여 앞에서 설명한대로 수행되었습니다 (S7). 간단히 말해서, HSV-G3a-GFP, HSV-G9aH9K-GFP 또는 HSV-GFP의 NAC 내 주입 1093 일 후, 마우스를 세 가지 별개의 환경으로 구성된 컨디셔닝 챔버에 배치했습니다. 두 개의 컨디셔닝 챔버 중 하나에 대해 상당한 선호도를 보인 마우스는 연구에서 제외되었습니다 (모든 동물의 <10 %). 컨디셔닝 그룹은 여전히 존재할 수있는 챔버 바이어스를 조정하기 위해 균형을 이룹니다. 다음 날에는 동물에게 식염수를 주입하고 오후에 한 방에 30 분 동안 가둔 다음 코카인 (10mg / kg, ip)을 주입하고 저녁에 다른 방에 30 분 동안 가두어 2 일 (20 일) 식염수와 두 개의 코카인 페어링). 테스트 당일, 마우스를 01294 분 동안 치료하지 않고 장치에 다시 넣고 어느 쪽이 선호되는지 평가하기 위해 테스트했습니다. 코카인에 대한 운동 반응은 약물 치료의 효과를 보장하기 위해 코카인 쌍 챔버에서 빔 브레이크를 통해 평가되었습니다. AAV 및 BIX10 CPP 실험의 경우 약간 수정 된 프로토콜이 사용되었습니다. 동물에게 식염수 또는 코카인 (30mg / kg, ip)을 다시 주입하고 4 분 세션 동안 특정 챔버에 가두었지만 대신 5 일 동안 하루에 한 번만 컨디셔닝 한 다음 XNUMX 일에 테스트를 수행했습니다 (동물은 컨디셔닝했습니다. 저녁과 컨디셔닝 처리가 번갈아 가며). 모든 그룹에 대해 식염수에 대한 기본 운동을 평가하여 운동이 바이러스 또는 억제제 치료에 영향을받지 않는지 확인했습니다.
정 맥 코카인 자기 관리
실험 시작시 230-250 g 무게의 수컷 사춘기 Long-Evans 쥐를 얻었다. 이들은 12 시간 명 / 암주기 (9 : 00 am에서 소등)가 반대로 습도 및 온도 제어 환경에 보관되었습니다. 광고 무제한 음식과 물에 대한 접근. 쥐는 새로운 환경에 적응하고 실험 시작 전 1 주 동안 매일 처리 하였다. 모든 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 국립 보건원 (National Institute of Health) 가이드에 따라 수행되었으며 시나이 산 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 자체 관리 장비에는 운동 행동을 측정하기 위해 적외선 빔이 장착되었습니다. 자가 관리는 이전에 설명한대로 수행되었습니다 (S15-S16) 이소 플루 란 (2.4–2.7 %) 마취하에 오른쪽 경정맥에 카테터를 이식합니다. 카테터를 0.1U 헤파린과 암피실린 (10mg / kg)을 포함하는 50ml의 식염수 용액으로 세척했습니다. 수술 후 3 주일 동안 회복 된 후,자가 관리 훈련은 명암주기의 어두운 단계에서 시작되었습니다. 동물은 고정 비율 -0.75 (FR1) 강화 일정에 따라 매일 1 시간 동안 코카인 (1 mg / kg / 주입)에 접근 할 수 있도록 허용했으며, 여기서 6 번의 활성 레버 프레스는 약물의 단일 주입으로 이어졌습니다. 쥐는 15 일 후 코카인 섭취를 안정화했습니다 (3 일 연속 반응률 75 % 미만, 강화 레버에 최소 24 % 반응). 최종자가 투여 세션 XNUMX 시간 후, 쥐는 빠르게 목을 베고, 뇌를 빠르게 제거하고 RNA 분리 및 qPCR을 위해 처리했습니다.
크로 마틴 면역 침전 (ChIP)
신선한 NAc 펀치를 포름 알데히드가 가교 결합시키고 전술 한 바와 같이 ChIP를 위해 제조 하였다 (S17-S18)를 약간만 수정하면됩니다. 간단히 말하면, 동물 당 4 14 게이지 NAc 펀치 (샘플 당 5 동물 풀링)를 수집하고, 1 % 포름 알데히드와 교차 결합하고, -2 ℃에서 동결하기 전에 80 M 글리신으로 켄칭 하였다. 샘플 초음파 처리 전 1 일에, 양 항-토끼 / 마우스 (강수 항체에 따라) IgG 자성 비드는 항 -G9a (토끼 다 클론 성 ChIP 등급) 또는 항 -H3K9me2 (마우스 단일 클론 성 ChIP 등급)와 적절한 자성 비드를 배양함으로써 제조되었다. 블록 용액에서 일정한 회전하에 4 ° C에서 밤새 항체. 조직 초음파 처리 및 염색질 전단은 전술 한 바와 같이 수행되었다 (S17). 초음파 처리 후, 동일한 농도의 염색질을 새로운 튜브로 옮기고 최종 생성물의 ~ 5 %를 '입력'대조군으로 사용하도록 저장 하였다. 접합 된 비드 / 항체 혼합물의 철저한 세척 및 재현 탁 후, 동일한 부피의 항체 / 비드 혼합물 (~ 7.5 μg 항체 / 샘플)을 각각의 염색질 샘플에 첨가하고 16 ℃에서 일정한 회전하에 ~ 4 시간 동안 인큐베이션 하였다. PCR 정제 키트를 사용하여 DNA 정제 전에 샘플을 추가로 세척하고 65 ℃에서 밤새 역 가교시켰다. DNA 정제 후, 샘플을 qPCR에 적용하고, 전술 한 바와 같이 그들의 적절한 '입력'대조군으로 표준화 하였다 (S17). 마우스 폴리 클로 날 항 -IgG 항체를 사용한 정상적인 마우스 IgG 면역 침전도 신호 증폭의 적절한 풍부화를 제어하기 위해 수행되었다. 아데닌 포스 포리보실 트랜스퍼 라제 (APRT)를 코카인 및 ΔFosB 과발현 실험에 대한 음성 대조군으로 사용 하였다. 만나다 보충 테이블 S5 프로모터 프라이머 서열 용.
수지상 척추 분석
생체 내 뉴런 형태의 조절에서 G9a의 역할을 연구하기 위해, 우리는 이전에 다음과 같이 수정 된 방법을 사용했다 (S1). HSV-GFP, HSV-G9a-GFP, HSV-ΔJunD-GFP (모든 바이러스는 야생형 C57B1 / 6J 마우스에 사용됨) 또는 HSV-Cre-GFP (G9a에 사용됨) 주사 후 3 일fl / fl 마우스), 바이러스 발현이 최대 일 때, 마우스를 관류시키고, 뇌를 동결 보호하고 나중에 비 브라 톰에서 100 μm로 절편 화 하였다. 이어서, 상기 기재된 바와 같이 GFP에 대한 항체를 사용하여 절편을 면역 염색시켰다 (면역 조직 화학 참조). 척추 수에 대한 G9a 과발현 및 녹아웃의 효과 및 ΔJunD 과발현의 영향을 평가하기 위해, 본 발명자들은 GFP- 발현 NAc 배지로부터의 적어도 1 μm의 2 차 수상 돌기의 뉴런 당 대략 2-299 신경 돌기에서 척추의 수를 측정 하였다 가시 뉴런 (MSN). MSN은 NAc의 다른 뉴런 집단과 형태 학적으로 구별되며 HSV가 주로이 뇌 영역에서 DARPP-32 발현 뉴런을 감염 시킨다는 이전 보고서를보고S19), 우리는이 연구에서 MSN이 독점적으로 평가되었다고 확신합니다. 각 동물에 대해, 그룹당 6–8 동물 (3 그룹)에서 ~ 4–7 뉴런을 조사한 후 통계 분석을 위해 각 동물에 대한 평균값을 얻었습니다. NAc 척추 밀도에 대한 ΔFosB 과발현의 효과를 조사하기 위해 설계된 실험은 AAV 벡터를 사용하여 연장 된 기간 (8 주) 동안 GFP 또는 ΔFosB-GFP를 발현시키는 것을 제외하고는 상기 기술 된 것과 유사하게 수행 하였다. 모든 HSV 이미지는 100X 오일 침지 대물 렌즈가있는 공 초점 현미경을 사용하여 캡처되었습니다 (AAV 이미지는 63X 오일 침수 대물 렌즈로 캡처되었습니다). 1 임의 단위 및 1024 × 1024 프레임 크기로 설정된 핀 홀로 이미지를 획득했습니다. 수지상 길이는 NIH Image J 소프트웨어를 사용하여 측정하였고, 슬라이드는 실험 스캐닝 전에 코딩되었으므로 1 차 실험자에 의해 가시 수를 맹검으로 계산 하였다. 덴 드라이트 10 μm 당 평균 스파인 수를 계산했습니다.
통계 분석
일군 및 이원 분산 분석을 수행하여 조건이 지정된 장소 환경 설정 및 수지상 척추 분석의 중요성을 두 그룹 이상으로 결정했습니다. G9a에서 HSV-GFP와 HSV-Cre를 비교 한 qPCR, 웨스턴 블로 팅, 수지상 척추 분석을 포함한 다른 비교에 스튜던트 t 테스트를 사용했습니다.fl / fl 마우스, 마이크로 어레이 분석 (위 참조) 및 염색질 면역 침강 실험. 계획된 학생의 t- 테스트는 약물 치료 및 바이러스의 중요한 주요 효과를 확인하면서 ΔFosB 과발현 후 수지상 척추 밀도의 양방향 ANOVA 분석에 따라 사용되었습니다. 그림 범례에 포함 된 모든 값은 평균 ± SEM을 나타냅니다 (* p ≤ 0.05; ** p <0.001). 에 대한 자세한 통계 분석 도 2 1-3 본문에는 다음이 제공됩니다. 통계를 포함한 상세 그림 범례.
각주
본인은 원고에 포함 된 어떠한 자료도 제목에 포함되지 않음을 증명합니다 코카인 유발 소성에서 히스톤 Methyltransferase G9a의 필수 역할 인터넷을 포함하여 이전에 게시되었거나 다른 곳에서 검토 중입니다.
동물 사용과 관련된 모든 작업은 University of Texas Southwestern Medical Center와 Mount Sinai School of Medicine에서 기관 및 IACUC 지침에 따라 수행되었습니다.
참조 및 메모
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