(Human) 만성 코카인에 대한 행동 및 구조 반응은 핵 가려 뱀 껍질 (2013)에서 ΔFosB 및 칼슘 / 칼 모둘린 의존성 단백질 키니 아제 II가 관여하는 피드 포워드 루프를 필요로한다.

전사 인자 ΔFosB 및 뇌 강화 칼슘/칼모듈린 의존성 단백질 키나아제 II(CaMKIIα)는 코카인 또는 기타 정신자극 약물 남용에 만성적으로 노출되어 측좌핵(NAc)에서 유도되며, 여기서 두 단백질은 감작된 약물 반응을 매개합니다. . ΔFosB와 CaMKIIα 모두 NAc에서 AMPA 글루타메이트 수용체 발현 및 기능, NAc 중간 가시 신경 세포(MSNs)의 수상 돌기 형성 및 코카인에 대한 운동 감작을 조절하지만, 이들 분자 사이의 직접적인 연관성은 지금까지 탐구되지 않았습니다. 여기에서 우리는 ΔFosB가 단백질 안정화 Ser27에서 CaMKIIα에 의해 인산화되고 CaMKII가 쥐 NAc에서 ΔFosB의 코카인 매개 축적에 필요합니다.

반대로 우리는 ΔFosB가 생체 내에서 CaMKIIα 유전자 발현의 코카인 유도에 필요하고 충분하다는 것을 보여줍니다.₁-NAc 셸 하위 영역의 MSN 입력.

또한, ΔFosB의 NAc 과발현 후 NAc MSN에 대한 수지상 가시의 유도 및 코카인에 대한 행동 반응 증가는 ​​둘 다 CaMKII 의존적입니다.

중요한 것은 NAc에서 ΔFosB 및 CaMKII의 유도를 처음으로 시연합니다. 인간 코카인 중독자, 향후 치료 개입을 위한 가능한 목표를 제안합니다. 이러한 데이터는 ΔFosB 및 CaMKII가 만성 코카인에 대한 반응으로 뇌의 보상 회로를 조절하기 위한 핵심 메커니즘으로서 세포 유형 및 뇌 영역별 포지티브 피드포워드 루프에 관여한다는 것을 입증합니다.

개요

증가하는 증거는 유전자 발현의 변화가 약물 중독의 메커니즘에 기여한다는 견해를 뒷받침합니다.로비슨 앤 네슬러, 2011). 이러한 변화의 중요한 매개체 중 하나는 Fos 계열 전사 인자인 ΔFosB입니다.네슬러, 2008). 거의 모든 남용 약물의 만성 투여는 보상 행동에 필수적인 변연계 영역인 측좌핵(NAc)에서 ΔFosB의 오래 지속되는 축적을 유도합니다. 에스이러한 유도는 D1 도파민 수용체를 발현하는 NAc 중간 가시 뉴런(MSN)의 부류에 특이적으로 나타납니다. 이 D1 형 NAc MSN에서 ΔFosB의 유도 가능한 과발현은 운동을 증가시키고 코카인과 모르핀에 대한 보상 반응 (Kelz 등, 1999; Zachariou 등, 2006), 코카인 자가 투여 증가 포함(Colby 등, 2003). 게다가, ΔFosB 전사 활성의 유전적 또는 바이러스성 차단은 이러한 약물의 보상 효과를 감소시킵니다.Zachariou 등, 2006), 이러한 ΔFosB의 지속적인 유도가 만성 약물 투여에 의해 NAc에서 유도된 지속적인 변화의 중요한 매개체임을 나타냅니다..

ΔFosB의 비정상적인 안정성(다른 모든 Fos 계열 단백질에 비해)은 전장 FosB에 존재하는 degron 도메인의 절단으로 인해 분자의 고유한 특성입니다.Carle et al., 2007) 및 규제 프로세스. ΔFosB는 인산화된다 체외에서 및 생체내에서 Ser27에서, 이 반응은 세포 배양 및 NAc에서 ΔFosB를 약 10배 더 안정화시킵니다. 생체내에서 (Ulery-Reynolds 등 2009). Ser27-ΔFosB가 카제인 키나아제-2의 기질인 것으로 나타났지만 체외에서 (Ulery et al., 2006), 그 메커니즘 생체내에서 인산화는 알려지지 않았습니다.

CaMKII(Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II)는 고도로 발현되는 세린/트레오닌 키나아제로, α 및 β 이소형이 XNUMX개의 동종 및 이종 홀로효소를 형성합니다. 생체내에서, 여러 형태의 신경가소성에 필수적입니다. (리스만 외, 2002; 콜브란과 브라운, 2004). CaMKIIα는 만성 암페타민에 의해 NAc 껍질에서 선택적으로 유도된다.Loweth et al., 2010), NAc 껍질에서 CaMKII 활동의 약리학적 차단은 암페타민에 대한 행동 감작을 감소시킵니다(Loweth et al., 2008) 및 코카인 (피어스 (Pierce) 등, 1998), 이 NAc 하위 영역에서 CaMKIIα의 바이러스 과발현은 암페타민에 대한 운동 감작과 자가 투여를 강화합니다.Loweth et al., 2010). CaMKIIα는 AMPA 글루타메이트 수용체 서브유닛의 조절을 통해 보상 행동에 영향을 미칠 수 있습니다.피어스 (Pierce) 등, 1998), CaMKIIα 활성은 AMPA 수용체 기능 및 여러 형태의 신경가소성에서 시냅스 표적화와 오랫동안 연관되어 왔기 때문에(Malinow 및 Malenka, 2002).

이 문헌은 ΔFosB와 CaMKII 사이의 몇 가지 유사점을 보여줍니다. 둘 다 남용 약물의 다중 행동 효과에 필요하고 충분하며 둘 다 다양한 신경 세포 유형에서 수지상 가시를 상향 조절합니다. 생체내에서 (Jourdain 등, 2003; Maze 등, 2010), 둘 다 AMPA 수용체의 조절을 통해 적어도 일부 행동 효과를 발휘합니다(Kelz 등, 1999; Malinow 및 Malenka, 2002; Vialou 등, 2010). 이러한 유사점에도 불구하고 ΔFosB와 CaMKII 사이의 기능적 연결은 알려져 있지 않습니다. 여기에서 우리는 ΔFosB와 CaMKII 사이의 상호 조절을 설정하고 두 단백질이 코카인에 의해 유도되고 다양한 코카인 반응을 조절하는 NAc 쉘에서 D1 유형 MSN 특정 피드 포워드 루프를 형성함을 입증합니다. 생체내에서.

이동 :

재료 및 방법

실험 1: 코카인 처리 후 NAc 쉘 및 코어의 iTRAQ 단백질체 분석(Fig 1A)

성인(8주) 수컷 쥐에게 20일 동안 하루에 한 번 24mg/kg 코카인 또는 식염수 비히클을 IP 투여했습니다. 마지막 주입 XNUMX시간 후, NAc 쉘과 코어를 미세해부했습니다(Fig 1A) 및 플래시 고정. iTRAQ 분석은 이전에 설명한 대로 수행되었습니다(로스 외, 2004; Davalos 등, 2010).

그림 1

코카인에 의한 NAc의 CaMKII의 쉘 특이 유도

실험 2: 코카인 처리 후 쥐 NAc 코어 및 쉘의 단백질 변화 정량화(그림 1B–D)

성인(8주) 수컷 쥐에게 운동 기록실에서 10일 동안 하루에 한 번 5mg/kg 코카인 또는 식염수 비히클 IP를 투여했습니다. 이전에 코카인("만성"이라고 함)으로 치료한 동물과 식염수로 치료한 동물의 일부("급성"이라고 함)에서 코카인(XNUMXmg/kg IP)의 단일 주사에 대한 운동 반응이 기록되었고 식염수에 대한 운동 반응이 기록되었습니다. 나머지 만성 식염수 처리 동물("식염수"라고 함)에서 단독으로 기록되었습니다. 이동 활동 분석은 설명된 대로 수행되었습니다(히로이 (Hiroi) 등, 1997). 간단히 말해서, 성체 수컷 쥐를 18"×24" PAS 오픈 필드 기록 상자(San Diego Instruments)에 30분 동안 넣어 길들여지게 하고 식염수를 IP로 한 번 주사하고 추가로 30분 동안 모니터링한 다음 5 mg/kg 코카인의 단일 IP 주입 및 30분 동안 모니터링.

이 최종 주사 24시간 후, 신경 단백질 수준 및 인산화 상태에 대한 마취제의 효과를 피하기 위해 마취 없이 래트의 목을 베었다. 뇌를 1.2mm 매트릭스(Braintree Scientific)에서 연속적으로 슬라이스하고 표적 조직을 NAc 코어용 14게이지 펀치 및 나머지 코어용 12게이지 펀치를 사용하여 프로테아제(Roche) 및 포스파타제(Sigma Aldrich) 억제제를 함유하는 인산염 완충 식염수에서 제거했습니다. NAc 쉘용 조직(참조 Fig 1A) 드라이아이스 위에서 즉시 동결시켰다. 샘플을 수정된 RIPA 완충액(10mM 트리스 염기, 150mM 염화나트륨, 1mM EDTA, 0.1% 소듐 도데실 설페이트, 1% 트리톤 X-100, 1% 소듐 데옥시콜레이트, pH 7.4, 프로테아제 및 포스파타제 억제제)에서 가벼운 초음파 처리로 균질화했습니다. 위와 같이. Laemmli 완충액을 첨가한 후 단백질을 4-15% 폴리아크릴아미드 구배 겔(Criterion System, BioRad)에서 분리하고 Odyssey 시스템(Li-Cor)을 사용하여 제조업체 프로토콜에 따라 Western blotting을 수행했습니다.

실험 3: 코카인 금단 후 쥐 NAc 코어 및 쉘의 단백질 변화 정량화(무화과 1E)

성인(8주) 수컷 쥐에게 10일 동안 하루에 한 번 14mg/kg 코카인 또는 식염수 비히클을 IP 투여했습니다. 마지막 주사 14일 후, 식염수로 치료한 동물은 또 다른 식염수 주사("식염수"라고 함)를 받았고, 코카인으로 치료한 동물은 또 다른 식염수 주사(14일 금단 또는 "14d WD"라고 함) 또는 코카인을 한 번 주사했습니다. 도전을 위해 "XNUMXd WD Chal"이라고 함). 최종 주사 XNUMX시간 후, 동물을 참수하고 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 실험 2.

실험 4: 코카인 자체 투여 후 쥐 NAc 코어 및 쉘의 단백질 변화 정량화(그림 2A–C)

쥐는 0.5일 동안 고정 비율 1 일정에 따라 0.5시간 세션에서 XNUMX mg/kg/코카인 주입을 자가 투여하도록 훈련되었습니다. XNUMX번의 기본 세션 후 쥐를 두 그룹으로 나누고 마지막 두 세션에서 코카인 섭취량에 따라 균형을 맞췄습니다. 한 그룹의 쥐는 XNUMX시간 동안 코카인(XNUMXmg/kg/주입)을 자가 투여(단기 접근, ShA)하는 반면 다른 그룹의 쥐는 XNUMX시간 세션(장기 접근, LgA)에서 코카인을 자가 투여했습니다. ) 추가 XNUMX일 동안(에스컬레이션 세션).

설명된 대로 면역조직화학을 위해 뇌 절편을 처리했습니다(페로 티 (Perrotti) 등, 2004). 뇌는 약물에 마지막으로 노출된 후 18-24시간 후에 관류되었고, 그 결과 남아있는 모든 면역 반응성이 ΔFosB를 반영하도록 잔류 전장 FosB 단백질이 분해되었습니다. 이 분해는 ΔFosB를 인식하지 않는 전장 FosB의 C 말단에 대한 항체로 유의한 염색을 나타내지 않는 웨스턴 블롯팅에 의해 확인되었습니다(데이터는 표시되지 않음). 35 μm 절편으로 자른 후 맹검 관찰자에 의해 각 쥐의 NAc를 통해 40개 절편에서 ΔFosB 면역양성 세포의 수를 정량화한 다음 각 동물의 영역별로 XNUMX× 필드당 평균값을 계산했습니다. 각 동물은 통계 분석을 위한 개별 관찰로 간주되었습니다. Paxinos 및 Watson을 사용하여 관심 영역을 식별했습니다(Paxinos와 Watson, 2007).

CaMKIIα 면역반응성의 정량화는 기술된 바와 같이 Licor 시스템을 사용하여 수행되었다(Covington et al., 2009). CaMKII 및 GAPDH의 통합 강도는 Odyssey 소프트웨어로 결정되었습니다. 결과는 mm당 통합 강도 값으로 표시됩니다.² 평균 ± sem(n = 그룹당 4–10). GAPDH의 값은 슬라이스 두께 및 조건에 대한 CaMKII 강도를 정규화하기 위한 참조로 사용되었습니다.

그림 2

자가 투여 쥐와 인간 코카인 중독자의 NAc 껍질에서 CaMKII 유도

실험 5: 코카인 의존 인간의 단백질 수준 정량화(무화과 2D)

순서

사후 인간 뇌 조직은 Quebec Suicide Brain Bank에서 입수했습니다. (Douglas Mental Health University Institute, 몬트리올, 퀘벡, 캐나다). 조직 보존은 기본적으로 설명된 대로 진행되었습니다(퀴리온 등, 1987). 간단히 말해서, 뇌가 추출되면 스티로폼 상자의 젖은 얼음 위에 놓고 Quebec Suicide Brain Bank 시설로 급히 이송됩니다. 반구는 뇌, 뇌간 및 소뇌의 중간에 시상 절단으로 즉시 분리됩니다. 혈관, 송과선, 맥락총, 소뇌 절반, 뇌간 절반은 일반적으로 왼쪽 반구에서 해부된 다음 동결되기 전에 1cm 두께의 조각으로 관상으로 절단됩니다. 후반부 소뇌는 동결되기 전에 시상으로 1cm 두께의 조각으로 절단됩니다. 조직은 ~2초 동안 -40°C에서 60-메틸부탄으로 급속 동결됩니다. 모든 냉동 조직은 장기 보관을 위해 -80°C에서 비닐 봉지에 별도로 보관됩니다. 환경의 온도를 제어하기 위해 주위에 드라이아이스가 있는 스테인리스 강판의 냉동 관상 슬라이스에서 특정 뇌 영역을 해부합니다. Western blotting은 다음에 설명 된대로 수행되었습니다. 실험 2.

보병대

코호트는 37-3세 범위의 남성 15명과 여성 66명으로 구성되었습니다. 모든 피험자는 장기간의 고통 상태 또는 장기간의 의학적 질병 없이 갑자기 사망했습니다.. 각각의 경우에 사망 원인은 퀘벡 검시관 사무실에서 확인되었고 사망 당시 약물 및 불법 약물 사용에 대한 정보를 얻기 위해 조직 샘플로 독성 검사를 실시했습니다. 피험자 그룹은 코카인 의존에 대한 SCID-I 기준을 충족한 20명의 개인으로 구성되었습니다. 대조군은 코카인 의존 병력이 없고 주요 정신과적 진단이 없는 20명의 피험자로 구성되었습니다. 모든 피험자는 뇌 조직에 직접적인 영향을 미치지 않는 원인으로 갑자기 사망했습니다. 평균 피험자 연령, 냉장 지연 및 pH에 대해 그룹을 일치시켰습니다. 모든 피험자에 대해 이전에 설명한 대로 심리적 부검을 수행했습니다(Dumais 등, 2005), 정신과 및 병력에 대한 자세한 사례 정보와 기타 관련 임상 및 사회인구학적 데이터에 액세스할 수 있습니다. 간단히 말해서 훈련된 면접관이 DSM-IV에 대한 구조화된 임상 인터뷰 사망한 정보원이 한 명 이상 있는 정신 장애(SCID-I). 임상의 패널이 SCID-I 평가, 사례 보고서, 검시관의 메모 및 의료 기록을 검토하여 합의된 정신과 진단을 얻었습니다.

실험 6: 래트 NAc에 대한 크로마틴 면역침전(그림 3A–C)

성인(8주) 수컷 쥐에게 10일 동안 하루에 한 번 24mg/kg 코카인 또는 식염수 비히클을 IP 투여했습니다. 마지막 주입 14시간 후, NAc 쉘과 코어를 미세해부했습니다. 크로마틴 면역침전(ChIP)은 총 98개 그룹(총 7마리의 동물, 7개의 코카인 풀, 80개의 식염수 풀)에서 그룹당 280마리의 래트로부터 쉘 또는 코어의 양측 NAc 펀치를 풀링하여 수행되었습니다. 조직을 가교하고, 세척하고, 초음파 처리에 의해 염색질이 전단될 때까지 -1°C에서 보관했습니다. 전단된 염색질은 이전에 자기 비드(Dynabeads M-450, Invitrogen)에 결합된 항체와 함께 밤새 배양되었습니다. 비 면역 IgG를 대조군으로 사용했습니다. 역 가교 및 DNA 정제 후 qPCR을 사용하여 CaMKIIα 프로모터 DNA의 수준을 측정했습니다. 프라이머는 전사 시작 부위 ~XNUMXbp 이전에 위치한 AP-XNUMX 컨센서스 서열을 포함하는 영역을 증폭하도록 설계되었습니다(정방향: ACTGACTCAGGAAGAGGGATA; 역방향: TGTGCTCCTCAGAATCCACAA).

그림 3

CaMKIIα의 세포 유형 및 지역별 ΔFosB 유도 생체내에서

실험 7: 세포 유형별 ΔFosB 과발현으로 CaMKII 전사체 및 단백질 발현 측정(무화과 3D)

에서 유래된 수컷 비트랜스제닉 마우스 NSE-tTA (라인 A) × TetOp-ΔfosB (11행) 및 NSE-tTA (라인 B) × TetOp-FLAG-ΔfosB (11행) 마우스(Chen 등, 1998; Kelz 등, 1999; Werme 등, 2002; Zachariou 등, 2006)는 발생하는 동안 ΔFosB 발현을 억제하기 위해 100 μg/ml doxycycline에서 고안되고 자랐습니다. 한배새끼는 젖을 뗀 시점에 나뉘었습니다: 반은 독시사이클린에 남아 있었고 나머지 반은 물로 전환되었으며, 동물들은 ΔFosB의 전사 효과가 최대가 되는 8-11주 후에 사용되었습니다.Kelz 등, 1999; McClung과 Nestler, 2003). 전사 분석을 위해 마우스를 빠르게 참수하고 뇌를 제거하여 얼음 위에 두었습니다. NAc의 해부는 14-게이지 니들 펀치로 취했고 RNA가 추출될 때까지 드라이아이스에서 빠르게 동결되었습니다. RNA 분리, qPCR 및 데이터 분석은 이전에 설명한 대로 수행되었습니다(LaPlant 등, 2009). 간단히 말하면, RNA는 TriZol 시약(Invitrogen)으로 분리되었고 Qiagen의 RNAeasy 마이크로 키트로 추가로 정제되었으며 Agilent의 Bioanalyzer로 품질을 확인했습니다. iScript(BioRad)를 사용하여 역전사를 수행했습니다. qPCR은 Applied Biosystems 7900HT RT PCR 시스템에서 다음 주기 매개변수로 수행되었습니다: 10°C에서 95분; 40°C에서 95분, 1°C에서 60초, 30°C에서 72초의 30주기; 단일 PCR 산물의 확인을 위한 해리 곡선을 생성하기 위해 95°C까지 등급이 매겨진 가열. ΔFosB 및 CaMKIIα 단백질 발현의 면역조직화학적 분석은 다음에 기술된 바와 같이 수행하였다. 실험 4.

실험 8: 코카인 매개 단백질 변화에 대한 Intra-NAc D1 및 D2 도파민 수용체 길항제의 효과(무화과 3H)

성인(8주) 수컷 쥐에게 10일 동안 하루에 한 번 30mg/kg 코카인 또는 식염수 비히클("비히클" 그룹) IP를 투여했습니다. 각각의 코카인 주사 1분 전, D23390 수용체 길항제 SCH 0.5(1 mg/kg, "D2 Ant" 그룹) 또는 D0.5 수용체 길항제 eticlopride(2 mg/kg, "D24 Ant" 그룹) 중 하나를 쥐에게 IP 투여했습니다. , 또는 식염수 대조군 주사("코카인" 그룹). 최종 주사 XNUMX시간 후 동물의 목을 베고 단백질을 Western blotting으로 정량하였다. 실험 2.

실험 9: 단백질 발현에 대한 AAV-매개된 ΔFosB 과발현의 효과(그림 4 A–C)

AAV-GFP(녹색 형광 단백질) 또는 AAV-GFP-ΔFosB(Maze 등, 2010). 33 게이지 바늘(Hamilton)이 모든 수술에 사용되었으며, 그 동안 0.5 μl의 정제된 고역가 바이러스를 5분 동안 양측에 주입한 후 주입 후 추가 5분 휴식 기간을 가졌습니다. 모든 거리는 Bregma를 기준으로 측정됩니다: 10° 각도, AP = +1.7mm, 위도 = 2.5mm, DV = -6.7mm. 수술 14일 후, ΔFosB 과발현의 행동 효과를 평가하기 위해 운동 모니터링 챔버에서 동물에게 10mg/kg 코카인을 단일 IP 주사했습니다. 이 최종 주사 24시간 후, 래트를 다음과 같이 참수하였다. 실험 2, 및 조직 현미해부는 GFP-양성 NAc 조직을 얻기 위해 형광 현미경 안내 하에 수행되었다. 그런 다음 Western blotting을 다음과 같이 수행했습니다. 실험 2.

그림 4

ΔFosB는 NAc 껍질에서 코카인 매개 D1 수용체 의존성 CaMKIIα 유도에 필요하고 충분합니다.

실험 10: AAV 매개 ΔJunD 과발현이 코카인 의존성 단백질 발현에 미치는 영향(그림 4 D–F)

AAV-GFP 또는 AAV-GFP-ΔJunD의 정위 주입은 다음과 같이 수행되었습니다. 실험 8. 수술 14일 후 동물에게 10 mg/kg 코카인 또는 식염수 비히클 IP를 하루에 한 번 5일 동안 운동 기록 챔버에서 투여했습니다. 코카인(24mg/kg IP) 또는 식염수의 단일 주사에 대한 운동 반응이 기록되었습니다. 이 최종 주사 XNUMX시간 후, 래트의 목을 베고, 조직을 채취하고, 웨스턴 블롯을 다음과 같이 수행하였다. 실험 9.

실험 11 : 체외에서 단백질 키나제 분석(그림 5A–D)

재조합 CaMKIIα와 ΔFosB는 곤충 세포에서 정제되었다(Brickey 등, 1990; Jorissen 등, 2007), 단백질 키나아제 분석을 수행했습니다(콜브란, 1993), 앞에서 설명한 대로. 간략하게, CaMKII는 2.5μM(또는 표시된 농도)의 ΔFosB, 1mM Ca와 함께 얼음 위에서 사전 배양되었습니다.²⁺, 40mM Mg²⁺, 15 μM 칼모듈린 및 200 mM HEPES pH 7.5. 인산화는 [γ-가 있거나 없는 200 μM ATP의 첨가에 의해 개시되었다.³²P]ATP 및 실온에서 10분 동안 진행하도록 허용됨(그림 5A & B) 또는 얼음 위에서 2분(그림 5C&D). 제품은 Western blotting(그림 5A & B) 또는 자동 방사선 사진 및 섬광 계수(그림 B–D).

그림 5

ΔFosB는 CaMKIIα의 강력한 기질입니다.

실험 12: Ser27 △FosB 인산화 확인(무화과 5E)

체외 키나아제 분석은 다음과 같이 수행되었습니다. 실험 11, SDS-PAGE로 단백질을 분리하고 ΔFosB에 해당하는 밴드를 잘라내어 직렬 질량 분석을 수행했습니다. 모든 패널에서 해당 이온 조각의 m/z 할당은 이온 피크 상단에 표시됩니다. 공간 제한으로 인해 모든 조각 이온에 레이블이 지정되지는 않습니다. 일반적으로 조각 이온 라벨의 텍스트는 관심 인산화 부위의 존재를 직접 확인하거나 증거를 추가하는 경우를 제외하고는 검은색으로 표시되며, 이 경우 빨간색으로 표시됩니다. 백본 단편화 산물에 대한 증거는 단일 아미노산 문자 지정과 함께 빨간색으로 표시된 인산화 잔기의 검출된 부위와 함께 포스포펩티드의 서열 판독에 제시됩니다. 관찰된 조각 이온의 수치적 설명은 펩티드 서열에 b 및 y 이온으로 표시됩니다. 더 낮은 강도 조각 이온을 표시하기 위한 m/z 축 섹션의 확대/축소 계수는 각 조각 질량 스펙트럼의 상단에 표시됩니다. 패널 H에 표시된 단편 이온은 Ser27, Ser28, Ser31 및 Thr34 부위에서 다른 인산화된 이소형의 혼합물 내에서 Ser37 인산화된 이소형의 존재를 확인합니다. pa5, pa5-P, pb5 및 pb5-P 이온의 존재는 Ser27 잔기의 인산화를 고유하게 확인합니다.

실험 13: Ser27 인산화 정량(무화과 5F)

표준 펩타이드는 Ser27 ΔFosB의 포스포 및 비포스포 형태를 모방하도록 설계되었습니다. 합성 및 정제 후, 각각의 "무거운" 이디오타입 펩티드를 50/50 아세토니트릴/물 완충액에 용해시키고 아미노산 분석을 위해 보내어 합성 펩티드 원액 상의 절대 농도를 결정하였다. 그런 다음 각각의 "무거운" 펩타이드를 4000 QTRAP 질량 분석기(MS)에 직접 주입하여 MS/MS 단편화 및 4000~1개의 MRM 전이를 위한 최상의 충돌 에너지를 결정했습니다. 다음으로 순수한 "무거운" 펩타이드를 1 QTRAP에서 LCMS로 처리하여 펩타이드 분리를 확인했습니다. Q3은 특정 전구체 m/z 값(Q1은 스캐닝하지 않음)으로 설정하고 Q2은 해당 펩타이드의 특정 단편에 해당하는 특정 m/z 값으로 설정하여 삼중 사중극자 모드에서 기기를 실행했습니다. MRM 모드에서 일련의 단일 반응(관심 조각 이온의 강도를 최적화하기 위해 충돌 에너지가 조정되는 전구체/조각 이온 전이)을 순차적으로 측정하고 주기(일반적으로 1.1-XNUMX초)를 전체적으로 반복했습니다. HPLC 분리의 전체 시간. MRM 전이는 기존 펩타이드의 MS/MS 스펙트럼에서 결정되었습니다. 그런 다음 고강도 단편 이온에 해당하는 펩타이드당 XNUMX개의 전이를 선택하고 충돌 에너지를 최적화하여 자동화 소프트웨어를 사용하여 MRM 전이의 신호 강도를 최대화했습니다. CaMKII 또는 대조군에 노출된 표준 펩타이드 및 ΔFosB 샘플에서 생성된 피크를 비교하여 반응에서 각 펩타이드 형태의 절대 풍부도를 결정했습니다. LC-MRM 데이터에 대한 데이터 분석은 AB Multiquant XNUMX 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다.

실험 14: CaMKII 과발현 마우스에서 ΔFosB 유도(무화과 5G&H)

T286D CaMKII를 과발현하는 트랜스제닉 마우스(메이포드 등, 1996; Kourrich et al., 2012) 및 야생형 한배새끼를 독시사이클린의 부재 하에 사육하여 트랜스진 발현을 허용하였다. 성인 마우스에게 20일 동안 매일 14회 24 mg/kg 코카인 또는 식염수 IP를 투여했습니다. 최종 주사 XNUMX시간 후, 동물을 참수하고 면역조직화학 및 ΔFosB 발현의 정량화를 하기와 같이 수행하였다. 실험 4.

실험 15: HSV 매개 ΔFosB 과발현 및 CaMKII 억제가 NAc 수지상 가시에 미치는 영향(그림 6A–E)

성체 수컷 마우스(8주)에 HSV-GFP, HSV-GFP-ΔFosB(Olausson 등, 2006), HSV-GFPAC3I 또는 HSV-GFPAC3I-ΔFosB. 이러한 구성에서 CaMKII 활성의 펩티드 기반 억제제인 ​​AC3I는 GFP의 C-말단에 융합됩니다. GFPAC3I는 다음 프라이머와 함께 GFPAC400I를 포함하는 pMM3-벡터를 주형으로 사용하여 PCR에 의해 클로닝되었습니다. GFP-AC3I-R: 5' CC TCCGGA TTACAGGCAGTCCACGGCCT 3'(클램프BspEIstop). 생성된 PCR 생성물을 NheI 및 BspEI 부위를 사용하여 p3+ 및 p5+-Δ FosB 벡터에 삽입하였다. 구조는 시퀀싱에 의해 검증되었습니다. 정위 좌표는 3° 각도, AP = +1005 mm, Lat = +1005 mm, DV = -10 mm입니다(Barrot et al., 1.6). 관류 및 뇌 절편은 다음과 같이 수행되었습니다. 실험 4.

척추 분석은 설명된 대로 수행되었습니다(Christoffel 등, 2011). 간단히 말해서, GFP를 발현하는 HSV 감염 세포에서 세포체로부터 50-150 μm 떨어진 수지상 세그먼트를 무작위로 선택했습니다. rayburst 알고리즘과 함께 NeuronStudio를 사용하여 형태학적 분석을 위해 공초점 LSM 710(Carl Zeiss)에서 이미지를 획득했습니다. NeuronStudio는 (1) 종횡비, (2) 머리 대 목 비율, (3) 머리 직경 값을 기준으로 가시를 가는 가시, 버섯 모양의 가시, 뭉툭한 가시로 분류합니다. 목이 있는 가시는 가느다란 가시 또는 버섯 가시로 분류될 수 있으며, 목이 뚜렷하지 않은 가시는 뭉툭한 가시로 분류됩니다. 목이 있는 척추는 머리 직경에 따라 가늘거나 버섯 모양으로 분류됩니다.

그림 6

CaMKII 활동의 차단은 NAc에서 ΔFosB의 형태 및 행동 효과를 방지합니다.

실험 16: HSV 매개 ΔFosB 과발현 및 CaMKII 억제가 코카인 반응에 미치는 영향(무화과 6F)

성체 수컷 쥐에게 다음과 같이 바이러스를 주입했습니다. 실험 15, 코카인의 단일 5 mg/kg 주사에 대한 운동 반응은 다음과 같이 측정되었습니다. 실험 9. 이동 데이터는 코카인 주입 후 30분 동안 전체 빔 중단으로 표시됩니다.

추가 정보

동물 주택

수컷 Sprague Dawley 쥐(250–275g, Charles River Laboratories)를 쌍으로 사육했습니다. 57주령 C6BL/1J 수컷 마우스(The Jackson Laboratory)를 케이지당 최대 23마리의 동물로 그룹 수용했습니다. 모든 동물은 실험 조작 전 25주 이상 동안 동물 시설에 길들여졌고 음식에 접근할 수 있는 12시간 명/암 주기(오전 7시에 조명 켜짐)로 기후가 조절되는 방(00–XNUMX°C)에 수용되었습니다. 그리고 물 광고 무제한. 실험은 Mount Sinai에서 Society for Neuroscience 및 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 지침에 따라 수행되었습니다.

약물

약물을 IP 투여하고 코카인(마우스의 경우 5 μl당 20–10 mg/kg, 쥐의 경우 1 ml당, NIDA) 및 SCH 23390 또는 eticlopride hydrochloride(0.5 ml당 1 mg/kg, Tocris)를 포함한 멸균 식염수에 용해했습니다. . 정위 수술을 위해 마우스를 멸균 식염수에 녹인 케타민(100mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)(Henry Schein)의 "칵테일"로 마취했습니다.

항체

CaMKIIα(전체): 북부 05–532, 1:5,000

CaMKII 인산-Thr286: Promega V111A, 1:1,000

ΔFosB(전체): 셀 시그널링 5G4, 1:250

ΔFosB 포스포-Ser27: 포스포솔루션, 1:500

GluA1(전체): Abcam, Ab31232, 1:1,000

GluA1 포스포-Ser831: 밀리포어 N453, 1:1,000

GluA1 포스포-Ser845: 케미콘 Ab5849, 1:2,000

GluA2: 밀리포어 07–598, 1:2,000

NR2A: 시그마 HPA004692, 1:2,500

NR2B: 밀리포어 Ab1557P, 1:1,000

통계 분석

모든 통계 분석은 Prism 6 소프트웨어 패키지(GraphPad)를 사용하여 수행되었습니다. 스튜던트 t-검정은 모든 쌍별 비교(t 값이 제공된 결과에 표시됨)에 사용되었고 일원 분산 분석은 모든 다중 비교(F 값이 제공된 결과 섹션에 표시됨)에 사용되었습니다.

이동 :

결과

만성 코카인은 NAc 껍질에서 CaMKII를 유도합니다

많은 연구에서 NAc 껍질과 코어에 있는 MSN이 남용 약물에 대한 만성 노출에 대해 다른 생화학적 및 생리학적 반응을 보인다고 밝혔습니다.쿠리치와 토마스, 2009; Loweth et al., 2010) 그리고 두 하위 영역이 약물 탐색 행동을 차등적으로 조절한다는 것 (Ito 등, 2004). NAc 껍질의 단백질 성분에 대한 코카인의 차등 효과를 결정하기 위해 대 코어에서는 iTRAQ(Multiplexed Isobaric Tagging) 및 MS/MS(tandem mass spectroscopy)를 사용했습니다. 성체 수컷 쥐에게 20일 동안 매일 코카인(7mg/kg) 또는 식염수를 IP 주사했습니다. 마지막 주입 24시간 후, NAc 쉘과 코어를 미세해부했습니다(Fig 1A) 및 플래시 고정. 그런 다음 이 샘플의 단백질을 iTRAQ을 사용하여 정량화했습니다. 1개의 모든 CaMKII 이소형은 코어와 비교하여 NAc 쉘에 특이적인 코카인 처리 후 발현이 크게 증가한 것으로 나타났습니다. 이전에 다른 시스템에서 다양한 CaMKII 기질과 연관되었던 PP2 촉매 및 조절 서브유닛과 PPXNUMXA를 포함한 여러 단백질 포스파타제(콜브란, 2004)도 비슷한 패턴을 따랐다. 이러한 발견은 CaMKII 신호 전달 경로가 껍질 특이적인 방식으로 NAc의 코카인에 의해 두드러지게 조절된다는 새롭고 편견 없는 증거를 제공했습니다.

이 결과를 보다 정량적으로 검증하기 위해 위와 같이 쥐를 코카인(다양한 용량) 또는 식염수로 처리하고 코카인(5mg/kg) 또는 식염수 챌린지 용량에 대한 운동 반응을 측정했습니다. 10mg/kg의 코카인에 반복적으로 노출되면 운동 감작의 전형적인 패턴이 나타납니다.무화과 1B). 이 투여 요법에 대한 추가 연구에서는 Western blotting을 사용하여 반복된 코카인이 코카인의 최종 주입 24시간 후 NAc 껍질에서 선택적으로 CaMKIIα를 유도한다는 것이 밝혀졌습니다.그림 1C 및 D; p=0.0019; F=7.943; df=29). 또한, AMPA 수용체의 GluA831 서브유닛의 표준 CaMKII 기질 Ser1의 인산화는 코어가 아닌 NAc 쉘에서 상당히 증가한 반면(p=0.0261; F=4.208; df=28), CaMKIIα Thr286 자가인산화는 강력하지만 그렇지 않았습니다. 쉘에서만 유도에 대한 상당한 경향(무화과 1D). 몇몇 다른 글루타메이트 수용체는 영향을 받지 않았습니다. CaMKII의 이러한 측정치와 대조적으로, 동일한 조직 샘플은 NAc의 쉘(p=0.0260; F=4.189; df=29) 및 코어(p=0.0350; F=3.807; df=29) 모두에서 ΔFosB의 유도를 나타냈다. (그림 1C 및 D), 이전 연구 결과와 일치(페로 티 (Perrotti) 등, 2008).

AMPA 수용체의 코카인 조절에 대한 여러 이전 연구가 만성 코카인에서 약 14일 후 동물을 분석했기 때문에(토론 참조), 이 시점에서 이러한 생화학적 분석을 반복했습니다. 우리는 코카인을 마지막으로 주입한 지 14일 후에 ΔFosB가 NAc에서 상승된 상태로 유지되는 반면(p=0.0288; F=4.258; df=22), CaMKII도 GluA1 Ser831의 인산화도 증가된 상태로 유지되지 않는다는 것을 발견했습니다.무화과 1E). 그러나 코카인의 단일 1 mg/kg 도전 용량 10시간 후, 총 CaMKII(p=0.0330; F=3.947; df=26) 및 GluA1 Ser831(p=0.0213; F=4.509; df=27)의 수준 인산화는 둘 다 초기 만성 코카인 노출 후 발견된 것과 유사한 정도로 상승한다.무화과 1E). 이러한 데이터는 NAc 껍질 뉴런이 아마도 CaMKII 유전자 프로모터의 직접 프라이밍을 통해 금욕의 연장된 기간 동안 CaMKII 유도를 위해 프라이밍되었음을 나타냅니다(토론 참조). 또한, ΔFosB 유도가 CaMKII 유도보다 더 지속적이라는 사실은 토론에서 다룬 바와 같이 염색질 기반이든 아니든 CaMKII 규정에 "제동"을 가하는 추가 메커니즘의 존재를 시사합니다.

이러한 관찰을 더욱 강화하기 위해 자발적인 약물 섭취와 관련된 코카인 자체 관리 모델을 조사했습니다. 성체 수컷 쥐에게 코카인을 단기간 또는 장기간 투여했습니다. 예상대로 (Ahmed와 Koob, 1998), 장기간의 접근 조건만이 약물의 자체 투여를 증가시켰습니다(Fig 2A). ΔFosB는 장기간에 의해 더 크게 유도되었습니다. 대 NAc 쉘(p=0.0011; F=11.12; df=17)과 코어(p=0.0004; F=13.86; df=17) 모두에서 코카인에 대한 짧은 액세스. 대조적으로, CaMKIIα는 코카인에 장기간 접근해야만 NAc 껍질에서 유도된다.그림 2B 및 C; p=0.0236; F=4.957; df=16). 접근이 짧은 동물(~12mg/kg IV), 장기 접근 동물(~70mg/kg IV), 실험자가 투여한 동물(10mg/kg)의 평균 일일 코카인 섭취량을 비교하는 것은 흥미롭습니다. 후자가 ΔFosB 및 CaMKII의 강력한 유도를 유도하는 반면 짧은 액세스는 그렇지 않은 이유를 물어보십시오. 이러한 불일치는 최고 코카인 수치의 차이(실험자가 투여한 코카인은 단일 볼루스 IP로 제공되는 반면 자가 투여 코카인은 여러 IV 용량을 통해 전달됨) 또는 약물 노출 기간의 차이(실험자의 경우 7일)로 인한 것 같습니다. 자가투여의 경우 19일).

코카인 작용에서 ΔFosB 및 CaMKII에 대한 많은 문헌에도 불구하고 인간 코카인 사용자에 대한 이러한 단백질에 대한 연구는 없습니다. 여기서 우리는 ΔFosB(p=0.0316; t=1.921; df=34)와 CaMKII(p=0.0444; t=1.755; df=32)의 수준이 코카인 의존적 인간의 NAc에서 증가한다는 첫 번째 증거를 제시합니다.무화과 2D, 표 1). 이 데이터는 설치류 NAc에서 코카인에 의한 ΔFosB 및 CaMKII 유도에 대한 우리의 조사가 임상적으로 인간 코카인 중독과 관련이 있음을 나타냅니다.

표 1

인간 코카인 중독자와 일치하는 대조군의 샘플 특성화

ΔFosB는 NAc Shell의 D1 유형 MSN에서 CaMKII 전사를 선택적으로 조절합니다.

CaMKII와 ΔFosB가 모두 설치류 NAc에서 코카인에 의해 상향 조절된다는 사실을 통해 ΔFosB가 CaMKII 유전자의 전사를 조절할 수 있는지 여부를 결정할 수 있었습니다. 우리는 이전에 NAc의 편향되지 않은 마이크로어레이 분석에서 CaMKIIα를 ΔFosB의 가능한 표적으로 보고했습니다.McClung과 Nestler, 2003), 그러나 이 발견은 해당 연구에서 더 이상 검증되지 않았습니다. 우리는 먼저 정량적 ChIP(qChIP-ChIP에 이어 정량적 PCR)를 사용하여 ΔFosB가 성체 수컷 쥐의 NAc에서 CaMKIIα 유전자 프로모터에 결합하는지 여부를 확인했으며, 이 결합이 껍질에서 만성 코카인 투여에 의해 현저하게 증가한다는 것을 발견했습니다. p=0.0133; t=2.901; df=12), 그러나 핵심이 아닌 소구역(Fig 3A). CaMKIIα 프로모터에 결합하는 ΔFosB의 이 하위 영역별 차이와 관련된 메커니즘을 더 이해하기 위해 qChIP를 사용하여 이 게놈 영역에서 히스톤 변형 상태를 특성화했습니다. 이전 연구에서는 전체 마우스 NAc에서 CaMKIIα 프로모터에서 H3 아세틸화의 코카인 유도를 입증했습니다.왕 (Wang) 등, 2010). 대조적으로, 우리는 코카인이 NAc 코어에서 선택적으로 CaMKIIα 프로모터에서 H3 아세틸화를 감소시킨다는 것을 발견했습니다.무화과 3B; p=0.0213; t=2.726; df=10), 껍질에 분명한 변화가 없으며, ΔFosB 결합을 넘어서는 하위 영역 특이적 염색질 변경과 일치합니다. 억제 마크인 디메틸화 H3 라이신 9(H3K9me2)에 대한 qChIP은 쉘 및 코어 하위 영역 모두에서 감소 경향을 나타냈습니다.무화과 3C).

ΔFosB가 CaMKIIα 전사를 조절하는지 확인하기 위해 생체내에서, 우리는 D1에서 특이적으로 ΔFosB를 유도적으로 과발현하는 두 개의 비트랜스제닉 마우스 라인을 활용했습니다. 대 음용수에 doxycycline 투여로 제어되는 방식의 D2 유형 MSN(Chen 등, 1998; Kelz 등, 1999; Werme 등, 2002). D1-유형 MSN에서만 ΔFosB를 과발현하는 성체 수컷 마우스는 NAc에서 CaMKIIα mRNA 수준이 상당히 증가했으며(p=0.0337; t=1.996; df=13), D2-유형 MSN에서 우세하게 ΔFosB를 과발현하는 마우스에서는 이러한 효과가 나타나지 않았습니다.무화과 3D). D1형 MSN에서 ΔFosB 발현에 의해 유도된 CaMKIIα mRNA의 증가는 NAc 쉘(p=0.0030; t=3.578; df=14)과 코어(p=0.0392; t =2.275, df=14, 그림 3E 및 F). 이 데이터는 ΔFosB가 두 하위 영역의 D1 유형 MSN에서 CaMKIIα 유전자 발현을 유도할 수 있음을 보여줍니다. 그림 3B CaMKIIα 프로모터(예: 감소된 아세틸화)에서 코카인 매개 염색질 변화가 ΔFosB가 코카인 후 코어 하위 영역에서 CaMKII를 상향 조절하는 것을 방지함을 시사합니다.

우리의 유전자 변형 마우스 데이터는 CaMKII 유전자 발현의 ΔFosB 유도가 NAc의 D1 유형 MSN에 특이적인 것으로 나타 났기 때문에 다음으로 CaMKII의 코카인 의존성 상향 조절이 D1 도파민 수용체의 활성화를 필요로하는지 여부를 결정하려고했습니다. 성체 수컷 쥐에게 전과 같이 만성 코카인 또는 식염수를 투여했지만 각 주사 30분 전에 코카인 그룹의 쥐에게 식염수, D1 길항제 SCH 23390(0.5 mg/kg) 또는 D2 수용체 길항제 에클로프라이드를 IP 주사했습니다. (0.5mg/kg). 코카인의 마지막 주입 후 24시간 후에 동물을 분석하였다. Western blotting은 이전에 보고된 바와 같이 D1가 아닌 D2 길항제가 ΔFosB의 코카인 매개 증가를 완전히 차단함을 밝혔습니다(p<0.0001; F=18.96; df=18).Nye 등, 1995), 뿐만 아니라 CaMKII(p=0.0005; F=10.99; df=18; 무화과 3G와 H). 이러한 데이터는 코카인이 특히 NAc 쉘의 D1 유형 MSN에서 CaMKII 유전자 발현의 ΔFosB 매개 증가에 관여한다는 가설을 뒷받침합니다. 이 뇌 영역 내에서 CaMKII 발현에 대한 코카인의 이러한 세포 유형 특정 효과를 직접 입증하는 것은 향후 연구에서 중요할 것입니다.

ΔFosB는 NAc 쉘에서 CaMKII의 코카인 유도에 필요하고 충분합니다.

bitransgenic 마우스의 사용을 보완하기 위해 다음으로 쥐에서 바이러스 매개 유전자 전달을 사용하여 CaMKIIα의 코카인 유도를 매개하는 ΔFosB의 역할을 연구했습니다. 우리는 ΔFosB + GFP 또는 GFP 단독을 과발현하기 위해 성체 수컷 쥐의 NAc 껍질(껍질을 선택적으로 표적으로 삼을 수 있음)에 아데노 관련 바이러스(AAV) 입자를 양측으로 주입했습니다. 그런 다음 동물에게 10mg/kg 코카인을 단일 IP 주사했습니다. ΔFosB/GFP를 과발현하는 동물은 GFP만 과발현하는 동물에 비해 증가된 운동 반응을 보였다.Fig 4A). 단일 코카인 주사 24시간 후, GFP-양성 NAc 조직을 형광 광원 하에서 해부하여 이들 동물로부터 절제하였다. 이 조직의 Western blotting(그림 4B 및 C)는 강한 ΔFosB 과발현뿐만 아니라 만성 코카인 투여에서 보이는 유도와 유사한 GFP 동물(p=0.0070; t=2.894; df=30)에 비해 총 CaMKIIα 단백질의 상당한 증가를 나타냈습니다. 또한, Thr286에서의 CaMKIIα 자가인산화(효소 활성화를 나타냄)는 ΔFosB 과발현에 의해 증가되었고(p=0.0330; t=2.243; df=28), CaMKII 기질인 GluA831의 Ser1(p=0.0540; t= 2.012; df=28), 다시 만성 코카인의 작용을 모방(그림 1C 및 D). 티종합하면, 이 데이터는 NAc 껍질에서의 ΔFosB 발현이 코카인에 대한 운동 민감화 및 이 하위 영역에서의 CaMKII 유도 및 활성화에 충분하다는 추가적인 증거를 제공합니다.

우리는 ΔFosB가 NAc 껍질에서 CaMKIIα의 코카인 매개 유도에도 필요한지 여부를 결정하기 위해 유사한 접근법을 사용했습니다. AAV는 ΔFosB 전사 활성화의 음성 조절자인 ΔJunD라고 하는 절단된 JunD 단백질을 과발현하는 데 사용되었습니다.Winstanley 등, 2007) 플러스 GFP 또는 GFP 단독. 10주 후, 이식유전자 발현이 최대가 되면, 동물에게 7일 동안 매일 코카인(5mg/kg) 또는 식염수를 투여하고, 마지막 만성 주사 24시간 후 코카인 챌린지(XNUMXmg/kg)에 대한 운동 반응을 테스트했습니다.무화과 4D). ΔJunD 과발현은 코카인에 대한 운동 감작을 막았고 또한 NAc 껍질에서 CaMKIIα 유도 및 활성화를 막았습니다.그림 4E 및 F; p=0.0437; F=2.997; total df=38), 이는 ΔFosB 전사 활성이 이 하위 영역에서 CaMKIIα의 코카인 매개 유도에 필요함을 나타냅니다. 흥미롭게도, 우리는 ΔJunD가 식염수 및 코카인 처리 조건 모두에서 ΔFosB의 수준을 감소시키는 것을 발견했으며(p=0.0004; F=8.110; df=35), ΔFosB가 자체 발현 수준에 대해 AP-1 활동에 의존한다는 새로운 가능성을 제기했습니다.

Ser27에서 CaMKII 인산화 ΔFosB

사용 체외에서 단백질 키나아제 분석에서 우리는 정제된 ΔFosB가 CaMKIIα에 대한 강력한 기질임을 확인했습니다. 그의 인큐베이션₆- CaMKIIα 및 ATP를 포함하는 ΔFosB는 ΔFosB의 전기영동 이동도의 상향 이동을 일으켰습니다(Fig 5A); 여러 결과 밴드는 인산화의 여러 사이트를 제안했습니다. 비슷한 체외에서 [γ-³²P]ATP는 이동된 ΔFosB 밴드(무화과 5B), 단백질의 직접적인 인산화를 보여줍니다. 우리는 이전에 특성화된 ΔFosB의 Ser27에 대한 인광 특이 항체를 생성했습니다(Ulery et al., 2006). 이 항체는 Ser27-인산화된 ΔFosB를 포함하는 뇌 추출물에 대해 신호를 생성하지 않지만(데이터는 표시되지 않음), 우리는 체외에서 CaMKII를 사용한 키나제 분석(무화과 5B). ΔFosB의 CaMKII 인산화에 대한 동역학 분석은 그것이 키나아제에 대한 강력한 기질임을 나타냅니다.무화과 5C), 겉보기 K_M 5.7±2.0µM 및 K_CAT 2.3±0.3분의^{- 1}. 이러한 결과는 잘 특성화 된 많은 생체내에서 CaMKII의 기판(콜브란과 브라운, 2004). 또한, 우리는 CaMKII가 2.27±0.07 mol/mol의 화학양론으로 ΔFosB를 인산화한다는 것을 확인했습니다(무화과 5D), His 내에 CaMKII 인산화 부위가 적어도 세 개 있음을 나타냅니다.₆-ΔFosB 단백질, 동의 Fig 5A.

인산화의 개별 사이트를 조사하기 위해 우리는 샘플의 MS 분석을 사용했습니다. 체외에서 키나제 분석. 무화과 5E 이전에 특성화 된 Ser27 및 여러 추가 사이트에서 ΔFosB 인산화를 보여줍니다 (데이터는 표시되지 않음). Ser27의 이전 기능적 특성을 감안할 때, 우리는 Ser27의 phospho- 및 nonphospho-상태를 모방하는 표지된 합성 펩타이드를 생성하여 이 사이트에 집중한 다음, ΔFosB 전후의 ΔFosB의 MRM 분석에서 표준으로 알려진 양의 이러한 펩타이드를 사용했습니다. 체외에서 CaMKII에 의한 인산화. 후속 정량(무화과 5F) Ser27이 CaMKII의 강력한 기질임을 확인합니다. 이러한 결과는 ΔFosB 내의 여러 인산화된 잔기 중에서 Ser27이 CaMKII에 대해 특히 효과적인 기질임을 나타냅니다.

CaMKII는 NAc 쉘에서 ΔFosB의 코카인 축적을 중재합니다.

CaMKII는 ΔFosB를 인산화할 수 있기 때문에 체외에서 안정성을 획기적으로 높이는 사이트에서 체외에서 및 생체내에서 (Ulery et al., 2006; Ulery-Reynolds 등 2009), 우리는 CaMKII 활동이 NAc에서 ΔFosB 수준을 제어하는지 여부를 결정했습니다. 생체내에서. 이 문제를 해결하기 위해 먼저 NAc를 포함한 여러 뇌 영역에서 CaMKIIα(T286D)의 칼슘 비의존 돌연변이를 과발현하는 마우스 라인을 사용했습니다.메이포드 등, 1996; Kourrich et al., 2012). 우리는 20일 동안 하루에 한 번 14 mg/kg 코카인 또는 식염수를 연령에 맞는 성인 남성 돌연변이 및 야생형 한배새끼에게 주사한 다음 최종 주사 후 하루에 동물을 분석했습니다. 우리는 ΔFosB의 기본 수준이 NAc 껍질의 돌연변이 동물에서 증가했지만(p=0.0001; F=9.207; df=37), 코어(무화과 5G와 H). 놀랍게도 ΔFosB의 코카인 의존성 유도는 쉘과 코어 모두에서 돌연변이 동물에서 차단되었으며 이는 CaMKII가 NAc 쉘에서 ΔFosB 안정성을 직접 조절할 수 있지만 두 NAc 하위 영역의 코카인 활성화 경로에서 ΔFosB의 상류에 있을 수도 있음을 시사합니다. .

CaMKII 활동은 ΔFosB 매개 구조 및 행동 가소성에 필요합니다.

NAc MSN에서 수지상 가시의 코카인 유도는 이 뇌 영역에서 가장 잘 확립된 약물 유도 적응 중 하나이며 이러한 척추 유도는 약물에 대한 민감한 행동 반응과 관련이 있습니다.로빈슨과 콜브, 2004; 루소 (Russo) 등, 2010) 및 D1 유형 MSN에 대해 선택적인 것으로 보고됨(Lee 외, 2006). 우리는 최근에 NAc에서 수지상 돌기의 코카인 유도가 ΔFosB 및 그것의 다운스트림 전사 프로그램에 의존한다는 것을 입증했습니다.Maze 등, 2010). 수지상 척추 형태와 다른 뇌 영역 및 실험 시스템에서의 유도에 CaMKII가 관여하는 것에 관한 광범위한 문헌이 있지만(Jourdain 등, 2003; Penzes et al., 2008; 오카모토 외, 2009), NAc MSN 척추 형성에서의 역할은 연구되지 않았습니다. 따라서 우리는 이전에 CaMKII 활성을 억제하는 것으로 나타난 구조물인 GFP에 융합된 CaMKII 억제제 펩타이드 AC3I의 HSV 매개 과발현을 활용하여 ΔFosB 매개 MSN 돌기 가시의 유도에 CaMKII 활성이 필요한지 여부를 결정했습니다. 생체내에서 (Zhang et al., 2005; Klug 등, 2012). 성인 마우스의 NAc 껍질에서 ΔFosB의 바이러스 과발현은 MSN 수지상 척추 밀도의 상당한 증가를 유도했습니다(p<0.0001; F=8.558; df=59; 그림 6A 및 B) 이전에 보고된 바와 같이(Maze 등, 2010), 이러한 증가는 주로 얇고(p=0.0027; F=5.319; df=59) 척추 유형(p=0.0378; F=2.988; df=59) 척추 유형(둘 다 미성숙 척추로 생각됨)(그림 6C-E). 더 성숙한 버섯 모양의 등뼈에서는 효과가 나타나지 않았습니다. 그러나, GFP-AC3I가 동시발현되었을 때 가시의 ΔFosB 유도는 완전히 제거되었다(그림 6A–E), NAc 껍질에서 수상 돌기의 ΔFosB 유도에 CaMKII 활성이 필요함을 나타냅니다.

다음으로 동일한 바이러스 도구를 사용하여 코카인에 대한 행동 민감도에 대한 ΔFosB의 영향에 CaMKII 활동이 필요한지 여부를 결정했습니다. NAc 껍질에 바이러스를 주입한 지 72시간 후, 동물에게 5 mg/kg 코카인을 한 번 주사하고 운동 활동을 기록했습니다. 이전에 ΔFosB의 더 확장된 AAV 과발현으로 표시된 것처럼(Fig 4A), △FosB의 HSV-매개 과발현은 코카인에 대한 운동 민감도를 증가시켰다(p=0.0002; F=8.823; df=37; 무화과 6F). 수지상 가시의 유도와 마찬가지로, GFP-AC3I의 동시발현에 의한 CaMKII 활성의 억제는 ΔFosB 매개 코카인 민감도의 증가를 완전히 차단하여 CaMKII 활성이 코카인의 행동 효과에서 ΔFosB-유도 변경에 필요함을 나타냅니다.

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토론

본 연구는 코카인이 NAc에서 ΔFosB를 유도하여 NAc 껍질에서 CaMKIIα 유전자의 전사를 선택적으로 상향 조절하는 새로운 피드 포워드 메커니즘을 설명합니다.. 이후 CaMKIIα는 ΔFosB를 인산화 및 안정화시켜 더 많은 ΔFosB 축적과 추가 CaMKIIα 유도를 유도합니다.무화과 6G). 코카인에 만성적으로 노출되는 동안 두 단백질의 공동 증가 수준은 약물에 대한 민감한 행동 반응에 필수적인 방식으로 기여합니다. 이것은 ΔFosB와 CaMKII가 각각 이전에 코카인에 대한 행동 반응 증가에 필요한 것으로 입증되었기 때문에 특히 매력적인 가설입니다. (피어스 (Pierce) 등, 1998; Peakman et al., 2003), 특히 바이러스 접근 방식을 사용하여 NAc 쉘에서 ΔFosB에 대한 이 발견을 복제합니다(무화과 4 및 and66).

D1-유형 MSN에서 트랜스제닉 ΔFosB 과발현이 코카인 순진 동물의 NAc 껍질과 코어 모두에서 CaMKII 유도를 유도할 수 있지만, 코카인과 관련하여 두 하위 영역에서 발생하는 내인성 ΔFosB의 축적은 특히 NAc 껍질에서 CaMKII의 유도를 유도합니다. . 이 차이는 우리의 bitransgenic 모델에서 유도된 더 높은 수준의 ΔFosB와 관련될 수 있지만, 껍질에서 CaMKIIα 프로모터를 차별적으로 변경하는 코카인의 능력을 반영할 수도 있습니다. 대 핵심 MSN은 전자에서 ΔFosB 결합을 촉진하거나 후자 하위 영역에서 이를 배제합니다. 사실, NAc 코어에서만 CaMKIIα 유전자 프로모터에서 히스톤의 코카인 매개 탈아세틸화를 나타내는 ChIP 데이터는 염색질 메커니즘의 가능한 관련성을 지원합니다. 이 가설에 따라 D1-유형 MSN에서 ΔFosB 과발현은 코카인이 없을 때 NAc 코어에서 CaMKIIα 유도를 유도할 수 있었습니다.무화과 3F), 만성 코카인 노출 동안 이러한 유도를 방지하는 CaMKIIα 프로모터의 활성 변형이 있음을 시사합니다. CaMKII 프로모터에서 염색질 지형의 조절은 CaMKII가 만성 코카인 금단 쥐의 NAc 껍질에 코카인 투여량에 의해 유발되는 이유를 설명할 수 있습니다.무화과 1E) 그러나 약물에 노출되지 않은 동물(무화과 1D). 이것은 ΔFosB의 후성 유전적 "유전자 프라이밍" 효과를 나타낼 수 있습니다(로비슨 앤 네슬러, 2011), 따라서 코카인 갈망을 배양하는 분자 메커니즘 중 하나일 수 있습니다(Pickens et al., 2011). 그러나 이 염색질 변화가 갈망의 잠복기와 인과적으로 연결되려면 시간이 지남에 따라 증가해야 합니다. 이것이 사실인지 확인하고 다른 유전자가 코카인에 의한 ΔFosB 의존적 하위 영역 특정 조절을 나타내는지 여부를 연구하는 것은 흥미로울 것입니다. 우리가 설명하는 피드포워드 루프가 CaMKII 또는 ΔFosB의 끝없는 축적으로 이어지지 않는다는 점에 유의하는 것도 중요합니다(무화과 1E); 이를 담당하는 분자 "브레이크"를 밝히는 것이 향후 연구의 중요한 목표입니다.

여러 실험 시스템 및 뇌 영역에서 ΔFosB 및 CaMKII의 알려진 기능은 여러 수준에서 수렴됩니다. (무화과 6F). 두 분자 모두 수지상 척추 성장과 밀접하게 연결되어 있습니다. CaMKII는 액틴 세포골격과 상호 작용합니다.오카모토 외, 2009), 척추 머리 크기 조절(Matsuzaki 외, 2004), 그리고 해마 기관형 절편 배양에서 가소성 유도 유족 및 시냅스 수의 증가에 필요하고 충분합니다.Jourdain 등, 2003), 승hile ΔFosB는 NAc MSN에서 코카인 유도 수지상 척추 형성에 필요하고 충분합니다.Maze 등, 2010). 또한 두 분자 모두 AMPA 글루타메이트 수용체의 조절과 관련이 있습니다. CaMKII는 AMPA 수용체 서브유닛의 전체 수준을 조절하지 않지만 AMPA 수용체를 시냅스로 삽입하고 AMPA 채널 전도도를 증가시킵니다. 생체내에서 (에서 검토 (Malinow 및 Malenka, 2002; 콜브란과 브라운, 2004)). 이러한 GluA1의 시냅스로의 이동 증가는 만성 코카인 작용과도 관련이 있습니다.Boudreau and Wolf, 2005). 더욱이, NAc에서 AMPA 수용체 활성화에 대한 행동 반응은 D1 도파민 수용체 의존적 방식으로 CaMKIIα 과발현에 의해 강화된다.싱어 (Singer) 등, 2010). ΔFosB의 장기 D1 특이 과발현은 NAc에서 GluA2 전사를 유도하는 것으로 나타났습니다.Kelz 등, 1999), 이는 GluA1을 통해 매개되는 AMPA 반응을 약화시키는 반면 단기 ΔFosB 과발현과 단기 코카인 노출은 이 서브유닛에 영향을 미치지 않는다는 것을 여기서 보여줍니다.Fig 1). 그럼에도 불구하고 우리는 최근 단기 ΔFosB 과발현이 그럼에도 불구하고 NAc의 D1-유형 MSN에서 AMPA 반응을 감소시킨다는 것을 발견했습니다.Grueter et al., 2013). 이 데이터는 아직 잘 이해되지 않은 중독 진행의 다양한 측면의 기초가 되는 코카인에 대한 일련의 신경 적응을 구성할 수 있는 시간적으로 뚜렷한 메커니즘을 제안합니다. 행동 수준에서 CaMKII와 ΔFosB는 모두 코카인에 대한 운동 감작에 필요하며(위 참조), 둘 다 설치류에서 지속적인 코카인 자가 투여에 필요합니다.Colby 등, 2003; 왕 (Wang) 등, 2010), 두 단백질이 부분적으로 별개의 기본 메커니즘을 통해 약물 노출에 대한 단기 및 장기 행동 적응 모두에 중요하다는 것을 제안합니다. 아마도 ΔFosB와 CaMKII는 NAc 시냅스 기능의 변화를 통해 그러한 복잡한 행동 적응을 조절하지만 시냅스 현상을 행동 변화에 직접 연결하기 위해서는 훨씬 더 많은 연구가 필요합니다.

CaMKII 홀로효소는 다양한 시냅스 관련 단백질과 동시에 상호작용한다.Robison 등, 2005)는 시냅스 가소성에 중요한 것으로 제안된 현상인 시냅스 후 밀도(PSD)에 대한 표적을 조절하는 것으로 생각됩니다. 특히, CaMKII와 NMDA-유형 글루타메이트 수용체의 GluN2B 서브유닛의 상호작용은 최근 시냅스 가소성과 학습을 모두 조절하는 것으로 밝혀졌다.Halt 등, 2012). AC3I 펩타이드는 CaMKII의 autoinhibitory domain을 모방하여 효소 촉매 활동을 억제하는 동시에 여러 단백질-단백질 상호작용을 차단하기도 합니다.Strack 등, 2000; Robison 등, 2005). 따라서 여기에서 보고된 HSV-GFP-AC3I의 행동 및 형태학적 효과는 CaMKII 표적 단백질의 감소된 인산화, CaMKII 표적의 변화 또는 시냅스에서 제안된 CaMKII의 구조적 역할의 변화를 통해 발생할 수 있습니다.리스만 외, 2002).

제안된 ΔFosB-CaMKII 루프를 NAc 셸로 제한하는 것은 특히 중요합니다. 최근 작업에서 코카인 투여에 대한 반응으로 NAc 셸과 코어 사이에 몇 가지 생리학적 차이가 입증되었기 때문입니다. 이 개념은 편향되지 않은 iTRAQ(표 S1) 데이터 . NAc 껍질의 MSN은 만성 코카인을 몇 주 동안 지속한 후 발화 능력이 저하되는 반면, 동일한 동물의 핵심 MSN은 발화 능력이 일시적(1~3일) 증가하여 2주 이내에 기본 수준으로 돌아갑니다.쿠리치와 토마스, 2009). 또한 수많은 시냅스 단백질이 NAc 껍질에서 차별적으로 조절됩니다. 대 GluA2를 포함한 만성 코카인에 노출된 동물의 핵심(Knackstedt et al., 2010). 만성 암페타민은 특히 NAc 껍질에서 CaMKIIα를 유도하므로(Loweth et al., 2010), 코카인과 유사한 효과를 발견한 것은 놀라운 일이 아닙니다. 그러나 ΔFosB는 만성 코카인에 의해 NAc 껍질과 코어 모두에서 유도되기 때문에(페로 티 (Perrotti) 등, 2008), 우리는 쉘에서의 CaMKIIα 유도가 ΔFosB 의존적이라는 것을 보여주기 때문에, 우리의 발견은 쉘에서 CaMKIIα의 선택적 유도를 담당하는 이 두 하위 영역 사이의 CaMKIIα 프로모터에서 뚜렷한 전사 메커니즘에 대한 새로운 증거를 제공합니다.

최근 많은 작업이 D1 유형과 D2 유형 NAc MSN 간의 차이점을 기술하는 데 초점을 맞췄습니다. D1 및 D2 수용체 모두 코카인의 보상 효과에 관여하지만 (셀프, 2010), 최근 연구에서는 D1 유형 MSN의 광유전학적 활성화가 코카인에 대한 행동 반응을 증가시키는 반면 D2 유형 MSN 활성화는 반대 효과를 나타냄을 보여줍니다.로보 (Lobo) 등, 2010). 이러한 결과에 따라 D1-수용체 녹아웃 마우스는 코카인 자가 투여 능력이 부족하다.Caine 등, 2007), D2 녹아웃은 그렇지 않습니다. (Caine 등, 2002). D1 작용제를 NAc에 직접 투여하면 복직 패러다임에서 코카인 추구 행동이 유발됩니다.셀프, 2010). 흥미롭게도, 이 효과는 NAc 껍질에서 CaMKII 활성의 D1 수용체 의존적 증가를 필요로 하지만 코어는 그렇지 않습니다.앤더슨 (Anderson) 등, 2008), 여기에 제안된 D1 및 쉘 특정 ΔFosB-CaMKII 루프와 잘 일치하는 결과입니다.

우리는 이전에 ΔFosB의 Ser27이 casein kinase-2에 의해 인산화될 수 있다고 보고했습니다.Ulery et al., 2006), 그러나 우리는 여기에서 CaMKII가 훨씬 더 큰 동역학 및 화학양론으로 이 사이트 및 다른 사이트에서 ΔFosB를 인산화하고 더 높은 겉보기 M 복제할 수 있음을 설정합니다._r ΔFosB에 대해 관찰됨(Fig 5A) 코카인 노출 생체내에서 (네슬러, 2008). 우리는 이미 Ser27 인산화가 ΔFosB 안정성과 전사 활성을 증가시킨다는 것을 알고 있습니다.Ulery et al., 2006; 울리와 네슬러, 2007; Ulery-Reynolds 등 2009). 향후 작업은 이제 본 연구에 의해 표시된 ΔFosB 인산화의 새로운 사이트의 식별 및 기능적 결과에 초점을 맞출 것입니다.

여기에 설명된 피드포워드 루프는 코카인의 반복 투여가 NAc의 진행성 이상을 유발하는 그럴듯한 새로운 메커니즘을 제공합니다. 이와 같이 이 생화학적 경로는 중독성 장애에 대한 미래의 치료 개입을 위한 중요한 목표를 제공할 수 있습니다. CaMKII는 어디에나 있고 많은 기초 신경 및 행동 기능에 필요하기 때문에 CaMKII 억제제의 직접적인 사용은 중독 치료로 피했습니다. 우리의 데이터는 개별 세포 유형과 뇌 보상 회로의 하위 영역에 특정한 CaMKII 유도 메커니즘의 보다 미묘한 표적화가 전신 CaMKII 억제의 합병증을 피할 수 있는 치료 표적을 제공할 수 있음을 시사합니다.

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감사의 글

이 작품은 국립 약물 남용 연구소(EJN), NIDA-예일 프로테오믹스 센터 DA018343(AJR 및 EJN) 및 하트웰 재단(AJR)의 보조금으로 지원되었습니다. 저자는 정화된 ΔFosB의 후한 선물에 대해 Gabby Rundenko와 정화된 CaMKIIα의 후한 선물에 대해 Roger Colbran에게 감사를 표합니다.

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