PSMC5, 19S Proteasomal ATPase, Nucleus Accumbens (2015)에서 코카인 작용 조절

PLoS One. 2015 월 11; 10 (5) : e0126710입니다. doi : 10.1371 / journal.pone.0126710. eCollection 2015.

오니시 YH1, 오니시 YN2, 나카무라 T3, 오노 M4, 케네디 PJ5, 야스 유키6, 니시 에이7, 니베 R8, 쓰 즈키 T4, 네슬러 EJ5.

추상

ΔFosB는 코카인이나 다른 약물 남용에 대한 만성 노출에 반응하여 뇌 보상 회로의 핵심 부분 인 핵 축적 (NAc)에 축적되는 안정적인 전사 인자입니다. ΔFosB는 활성 전사 인자 복합체를 형성하기 위해 Jun 패밀리 구성원과 이종이 량체 화하는 것으로 알려져 있지만, 지금까지 뇌에서 ΔFosB에 대한 다른 가능한 결합 파트너에 대한 개방형 탐색은 없었습니다. 여기, 효모 5- 하이브리드 분석을 사용하여, 우리는 1S 프로 테아 좀 복합체의 ATPase 함유 서브 유닛 인 SUG19으로도 알려진 PSMC5를 ΔFosB와의 새로운 상호 작용 단백질로 식별합니다. 우리는 NAc에서 내인성 ΔFosB와 PSMC5 사이의 이러한 상호 작용을 확인하고 두 단백질 모두 유전자 활성화와 관련된 다른 염색질 조절 단백질과 복합체를 형성한다는 것을 보여줍니다. 우리는 만성 코카인이 핵을 증가 시키지만 세포질이 아닌 NAc에서 PSMC5의 수준을 증가시키고이 뇌 영역에서 PSMC5의 과발현이 코카인에 대한 운동 반응을 촉진한다는 것을 보여줍니다. 함께, 이러한 발견은 ΔFosB의 작용에 기여하는 새로운 메커니즘을 설명하고 처음으로 PSMCXNUMX를 코카인 유도 분자 및 행동 가소성에 연루시킵니다.

인용 : Ohnishi YH, Ohnishi YN, Nakamura T, Ohno M, Kennedy PJ, Yasuyuki O 등 (2015) 5S 프로 테아 좀 ATPase 인 PSMC19는 핵 축적에서 코카인 작용을 조절합니다. ONE 10 (5) : e0126710를 선택하십시오. doi : 10.1371 / journal.pone.0126710

학술 편집기 : 제임스 에드가 McCutcheon, 레스터 대학, 영국

수신 : 12 월 10, 2014; 수락 : 4 월 7, 2015; 게시 : 2015 년 5 월 11 일

저작권 : © 2015 Ohnishi et al. 이 문서는 크리에이티브 커먼즈 저작자 표시 라이선스, 어떤 매체에서든 무제한 사용, 배포 및 복제가 가능하며 원 저작자와 출처를 적립 한 경우

데이터 가용성 : 모든 관련 데이터는 논문 내에 있습니다.

기금 : 이 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health), 국립 약물 남용 연구소 (National Institute of Drug Abuse), 이시바시 재단 (Ishibashi Foundation) 및 일본 과학 진흥 협회 (KAKENHI 번호 : 24591735, 26290064, 25116010)의 지원으로 이루어졌습니다. 연구자들은 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할을하지 않았습니다.

경쟁 관심: 저자는 경쟁적 이익이 없다고 선언했다.

개요

ΔFosB, FosB 유전자는 c-Fos, 전장 FosB, Fra-1 및 Fra-2를 포함하는 Fos 전사 인자 패밀리에 속한다. ΔFosB는 다른 Fos 단백질과 마찬가지로 Jun 패밀리 단백질 (c-Jun, JunB 또는 JunD)과 이종 이합체 화되어 활성 AP-1 (활성화 제 단백질 -1) 전사 인자 복합체를 형성하여 특정 표적 유전자의 발현을 유도하거나 억제합니다 [1,2].

ΔFosB는 약물 중독에서 중요한 역할을하는 것으로 나타났습니다.2]. Fos 계열 단백질 중에서 독특하게 높은 수준의 안정성으로 약물 투여를 반복 한 후 핵 축적 (NAc) 및 기타 보상 관련 뇌 영역에 축적됩니다.3,4], 이는 C- 말단 데 그론 도메인의 결여 및 몇몇 단백질 키나제에 의한 인산화에 의해 매개된다 [5-7]. NAc에서 ΔFosB의 이러한 유도는 남용 약물에 대한 행동 반응 증가를 매개한다. 따라서, 바이러스 성 벡터 또는 유도 성 이종 이식 마우스를 사용하여, 성인 동물의이 뇌 영역에서 ΔFosB의 과발현은 코카인 및 아편 제의 운동 활성화 및 보상 효과에 대한 동물의 민감성을 증가시킬뿐만 아니라 자기-투여에 대한 동물의 동기를 증가시킨다 코카인 [7-11]. 반대로, ΔFosB의 우세한 음성 길항제의 과발현은 반대 행동 표현형을 유발한다 [10-12].

우리와 다른 사람들은 겔 시프트 분석을 사용하여 JunD와 아마도 다른 Jun 패밀리 단백질이 생체 내 뇌에서 ΔFosB의 주요 결합 파트너임을 확인했다.13-15]. 그러나 현재까지 뇌에서 ΔFosB의 결합 파트너에 대한 개방적이고 편견없는 평가는 없었습니다. 여기, 우리는 효모 2- 하이브리드 분석을 사용하여 ΔFosB에 대한 새로운 바인딩 파트너를 식별하려고16,17]. 우리의 데이터는 SUG5로도 알려진 PSMC1가 시험관 내 및 NAc 생체 내에서 ΔFosB의 강력한 파트너이며, 여기서 CBP (CREB 결합 단백질을 포함하는 코카인-유도 전사 활성화 복합체의 일부로서 ΔFosB에 합류 함) ) 및 p300- 히스톤 아세틸 트랜스퍼 라제 (HAT) 둘 다뿐만 아니라 BRG1 (크로 마틴 리모델링 단백질). 우리는 코카인에 대한 만성 노출이 NAc에서 5S 프로 테아 좀 복합체의 ATPase- 함유 서브 유닛 인 PSMC19의 핵 수준을 변경시키고, PSMC5가 코카인에 대한 행동 반응을 제어 함을 보여 주었다.

재료 및 방법

효모 이종 스크리닝

MaV203 효모 세포 (Invitrogen Life Technologies)를 ΔFosB 단백질의 상이한 단편을 구동하는 pDBLeu로 공동 형질 감염시키고, 마우스 뇌 라이브러리를 pPC86 (Invitrogen Life Technologies)에 서브 클로닝 하였다. 형질 전환 된 세포는 류신, 트립토판 및 히스티딘이없고 10 mM의 3- 아미노 트리아 졸을 함유하는 SC- 매질에서 성장되었다. FosB 단편과 후보 파트너 사이의 결합은 세 가지 리포터 유전자를 유도합니다 (His3, Ura3및 LacZ), 유도는 형질 전환 체가 사용 된 배양 조건 하에서 생존 할 수있게한다. MaV203 세포에서 재 변환 분석에 의해 새로운 pDBLeu-ΔFosB 단편으로 양성 클론을 재시험 하였다.

세포주

마우스 신경 2A 신경 모세포종 세포 (ATCC)는 Eagle의 최소 필수 배지 (EMEM) (ATCC)에서 유지되었으며, 10 ° C 및 37 % CO에서 5 % 소 태아 혈청 (FBS)이 보충되었습니다.2. 쥐 1A 세포는 Yusaku Nakabeppu (일본 후쿠오카)의 선물이었다.18] 및 10 ° C 및 37 % CO에서 5 % FBS가 보충 된 Dulbecco의 MEM (DMEM) (Life Technologies)에서 유지2. 플라스미드 DNA로 세포의 형질 감염은 제조사의 지시에 따라 이펙 텐 (Qiagen)을 사용하여 달성되었다.

PSMC5 및 ΔFosB 구성

N- 말단에 각각 FLAG- 태그 된 PSMC5의 몇몇 돌연변이 형태는 면역 침전 또는 바이러스-매개 유전자 전달 실험에 사용하기 위해 생성되었다. PSMC5-K196M, PSMC5-Δ 코일-코일 도메인 (PSMC5-ΔCC, 아미노산 27-68가 없음), PSMC5-NT (단백질의 N- 말단 단편, 아미노산 1-151로 구성됨) 및 PSMC5 -CT (단백질의 C- 말단 단편, 172 아미노산으로 구성) (참조 Fig 1). 우리는 또한 류신-지퍼 도메인에서 돌연변이를 갖는 ΔFosB뿐만 아니라 야생형 ΔFosB의 N- 말단 MYC- 태그 된 형태를 이용 하였다 (Jun 계열 단백질로 이종이 량체 화를 제거하는 것으로 알려진 아미노산 182에서 205 로의 돌연변이]6].

미리보기
그림 1. ΔFosB는 시험 관내에서 PSMC5에 결합한다.

 

A. 류신 지퍼 도메인이 돌연변이되어 Jun 단백질로 ΔFosB 이종이 량체를 제거하기 위해 ΔFosB, ΔFosB-LZM의 개략도 및 ΔFosB N- 말단의 첫번째 2 아미노산이 결여 된 Δ78ΔFosB. B. PSMC5의 첫 번째 5 아미노산을 포함하는 PSMC151, PSMC5-NT의 개략도, PSMC5의 첫 번째 235 아미노산이없는 PSMC5-CT 및 코일 코일 도메인이없는 PSMC5-ΔCC (아미노산 28-68) . AAA 도메인은 많은 ATPase에 존재하는 모티프, 다양한 세포 활성과 관련된 ATPases에 해당한다. C. 2.4 μg의 pcDNA3.1-ΔFosB (레인 1-4) 또는 ΔFosB-LZM (레인 5)을 2.4 μg의 FLAG- 태그 된 PSMC5 또는 다양한 결실 돌연변이 체와 Neuro2a 세포에 공동 형질 감염시켰다. 형질 감염 이틀 후, 세포를 용해시키고 항 -FLAG 항체로 면역 침전시킨 다음, 항 -ΔFosB 또는 항 -FLAG 항체로 웨스턴 블 롯팅 하였다. ΔFosB-LZM이 아닌 ΔFosB는 PSMC5 또는 PSMC5-NT에 강력하게 결합하지만 PSMC5-CT 또는 PSMC5-ΔCC에는 강하게 바인딩되지 않습니다. 도면에 도시 된 데이터는 3 개의 개별 실험 각각에서 3 회 반복하여 복제되었다.

doi : 10.1371 / journal.pone.0126710.g001

동물

9 내지 11 주령의 C57BL / 6J 수컷 마우스 (잭슨 연구소)를 모든 실험에 사용 하였다. 동물들은 음식과 물에 접근 할 수있는 12-h 명암주기에 수용되었다 광고 무제한 실험 전 1 주에 익숙해졌습니다. 2 개의 코카인 치료 요법이 사용되었다. 코카인의 생화학 적 효과를 연구하기 위해, 동물에게 7 일일 용량의 코카인 (20 mg / kg) 또는 식염수를 투여하고 마지막 주사 후 24 폐색으로 사멸시켰다. 이것은 표준 프로토콜이며 약물에 대한 수많은 분자 및 세포 반응을 생성하는 것으로 나타났습니다.7]. 코카인에 대한 행동 반응에 대한 핵 축적에 대한 PSMC5의 영향을 연구하기 위해, 우리는 PSMC7.5가 ΔFosB와 같이 동물의 감수성을 증가 시킨다는 가설에 근거하여 약물의 서브 임계 용량 (5 mg / kg; 아래 운동 민감도 참조)을 사용했습니다. 코카인 [8]. 모든 동물 실험은 시내산의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다.

면역 석출 및 웨스턴 블로 팅

신경 2A 세포를 야생형 또는 돌연변이 형태의 PSMC5로 형질 감염시켰다. 형질 감염 이틀 후, 세포를 PBS로 세척하고 RIPA 완충액 (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 % NP-40, 0.25 % 나트륨 데 옥시 콜레이트, 10 mM 나트륨 부티레이트, 프로테아제 억제제 칵테일)에 용해시켰다. . 용 해물을 분할하고 3 ℃에서 4 시간 동안 비 면역 IgG (Sigma) 또는 항 -FLAG 항체 (Sigma)와 함께 배양 하였다. 면역 침전은 설명 된대로 단백질 G 비드 (Invitrogen)로 수행되었다.19]. 간단히 말해서, 면역 침전 된 단백질에 SDS-PAGE를 적용하고 공개 된 프로토콜을 기반으로 항 -FosB / ΔFosB 항체 (Cell Signaling Technology)를 사용하여 Western blotting으로 분석 하였다 [7]. 생체 내 단백질 결합 분석을 위해, 만성 코카인 처리 후 마우스의 펀치 절개 NAc로부터 정제 된 핵 분획을 사용 하였다 (마우스는 마지막 주사 후 20 시간을 사용한 7 일 동안 매일 24 mg / kg IP). 핵 분획으로부터의 공동-면역 침강은 제조자의 지시에 따라 핵 복합체 Co-IP 키트 (Active Motif)를 사용하여 수행 하였다. MYC 또는 ß-actin, Cell Signaling Technology (Danvers, MA), PSMC5 및 히스톤 H3, Abcam (Cambridge, MA), CBP, p300 및 BRG1, Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) 및 플래그 M2, 시그마.

면역 조직 화학

면역 조직 화학은 공개 된 절차에 따라 수행되었다.20]. 마우스를 마취시키고 PBS 중 4 % 파라 포름 알데히드로 심장 내로 관류시켰다. 30 % 슈 크로스로 뇌를 동결 보호 한 후, 사용할 때까지 -80 ° C에서 냉동 보관 하였다. 코로나 섹션 (40 μm)을 저온 조절기에서 절단하고 면역 조직 화학을 위해 처리 하였다. 자유 부유 섹션을 0.3 % 트리톤 및 3 % 정상 당나귀 혈청을 함유하는 차단 완충액에서 예비 배양 하였다. ΔFosB는 단백질의 N- 말단 부분 (1 / 1000 Santa Cruz Biotechnology)에 대해 생성 된 염소 폴리 클로 날 항체를 사용하여 검출되었다. 토끼 폴리 클로 날 항체 (5 / 1 Abcam, MA, Cambridge)를 사용하여 PSMC100를 검출 하였다. 공 초점 현미경 (60x 배율; Zeiss)으로 이미지를 촬영했습니다.

운동 감작

모든 마우스는 3 일 동안 식염수를 매일 IP 주사하여 주사의 스트레스에 적응시켰다. 다음날, 마우스에 식염수 또는 서브 임계량의 코카인 (7.5 mg / kg; 상기 동물 아래 참조)을 IP에 주사하고 즉시 새로운 운동 상자에 넣었다. 마우스의 운동 활성은 30 분 동안 보행 빔 브레이크로서 포토 빔 시스템을 사용하여 기록되었다. 이 치료는 3 일 동안 매일 반복되었습니다.

바이러스 성 유전자 전이

바이러스 매개 유전자 전이에 광범위하게 공개 된 방법을 사용했습니다.7,8,11,19]. 간단히 말하면, PSMC5 또는 이의 몇몇 돌연변이 체 (상기 PSMC5 및 ΔFosB 구축물 참조)에 대한 발현 플라스미드는 CMV 프로모터의 제어하에 GFP를 발현하는 비 시스 트로닉 p1005 (+) HSV 플라스미드에 서브 클로닝되었고, PSMC5 또는 이의 돌연변이 체는 IE4 / 5 프로모터. 케타민 (100 mg / kg) / 자일 라진 (10 mg / kg) 마취하에, 마우스를 소 동물 입체 세기구에 위치시키고 두개골 표면을 노출시켰다. 33 개의 게이지 주사기 바늘을 사용하여 0.5 μl / 분의 속도로 10 ° 각도 (AP + 1.6; ML + 1.5; DV -4.4)에서 HSV 벡터의 0.1 μl를 NAc에 양으로 주입 하였다. HSV 주사를받은 동물을 실험 전에 수술 후 2 일 동안 회복시켰다.

통계

분산 분석 및 학생 t- 검정이 사용되었으며 다중 비교를 위해 수정되었으며 유의성은 p <0.05로 설정되었습니다.

결과

PSMC5 : ΔFosB의 새로운 바인딩 파트너

본 발명자들은 시스템을 자동 활성화시키지 않고 효모 2- 하이브리드 분석에서 미끼로서 작용하는 ΔFosB의 적절한 단편을 확인하기 위해 예비 실험을 수행 하였다. Holo-ΔFosB는 단백질의 N- 말단 1-78 아미노산 단편과 마찬가지로 자체적으로 리포터 유전자 활성을 유도했다. 그러나 N- 말단이 잘린 ΔFosB (Fig 1A단백질의 첫 번째 2 아미노산이없는 Δ78ΔFosB로 명명 된)는이 효과를 갖지 않았다. 따라서, 우리는 미끼 단백질로 Δ2ΔFosB를 사용했습니다.

잠재적 인 결합 파트너를 선별하기 위해 pPC86에 서브 클론 된 마우스 뇌 라이브러리를 사용했습니다. 바인딩 파트너에 대한 11 후보를 식별했습니다. 이들 단백질에는 ΔFosB의 공지 된 이종이 량체 화 파트너, c-Jun 및 JunD (표 1)에서 가장 널리 사용되는 후보는 PSMC5입니다. PSMC5가 수 년 전 단일 보고서에서 c-Fos와 생체 외에서 결합하는 것으로 나타났기 때문에 이것은 놀라운 결과였습니다.21]. 그러나 PSMC5가 코카인 작용에 관여한다는보고는 없습니다. 그럼에도 불구하고, 효모 2- 하이브리드 분석에서 PSMC5 신호의 강도 때문에, 가능한 ΔFosB-PSMC5 상호 작용을 더 연구하기 시작했습니다.

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표 1. Δ2ΔFosB를 사용한 효모 2- 하이브리드 스크리닝 결과.

doi : 10.1371 / journal.pone.0126710.t001

먼저, ΔFosB와 PSMC5 간의 물리적 상호 작용을 확인하기 위해, 시험 관내 공동 면역 침전 실험을 수행 하였다. FLAG 태그가 지정된 PSMC5 (무화과 1B), Neuro 2A 세포로 형질 감염, ΔFosB (무화과 1C). 둘째, ΔFosB에 대한 결합을 담당하는 PSMC5에서 영역을 식별하기 위해, FLAG- 태그 된 PSMC5 돌연변이 체를 생성 하였다 (무화과 1B) 및 공동 면역 침강 실험을 반복 하였다. ΔFosB는 PSMC151의 N- 말단 5 아미노산 (PSMC5-NT)에서는 효과적으로 풀다운되었지만 단백질의 C- 말단 172 아미노산 단편 (PSMC5-CT)에서는 그렇지 않았습니다 (무화과 1C). 코일 코일 영역 (PSMC5-ΔCC)이없는 PSMC5도 ΔFosB를 침전시키는 데 효과적이지 않았다. 이러한 결과는 PSMC5가 코일 코일 도메인 (아미노산 27-68)을 통해 ΔFosB에 결합 함을 시사한다. 또한, FLAG- 태깅 된 PSMC5는 돌연변이 된 류신 지퍼 도메인 (ΔFosB-LZM)과 함께 ΔFosB의 돌연변이 형태를 침전시키지 않았다 (무화과 1C), ΔFosB가이 도메인을 통해 PSMC5에 결합하거나 PSMC5 결합에 ΔFosB 이종이 량체 화가 필요할 가능성이 있음을 나타냅니다.

만성 코카인 투여 후 NAc에서 PSMC5-ΔFosB 결합

이러한 연구 결과를 바탕으로 NAc의 PSMC5 수준이 만성 코카인 투여에 반응하여 변경되는지 여부를 연구했습니다. 우리는 subcellular 분류 및 웨스턴 blotting에 의해 만성 코카인이 세포질 수준의 변화 없이이 뇌 영역에서 PSMC5의 핵 수준을 증가시키는 것으로 나타났습니다 (Fig 2A). 이 효과는 단일 용량의 코카인 후에는 나타나지 않았습니다 (데이터는 표시되지 않음). 우리는 다음 공 촛점 면역 형광 검사법에 의해 NAc에서 PSMC5 및 ΔFosB의 지역화를 검사했습니다. 우리는 코카인의 마지막 반복 복용 후 마우스 24 시간, ΔFosB가 유일한 검출 가능한 시점 인 시점을 분석 하였다 FosB 유전자 산물 (Nestler 2008 참조). 우리는 강력한 핵 신호를 포함하여 NAc에서 강력한 PSMC5 면역 반응성을 발견했다. PSMC85에 대해 공동 염색 된 ΔFosB + 핵의 ~ 5 % (무화과 2B). 또한, 본 발명자들은 NAc 추출물에 대한 공동 면역 침전 실험을 수행하였고, 만성 코카인 처리 후, 항 -PSMC5 항체에 의해 ΔFosB가 효과적으로 저하됨을 발견 하였다 (무화과 2C). 대조적으로, 약물-순수 NAc의 분석 (식염수 주입을 반복 한 후)에는 검출 가능한 ΔFosB 풀다운이 없음이 밝혀졌다 (데이터는 나타내지 않음). 이러한 데이터는 세포 배양에서 우리의 연구 결과와 일치하며 ΔFosB와 PSMC5가 생체 내 NAc에서 상호 작용한다는 것을 확인합니다.

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그림 2. 마우스 NAc에서의 PSMC5 조절.

 

A. 마지막 주사 20 시간 후 동물을 분석하여 7 일 동안 식염수 또는 코카인 (24 mg / kg)으로 매일 처리 된 마우스 NAc의 핵 및 세포질 분획의 웨스턴 블 롯팅. 코카인은 PSMC5의 세포질 수준이 아닌 핵을 증가시킵니다. 코카인의 영향을받지 않은 Histone H3 및 ß-actin을 로딩 컨트롤로 사용했습니다. 데이터는 평균 ± SEM (n = 8–10 / 그룹, * p <0.05)입니다. B. 만성 코카인 처리 후 마우스 NAc의 AC 핵 용 해물에서와 같이 코카인으로 만성적으로 처리 된 마우스의 NAc에서 내인성 PSMC5 (녹색) 및 ΔFosB (파란색)의 공동 국소화를 대조군으로 항 -PSMC5 항체 또는 마우스 IgG를 사용하여 면역 침강을 실시했습니다. , 그리고 나서 anti-FosB / ΔFosB 항체로 Western blotted. 그림은 생체 내 NAc에서 PSMC5-ΔFosB 상호 작용을 보여줍니다. B와 C의 데이터는 세 번의 개별 실험에서 각각 세 번 복제되었습니다.

doi : 10.1371 / journal.pone.0126710.g002

PSMC5는 시험관 내에서 ΔFosB 발현을 향상시킵니다

PSMC5는 프로 테아 좀 복합체의 알려진 구성원이므로, 우리는 그것이 쥐 1A 세포를 사용하여 ΔFosB 수준을 조절하는지 여부를 테스트했습니다. PSMC5 과발현은 ΔFosB의 기본 수준에 영향을 미치지 않았지만, 세포의 혈청 자극시 ΔFosB 유도의 작지만 유의미한 향상을 일으켰습니다 (Fig 3A). 전장 FosB에서도 유사한 경향이 나타 났지만, 그 효과는 통계적 유의성을 달성하지 못했다. 반대로, PSMC5를 표적으로하는 siRNA를 사용함으로써 달성 된 랫트 1A 세포에서 내인성 PSMC5 발현의 억제는 기저 ΔFosB 수준에 영향을 미치지 않았지만 혈청 자극에 의한 ΔFosB 유도를 강하게 억제 하였다 (무화과 3B). 전장 FosB에 대해서도 유사한 효과가 나타났다. 이들 데이터는 PSMC5가 프로 테아 좀의 핵심 서브 유닛으로서 예상 될 수있는 바와 같이 ΔFosB의 프로 테아 좀 분해를 촉진시키지 않고 대신에 최대 축적을 위해 요구됨을 시사한다 FosB 아마도 단백질 안정화를 통해 시험관 내에서 유전자 산물.

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그림 3. 래트 5A 세포에서 FosB / ΔFosB 발현의 PSMC1 조절.

 

A. 래트 1A 세포를 4μg의 PSMC5 또는 대조군 DNA로 형질 감염시켰다. PSMC5 과발현은 Western blotting에 의해 결정된 FosB 또는 ΔFosB 단백질의 기본 발현 수준에 영향을 미치지 않았지만 혈청 자극에 의한 ΔFosB의 유도를 작지만 유의하게 증가 시켰습니다 (F (2,21) = 9.75, p = 0.001). B. 랫트 1A 세포를 5 개의 siRNA 또는 스크램블 된 RNA (대조군) 중 5 pmol로 형질 감염시켰다. 두 siRNA 모두 대조군 조건과 비교하여 PSMC1 단백질 수준을 효과적으로 감소 시켰습니다 (siRNA # 23, 대조군의 5 ± 2 %; siRNA # 18, 6 ± 0.05 %; p <4; n = 5). PSMC2,6 녹다운은 FosB 또는 ΔFosB의 기저 수준에 영향을 미치지 않았지만 혈청 자극에 의한 FosB 및 ΔFosB의 유도를 모두 약화 시켰습니다 (FosB : F (20.99) = 0.002, p = 2,6; ΔFosB : F (22.83) = 0.002 , p = XNUMX).

doi : 10.1371 / journal.pone.0126710.g003

NAc에서 CBP, p5 및 BRG300와 ΔFosB 및 PSMC1 폼 컴플렉스

PSMC5가 ΔFosB 기능에 영향을 미칠 수있는 전사 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해, 만성 코카인 처리 조건 하에서 NAc의 두 단백질에 대한 가능한 추가 결합 파트너를 조사했다. PSMC5가 CBP (HAT)에 결합하고 HeLa 세포의 MHC-II 근위 프로모터에서 히스톤 H3 아세틸 화를 증가 시킨다는보고가있다 [22]. 또한, CBP가 결핍 된 마우스는 코카인에 대한 행동 민감도를 감소시킬뿐만 아니라 FosB 프로모터 [23]. 따라서 PSMC5가 CBP 및 다른 전사 활성화 제를 포함하는 복합체의 일부로 ΔFosB와 결합 할 수 있는지 여부를 테스트했습니다.

우리는 먼저 ΔFosB가 Neuro300A 세포에서 관련 HAT 인 CBP와 p2를 효과적으로 끌어 내렸다는 것을 증명했습니다 (Fig 4A). 대조적으로, 루신 지퍼 돌연변이 체 형태의 ΔFosB는 예상대로이 활성을 나타내지 않았다. 마찬가지로 PSMC5는 CBP 및 p300 (무화과 4B). 흥미롭게도,이 효과는 PSMC5-ΔCC에서도 나타 났는데, 이는 ΔFosB를 풀다운시키지 않았는데, 이는 PSMC5가 단백질의 다른 도메인을 통해 CBP 및 p300와 상호 작용하고 ΔFosB 에의 결합과는 독립적이라는 것을 나타낸다.

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그림 4. ΔFosB 및 PSMC5는 시험 관내 및 생체 내에서 CBP, p300 및 BRG1와 상호 작용한다.

 

A. Neuro2A 세포를 2.4 μg의 MYC- 태그 된 ΔFosB 또는 MYC- 태그 된 ΔFosB-LZM으로 형질 감염시켰다. 세포 추출물을 항 -CBP 또는 항 -p300 항체로 면역 침전시키고, 침전물을 동일한 항체 또는 항 -MYC 항체로 웨스턴 블 롯팅 하였다. CBP와 p300는 모두 ΔFosB와 상호 작용하며 이러한 상호 작용에는 완전한 류신 지퍼가 필요합니다. B. Neuro2A 세포를 2.4 μg의 FLAG- 태그 된 PSMC5 또는 FLAG- 태그 된 PSMC5-ΔCC로 형질 감염시켰다. 세포 추출물을 항 -CBP 또는 항 -p300 항체로 면역 침전시키고, 침전물을 동일한 항체 또는 항 -FLAG 항체로 웨스턴 블 롯팅 하였다. CBP 및 p300는 모두 PSMC5와 상호 작용하므로 이러한 상호 작용에는 CC 도메인이 필요하지 않습니다. C. 만성 코카인 처리 후 마우스 NAc의 핵 용 해물을 항 -CBP 또는 항 -p300 항체로 면역 침전시켰다. 항 -FosB / ΔFosB 항체로 생성 된 침전물의 후속 웨스턴 블 롯팅은 ΔFosB와 CBP / p300 사이의 내생 적 상호 작용을 나타냈다. D. 동일한 핵 용 해물의 분취 액에 항 -BRG1 또는 항 -PSMC5 항체로 면역 침전시킨 후, 항 -FosB / ΔFosB 또는 항 -BRG1 항체로 침전물을 웨스턴 블 롯팅 하였다. 결과는 ΔFosB와 BRG1, BRG1와 PSMC5 사이의 내생 상호 작용을 보여줍니다. E. CBP / p300, BRG1 및 PSMC5와 상호 작용하는 ΔFosB : JunD 이종이 량체로 구성된 전사 활성화 복합체의 개략도.

doi : 10.1371 / journal.pone.0126710.g004

이러한 상호 작용이 생체 내에서 발생하는지 확인하기 위해, 우리는 만성적으로 코카인을 투여하여 ΔFosB 및 핵 PSMC5 수준을 유도 한 다음, 항 -CBP 또는 항 -p300 항체로 면역 침전 된 NAc 추출물을 유도했습니다. 우리의 세포 배양 데이터와 일치하여, CBP 또는 p300의 면역 침전은 효과적으로 ΔFosB (무화과 4C). 우리는 SWI-SNF 염색질 리모델링 복합체의 핵심 소단위 인 BRG1가 또한 만성 코카인 후 NAc에서의 활성화와 협력하여 특정 ΔFosB 표적 유전자에 BRG5가 동원되었다는 이전의 발견에 근거하여, ΔFosB 및 PSMC1에 결합 할 수 있는지 여부를 테스트했다.24]. 우리는 BRG1의 면역 침전이 NAc 추출물에서 ΔFosB를 끌어 내렸고, PSMC5의 면역 침전도 마찬가지로 내인성 BRG1를 coprecipitated한다는 것을 발견했다.무화과 4D). 종합하면, 이들 결과는 CBP / p5 및 BRG300를 포함하는 NAc에서 ΔFosB-PSMC1 형태 복합체를 제안한다 (무화과 4E).

PSMC5 과발현은 코카인에 대한 운동 반응을 증가시킵니다

NAc에서 ΔFosB와 PSMC5의 현저한 결합은이 뇌 영역에서 PSMC5 수준의 증가가 코카인에 대한 행동 반응을 조절하는지 여부를 조사하도록 촉구했다. 야생형 PSMC5 또는 해당 돌연변이 중 하나를 과발현하고 생체 내 NAc의 벡터를 검증하는 단순 포진 바이러스 (HSV) 벡터를 생성했습니다 (Fig 5A). PSMC5의 바이러스-매개 발현은 세포핵에서 우세하다 (무화과 5B). 야생형 PSMC5를 과발현하는 마우스는 코카인의 초기 용량에 대해 변경된 반응을 나타내지 않았지만, GFP- 발현 제어 마우스에 비해 반복 된 코카인 용량에 반응하여 증가 된 운동 활성화를 나타냈다. 대조적으로, 코일 코일 도메인 (PSMC5-ΔCC)이 결여 된 PSMC5의 돌연변이 형태를 과발현하는 마우스는 이러한 효과를 나타내지 않았다 (무화과 5B). 흥미롭게도, 야생형 단백질의 ATPase 활성이 결여 된 PSMC5-K196M의 과발현은 또한 코카인의 운동 반응을 강화시켰다.

미리보기
그림 5. NAc에서의 PSMC5 과발현은 코카인에 대한 운동 반응을 증가시킨다.

 

A. 내측 NAc에서 대표적인 HSV 매개 이식 유전자 발현. AC, 전방 교합. NAc 코어 및 쉘 하위 영역이 그림에 표시되어 있습니다. B. HSV-PSMC60 주사 후 NAc 뉴런에서 PSMC5의 면역 조직 화학적 염색의 대표적인 고배율 (5x)은 단백질이 DAPI 염색으로 표시된 바와 같이 주로 핵임을 나타냅니다. C. 마우스는 NAc에 양측 HSV 주사를받은 다음, 임계치 이하 용량의 코카인 (7.5 mg / kg)을 매일 IP 주사했습니다. 운동 반응은 3 일 5 회 약물 투여 중 처음과 마지막에 대한 반응으로 표시됩니다. PSMC5 또는 PSMC196-K5M의 과발현은 반복 된 코카인에 대한 운동 반응을 증가 시키며, 이는 PSMC3,125-ΔCC에서는 볼 수없는 효과입니다. 초기 코카인 용량에 대한 운동 반응에 대한 이식 유전자의 유의 한 효과는 없었다. ANOVA F (4.163) = 0.05, * p <XNUMX, Dunnett의 사후 테스트.

doi : 10.1371 / journal.pone.0126710.g005

토론

본 연구의 결과는 ΔFosB가 뇌에 미치는 영향을 매개하는 새로운 메커니즘과 코카인 작용과 관련된 새로운 메커니즘을 보여준다. 편견없는 접근법, 효모 2- 하이브리드 분석을 사용하여, PSMC5를 ΔFosB에 대한 신규 결합 파트너로 확인 하였다. 우리는 강력한 PSMC5-ΔFosB 바인딩을 시연함으로써 생체 외 배양 세포와 NAc 생체 내에서이 발견을 검증했습니다. 중요하게도, PSMC5의 핵 수준은 만성 코카인 투여에 의해 NAc에서 유도된다. 우리는 PSMC5-ΔFosB 바인딩이 여러 다른 전사 활성화 단백질, 즉 CBP 및 p300 (두 HAT) 및 BRG1 (SWI-SNF 염색질 리모델링 컴플렉스의 핵심 구성 요소)와 함께 발생 함을 추가로 보여 주었다. 함께, 우리의 연구 결과 PSMC5는 만성 코카인 투여 과정에서 적어도 특정 ΔFosB 유발 유전자로 모집되는 전사 활성화 복합체의 일부라는 가설을지지합니다 (무화과 4E). 이 가설에 따르면 NAc에서 PSMC5의 과발현은 ΔFosB 자체의 과발현과 같이 코카인에 대한 행동 반응을 촉진한다는 추가적인 발견이다. 시험 관내 리포터 분석법을 사용하여 PSMC5-ΔFosB-HAT-BRG1 상호 작용의 특성화로 이들 생체 내 관찰을 추적하는 것이 미래 연구에서 흥미로울 것이다.

코카인 작용에 PSMC5의 참여는 완전히 새로운 것입니다. PSMC5는 수년에 걸쳐 프로 테아 좀을 구성하는 ATPases의 대가족의 일원으로 확인되었으며, c-Fos, p53, 핵 호르몬 수용체 및 기저 전사 복합체의 구성 성분을 포함한 여러 전사 인자와 상호 작용하는 것으로 밝혀졌다.25], 그러나 몇 년 동안 기능 연구가 거의 수행되지 않았다 [26]. 가장 잘 확립 된 작용은 배양 된 세포에서 MYC 전사 인자의 활성을 증진시키는 것이다.27]. 전사 메커니즘에서 PSMC5의 의미는 유전자 전사의 조절에서 유비퀴틴 화-프로 테아 좀 활성에 대한 잠재적 인 역할을 제안했지만, 그러한 조절에서 PSMC5의 관여는 현재까지 시험되지 않은 상태로 남아있다 [28,29].

뇌의 PSMC5 기능에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 이전의 연구는 뇌 전체에 PSMC5 mRNA의 광범위한 발현을 보여주었습니다.30], 그러나 그 기능적 활동은 아직 연구되지 않았습니다. 우리의 연구 결과는 유전자 전사 조절의 역할과 뇌의 유비퀴틴 화-프로 테아 좀 기능과의 관계를보다 잘 이해하기 위해이 흥미로운 단백질에 대한 추가 조사를 촉구한다. PSMC5와 ΔFosB의 결합은 PSMC5의 코일 코일 도메인에 의해 중재됩니다. 또한, 코일 코일 도메인을 요구하면서 코카인에 대한 운동 반응을 촉진시키는 PSMC5의 능력은 단백질에 본질적인 ATPase 활성을 요구하지 않는다. 이러한 결과는 적어도 우리의 시스템에서 PSMC5의 주요 활성이 프로 테아 솜 관련 활성 자체가 아닌 ΔFosB 및 기타 전사 조절 단백질에 대한 결합을 통해 매개 될 수있는 가능성을 높인다. 이 가능성과 대체 가능성을 직접 테스트하려면 추가 작업이 필요합니다. PSMC5의 바이러스-매개 된 과발현이 3 일 코카인 치료 요법의 사용에도 불구하고 ΔFosB와의 상호 작용을 통해 코카인에 대한 운동 반응을 증가 시킨다는 가설은이 기간 내에 뇌에 상당한 수준의 ΔFosB가 축적된다는 것이 알려져 있기 때문에 [3].

본 연구 결과는 뇌 조절의 분자 기초를 연구 할 때 편견없는 개방형 실험 접근법을 사용하는 유용성을 추가로 입증한다. PSMC5에 대한 우리의 초기 관심은 효모 2- 하이브리드 분석에서 ΔFosB에 대한 탁월한 결합에만 기초했지만, 반복 된 코카인 투여에 의해 NAc에서 모집되는 전사 변화의 중요한 구성 요소 인 것으로 보인다. 코카인에 의해 PSMC5의 핵 수준이 유도되고 그에 따라 PSMC5가 코카인에 의한 전사 활성화 복합체에 기여하는 상세한 메커니즘에 대한 더 나은 이해는 현재 조사의 초점이다. 한편, 우리의 효모 2- 하이브리드 분석은 ΔFosB의 몇 가지 추가적인 추정 결합 파트너를 밝혀냈다.표 1코카인 모델에서 직접 검사를 보증합니다. 이 연구는 코카인이 NAc 기능을 변화시키는 복잡한 분자 메커니즘에 대한 이해를 높이는 데 기여하고있다.

감사의

이 연구는 국립 약물 남용 연구소 (National Institute of Drug Abuse)의 지원금과 이시바시 재단 (Ishibashi Foundation) 및 일본 과학 진흥 협회 (KAKENHI 번호 : 24591735, 26290064, 25116010)의 지원을 받았습니다.

작성자 기여

실험을 생각하고 설계했습니다 : YHO YNO EJN. 실험 수행 : YHO YNO PJK RN. 데이터 분석 : YHO YNO EJN. 기증 된 시약 / 재료 / 분석 도구 : TN MO OY AN RN TT. 논문 작성 : YHO EJN.

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