인산화에 의한 DeltaFosB 안정성 규제 (2006)-당신의 두뇌에 포르노

J Neurosci. 2006 May 10;26(19):5131-42.

출처

미국 텍사스 달라스에있는 텍사스 대학교 남서부 의료 센터, 기본 신경 과학 센터 정신과, 75390-9070, 미국.

추상

전사 인자 DeltaFosB (FosB2 또는 FosB [짧은 형식]이라고도 함)는 남용, 스트레스 및 전기 경련성 발작 약물을 포함하여 여러 유형의 정신 활동 자극에 만성적으로 노출되어 뇌에서 유도 된 장기 소성의 중요한 매개자입니다. . DeltaFosB의 뚜렷한 특징은 일단 유발되면 추가 자극이없는 상태에서 뇌에 비교적 오랜 시간 동안 지속된다는 것입니다. 그러나 이러한 명백한 안정성의 기본 메커니즘은 알려지지 않은 채 남아 있습니다. 여기, 우리 DeltaFosB 세포 배양에서 약 10 h의 반감기와 상대적으로 안정적인 녹음 방송 요인입니다 보여줍니다. 또한, 우리는 DeltaFosB 두뇌에 phosphoprotein이며 DeltaFosB에 보존 된 세린 잔류 물 (Ser27)의 인 산화 proteasomal 저하로부터 보호 보여줍니다. 우리는이 인산화가 카제인 키나제 2에 의해 매개된다는 것을 암시하는 여러 줄의 증거를 제공합니다. 이러한 발견은 DeltaFosB가 인산화된다는 첫 번째 증거를 구성하며 인산화가 안정성에 기여한다는 것을 증명하며, 이는 뇌에서 오래 지속되는 적응을 매개하는 능력의 핵심입니다.

개요

FosB2 또는 FosB [짧은 형태]라고도하는 전사 인자 ΔFosB는 바로 초기 유전자의 C 말단 절단 스플 라이스 변이체입니다. fosb (Dobrazanski 등, 1991; 나카 베푸와 네이선 스, 1991; 엔 외, 1991). 전장 FosB와 마찬가지로 ΔFosB에는 DNA 결합 기본 도메인과 류신 지퍼가 있으며이를 통해 Jun 단백질과 이량 체화되어 활성화 단백질 -1 (AP-1) 전사 인자 복합체를 형성하여 많은 유전자의 발현을 조절합니다 (Morgan과 Curran, 1995; 2004, Rylski and Kaczmarek). ΔFosB는 FosB의 C 말단에서 발견 된 전이 활성화 도메인의 일부가 없음에도 불구하고, 배양 된 세포 및 뇌에서 강력한 전사 활성화 제 및 억제제로서 기능한다 (Dobrazanski 등, 1991; 나카 베푸와 네이선 스, 1991; Chen 등, 1997; McClung과 Nestler, 2003; 쿠마 (Kumar) 등, 2005).

ΔFosB는 스트레스, 특정 병변, 항 정신병 약 및 항우울제, 남용 약물 및 자연 보상을 포함하여 다양한 정신 활동 자극에 만성적이지만 급 성적이지 않은 뇌에서 지역별 방식으로 높은 수준으로 유도됩니다. (Hope 외, 1994b; 히로 이와 그레이 비엘, 1996; Moratalla 등, 1996; 빙 등, 1997; Mandelzys et al., 1997; Kelz 등, 1999; Werme 등, 2002; Andersson et al., 2003; Colby 등, 2003; Peakman et al., 2003; 페로 티 (Perrotti) 등, 2004; Zachariou 등, 2006). ΔFosB의 유도는 뇌에 대한 이들 자극 중 일부의 기능적 영향과 직접적으로 관련되어있다. 추가 자극이없는 경우에도 ΔFosB의 지속성은 다른 모든 Fos 계열 전사 인자와 구별되는데, 이는 급성 자극에 반응하여 빠르게 유도되고 몇 시간 내에 기저 수준으로 감소하며 일반적으로 만성 자극 후 탈감작을 나타냅니다 (호프 (Hope) 등, 1992; Daunais et al., 1993; Persico 등, 1993; 히로 이와 그레이 비엘, 1996; 페로 티 (Perrotti) 등, 2004). 이것은 ΔFosB를 특정 만성 자극에 의해 야기되는 안정한 뉴런 적응의 기초가되는 유전자 발현의 오래 지속되는 변화의 일부를 매개하는 매력적인 후보로 만든다.

ΔFosB의 연장 된 존재는 mRNA의 추가 유도가없는 상태에서 발생하기 때문에 (Chen 등, 1995), 본 발명자들은 전장 FosB 및 본질적으로 불안정한 다른 모든 Fos 패밀리 단백질과 달리, ΔFosB는 비정상적으로 안정적인 전사 인자 일 수 있다고 추측 하였다 (Hope 외, 1994b; Chen 등, 1997; 네슬러 (Nestler) 등, 2001; McClung 외, 2004). 또한, 급성 대 만성 자극 뇌 조직의 immunoblotting 분석 ΔFosB 명백한 변화를 제안 M_r 만성 치료 중 급성 상태에서 ~ 33 kDa에서 ~ 35-37 kDa로 (분자량)Hope 외, 1994a; Chen 등, 1995). 이러한 다양한 이소 형을 인코딩 할 수있는 추가적인 mRNA의 존재에 대한 증거가 없기 때문에, 본 발명자들은 ΔFosB가 번역 후 변형되고 아마도 이것이 그의 특이한 안정성에 기여한다고 추측했다. 그러나, 현재까지, ΔFosB의 전환 또는 번역 후 변형에 대한 생화학 적 분석은보고 된 바 없다. 본 연구의 목표는 ΔFosB가 인 단백질인지 및 인산화가 그의 안정성에 중요한 역할을 하는지를 결정하는 것이었다.

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재료 및 방법

포유류 세포주 및 DNA 구조물.

PC12 세포 (Clontech, Mountainview, CA)를 1- 글루타민 (L-Gln)을 함유하는 고-글루코스 DMEM에서 배양하고 5 % 태아 소 혈청 (FBS), 10 % 말 혈청 (둘 다 캘리포니아 주 칼스 배드 소재의 인비 트 로젠 (Invitrogen))이 보충되었다 , 100 U / ml 페니실린 및 100 μg / ml 스트렙토 마이신 (모두 미주리 주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich)). HeLa 세포 (American Type Culture Collection, VA, Manassas, VA)를 L-Gln을 함유하는 고 포도당 DMEM에서 배양하고 10 % FBS, 페니실린 및 스트렙토 마이신이 보충되었다. 두 세포주 모두 습한 37 % CO에서 5 ° C로 유지₂ 분위기.

DNA에 의한 일시적 형질 감염을 위해, PC12 또는 HeLa 세포를 다음 웰에 12-90 % 합류에 도달하도록 6- 웰 플레이트 (PC100 세포에 콜라겐 I로 코팅)에 시딩 한 다음 리포 펙 타민 2000 (Invitrogen)를 사용하여 형질 감염시켰다. 일부 실험에서 (참조 도 2 1 ⇓⇓⇓⇓⇓-7), ΔFosB는 재조합 헤르페스 심플 렉스 바이러스 (HSV)에 의한 감염을 통해 PC12 세포에서 일시적으로 발현되었다.

ΔFosB 및 FosB cDNA는 당사의 pTetop 구조 (Chen 등, 1997), pcDNA3.1 벡터 (Invitrogen)로 서브 클로닝 됨. 이들 pcDNA3.1-ΔFosB / FosB 구축물을 포유 동물 세포에서의 발현 및 부위-지정 돌연변이 유발의 주형으로 사용 하였다. 재조합 HSV-ΔFosB는 전술 한 바와 같이 제조되었다 (Neve 등, 1997), 및 제제는 ~ 1 × 10의 역가를 가짐⁸ pfu / ml.

펄스 추적 실험.

감염 / 형질 감염 후 대략 24 시간, 6- 웰 플레이트의 세포 (PC12 또는 HeLa)를 2 ml의 PBS로 2 내지 3 회 세척하고 37 ml의 Cys / Met-free DMEM에서 ~ 1h 동안 2 ° C에서 배양 하였다. 5 % 투석 된 FBS (Hyclone, Logan, UT)로 보충 된 (Invitrogen)은 Met 및 Cys의 세포 내 풀을 고갈시킨다. 이 "기아"기간의 말기에, 약물 (세포를 치료해야하는 경우)을 첨가하고, 세포를 12-25 μCi의 ³⁵S 단백질 라벨링 믹스 (퍼킨 엘머, Wellesley, MA), 1 ℃에서 ~ 37 h 동안 모든 새로 합성 된 단백질을 표지한다. 이어서, 2 ml의 PBS로 세포를 2 내지 3 회 세척함으로써 방사성 표지를 제거하고, ³⁵배지를 5 % FBS가 보충 된 "차가운"(비 방사성) 배지로 교체하고 다양한 시점에서 세포를 수확함으로써 S- 표지 된 단백질을 추적 (추적) 하였다. 체이스 내내 세포 처리가 유지되었다. 이들 실험의 모든 수치는 턴 오버율의 비교를 최적화하기 위해 다양한 초기 단백질 양이 유사하다는 것을 보여준다.

동물 및 만성 전기 경련 발작 치료.

성인 Sprague Dawley 수컷 쥐 (200-300 g; Charles River Laboratories, Kingston, RI)를 7-9 d에 대해 전기 경련성 발작 (ECS)으로 매일 1 회 처리 하였다. ECS는 앞에서 설명한대로 수행되었습니다 (Hope 외, 1994a)를 사용하여 우고 바 실레 (Comerio VA, Italy) ECS 장치 (주파수, 100 펄스 / s); 0.5 ms의 펄스; 충격 지속 시간, 1.0 s; 그리고 전류, 75 mA. 전류없이 귀 클립 전극을 적용함으로써 샴 대조군 동물을 병렬로 처리 하였다.

³² P 대사 표지.

뇌 절편의 표지를 위해, 래트를 탈락시키고, 뇌를 빠르게 절개하고, 300 μm 정면 피질 절편을 DSK 마이크로 슬라이서 (Ted Pella, Redding, CA)로 제조 하였다. 슬라이스를 2 ml의 포스페이트-결핍 인공 CSF (ACSF) 중 플라스틱 튜브 내에서 배양하고 O를 사용하여 일정한 부드러운 버블 링하에 30 ° C에서 유지시켰다₂/ CO₂ 혼합물 (헤밍 스 등, 1989). 오카다 산 (1.3 ng / ml)의 존재 또는 부재하에 슬라이스 (튜브 당 2 개의 슬라이스)를 8-10 h에 대해 100 mCi로 라벨링 하였다. 이 배양이 끝나면 슬라이스를 차가운 ACSF로 3 회 이상 헹군 다음 250 μl의 차가운 방사선 면역 침전 분석 (RIPA) 버퍼에서 초음파 처리하여 균질화 하였다 [PBS, pH 7.4, 150 mm NaCl, 1 % (v / v) ) Igepal, 0.5 % (w / v) 나트륨 데 옥시 콜레이트, 0.1 % (w / v) SDS, 1 mm EDTA], 0.6 %까지 SDS와 함께 사용하기 전에 보충, 포유 동물 세포를위한 프로테아제 억제제 칵테일 (5 μl / ml에서 사용됨); 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich), 포스파타제 억제제 칵테일 I 및 II (1 : 100에서 사용됨; 시그마-알드리치), 1 mm PMSF 및 2 % 글리세롤. 이어서 균질 물을 15 분 동안 비등시키고 15,000 ×에서 원심 분리로 제거 하였다. g 15 분 생성 된 상청액에서의 단백질 농도는 BCA 단백질 분석 (Pierce, Holmdel, NJ)을 사용하여 평가되었다.

다음 ³²배양 된 세포의 P 표지, 감염 / 형질 감염 후 ~ 24h, 세포를 인산염이없는 배지로 2 내지 3 회 세척하고이 배지에서 ~ 1h 동안 배양 하였다. 이 기아 기간 후에 0.2–0.3 mCi ³²PH₃PO₄ (퍼킨 엘머)를 각 웰에 첨가하고, 실험의 종류에 따라 세포를 4-12 h로 표시 하였다 (사양은 그림 1-7 참조). 이어서, 세포를 PBS로 3 회 세척하고 15 μl의 보충 된 RIPA 완충제를 사용하여 얼음상에서 50 분 동안 용해시켰다. 용 해물을 스크래핑하여 수집하고 10 ga 바늘을 통해 25 회 통과시켜 DNA를 전단하고, 10 분 동안 끓이고, 15,000 ℃에서 15-30 분 동안 4 rpm에서 원심 분리 하였다. 정화 된 용 해물 (상청액)을 새로운 튜브로 옮기고 BCA 단백질 분석 (Pierce)을 수행 하였다. 이들 실험의 모든 수치는 유사한 양의 총 야생형 (WT) 및 S27A ΔFosB 단백질을 보여 그들의 상대적인 인산화 수준의 비교를 최적화한다.

화학 물질 및 세포 배양 처리.

오카다 산 (OA; Sigma-Aldrich)을 에탄올에 용해시키고 100 ng / ml의 최종 농도로 사용 하였다. 5,6- 디클로로 -1-β-d- 리보 푸라 노실-벤즈 이미 다졸 (DRB; Biomol, Plymouth Meeting, PA)을 디메틸 설폭 사이드 (DMSO; Sigma-Aldrich)에 용해시키고 50 μm의 최종 농도에서 세포 배양에 사용 하였다. 스 페르 민 (Sigma-Aldrich)을 물에 용해시키고 200 μm의 최종 농도로 사용 하였다. 칼 포스 틴 -C (Biomol)를 DMSO에 용해시키고 0.2 μm에서 사용하였고, 반면에 포르 볼 12- 미리 스테이트 13- 아세테이트 (PMA; Promega, WI, Madison, WI)를 DMSO에 용해하여 0.1 μm에서 사용 하였다. 미리 스토 릴화-오토 캠 타이트 -2 관련 억제 펩티드 (m-AIP; Biomol)를 물에 용해시키고 1 및 10 μm의 최종 농도로 사용 하였다. 광범위 단백질 키나제 억제제 H-7 및 H-8 (Biomol)를 물에 용해시키고 각각 150 및 200 μm의 최종 농도로 사용 하였다. MG132 (캘리포니아, 샌디에고, 캘리포니아) 및에 폭소 마이신 (Peptides International, KY의 루이빌)을 DMSO에 용해시키고 각각 12.5 및 7.5 μm의 최종 농도로 사용 하였다. 모든 실험에서, 처리에 걸쳐 일정한 양의 DMSO를 유지하기 위해 필요에 따라 DMSO (차량)를 세포에 첨가 하였다. 에 대한 ³²P 라벨링 실험에서, 약물을 라벨 바로 앞에 첨가하고 나머지 라벨링 기간 동안 유지 하였다. 맥박 추적 실험을 위해, Cys / Met "기아"시점에 약물을 첨가하고, 표지 기간 동안 유지 한 다음 추적 배지에 다시 첨가 하였다. 프로 테아 좀 억제제를 체이스 내내 3-4h마다 스파이 킹하여 이들 펩티드의 빠른 전환을 보상 하였다.

ΔFosB 면역 침전, 면역 블 롯팅 및자가 방사선 촬영.

면역 침전의 경우, 용 해물을 평범한 RIPA로 1 : 5로 희석하여 면역 침전 (IP)을 진행하기 전에 SDS 농도를 0.1 %로 낮추었다. 비특이적 결합을 제한하기 위해, 적어도 4h 동안 비 면역 IgG 및 단백질 G- 세 파로스 (Sigma-Aldrich)로 면역 침전시켜 용 해물을 먼저 제거 하였다. 이어서, ΔFosB는 용 해물 단백질의 48 μg 당 0.5-1 μg IgG에서 10-50 μg IgG에서 FosB 및 ΔFosB (SC-300G; 산타 크루즈 바이오 테크놀로지스 (Santa Cruz Biotechnology))에 존재하는 내부 에피토프를 인식하는 염소 폴리 클로 날 항체를 사용하여 제거 된 용 해물로부터 면역 침전되었다 0.5 ml의 총 부피에서 (4-8 μg의 총 단백질). IP를 로터에서 15 ℃에서 4h 이상 동안 부드럽게 혼합 한 다음, 3000 μl의 단백질 G- 세 파로스를 첨가하고 IP를 다른 XNUMXh 이상 동안 혼합 하였다. XNUMX ×에서 회전시켜 IP를 펠릿 화 g 3 ° C에서 5–4 분 동안, 0.5 ml의 차가운 일반 RIPA로 3 회, 0.1 % 트윈 20를 함유하는 차가운 PBS로 2 회 세척 하였다. 이어서, IP를 차가운 PBS의 0.5 ml에 재현 탁시키고, 새 튜브에서 펠릿 화하고, 펠렛 화 한 다음, 15-25 μl의 2 x 환원 Laemmli 단백질 샘플 완충제를 첨가하여 면역 침전 된 단백질을 용리시켰다. 이 IP 프로토콜은 용 해물에서 사실상 모든 ΔFosB의 구체적이고 효과적인 침전을 초래했다. 면역 침전 된 단백질을 전체 IP를 12.5 % Tris-HCl Criterion gel (Bio-Rad, Hercules, CA)에 로딩하여 SDS-PAGE 한 후 PVDF 또는 니트로 셀룰로스로 옮겼다. 이송 후, 막을 공기 건조시키고 ³²P와 ³⁵S- 방사성 표지 된 단백질 밴드는 Kodak (뉴욕 주 로체스터) 자동 방사 필름을 사용한 자동 방사선 촬영법과 스톰 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) PhosphorImager를 사용하여 인산화하여 관찰 하였다. 세포 용 해물 또는 뇌 균질 물 중 총 (비 인산화 및 인산화) ΔFosB는 면역 침전 된 단백질 중 하나의 면역 블 롯팅에 의해 검출되었다 ( ³²P- 표지 단백질), 또는 SDS-PAGE에 적용되고 PVDF 또는 니트로 셀룰로스로 옮긴 동량의 용 해물 / 균질 물 단백질. 막은 1 ° C에서 0.1 h 동안 20 % (v / v) 트윈 1 (시그마)가 보충 된 PBS 중 25 % (w / v) 무 지방 건조 우유 (바이오-라드)와 함께 배양함으로써 막을 차단 하였다. 이어서 막을 4 ℃에서 밤새 면역 블 롯팅하여 FosB / ΔFosB의 아미노산 1-16 (1 : 10,000에서 사용)에 대해 생성 된 자체 토끼 항 -FosB 폴리 클로 날 항체를 사용하여 면역 블 롯팅 하였다. 1 차 인큐베이션 후, 막을 차단 완충액으로 5 분 동안 4 회 세척 한 후, 와사비 퍼 옥시 다제에 접합 된 염소 항-토끼 IgG와 함께 25 ℃에서 ~ 1h 동안 인큐베이션 하였다 (차단 완충액에서 1 : 5000에서 벡터로부터 사용됨). 실험실, 캘리포니아 주 벌링 게임). 이어서 막을 차단 완충액으로 10 분 동안 3 회, PBS로 5 분 동안 1 회 세척 하였다. 총 ΔFosB 단백질 밴드는 강화 된 화학 발광 (Pierce) 및 / 또는 ECL-Plus 시약 (Amersham Biosciences) 및 Storm PhosphorImager를 사용한 형광의 검출에 의해 Kodak MR 필름에서 시각화되었습니다.

곤충 세포로부터 재조합 ΔFosB의 과발현 및 정제.

ΔFosB는 Sf9 곤충 세포에서 Bac-to-Bac 바큘로 바이러스 발현 시스템 (Invitrogen)을 사용하고 제조사의 지시에 따라 N 말단 헥사 -His- 태그 된 단백질 (N-His (6) ΔFosB)로서 Sf2 곤충 세포에서 과발현되었다. 간략하게, 친 화성 N- 말단 태그 MGHHHHHHAG가 선행 된 ΔFosB cDNA (잔류 물 237-1)가 pFASTBacTM9 벡터에서 서브 클로닝되었으며, 이는 재조합 바큘로 바이러스를 생성하는데 사용되었다. Sf6 세포를 재조합 바이러스로 감염시키고, N-His (XNUMX) ΔFosB를 니켈 컬럼 (Qiagen, Valencia, CA)을 사용한 친 화성 크로마토 그래피, 모노 -Q 컬럼을 사용한 음이온 교환 (Amersham)을 포함한 여러 크로마토 그래피 단계로 세포 용 해물로부터 정제 하였다 (Amersham 겔 여과 컬럼 (Amersham Biosciences)을 사용한 크기 및 배제.

체외 인산화 연구.

체외 시간 경과 및 화학량 론 분석을위한 인산화 반응은 30 μm 기질 (N-His (10) ΔFosB 또는 양성 대조군 기질), 6 μm ATP 및 250 μCi / μl를 함유하는 1 μl의 부피에서 수행되었다 [γ-³²P] ATP, 키나제 제조사에 의해 공급 된 완충제, 및 다음 키나제 중 하나 : CK2 (20 ng / μl; 업 스테이트, 버지니아 주 샬롯 스빌), CaMKII (10 ng / μl; 업 스테이트), PKC (1.6 ng / μl; Calbiochem) 또는 p70S6K (2.5 mU / μl; 업 스테이트). 지정된 시점에서 반응 용액으로부터 5 μl 분취 량을 제거하고 동일한 부피의 4 x 환원 Laemmli 단백질 샘플 완충제를 첨가하여 시간 경과 반응을 수행 하였다. CK2 반응에 대한 Michaelis-Menten 동역학 파라미터는 실험적으로 정의 된 선형 정상 상태 조건에서 결정되었다. 이러한 반응은 15 ng / μl 효소, 10 μm ATP, 2 μCi / μl [γ-³²P] ATP 및 6-2.5 μm 범위의 N-His (30) ΔFosB 농도. 모든 반응은 수조에서 30 ℃에서 수행되었다. SDS-PAGE 및 Bio-Safe Coomassie (Bio-Rad)로 겔을 염색 한 후, 겔을 건조시키고, ³²P- 포스페이트 혼입은 인산화 분석 (아래, 데이터 정량화, 계산 및 통계 참조)에 의해 평가되었다.

2 차원 포스 포 펩티드 맵 및 포스 포 아미노산 분석.

이 두 가지 분석은 Ploegh and Dunn (2000). 간단히 말하면, 건조 젤 조각 ³²P- 표지 된 ΔFosB ( 체외에서 대사 적으로 표지 된 세포의 반응 또는 면역 침전물로부터의 반응)을 절제하고, 재수 화시키고, 세척하고, 트립신 소화시켰다. 트립신 분해 생성물을 함유하는 상청액을 동결 건조하고 동결 건조물을 여러 번 세척하고 10 μl의 전기 영동 완충액, pH 1.9에 재현 탁시켰다. 샘플 (3 μl)을 셀룰로스 박층 크로마토 그래피 (TLC) 플레이트 (Analtech, Newark, DE) 상에 스팟 팅하고 전기 영동에 의해 한 차원에서, TLC를 상승시킴으로써 다른 차원에서 분리 하였다. 생성 된 포스 포 펩티드 맵을 자동 방사선 사진 및 인산화에 의해 시각화 하였다. 포스 포 아미노산 분석을 위해, 전기 영동 완충액에 재현 탁 된 트립신 분해물의 2 μl을 N 하에서 105 m HCl에서 25 분 동안 3 ° C에서 HCl 가수 분해에 의해 추가로 절단 하였다₂ 분위기. 물에서 6 배 희석하여 반응을 정지시키고, 혼합물을 동결 건조시켰다. 동결 건조물을 5 μl의 전기 영동 완충액, pH 1.9에 재현 탁시키고, 포스 포 -Ser, -Thr 및 -Tyr 표준과 함께 셀룰로오스 TLC 플레이트에서 발견 하였다. 전기 영동 완충액, pH 1.9를 사용하여 TLC 플레이트 길이의 절반에 대해 전기 영동을 수행 한 후, 플레이트를 pH 3.5 완충액으로 옮기고 전기 영동을 완료 하였다. TLC 플레이트에 아세톤 중 1 % (v / v) 닌히 드린 용액을 분무하여 포스 포 아미노산 표준을 시각화하고, ³²P- 표지 된 아미노산 샘플을자가 방사선 법 및 인광 화법에 의해 가시화 하였다.

siRNA- 유도 된 CK2α 녹다운.

CK2 수준을 선택적으로 녹다운하기 위해 RNA 간섭 방법을 사용했습니다.Di Maira et al., 2005). PC12 세포를 콜라겐 I- 코팅 된 6- 웰 플레이트 상에 시딩하여, 다음날, 비 표적화 siRNA의 70 nm (최종 농도) 또는 촉매의 mRNA를 향한 siRNA로 일시적으로 형질 감염되었을 때 ~ 80-20 % 합류에 도달 하였다. 형질 감염 제 SilentFectin (Bio-Rad)의 2 μl을 사용하고 제조사의 지시에 따라 Rat CK5의 α 서브 유닛. 대략 24 시간 후, 세포를 상기 언급 된 바와 같이 ΔFosB 플라스미드로 일시적으로 형질 감염시켰다. 대략 24 시간 후 (siRNA 형질 감염 후 ~ 48 시간), 세포에 ³²상기 한 바와 같은 P 대사 표지 또는 펄스 추적 분석. 다음의 4 개의 CK2α siRNA가 유사한 결과로 사용되었다 : 5'P-CAAACUAUAAUCGUACAUCUU3 ', 5'P-UCAAUCAU-GACAUUAUGCGUU3', 5'P-UAGUCAUAUAUAUAUUCUCCGUU3 ', 5'P-AAAUCAUACAU 부정적인 통제로 우리는 소음 장치 Ambion (Austin, TX)으로부터의 음성 대조군 #3 siRNA. CK2 녹다운의 정도는 2 : 06 희석에서 밤새 항 -CK873 폴리 클로 날 항체 (Upstate로부터의 카탈로그 # 1-1000)를 사용하여 면역 블 롯팅에 의해 모니터링되었다. β- 투 불린을 로딩 대조군으로 사용하고 05 : 661 희석에서 밤새 단일 클론 항체 (업 스테이트로부터의 카탈로그 # 1-20,000)로 검출 하였다.

부위 지향적 돌연변이 유발.

Ser27의 Ala 또는 Asp 로의 돌연변이는 Quick Change Site-Directed Mutagenesis 키트 (Stratagene, La Jolla, CA)를 사용하고 제조업체의 지시에 따라 수행되었습니다. 마우스 ΔFosB 단백질에서 Ser27 돌연변이를 도입하기 위해, 다음 돌연변이 유발 프라이머를 사용 하였다. Ser27에서 Ala로 : (역 프라이머) 5'GCCGAAGGAGTCCACCGAAGCCAGGTACTGAGACTCGGCGGAGGG3 '. Ser27에서 Asp로 (전방 프라이머) 5'CCCTCCGCCGAGTCTCAGTACCTGGATTCGGTGGACTCCTTCGGC3 '. 돌연변이 된 염기는 굵게 표시되고 Ser27 코돈은 이탤릭체로 표시됩니다.

생물 정보학.

ΔFosB에 대한 잠재적 인산화 부위 및 키나제는 마우스 단백질 서열을 ProSite (http://www.expasy.org/prosite/), PredictProtein (Rost et al., 2004) 및 NetPhosK (Blom et al., 2004).

데이터 수량화, 계산 및 통계

PVDF 또는 니트로 셀룰로스 막에 존재하는 단백질의 양은 스톰 포스 포 이미 저 및 수반 된 ImageQuant 소프트웨어 (Amersham Biosciences / Molecular Dynamics)를 사용하여 정량화 하였다. 세포 배양 및 뇌 슬라이스 인산화 연구에서 ³²이어서, P- 표지 된 단백질을 총 ΔFosB에 대해 수득 된 값으로 나누고, 비율로 표현 하였다. 에서 체외에서 인산화 연구, 양 ³²ΔFosB의 몰당 P- 표지 된 ΔFosB (화학 양론)는 전술 한 바와 같이 계산되었다 (Sahin et al., 2004). 모든 측정은 사용 된 기기의 선형성 범위 내에서 수행되었습니다. 동역학 파라미터는 Michaelis-Menten 모델을 사용하여 계산되었습니다. V = V_Max[S] / ([S]+K_M) and V_Max = k₂[E_금액]. 반감기 (t_1/2)의 ΔFosB 및 FosB는 펄스-추적 플롯 (데이터 포인트에 가장 잘 맞는 비선형 회귀 사용)에서 추정되었으며 잔류 단백질의 양이 원래의 50 % 인 시간에 해당합니다. 모든 도면에서, 제시된 결과는 적어도 2 내지 3 회의 독립적 인 실험을 나타낸다. 모든 그래프에서 표시된 데이터는 평균 ± SEM입니다 (3 ≤ n ≤16). 차이의 통계적 유의성은 짝을 이루지 않은 채로 평가되었습니다. t 테스트, 다중 비교를 위해 수정되었으며 별표는 p ≤ 0.05.

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결과

ΔFosB는 비정상적으로 안정적인 전사 인자입니다

우리는 이전에 ΔFosB가 비교적 안정적인 전사 인자라고 추측했지만네슬러 (Nestler) 등, 2001), 단백질의 회전율 프로파일의 직접적인 분석은 현재까지 수행되지 않았다. 이 질문을 해결하기 위해, 뉴런 유사 세포주로서 광범위하게 사용 된 PC12 세포를 사용하여 펄스 추적 실험을 수행하였으며, 여기서 ΔFosB는 재조합 헤르페스 심플 렉스 바이러스 (HSV-ΔFosB)에 의한 감염을 통해 일시적으로 발현되었다. 새롭게 합성 된 단백질은 ³⁵S-Met / Cys 및 ³⁵S- 표지 된 ΔFosB (³⁵S-ΔFosB)는 방사성 표지 된 아미노산을 제거한 후 다양한 시점에서 얻은 세포 용 해물로부터 면역 침전시켜 모니터링 하였다. SDS-PAGE 및자가 방사선 사진에 의한 면역 침전물의 분석은 PC12 세포에서 ΔFosB의 반감기가 ~ 10 h (Fig. 1). 이러한 발견은 ΔFosB의 반감기가 세포 배양에서 반감기가 ~ 90 min (1) 인 것으로보고 된 전장 FosB를 포함하여, 대부분의 유도 성 전사 인자의 것보다 더 높은 것으로 나타났다 (토론 참조).Dobrazanski 등, 1991; Carle et al. 2004). 또한, ΔFosB의 분해는 1도 지수 감쇠 곡선에 적합하지 않지만, 오히려 분해 속도가 느리기 시작하여 2 상이라는 점에 주목할 가치가 있습니다. 이는 하나 이상의 ΔFosB 종 및 / 또는 하나 이상의 분해 경로의 존재를 시사한다.

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그림 1.

ΔFosB는 비정상적으로 안정적인 전사 인자입니다. ΔFosB의 반감기는 세포 배양에서 ~ 10h이다. HSV-ΔFosB에 의한 감염 또는 ΔFosB 함유 플라스미드에 의한 일시적 형질 감염에 의해 PC12 세포에서 ΔFosB를 발현시키고, 물질 및 방법에 기재된 바와 같이 세포를 펄스 추적 실험에 적용 하였다. ΔFosB를 과발현하는데 사용 된 방법에 관계없이 동등한 결과가 얻어졌다. 이 그림은 ΔFosB 분해의 시간 경과 (및 대표적인 오토 라디오 그램)를 보여줍니다. 플롯 된 데이터는 적어도 5 개의 독립적 인 실험으로부터 얻은 15 이상의 개별 데이터 포인트의 평균 ± SEM입니다. 비교를 위해, 전장 FosB의보고 된 반감기가 표시됩니다.

ΔFosB는 뇌의 인 단백질입니다

우리는 ΔFosB의 번역 후 변형이 외관 안정성에 기여할 수 있다고 가정했다. 인산화는 안정성을 포함하여 여러 방식으로 전사 인자의 활성을 조절하는 것으로 나타났기 때문에 (검토를 위해, Desterro et al., 2000; Whitmar and Davis, 2000), 우리는 ΔFosB가 인 단백질인지 조사했다. 이를 위해, ΔFosB 발현은 만성 ECS를 사용하여 랫트 뇌에서, 특히 전두 피질에서 높은 수준의 ΔFosB를 유도하는 것으로 알려진 치료법을 사용하여 유도되었다 (Hope 외, 1994a). 마지막 ECS 처리 후 1 일, ΔFosB 수준이 높게 유지 될 때, 얇은 정면 피질 슬라이스를 제조하고 대사 적으로 표지 하였다. ³²P- 오르토 포스페이트. 평행 한 슬라이스 세트는 방사성 표지되지 않았으며, 이들은 총 ΔFosB 수준을 검출하는데 사용되었다. 특정 항 -FosB / ΔFosB 항체로 면역 침전 및 SDS-PAGE에 의한 면역 침전 단백질 분리 후 인산화 ³²P- 표지 된 ΔFosB는자가 방사선 법에 의해 검출되는 반면, 총 ΔFosB는 면역 블 롯팅에 의해 검출되었다. 이 분석은 ΔFosB가 뇌에서 인산화되는 것으로 밝혀졌다. ³²만성적으로 처리 된 뇌 샘플에 존재하는 ~ 35 kDa의 P- 표지 된 밴드, 그러나 가짜 처리 된 대조군에서는 사실상 검출 될 수 없다 (Fig. 2A). 이것은 만성 자극이 없을 때 ΔFosB의 기본 수준이 매우 낮다는 사실과 일치합니다. 면역 침전 반응의 특이성은 비 면역 IgG 침전물에 신호가없는 것으로 설명된다.

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그림 2.

ΔFosB는 뇌의 인 단백질입니다. A, ΔFosB는 뇌에서 인산화된다. 재료 및 방법에 기술 된 바와 같이 만성 ECS 처리에 의해 래트 뇌에서 내인성 ΔFosB가 유도되었다. 전두엽 피질 슬라이스는 대사 적으로 표지되었다 ³²PH₃PO₄ 몇 시간 동안. 슬라이스의 균질화 후, ΔFosB를 면역 침전시키고, 인산화 ΔFosB (³²P-ΔFosB)는 자동 방사선 사진 (상단 패널)에 의해 검출되었다. 비 방사성 면역 침전물 중 총 ΔFosB는 면역 블 롯팅 (하단 패널)에 의해 검출되었다. 음성 대조군으로서, 모의 처리 된 동물 및 비 면역 IgG의 면역 침전물이 도시되어있다. B, 마우스 ΔFosB 단백질 서열에 대한 상응하는 예측 점수를 갖는 후보 인산화 부위 및 키나제를 생체 정보 분석에 의해 수득 하였다. 예측 점수가 더 높은 후보 부위는 단백질 서열에서 강조 표시되고 표에 나열됩니다. DNA- 결합 (기본) 도메인 및 류신 지퍼는 단백질 서열에서 굵게 표시되어 있습니다. C, DΔFosB 인산화는 Ser / Thr 포스파타제 억제제 OA에 의해 증가된다. C, ³²부재 (Ctr) 또는 100 ng / ml OA의 존재 (그래프 및 상부 패널)로 라벨링 된 정면 피질 슬라이스로부터의 면역 침전물에서의 P-ΔFosB 수준을자가 방사선 촬영에 의해 검출 하였다. 하부 패널은 면역 블 롯팅에 의해 표지되지 않은 슬라이스로부터 면역 침전물에서 검출 된 총 ΔFosB를 보여준다. DPC12 세포를 HSV-ΔFosB 또는 HSV-LacZ (벡터)로 감염시키고 다음과 같이 대사 적으로 표지 하였다 ³²PH₃PO₄ 100 ng / ml OA의 부재 (Ctr) 또는 존재하에. ³²면역 침전물에서의 P-ΔFosB 수준은자가 방사선 사진 (그래프, 상단 패널)에 의해 검출되었다. 하부 패널은 면역 블 롯팅에 의해 세포 용 해물에서 검출 된 총 ΔFosB를 보여준다.

어느 키나제 (들) 및 부위 (들)가 ΔFosB 인산화에 관여 하는지를 규명하기위한 첫 단계로서, 본 발명자들은 아미노산 서열을 몇 가지 생체 정보 분석에 적용 하였다. 이것은 비록 ΔFosB가 Tyr 인산화 후보 부위를 포함하지 않지만, 3 개의 CaMKII 부위, 3 개의 CK2 부위, 및 매우 높은 인산화 예측 점수를 갖는 2 개의 PKC 부위를 포함하는 여러 Ser / Thr 키나제 컨센서스 부위를 함유한다는 것을 밝혀냈다 (Fig. 2B). 생물 정보학을 통해 예측 된 바와 같이, ΔFosB가 Ser 또는 Thr 잔기에서만 인산화되는 경우, 그 인산화는 Ser / Thr 포스파타제의 활성에 의해 상당히 조절되어야한다. 이 가설을 테스트하기 위해 정면 대뇌 피질 슬라이스에 ³²Ser / Thr 단백질 포스파타제 억제제 인 OA의 존재 또는 부재 하의 P- 오르토 포스페이트. 그림과 같이 그림 2COA로 인해 (~ 2.5 배) 크게 증가 ³²P-ΔFosB. 또한 총 ΔFosB 수준의 작은 증가를 일으켰는데, 이는 OA의 발암 효과를 Fos 단백질을 포함하여 몇 가지 즉각적인 초기 유전자를 유도하는 능력과 연결하는 이전의 보고서와 일치합니다 (Miller et al., 1998; Choe 등, 2004). 최종 결과는 인산화 된 ΔFosB 수준에서 전체적으로 유의미한 증가 (~ 60 %)입니다.

우리는 실험 조작에 더 적합한 PC12 세포에서 ΔFosB가 뇌에서 보이는 것과 유사한 인산화 패턴을 보였는지를 조사했다. 우리는 HSV-ΔFosB 감염을 통해 PC12 세포에서 ΔFosB를 발현하고 대사 적으로 세포를 ³²OA의 존재 또는 부재 하의 P- 오르토 포스페이트. HSV-ΔFosB- 감염 세포로부터 단백질의 성공적인 발현 및 면역 침전은 면역 블롯 (Fig. 2D벡터-감염된 세포에는 존재하지 않고 ~ 35 kDa 밴드의 오토 라디오 그래프 (상부 패널) 및 하부 사진). 뇌에서 관찰 된 바와 같이, OA는 총 ΔFosB 수준에서 약간의 증가를 일으켰지 만, 훨씬 더 (약 2 배) 증가했습니다. ³²P-ΔFosB는 ΔFosB 인산화에서 상당한 (~ 50 %) 순 증가를 초래한다. 또한, 생물 정보 학적 예측과 일치하여, Tyr 포스파타제 억제제로 PC12 세포를 처리해도 유의미한 변화는 발생하지 않았다. ³²P-ΔFosB 레벨 (데이터는 표시되지 않음). 함께, 이러한 발견은 ΔFosB가 뇌 및 PC12 세포에서 Ser 및 / 또는 Thr 잔기에서 인산화되고 후자가 ΔFosB의 인산화 및 분해 프로파일을 추가로 연구 할 수있는 우수한 세포 배양 시스템임을 확인 하였다.

CK2이지만 PKC 또는 CaMKII는 ΔFosB를 인산화하지 않음 체외에서

전술 한 바와 같이, ΔFosB 아미노산 서열의 분석은 CK2, PKC 및 CaMKII 인산화 부위에 대한 높은 예측 점수를 나타냈다. 이들 키나제 중 어느 것이 ΔFosB를 인산화 할 수 있는지를 결정하기 위해, 우리는 일련의 체외에서 정제 된 키나제 및 정제 된 재조합 ΔFosB를 사용한 인산화 반응. 그림과 같이 그림 3A3 개의 후보 키나제 중에서, CK2만이 유의 한 방식으로 ΔFosB를 인산화시켰다. 또한, 몇몇 다른 키나제 (예를 들어, GSK3 및 p70S6K)를 시험하였으나 ΔFosB를 유의하게 인산화하지 못 하였다 (데이터는 나타내지 않음). 시간 경과 분석에 의한 CK2 반응의 추가 특성화는이 키나제가 ΔFosB 1 몰당 ~ 0.5 몰의 인산염의 혼입을 촉매 할 수 있음을 나타냈다 (Fig. 3B). CK2가 ΔFosB를 인산화 할 수 있다는 사실 체외에서 상당한 화학량 론 (~ 50 %)은 생리적으로 관련된 반응을 암시한다. 우리는 증가 된 양의 정제 된 ΔFosB의 존재하에 CK2를 배양 하여이 반응의 동역학을 연구했으며, 우리는 CK2가 ΔFosB를 V_최대 5.8 pmol · 분^{- 1} · μg^{- 1} 효소의 K_M 18.4 μm 및 k_방법 0.2 / s의Fig. 3C). 이들 동역학 파라미터에 대해 얻어진 값은이 반응의 생리 학적 관련성을 추가로지지한다. 예를 들어 K_M 가장 잘 알려진 기질 중 하나 인 DARPP2에 대한 CK32는 3.4 μm이며 k_방법 ~ 0.3 / s (Girault 등, 1989); 그만큼 K_M ATP 범위 ~ 10–40 μm (Cochet et al., 1983; Silva-Neto 등 2002), 카세인의 경우 ~ 10 ~ 50 μm (메 지오 (Meggio) 등의 1977; Pyerin et al., 1987). 함께,이 데이터는 ΔFosB가 CK2의 선의 기판임을 나타냅니다. 체외에서.

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그림 3.

CK2이지만 PKC 또는 CaMKII는 ΔFosB를 인산화하지 않음 체외에서. 자동 방사선 사진 (상단 패널)은 인산화 된 생성물을 나타내고, 쿠마시 염색 된 겔 (하단 패널)은 반응에 존재하는 총 ΔFosB를 나타낸다. A, 정제 된 재조합 ΔFosB에 적용 체외에서 다양한 후보 키나제에 의한 인산화 (3 개가 도시 됨). B, 시간 경과 및 화학량 론 분석은 CK2가 ΔFosB를 인산화 할 수 있음을 나타냅니다 체외에서 화학량 론은 ~ 50 %이다. C, CK2 반응의 동 역학적 분석은 ΔFosB가 선의의 것으로 밝혀졌다 체외에서 기판. 반응의 선형화는 이중 왕복 플롯 (아래)으로 표시되지만, 운동 파라미터는 Michaelis-Menten 곡선 (위)에서 도출되었습니다.

CK2는 온전한 세포에서 ΔFosB의 인산화 및 안정성을 조절합니다

ΔFosB의 CK2- 매개 인산화의 생리 학적 관련성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 비교 포스 포 펩티드 맵핑을 사용하여 수행 하였다. 체외에서 인산화 및 PC12 세포 인산화 ΔFosB. SDS-PAGE 및 겔 용리 후 ³²P-ΔFosB ( 체외에서 의 반응 또는 면역 침전 ³²P- 표지 된 세포), 단백질을 트립신으로 소화시키고, 생성 된 포스 포 펩티드를 2 차원 분리시켰다. 이 분석은 CK2 반응으로부터의 주요 포스 포 펩티드가 PC12 세포에서 인산화 된 ΔFosB로부터의 2 개의 주요 포스 포 펩티드 중 하나와 개시됨을 밝혀냈다 (Fig. 4APKC 또는 CaMKII 반응에 의해 생성 된 포스 포 펩티드는 반응하지 않았다. PC12 세포로부터의지도에 두 번째 ΔFosB 포스 포 펩티드가 존재했지만, 키나제의 임의의 무능력으로 인해 유사한 포스 포 펩티드를 생성하기 위해 테스트 한 바있다 체외에서현재,이 제 2 포스 포 펩티드가 다른 포스 포 펩티드와 상이한 포스 포 릴화 부위를 함유하는지 또는 그것이 동일한 포스 포 릴화 부위를 함유하는 별개의 트립신 펩티드를 나타내는 지 여부는 현재 알려져 있지 않다.

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그림 4.

CK2는 온전한 세포에서 ΔFosB의 인산화 및 안정성을 조절합니다. A, PKC가 아닌 CK2는 세포에서 ΔFosB를 인산화하는 것으로 보인다. CK2 또는 PKC에 의해 인산화 된 ΔFosB의 2 차원 포스 포 펩티드 맵 체외에서 또는 온전한 PC12 세포에 의해. 화살표는 PC2 세포로부터 수득 된 ΔFosB 포스 포 펩티드 중 하나와 PKC- 포스 포 릴화 된 CK12- 포스 포 릴화 된 펩타이드의 개시를 나타낸다. B, 강력한 CK12 활성화 제 스 페르 민 (SP)으로 세포를 처리함으로써 PC2 세포에서 ΔFosB 인산화가 증가하고 CK2 억제제 DRB로 처리함으로써 감소된다. 대조적으로, PC12 세포에서의 ΔFosB 인산화는 PKC 활성화 제 (PMAC) 또는 PKC- 특이 적 억제제 칼 포스 틴 -C (Calph) 로의 처리에 의해 영향을받지 않았다. 대표적인 오토 라디오 그램 (상단 패널) 및 면역 블롯 (하단 패널)이 도시되어있다. C-F, ΔFosB 안정성에 대한 CK2 활성의 영향. 도면은 ΔFosB 분해의 시간 경과 (및 대표적인 오토 라디오 그램)를 나타낸다. ΔFosB를 일시적으로 발현하는 PC12 세포는 CK2 억제제 DRB의 부재 또는 존재하에 수행 된 펄스 추적 실험에 적용되었다 (C), CK2 활성화 제 스 페르 민 (D) 또는 광범위 키나제 억제제 H-8 (E)는 DRB의 비특이적 효과를 제어하는 데 사용되었습니다. F, CKFNUMX의 촉매 서브 유닛을 녹다운시키는 것이 ΔFosB 안정성에 미치는 영향. PC2 세포를 비 표적화 siRNA (Ctr) 또는 siRNA 표적화 랫트 CK12α로 형질 감염시키고, 2h를 나중에 ΔFosB 플라스미드로 형질 감염시켰다. 상부 패널은 CK24 및 ΔFosB 단백질 수준에 대한 CK2 siRNA의 효과를 나타내는 전 세포 용 해물의 면역 블롯을 도시한다. β- 튜 불린에 대한 상응하는 면역 블롯은 로딩 대조군으로서 도시되어있다.

ΔFosB 키나제로서 CK2의 생리적 관련성을 추가로 다루기 위해, 본 발명자들은 CK12 활성을 조절하는 2 개의 약물로 ΔFosB- 발현 PC2 세포를 처리 하였다. 그림과 같이 그림 4B, 세포 투과성 CK12 억제제 DRB로 PC2 세포를 처리함으로써 ΔFosB 인산화가 감소되었다 (메 지오 (Meggio) 등의 1990; Szyszka et al., 1995) 및 강력한 CK2 활성화 제로 알려진 폴리아민 스 페르 민으로 처리함으로써 증가됨 (코 chet과 참 바즈, 1983; 메 지오 (Meggio) 등의 1983). 대조적으로, PKC 억제제 칼 포스 틴 -C로 PC12 세포의 처리 (고바야시 (Kobayashi) 등, 1989; 타마 오키 (Tamaoki) 등, 1990) 또는 PKC 활성화 제 PMA (슈미트와 헤커, 1975; Beh et al., 1989)는 ΔFosB 인산화에 중대한 변화를 초래하지 않았다. PMA의 경우, 약간 (그리고 유의하지 않은) 증가 ³²P-ΔFosB는이 약물에 의해 야기 된 총 ΔFosB 수준의 증가에 의해 설명 될 수 있으며; 실제로, 포볼 에스테르는 FosB를 포함하여 여러 Fos 계열 단백질의 발현을 유도한다고보고되었습니다.Yoza et al., 1992; Suh et al., 2004). 또한, 특정 세포 투과성 CaMKII 억제제 m-AIP (이시다와 후지사와 1995; Stevens et al., 1999)는 또한 감소 된 ΔFosB 인산화를 초래하지 않았다 (데이터는 나타내지 않음). 이러한 결과는 체외에서 결과는 온전한 세포에서 ΔFosB가 PKC 또는 CaMKII가 아닌 CK2에 의해 인산화 될 가능성이 있음을 나타낸다. CK2 억제가 ΔFosB 인산화를 완전히 예방하지 못한다는 사실은 단백질에 추가 인산화 부위가 존재 함을 나타낸다.

다음으로, CK2가 ΔFosB의 회전율 및 그 안정성에 중요한 역할을하는지 여부를 조사했습니다. 이를 위해, 본 발명자들은 CK12 억제제 또는 인산화 연구에 사용 된 CK2 활성화 제로 처리 된 ΔFosB- 발현 PC2 세포를 사용하여 펄스 추적 실험을 수행 하였다. 그림과 같이 그림 4CCK2 억제제 DRB로 세포를 처리하는 것은 2상에서 지수 붕괴에 가까운 곡선으로의 분해 곡선의 형태의 변화에 의해 입증 된 ΔFosB의 전환율에 유의 한 영향을 미쳤다. 반대로, CK2 활성화 제 스 페르 민의 존재는 ΔFosB의 분해 속도를 현저하게 감소 시켰으며, 이는 추적 첫 시간 동안 단백질의 축적을 초래했다.Fig. 4D).

많은 키나제 활성화 제 및 억제제의 경우에서와 같이, 스 페르 민 및 DRB는 CK2 활성의 조절 외부에서 대사 효과를 가질 수있다. 실제로, DRB는 전사 인자 IIH (TFIIH)-관련 키나제를 억제하는 것으로 나타났다 (Yankulov et al., 1995), 이는 RNA 폴리머 라제 II- 매개 전사를 억제시킨다. 이 효과는 ΔFosB의 안정성에 영향을 줄 수 있기 때문에 광범위한 키나제 억제제 H-8의 효과를 분석했습니다.히다카와 코바야시, 1992) TFIIH 관련 키나제를 억제하지만 CK200는 억제하지 않는 것으로 알려진 농도 (2 μm)에서 ΔFosB 회전율Yankulov et al., 1995). 도시 된 바와 같이 그림 4EH-8 처리는 ΔFosB의 회전율에 영향을 미치지 않았다. TFIIH- 연관 키나제를 억제하지만 CK7는 억제하지 않는 농도로 사용 된 또 다른 광대역 키나제 억제제 인 H-2로 유사한 결과를 얻었다 (데이터는 나타내지 않음). 이들 데이터는 DRB에 의해 야기 된 ΔFosB 안정성의 감소가 CK2의 억제에 기인 할 수 있다는 해석을 추가로지지한다.

ΔFosB 회전율에서 CK2의 역할을 추가로 확립하기 위해, 우리는 siRNA를 통해 CK2를 무너 뜨리는 결과를 조사했다. 본 발명자들은 먼저 대조군 (비 표적화) siRNA 또는 래트 CK12 (CK2α)의 촉매 서브 유닛의 mRNA를 표적으로하는 siRNA 및 나중에 ΔFosB로 형질 감염된 2 h로 형질 감염된 PC24 세포를 사용하여 이들 실험을 수행 하였다. 그림과 같이 그림 4FCK2α siRNA에 의한 형질 감염은 ΔFosB 수준에 영향을 미치지 않으면 서 CK2α 단백질 수준을 효율적이고 구체적으로 녹다운시켰다 (상부 패널). 펄스 추적 분석 결과, CK2를 녹다운 시키면 단백질의 더 빠른 분해에 의해 입증 된 바와 같이 ΔFosB 회전율이 상당히 증가한 것으로 나타났다. CK2 활성을 억제하면 (DRB 처리 또는 siRNA를 통해) ΔFosB의 전환율이 증가하고 2 상 곡선의 느린 속도 성분이 사라지는 반면, CK2 활성화는 곡선의 느린 단계를 향상시키고 강력한 지원을 제공합니다. CK2가 ΔFosB 안정성을 조절하는 역할을한다는 아이디어.

CK2는 Ser27에서 ΔFosB를 인산화합니다

CK2에 의해 인산화 된 ΔFosB의 부위를 확인하기 위해, 우리는 CK2에 의해 인산화 된 재조합 ΔFosB의 포스 포-아미노산 분석을 수행 하였다 체외에서 및 PC12 세포에서 인산화 된 ΔFosB. 이 실험은 두 경우 모두에서 포스 포-아미노산 만 검출 된 것은 포스 포 -Ser (Fig. 5A). 이 발견은 CK2에 대해 얻은 화학량 론과 함께 체외에서 인산화 반응 (~ 50 %) (Fig. 3B) 및 CK2 포스 포 펩티드 맵에서 단 하나의 중요한 지점의 존재 (Fig. 4A), ΔFosB의 CK2 인산화는 아마도 단일 세린 잔기로 제한 될 수 있음을 시사한다. 이 결론은 인산화 합의 부위 분석 (Fig. 2B)는 CK27에 대해 하나의 후보 세린, 즉 Ser2 만 예측했습니다. 분류 분석 결과, Ser27는 Fos 가족 구성원 사이의 진화를 통해 매우 보존 된 것으로 나타났습니다.Fig. 5B), 중요한 생리 기능을 가질 수 있음을 시사합니다.

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그림 5.

CK2는 Ser27에서 ΔFosB를 인산화합니다. A, CK2- 포스 포 릴화 된 포스 포 아미노산 분석 (체외에서) 및 PC12 세포-인산화 된 ΔFosB는 두 경우 모두 인산화 된 주요 잔기가 세린임을 나타낸다. B, FosB / ΔFosB 아미노산 서열의 종간 분석은 인간에서 제브라 피쉬까지의 Fos 패밀리 구성원들 사이에서 Ser27의 높은 보존을 나타냈다 (다크 하이라이트). 그러나 CK3 컨센서스 사이트에 필요한 + 2 위치의 산성 잔류 물은 보존되지 않습니다 (밝은 하이라이트). C, HeLa 세포를 Ser27를 Ala (S27A)로 대체하기 위해 점 돌연변이를 함유하는 야생형 ΔFosB (WT) 또는 ΔFosB로 일시적으로 형질 감염시켰다. 세포는 대사 적으로 표지되었다 ³²PH₃PO₄ CK2를 활성화시키기 위해 비히클 또는 스 페르 민 (SP)으로 처리됨. 얻어진 ΔFosB 면역 침전물의 대표적인 오토 라디오 그램 (상단 패널) 및 면역 블롯 (하단 패널)이 도시되어있다. 모의 형질 감염된 세포 (벡터)의 면역 침전물이 도시되어있다.

Ser27가 ΔFosB에서 인산화되는지를 결정하기 위해,이 잔기를 Ala로 돌연변이시키고, 단백질의 인산화 상태에 대한 결과를 분석 하였다. 이를 위해, 본 발명자들은 HeLa 세포 (보다 높은 효율로 형질 감염 될 수 있음)를 사용하여 WT 또는 S27A 돌연변이 체 ΔFosB를 일시적으로 발현시켰다. 형질 감염 후 대략 24 시간 후에, 세포를 대사 적으로 표지 하였다 ³²P- 오르토 포스페이트 및 전 세포 용 해물을 제조 하였다. 면역 침전 및 SDS-PAGE에 이어 ³²P-ΔFosB는자가 방사선 법에 의해 검출되었고 총 ΔFosB는 면역 블 롯팅에 의해 검출되었다. 그림과 같이 그림 5C (하단 패널), ΔFosB는 벡터-감염된 세포에서 검출되지 않은 반면, WT 또는 S27A 돌연변이 체 ΔFosB로 형질 감염된 세포는 단백질을 성공적으로 발현시켰다. S27A 돌연변이가 현저한 (~ 30 %) 감소를 일으킨다는 것을 발견했습니다. ³²P-ΔFosB 레벨 (Fig. 5C, 살아있는 세포에서 ΔFosB가 Ser27에서 인산화됨을 나타내는 상단 패널 및 그래프). 세포에서 Ser27가 실제로 CK2에 의해 인산화되는지 여부를 확인하기 위해 WT 및 S2A ΔFosB의 인산화를 조절하는 CK27 활성화 제 스퍼민의 능력을 비교 하였다. 이전에 PC12 셀에서 관찰했듯이 (Fig. 4B), 스퍼민으로 HeLa 세포의 처리는 WT 단백질의 인산화를 유의하게 증가시켰다. 이 효과가 S27A 돌연변이에 의해 현저히 감소되었다는 사실은Fig. 5C)는 ΔFosB의 Ser27가 CK2의 생리적 기질이라는 해석을 지원합니다.

Ser27의 인산화는 ΔFosB의 안정성을 조절합니다

CK2가 억제되면 ΔFosB의 안정성이 감소하고 CK2가 활성화되면 강화됩니다 (Fig. 4), CK2는 Ser27에서 ΔFosB를 인산화합니다 (Fig. 5), 우리는이 부위의 인산화를 막 으면 단백질이 불안정해질 것이라고 예측했다. WT 또는 S27A 돌연변이 체 ΔFosB를 일시적으로 발현하는 HeLa 세포로 수행 된 펄스 추적 실험은 예측 된 바와 같이, S27A 돌연변이가 ΔFosB의 분해 속도의 현저한 증가 및 단백질 반감기의 동반 감소를 초래한다는 것을 밝혀냈다 (Fig. 6A). 그런 다음이 조절 메커니즘이 더 뉴런 같은 PC12 세포주에서 발생하는지 조사했습니다. 이 실험은 우리가 HeLa 세포에서 관찰 한 바와 같이, S27A 점 돌연변이가 PC12 세포에서 ΔFosB의 반감기를 급격히 감소시키는 것으로 밝혀졌다 (~ 11에서 ~ 4 h까지).Fig. 6B). 이 불안정화는 CK2 억제 또는 녹다운 (knock-down)으로 인한 것과 유사합니다 (Fig. 4)는 Ser2의 CK27- 매개 인산화가 ΔFosB의 안정성을 조절한다는 아이디어에 대한 추가 지원을 제공한다. ΔFosB 단백질 회전율에 대한 Ser27 인산화의 조절 역할에 대한 추가 증거는 인지질 Ser27 대 Asp 돌연변이 (S27D)를 사용하여 수득 하였다. S27D 돌연변이는 아미노산 27에 큰 음으로 하전 된 (카르 복실)기를 배치하여 Ser27의 인산화를 부분적으로 모방하기 때문에 인지질로 간주됩니다. 그림과 같이 그림 6CS27D 돌연변이는 S27A 돌연변이의 반대 효과를 일으켜 WT 단백질보다 훨씬 더 안정적인 단백질을 초래 하였다. CK2 활성화 후 얻은 효과와 유사Fig. 4D)에 따르면, S27D 돌연변이는 체이 킹의 첫 시간 동안 축적되어 ΔFosB 수준을 증가시켰다.

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그림 6.

Ser27의 인산화는 ΔFosB의 안정성을 조절합니다. A, C, ΔFosB의 회전율에 대한 Ser27 인산화의 효과를 나타내는 펄스 추적 분석. 야생형 ΔFosB (WT), Ser27 대 Ala 돌연변이 체 (S27A) 및 인지질 Ser27 대 Asp 돌연변이 체 (S27D)의 분해 프로파일 및 추정 반감기가 제시되어있다. HeLa 세포에서 동일한 결과가 얻어졌다 (A) 및 PC12 셀 (B, C).

Ser27 인산화는 프로 테아 좀 분해를 방지하여 ΔFosB를 안정화시킵니다

Ser27의 인산화가 ΔFosB를 안정화시키는 메카니즘의 해명을 시작하기 위해, 우리는 프로 테아 좀 억제제 MG132의 능력을 조사했다 (Palombella et al., 1994; 쓰 부키 외, 1996) 및에 폭소 마이신 (하나 다 외 1992; Kim et al., 1999)를 사용하여 WT 및 S27A 돌연변이 체 ΔFosB의 분해 속도를 조절한다. WT 또는 S12A ΔFosB를 발현하는 재조합 HSV로 감염되고 DMSO 또는 2 개의 프로 테아 좀 억제제 중 하나로 처리 된 PC27 세포를 사용하여 펄스 추적 실험을 수행 하였다. 이 실험은 비록 WT 단백질의 분해 속도가 두 프로 테아 좀 억제제 중 하나의 존재에 상대적으로 둔감하다는 것을 보여 주었다 (Fig. 7A), S27A 돌연변이 체의 돌연변이 체는 이러한 약물 (Fig. 7B). 이는 WT 단백질과 달리 S27A 돌연변이 체가 프로 테아 좀 분해의 표적임을 나타낸다. 실제로, MG132 또는에 폭소 마이신을 사용한 세포의 처리는 S27A 돌연변이의 반감기가 MG27에 대해 ~ 4에서 ~ 9 h로 증가하고 MG132에 대해 ~ 에 폭소 마이신의 12 h (Fig. 7B). 함께, 이러한 발견 Ser27에 ΔFosB의 인 산화 단백질 프로 테아 좀 저하에서 보호 하 고 따라서 그 특이 한 안정성에 필수적입니다 나타냅니다.

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그림 7.

Ser27의 인산화는 프로 테아 좀 분해를 방지함으로써 ΔFosB를 안정화시킨다. A, B, 야생형 ΔFosB의 분해 프로파일 및 추정 된 반감기를 나타내는 HSV- 감염 PC12 세포를 이용한 펄스 추적 분석 (A) 또는 S27A ΔFosB (B) 2 개의 프로 테아 좀 억제제 [MG132 및에 폭소 마이신 (Epoxo)] 중 하나의 부재 또는 존재. 어느 약물도 야생형 ΔFosB의 전환에 유의 한 영향을 미치지 않는 반면, 프로 테아 좀 억제제로 세포를 처리하면 S27A ΔFosB가 안정화되었다는 사실에 주목하십시오. C, 장기 뇌 가소성을 매개하는 ΔFosB의 능력에서 Ser27 인산화의 역할에 대한 모델. 일단 유도되면, ΔFosB의 일부는 S2의 CK27- 매개 인산화에 의해 뇌에서 안정화된다. 그 결과 축적이 생겨 유전자 발현이 오래 지속됩니다. 유전자 발현의 이러한 안정한 변화는 안정한 행동 적응에 기여한다. 반대로, Ser / Thr 포스파타제 PP27 및 / 또는 PP1A에 의한 S2의 탈 인산화는 단백질의 불안정화 및 프로 테아 좀기구에 의한 처리를 초래한다.

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토론

현재의 연구에서, 우리는 세포 배양에서 ΔFosB의 반감기가 ~ 10 h이며, 이는 전장의 FosB 및 세포 배양에서 반감기가 짧을 수있는 대부분의 다른 유도 성 전사 인자와 비교하여 안정적이라는 것을 보여준다 몇 분 동안 3 h를 초과하는 경우는 거의 없습니다. (Hann and Eisenman, 1984; Dobrazanski 등, 1991; Roberts and Whitelaw, 1999; 페라라 외, 2003; Hirata et al., 2004). 또한, 우리는 ΔFosB가 뇌에서 인산화되고 그 인산화가 PP1 / PP2A 억제제 오카다 산에 민감하다는 것을 발견 하였다. 우리의 세포 배양 연구는 ΔFosB의 안정성이 단백질을 안정화시키는 더 높은 CK2 활성과 함께 CK2에 의해 조절된다는 것을 입증한다. 마지막으로, 우리의 발견은 CK2가 고도로 보존 된 N 말단 세린 (S27)에서 ΔFosB를 인산화하고 S27의 인산화가 ΔFosB를 프로 테아 좀 분해로부터 보호한다는 것을 입증한다. 따라서 우리는 CK27에 의한 S2에서 ΔFosB의 인산화가 ΔFosB의 전환의 중요한 규제 메커니즘 인 모델을 제안합니다.Fig. 7C). ΔFosB의 이러한 인산화-매개 안정화는 기능적으로 중요하다. 특히 뇌 영역에서 ΔFosB의 증가 된 수준은 수많은 뉴런 유전자를 직접 조절하는 것으로 밝혀 졌기 때문이다 생체내에서 그리고 몇몇 신경 정신병 적 장애의 동물 모델에서 강력한 행동 효과를 발휘합니다 (소개 참조).

인산화는 CREB (cAMP response element binding protein)와 같은 특정 전사 인자의 전사 활성을 조절하는 빠르고 가역적 인 방법이지만 (Bohmann, 1990), 전사 인자의 분해를 조절하는 것은 훨씬 더 강력한 (쉽게 가역적 인) 형태의 조절 (Desterro et al., 2000). 기능적 활성이 분해 수준에서 조절되는 전사 인자는 NFκB (Desterro et al., 2000), c-Myc (시어스 외, 1999) 및 c-Fos (페라라 외, 2003) 등이 있습니다. 많은 경우에, 인산화는 c-Fos에 대해 나타낸 바와 같이 전사 인자의 안정성의 주요 조절제이다 (오카자키와 사가 타, 1995; 쓰 루미 (Tsurumi) 등, 1995), Fos 관련 항원 -1 (Fra-1) (약병과 마샬, 2003), Fra-2 (Manabe et al., 2001), c-Jun (Fuchs 등, 1996), JunB (Fuchs 등, 1997), ATF2 (Fuchs 등, 2000) 및 p53 (Buschmann et al., 2001). 우리의 연구 따라서 따라서 기능 활동의 인 산화 종속 안정성을 통해 규제 전사 요소 목록에 ΔFosB를 추가합니다.

CK2는 지금까지 확인 된 300 개 이상의 기질을 가지고 있으며 세포 사멸 및 생존을 포함한 여러 생물학적 과정에 연루된 유비쿼터스 및 구성 활성 Ser / Thr 키나아제입니다 (리치 필드, 2003; Unger et al., 2004), 세포 스트레스 반응 (야나가와 등 1997; 카토 등, 2003), DNA 복구 및 염색질 리모델링 (Barz et al., 2003; 크론 (Krohn) 등의 2003). CK2의 추정 기질의 3 분의 1 이상이 유전자 발현 조절에 관여하는 단백질입니다 (메기 오와 피나, 2003). 실제로 CK2는 눈에 띄는 핵 키나아제 인 것으로 나타났습니다 (Krek et al., 1992) (검토에 대해서는 Yu et al., 2001) 및 여러 전사 인자의 bZIP 도메인과 상호 작용야마구치 외 1998). CK2- 매개 인산화는 또한 IkB를 포함하여 많은 단백질의 분해 (강화 또는 감소)를 조절하는 것으로 나타났다 (슈왈츠 (Schwarz) 등의 1996), PTEN (토레스와 풀리도, 2001), 렌즈 코 넥신 (Yin et al., 2000), 염색질 관련 단백질 HMG1 (Wisniewski et al., 1999) 및 HMGB (Stemmer et al., 2002), Myf-5 (Winter 외, 1997) 및 c-Myc (Channavajhala와 Seldin, 2002). CK2는 뇌에서 가장 풍부합니다 (Alcazar 등, 1988; Girault 등, 1990), 그리고 그 활동은 신경 생존을 포함한 뇌 기능의 여러 측면에 관련되어 있습니다.Boehning et al., 2003), 차별화 (Nuthall et al., 2004), 이온 채널 기능 (존스와 야켈, 2003; 빌들 (Bildl) 등, 2004), 장기 강화 및 신경 가소성 (Diaz-Nido 등, 1992; Lieberman and Mody, 1999; Reikhardt et al., 2003).

뉴런 기능의 조절에서 CK2의 역할에 대한 이러한 증가하는 증거에도 불구하고, 그것의 활동을 제어하는 것에 대해서는 알려진 바가 거의 없다. CK2는 주로 세포 내 위치 변화 (예 : 세포질 대 핵)의 변화에 의존하는 특정 기질을 인산화하는 능력의 조절과 함께 구성 적으로 활성 인 것으로 생각된다 (Ahmed와 Tawfic, 1994; Yu et al., 1999). 이 정보는 만성 자극 후 뇌에서 ΔFosB 축적을 유도하는 데 필요한 신호에 관한 중요한 질문을 제기합니다 (Fig. 7C). 하나의 요구 사항은 fosB ΔFosB mRNA의 유전자 및 유도Chen 등, 1995). 우리의 데이터는 ΔFosB의 CK2 인산화가 안정성에 중요하다는 것을 나타내며, 두 번째 신호는 유전자 발현, 즉 CK2에 의해 단백질의 인산화를 자극하는 신호에 대한 ΔFosB의 장기 효과에 필요할 수 있음을 시사합니다. 이것은 알려지지 않은 메커니즘에 의한 CK2의 활성화 또는 핵으로의 전위와 관련이 있습니다. 대안 적으로, ΔFosB의 CK2 포스 포 릴화는 ΔFosB 단백질이 각각의 자극에 반응하여 번역 될 때, 그 일부가 포스 포 릴화되고 따라서 안정화되어 반복 된 자극으로 영향을받는 뉴런에서 높은 수준으로 축적되도록 구성적일 수있다.

우리의 연구 결과 CK2 및 S27는 아마도 유일한 키나아제 및 ΔFosB 인산화에 대한 책임이있는 사이트가 아니라는 것을 보여줍니다. 마찬가지로 S2A 돌연변이가 phospho-ΔFosB에서 27 % 감소를 가져온다는 사실은 S27가 단백질의 주요 인산화 부위라고 주장합니다. 그럼에도 불구하고, 우리는 ΔFosB의 다른 추정 키나제 및 인산화 부위를 조사하고 있습니다. 궁극적으로 S30의 인산화와 뇌의 ΔFosB에있는 다른 인산화 부위를 분석하는 것이 중요합니다. 생체내에서 다양한 유형의 만성 자극 후, 예를 들어 질량 분석 또는 포스 포 특이 적 항체의 사용.

위에서 언급 한 바와 같이, ΔFosB의 S27는 진화 및 다른 Fos 계열 단백질 중에서도 매우 보존 적이다. 그러나 CK2에 대한 합의 사이트는 다음과 같습니다. 그림 5Bc-Fos 또는 Fra-2가 아닌 FosB / ΔFosB (및 Zebrafish xenolog) 만 CK3 인산화의 주요 결정 인 + 2에 산성 잔류 물이 있습니다 (마린 (Marin) 등, 1986; 메 지오 (Meggio) 등의 1994). 따라서, S2상의 CK27 인산화의 결여는 왜 다른 Fos 패밀리 단백질이 ΔFosB만큼 안정적이지 않은지를 설명 할 수있다. 그러나 이것은 ΔFosB와 동일한 CK2 합의 사이트를 갖는 전장 FosB가 유사하게 안정화되지 않은 이유를 설명하지 않습니다. 우리는 전장 FosB가이 보존 된 잔류 물에서 CK2에 의해 인산화되는지 여부를 모른다. FosB의 유일한 보고서 (스키너 등, 1997) 및 c-Fos (오카자키와 사가 타, 1995; Chen 등, 1996) 인산화는 ΔFosB에는없는 이들 단백질의 C- 말단 영역의 부위를 기술한다. CK2에 의한 전장 FosB 및 기타 Fos 패밀리 단백질의 잠재적 인산화는 직접적인 조사가 필요합니다. 그러나, 이들이 인산화 되더라도, 다른 Fos 패밀리 단백질은 C 말단에 모티프를 함유하여 단백질을 급속하게 분해하는 것으로 알려져있다 (Papavassiliou et al., 1992; Jariel-Encontre et al., 1997; Acquaviva 등, 2002). 예를 들어, 모든 Fos 패밀리 단백질의 C 말단에 존재하지만 ΔFosB에는 존재하지 않는 ~ 21 잔기의 신장이 c-Fos에 대한 불안정화 도메인으로서 작용하는 것으로 나타났다 (Acquaviva 등, 2001). 비록이 서열이 전장 FosB를 유사하게 불안정화하지만 (Carle et al., 2004)에서, ΔFosB에서이 도메인의 부재는 그 안정화를 완전히 설명하지 못한다. 오히려,이 C 말단 도메인의 부재와 Ser27 인산화의 조합은 ΔFosB와 FosB 사이의 안정성의 대략 5 배 차이를 완전히 설명하는 것으로 보인다.

Fos 패밀리 단백질의 분해는 복잡하고 완전히 이해되지는 않지만, 프로 테아 좀 분해는 관련된 주요 경로 인 것으로 보입니다 (Salvat 등, 1999; Acquaviva 등, 2002; 페라라 외, 2003). 프로 테아 좀 억제제가 ΔFosB 분해 속도를 크게 변화시키지 않는 데이터는, 다른 Fos 패밀리 단백질과는 달리, ΔFosB는 26S 프로 테아 좀을 회피하며, 이는 안정화에 중심적인 역할을한다고 주장한다. 따라서 우리는 ΔFosB의 향상된 안정성이 두 가지 주요 요소의 조합에 기인하는 방식을 제안한다 : (1) C- 말단 불안정화 도메인의 부재 및 (2) CK27에 의한 S2의 인산화.

요약하면, 본 연구는 왜 초기 유전자의 산물 인 ΔFosB에 대해 기계적인 통찰력을 제공합니다 fosB다른 Fos 가족과 달리 비교적 오래 지속되는 단백질입니다. 다른 Fos 계열 단백질은 신속하지만 일시적인 자극 전사 커플 링을 매개하는 것으로 생각되지만 (Morgan과 Curran, 1995), ΔFosB의 상대적인 안정성은 만성 자극에 의해 유도 된 더 오래 지속되는 전사 변화를 매개하는 능력을 부여한다. 이것은 ΔFosB가 뇌에서 지속적인 분자 스위치로서 기능하여 점차적으로 급성 반응을 만성적 적응으로 전환 시킨다는 견해를지지한다. ΔFosB의 안정성을위한 중심 메카니즘으로서 Ser27 인산화의 확인은 ΔFosB의 기능을 조절하고 신경 및 행동 가소성에 대한 장기적인 영향을 조절하는 수단의 개발을위한 새로운 길을 열어 준다.

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각주

11 월 21, 2005을 받았다.
개정판에 2 월 21, 2006이 (가) 접수되었습니다.
4 월 2, 2006 허용.

이 연구는 정신 분열증 및 우울증 젊은 수사관에 대한 국가 연합 연구 협회 PGE에 대한 국립 연구 협회 상, PGU에 대한 국립 약물 남용 연구소 (NIDA) 국립 연구 서비스 상을 수상했으며, 국립 정신 건강 연구소 및 NIDA로부터 EJN Dr. James Bibb에게 도움을 주셔서 감사합니다. 체외에서 인산화 분석, Ming Han Huh 박사는 대사 표지에 사용되는 뇌 조각의 준비에 도움을 주었고 Rachael Neve 박사는 재조합 HSV의 포장에 도움을주었습니다.
G. Rudenko의 현재 주소 : 미시간 대학교 생명 과학 연구소 및 약리학과, 210 Washtenaw Avenue # 3163A, Ann Arbor, MI 48109-2216.
해당 내용은 TX 5323-75390, Dallas, 9070 Harry Hines Boulevard, Eric J. Nestler에게 문의하십시오. 이메일: [이메일 보호]

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참고자료

Acquaviva C, Brockly F, 페라라 P, Bossis G, Salvat C, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2001) G (0) -S 상 전이 동안 c-Fos 원 종양 단백질의 신속한 프로 테아 좀 분해의 제어에 관여하는 C- 말단 트리 펩티드 모티프의 확인. 종양 유전자 20:7563-7572.

추상

개요

재료 및 방법

포유류 세포주 및 DNA 구조물.

펄스 추적 실험.

동물 및 만성 전기 경련 발작 치료.

32 P 대사 표지.

화학 물질 및 세포 배양 처리.

ΔFosB 면역 침전, 면역 블 롯팅 및자가 방사선 촬영.

곤충 세포로부터 재조합 ΔFosB의 과발현 및 정제.

체외 인산화 연구.

2 차원 포스 포 펩티드 맵 및 포스 포 아미노산 분석.

siRNA- 유도 된 CK2α 녹다운.

부위 지향적 돌연변이 유발.

생물 정보학.

데이터 수량화, 계산 및 통계

결과

ΔFosB는 비정상적으로 안정적인 전사 인자입니다

ΔFosB는 뇌의 인 단백질입니다

CK2이지만 PKC 또는 CaMKII는 ΔFosB를 인산화하지 않음 체외에서

CK2는 온전한 세포에서 ΔFosB의 인산화 및 안정성을 조절합니다

CK2는 Ser27에서 ΔFosB를 인산화합니다

Ser27의 인산화는 ΔFosB의 안정성을 조절합니다

Ser27 인산화는 프로 테아 좀 분해를 방지하여 ΔFosB를 안정화시킵니다

토론

각주

참고자료

이 기사를 인용 한 기사

한눈에 보기

³² P 대사 표지.