코카인 자체 투여 및 철회 중 DeltaFosB, FosB 및 cFos의 선조체 조절 (2010)

J Neurochem. 저자 원고; PMC 10 월 1, 2011에서 사용 가능합니다.
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추상

만성 약물 노출은 약물 중독의 발달의 기초가되는 것으로 생각되는 유전자 발현 프로파일의 변경을 유도한다. 본 연구는자가-투여 및 요킹 된 랫트에서 만성 정맥 코카인 투여 동안 및 이후에 선조 하위 영역에서 전사 인자, 특히 cFos, FosB 및 ΔFosB의 Fos 패밀리의 조절을 조사 하였다. 우리는 cFos, FosB 및 ΔFosB 만성 코카인 관리 후 핵 accumbens (NAc) 셸 및 코어에 ΔFosB 단백질의 더 큰 축적과 함께 지역 및 시간적으로 독특한 식 패턴을 전시하는 동안 caudos-putamen (CPu)에서 ΔFosB 증가 남아 발견 급성 또는 만성 투여와 유사합니다. 대조적으로, 만성 투여를 갖는 모든 3 선조체 하위 영역에서 ΔFosB에 대한 코카인-유도 mRNA에 대한 내성이 개발되었다. 또한 공차는 FosB 발현, 특히 NAc 쉘 및 CPu에서 발달 하였다. 흥미롭게도, 코카인으로 유도 된 cFos 유도에 대한 내성은 배 쪽에서 코카인 섭취의 자발적 조절에 의존적이지만 등쪽 선조 영역에서는 그렇지 않았지만, FosB 및 ΔFosB의 조절은 코카인자가 투여 및 요크 된 동물에서 유사 하였다. 따라서, CPu에서의 ΔFosB- 매개 신경 적응은 정맥 코카인 사용의 개시로 이전에 생각 된 것보다 일찍 일어날 수 있고, NAc에서의 ΔFosB의 더 큰 축적과 함께 코카인-탐구 행동의 중독 관련 증가에 기여할 수있다.

키워드 : 코카인, 자기 관리, 철수, 선조, Fos

개요

중독성 약물에 반복적으로 노출되면 뇌 보상 경로에서 신경 적응이 이루어지며, 이는 강박 적 약물 복용의 발달과 갈망 및 약물 복용 행동의 재발의 지속성에 기초하는 것으로 생각됩니다. 이러한 신경 적응 중 상당수는 전사 인자의 유도 및 유전자 발현의 후속 조절에 기인하며, 이는 뉴런 구조 및 기능에 잠재적으로 오래 지속되는 영향을 미칠 수 있습니다.장 et al. 2006). 이 패밀리의 구성원이 급성 및 만성 코카인 노출 후 선조 영역에서 차등 유도 패턴을 나타 내기 때문에 Fos 전사 인자 패밀리가 특히 중요하다. 코카인이 수동적 인 비-병행 적 방식으로 (즉, 복강 내 (IP) 주사에 의해) 급성으로 투여 될 때, 등 (caudate-putamen, CPu) 및 복부 (nucleus accumbens, NAc) 둘 다에서 cFos 및 FosB mRNA 및 단백질을 증가시킨다 선조 (그레이 비엘 et al. 1990; 젊은 et al. 1991; 소망 et al. 1992), 이 반응에 대한 내성은 만성 수동 투여로 발생하지만 (소망 et al. 1992, 1994; 알리바이 et al. 2007). 대조적으로, ΔFosB (35-37 kDa)의 선조 수준은 fosB 유전자, 만성이지만 급성 수동 코카인 노출 후 상승 (소망 et al. 1994; NYE et al. 1995; 첸 et al. 1995, 1997). 이러한 안정적인 ΔFosB 이소 형은 cFos 또는 FosB와 다른 Jun 계열 단백질로 이종이 량체 화 될 수 있습니다.첸 et al. 1995), 자체 기능적 동종이 량체 (Jorissen)를 형성 할 수 있음 et al. 1997), 만성 코카인 후 활성화 제 단백질 -1 (AP-1) 복합체의 차등 형성은 급성 코카인 노출에 의해 생성 된 유전자 발현과는 다른 방식으로 AP-1 부위에서의 유전자 발현을 변화시킬 수 있음을 시사한다 (희망, 1998; Kelz and Nestler, 2000). ΔFosB 상승이 단기 또는 장기인지에 따라 유전자 발현 프로파일의 차등 변화가 발생하며, 이러한 변화는 코카인 매개 행동의 차등 발현을 야기 할 수있다 (맥 클룽 앤 네슬러, 2003). 암페타민, 모르핀, Δ를 포함한 다른 약물에 만성 노출9-THC, 니코틴, 에탄올 및 phencyclidine은 또한 선조 부위에 안정적인 ΔFosB 이소 형의 축적을 초래합니다 (McClung et al. 2004; 페로 티 et al. 2008). 또한, 최근의 발견은 만성 자극제 노출 후 발견 된 cFos 유도에 대한 내성을 설명 할 수있는 ΔFosB 축적과 암페타민-유도 된 cFos 사이의 음성 상호 작용을 제안한다 (Renthal et al. 2008). 함께, 이러한 발견은 안정한 ΔFosB 이소 형이 "분자 스위치"로서 작용할 수 있고 초기 약물 사용에서보다 중독 된 생물학적 상태로의 전환을 촉진 할 수 있다는 가설을 이끌어 냈다. (네슬러 et al. 2001; 네슬러, 2008).

대부분의 이전의 연구는 Fos 패밀리 단백질의 발현을 연구하기 위해 반복 된 수동 코카인 처리를 사용 하였지만, 코카인이 인간 학대 패턴의 전형적인 몇 시간 동안 정맥 내 (IV)자가 투여 될 때 이러한 조절의 예는 비교적 적다. 한 연구에 따르면 cFos mRNA는 생쥐에서 코카인자가 투여의 단일 30- 분 세션 (Kuzmin and Johansson, 1999) 후 CPu에서 상승한 반면, 하위 시간 경과 후 쥐의 CPu에서는 변화가 발견되지 않았습니다 ( 3 일) 또는 만성 (6-12 주) 코카인자가 관리 (Daunais et al. 1993, 1995). 철수 기간 후, NAc에서 cFos 단백질의 코카인 매개 증가는 사전에 증가 된 코카인 섭취량을 가진 쥐에서 감소합니다 (벤샤 하르 et al. 2004), 코카인 관련 단서에 노출 된 후 선조체 전체에서 cFos 수준이 높아짐 (네이 수완 더 et al. 2000; 쿠팔 et al. 2009). cFos와 대조적으로, 만성 코카인자가 투여 후 선조체 전반에 걸쳐 증가 된 ΔFosB의 단백질 수준이 나타 났으며,이 축적은 적어도 1 일 동안 금단으로 지속될 수있다 (피치 et al. 1997; Perotti et al. 2008). 그러나, 다중 Fos 패밀리 단백질의 반응성의 변화를 급성 또는 만성 노출과 같은 정맥 내 코카인 투여와 비교하는 보고서는 없다. ΔFosB와 cFos 사이의 잠재적 인 상호 작용, 차등 AP-1 복합체 형성이 유전자 발현에 대한 차등 효과를 생성하는 능력 및 이러한 차이가 코카인 매개 행동에 미치는 영향을 고려할 때, 비 우발적 투여 후 발생하는 cFos, FosB 및 ΔFosB의 발현은 또한 코카인이 자발적으로 자체 투여 될 때 발견되며, 코카인 투여가 종료 된 후 이러한 변경이 지속될 수있는 기간을 결정한다. 따라서, 본 연구에서 우리는 만성 IV 코카인 투여가 코카인 투여 및 회수 동안 선조 소 영역에서 ΔFosB, FosB 및 cFos의 발현에 미치는 영향을 비교 하였다. 우리는 급성 또는 만성 노출 후 자발적 요크 주입을 통해 코카인의 동일한 양과 시간적 패턴을받는 동물에서의 조절과 의지 적 자기 관리로 발견 된 조절을 비교했습니다. FosB와 ΔFosB가 동일한 스플 라이스 변형 인 경우 fosB 유전자, 우리는 또한 단백질 수준에서의 조절과 FosB 및 ΔFosB에 대한 mRNA의 조절을 비교 하였다.

실험 절차

과목 및 수술

초기에 대략 250-300 g의 무게를 갖는 성인 수컷 스프 라그-돌리 (Sprague-Dawley) 래트를 12 h 명암주기 (7 : 00 AM에서 점등)에서 온도 및 습도 제어 환경에 수용 하였다. 동물에게 음식과 물을 공급했습니다 광고 무제한 슈 크로스 펠렛 (85 mg, BioServ)에 대한 레버-프레스 훈련 동안 자유 공급 중량의 45 %로 유지되는 것을 제외하고는 항상 예외. 고정 비율 100 (FR3) 강화 일정에 따라 획득 기준이 충족 될 때까지 (1 연속 세션의 세션 당 1 펠릿) 환기 식 작동 챔버 (Med Associates, Georgia, VT)에서 레버 프레스 교육을 실시했습니다. 그런 다음 동물에게 먹이를주었습니다 광고 무제한 수술 전 24 시간 이상. 수술을 위해, 래트에게 호흡을 보조하기 위해 아트로핀 (0.04 mg / kg, 피하)을 투여하였고, 이전에 공표 된 절차에 따라 나트륨 펜 토바 비탈 (50 mg / kg, IP) 마취하에 오른쪽 목 정맥에 만성 유치 카테터를 삽입 하였다 (Edwards et al. 2007a). 수술 후, 래트에게 감염을 방지하기 위해 페니실린 (200,000 IU / kg, 근육 내)을 주사하고 카테터를 매일 0.2 ml 헤파린 화 (20 IU / ml) 정균 식염수로 젠타 마이신 설페이트 (0.33 mg / ml)를 함유하여 세척 하였다. 모든 실험 절차는 국립 보건원에 따라 수행되었습니다. 실험실 동물의 관리 및 사용 안내서, UT 남서부 의료 센터 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다.

장치 및 자체 관리 절차

수술로부터 1 주 회복 후, 동물을 다수의 실험 그룹 / 탈퇴 시간으로 나누었다 (1A), 이전에 설명한대로 일일 세션에서 운영 테스트 챔버로 반환 (Edwards et al. 2007b). 처리되지 않은 대조군 그룹의 랫트를 단독으로 수용하고자가 투여 환경에 노출시키지 않고 그들의 집 케이지에서 매일 처리 하였다. 코카인자가 관리 (CSA) 그룹의 쥐는 매일 0.5 h 세션에서 고정 비율 50 (FR1) 강화 일정에 따라 코카인 (1 mg / kg / 4 μl 주입)을 자발적으로자가 투여 할 수있었습니다. / wk, 총 6 일입니다. 각 활성 레버 프레스는 활성 레버 위의 큐 라이트의 조명과 관련된 18의 코카인 주입을 생성했습니다. 코카인 주입 동안 하우스 라이트가 소멸되었으며, 주입 후 하우스 라이트가 꺼진 상태에서 2.5의 시간 초과 기간이 추가로 발생했습니다. 주입 및 타임 아웃 기간 동안의 레버 반응은 기록되었지만 결과는 없었다. 추가 비활성 레버가 챔버에 있었지만이 레버에 반응해도 아무런 영향을 미치지 않았습니다. 만성 요크 (CY) 그룹의 랫트는 능동적으로자가-투여하는 랫트와 짝을 이루고, 그들의 자기-투여 파트너와 동일한 양 및 시간적 패턴으로 수동 코카인 주입을 받았다. 급성 요크 (AY) 그룹의 쥐들도 만성 CSA 그룹의 쥐들과 짝을 이루었지만, 첫 투여를위한 수동 코카인 주입의 단일 세션을 받았을 때 자기 관리의 마지막 날까지 코카인 대신 수동 식염수 주입을 받았다. 시각. 마지막으로, Saline SA 그룹은 치료하지 않은 대조군과 비교할 때 수술, 테스트 또는 기타 실험 절차와 관련된 잠재적 인 변화를 식별하기 위해 식염수를 자체적으로 관리 할 수있었습니다. 급성 및 만성 코카인 노출에 의한 cFos, FosB 또는 ΔFosB의 반응성 변화를 확인하기 위해 AY와 CY 그룹의 비교를 사용하였고, CSA와 CY 그룹을 비교하여 cFos, FosB 또는 ΔFosB 발현의 변화를 확인 하였다 코카인의 보전 대 약리학 적 효과와 관련이 있습니다. cFos, FosB 및 ΔFosB의 코카인 유발 조절을 비교하기 위해 최종 12.5 h 테스트 세션 직후에 모든 연구 그룹으로부터 조직을 수집하고, 조직이 4 h 또는 24로 수집 된 조직을 갖는 일부 연구 그룹에 대해 코카인 유발 변화의 지속성을 결정 하였다 최종 테스트 세션 후 wk. 정량적 웨스턴 블롯 및 RT-PCR 절차를 선조체 하위 영역의 해부에서 사용하여 항체 교차 반응성과 관련된 잠재적 문제를 회피하고 변화를 검출하기위한 민감성을 개선시켰다.

그림 1  

(A) 코카인 투여 및 철수 (WD) 요법을 나타내는 타임 라인. 실선은 만성 코카인자가 투여 (CSA) 및 만성 요크 (CY) 동물에서 코카인 주입 (0.5 mg / kg / 주입)의 정맥 투여를 나타냅니다. ...

조직 수집

랫트는 헤드 영역 (5 kW, 1.5 s, Murimachi Kikai, Tokyo, Japan)을 겨냥한 마이크로파 조사에 의해 희생되었다. 뇌를 신속하게 해부 및 식히고, 핵 축적 (NAc) 셸, NAc 코어 및 caudate-putamen (CPu)의 양측 조직 펀치 (14 게이지)를 1.5 mm 관상 슬라이스에서 얻은 좌표를 기반으로 획득했습니다. Paxinos와 Watson (1998에 설명 된 그림 1B). 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 함유하는 용해 완충액에서 초음파 처리에 의해 조직 샘플을 균질화시켰다. 이어서, 균질 물을 5 분 동안 끓여 얼음에 놓은 후, 단백질 농도를 결정하기 위해 Lowry에 의해 분석 하였다. 이어서, 균질 물을 20 μg 샘플에서 분취하고, 사용할 때까지 -80 ℃에 저장 하였다.

웨스턴 블롯

조직 샘플을 트리스 / 글리신 / 나트륨 도데 실 설페이트 완충 식염수 용액 (TGS; Bio-Rad, Hercules, CA)에서 전기 영동에 의해 분리하기 위해 12 % 폴리 아크릴 아미드 겔에 로딩 하였다. 분리 후, 샘플을 전기 영동 (250 h의 경우 18 mA)에 의해 폴리 비닐 리덴 플루오 라이드 막 (PVDF; Amersham, Piscataway, NJ)으로 옮긴 다음 3 % 무 지방 분유 및 1 × Tris / Tween 완충 식염수 용액 (TTBS; Bio 4 ° C에서 하룻밤 사이에 -Rad, Hercules, CA). 이어서 막을 1 ° C에서 밤새 1000 % 우유 / 3xTTBS 용액에서 1 차 Fra 항체의 1 : 4 희석액 (친절하게 MD. Bethesda, National Healths Institute, Michael Iadarola 박사에 의해 제공됨)에서 1 : 4 희석에서 배양 하였다. 막을 세척 하였다. 15 × TTBS (1 회, 각각 1 분)에서, 및 방에서 25000h 동안 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (Bio-Rad, Hercules, CA)에 접합 된 염소 항-토끼 이차 항체의 1 : XNUMX 희석을 함유하는 XNUMX × TTBS에서 배양 온도. 막을 다시 세척 한 다음, 피어스 슈퍼 시그널 웨스트 듀라 (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL) 화학 발광-매개 검출 된 하이퍼 필름 (ECL plus; Amersham)을 사용하여 막을 세척 하였다. cFos, FosB 및 ΔFosB 단백질 밴드의 지역화는 그림 1C. 본 연구에서는 안정적으로 발현 된 ΔFosB 형태 (즉, 35-37 kDa) 만 검사하기로 선택했는데, 이는 만성 약물 사용으로 축적되고 중독의 기초가되는 신경 가소성을 생성하는 것으로 생각되는 형태이기 때문입니다 (네슬러 et al. 2001). 밴드에 절대 면역 반응성을 부여하기 위해 Scion Image (Frederick, MD)를 사용하였고, 필름의 디지털 이미지를 촬영하기 위해 스캐너를 사용 하였다. 검출 후, 막을 스트리핑하고 β- 튜 불린 (1 : 200000, Cell Signaling, Danvers, MA)에 대해 재 프로빙 하였다. β- 튜 불린 수준을 Fos 관련 단백질의 수준을 정상화하기위한 로딩 대조군으로 사용 하였다.

RT-PCR

정량적 RT-PCR (qRT-PCR)을 사용하여 FosB 및 ΔFosB mRNA의 변화 및 코카인 투여 후 24h의 변화를 즉시 측정 하였다. 동물을 빠른 탈포에 의해 안락사시키고 NAc 코어, NAc 쉘 및 CPu를 기재된 바와 같이 단리 하였다 (그레이엄 et al. 2007; 바흐 텔 et al. 2008). 개별 샘플을 RNA-STAT-60 (IsoTex Diagnostics Inc, Friendswood, TX)에서 즉시 균질화하고 mRNA가 제조업체의 지침에 따라 추출 될 때까지 드라이 아이스에서 냉동했습니다. 간단히 말해서, 클로로포름을 각 샘플에 첨가하고 원심 분리 후 수성 층을 분리했습니다. 선형 아크릴 아미드 (Ambion, Austin, TX)의 존재하에 전체 mRNA를 이소프로판올로 침전시켰다. 샘플을 원심 분리하고 추출 된 mRNA 펠릿을 70 % 에탄올로 세척하고 DEPC 물에 재현 탁시켰다. 총 mRNA는 DNAase 처리 (Ambion, Foster City, CA)로 처리하고 Superscript III (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 무작위 3 량체로 cDNA로 역전사되었습니다. FosB, ΔFosB 및 글리 세르 알데히드 -5- 포스페이트 탈수소 효소 (GAPDH)를 증폭하는 데 사용 된 프라이머 서열은 3'-GTGAGAGATTTGCCAGGGTC-5 '및 3'-AGAGAGAAGCCGTCAGGTTG-5', 3'-AGGCAGAGCTGGAGTCGGAGAT-5 '및 3'-GCCGAGGACTTGAACTTCACTCGAGACTTGAGAGATTTGCCAGGGTC-5'입니다. '및 3'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-5'및 3'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-XNUMX '각각. 주기 역치 (cT)는 증폭 곡선의 XNUMX 차 도함수를 사용하여 삼중 반응에서 계산되었습니다. FosB 및 ΔFosB cT 값은 GAPDH가 코카인에 의해 조절되지 않았기 때문에 GAPDH cT 값 (ΔcT)으로 정규화되었습니다. 폴드 변경은 이전에 설명한대로 ΔΔcT 방법을 사용하여 계산되었습니다 (Applied Biosystems 매뉴얼).

통계 분석

각 단백질의 수준은 각 뇌 영역 및 시점에 대해 처리되지 않은 대조군과의 % 변화로 표현되었으며, 연구 그룹은 p <0.05로 설정된 유의 수준으로 일원 분산 분석 (ANOVA)으로 비교되었습니다. 전반적인 효과는 Fishers LSD 테스트를 사용한 사후 비교로 이어졌습니다. 코카인 섭취와 단백질 수준의 변화 간의 상관 관계는 선형 회귀를 사용하여 평가되었습니다.

결과

코카인을 자발적으로자가 투여 할 수있는 CSA 그룹의 동물은 SA의 세 번째 주 (13-18 일)까지 안정한 코카인자가 투여 패턴을 나타냈다. SA의 마지막 주에 걸쳐 CSA 래트 및 그들의 CY 파트너에서 평균 일일 코카인 섭취량은 46.9 (± 1.8) mg / kg / 일 (범위 : 37-60 mg / kg / 일)이었다. 최종 시험일에, 0 h 철수 (WD) 그룹의 CSA 래트는자가 투여 44.5 (± 2.5) mg / kg 코카인 (범위 25.5-57.5 mg / kg) 및 CY에 의해 동일한 양의 코카인을 받았다 그리고 AY 파트너.

급성 또는 만성 코카인 후 선조체 하위 영역에서 ΔFosB 단백질의 차등 조절

ΔFosB 단백질의 차등 조절은 4 h의 정맥 코카인 투여 (0 h WD) 직후에 선조체 하위 영역에서 발견되었다. NAc 쉘에서는 만성 코카인 만 처리되지 않은 대조군과 비교하여 CSA 및 CY 그룹 (45-61 %)이 유의하게 증가했습니다 (2A, F4,60 = 4.22, p = 0.005). NAc 코어에서, AY 그룹에서 급성 노출 후 ΔFosB (41 %)의 상당한 증가가 발견되었다 (그림 2B, F4,60 = 17.04, p <0.001), 만성 코카인 이후 더 큰 증가 (89-95 %)가 발견되었습니다. 만성 코카인 투여로 NAc에서 ΔFosB의 더 많은 축적과 대조적으로, CPu는 급성 및 만성 코카인 그룹 모두에서 ΔFosB (86-102 %)에서 유사한 증가를 보여주었습니다 (2C, F4,78 = 19.09, p <0.001). 선조체 소 지역에서 CSA와 CY 그룹 사이에 ΔFosB 증가에 차이가 없었으며, 이는 규제가 자발적인 코카인 소비와 관계없이 코카인 노출과 관련이 있음을 나타냅니다. ΔFosB의 조절은 NAc 껍질에서 만성 코카인 이후 최소 24 시간 동안 지속되었습니다 (F2,32 = 5.19, p = 0.02), NAc 코어 (F4,60 = 4.53, p = 0.02) 및 CPu (F2,34 = 12.13, p <0.001), 그러나 3 주 후 기준 수준으로 돌아 왔습니다. ΔFosB의 유사한 증가는 코카인 그룹을 식염수 SA 그룹과 비교했을 때 발견되었지만, AY 동물의 NAc 껍질에서 더 작은 증가가 식염수 SA와 비교할 때 유의미를 얻었지만 처리되지 않은 대조군과는 그렇지 않았습니다. 그러나, 치료되지 않은 대조군과 비교할 때 훈련 내내 식염수를자가 투여 한 동물에서 ΔFosB의 유의 한 조절이 없었으며, 이는 ΔFosB의 조절이 수술 또는 시험 절차의 결과가 아니라 코카인 때문임을 나타냅니다.

그림 2  

코카인 투여 직후 및 24 h 및 3 주 WD에서 ΔFosB의 조절. ΔFosB (35-37 kDa)의 수준은 처리되지 않은 홈 케이지 대조군 (대조군)으로부터의 평균 ± SEM 퍼센트 변화로 표현된다. 식염수에서 조직 ...

만성 코카인 후 FosB 단백질 조절에 대한 내성

ΔFosB의 조절과 대조적으로, IV 코카인 투여의 4 h에 대한 단일 노출은 모든 3 선조 하위 영역에서 FosB 단백질의 실질적으로 더 큰 증가를 생성 하였지만,이 반응에서 실질적인 내성은 만성 코카인 투여 후 발생 하였다. NAc 쉘에서, FosB는 AY 동물에서 급성 코카인 투여의 260h 직후에 (4 %) 증가하였으나, CY 및 CSA 그룹 모두에서 만성 투여 후 이러한 증가는 감소 하였다 (142-146 %).3A, F4,77 = 23.16, p <0.001). FosB (295 %)의 유사한 증가가 AY 동물의 CPu에서 발견되었으며 CY 및 CSA 그룹에서 만성 코카인 투여 후 (135-159 %로) 감소했습니다 (3C, F4,69 = 13.362, p <0.001). NAc 코어에서 급성 코카인 투여는 다른 뇌 영역에 비해 AY 동물에서 FosB (164 %)가 덜 실질적으로 증가했습니다. 그러나 이러한 증가는 CY 및 CSA 그룹 (109-112 %)에서 만성 투여 후 생성 된 것보다 여전히 더 컸습니다 (XNUMX-XNUMX %).그림 3B, F4,57 = 20.23, p <0.001). ΔFosB에서 발견 된 바와 같이, 만성 코카인 후 FosB의 조절은 코카인 섭취의 의지 적 조절에 의해 조절되지 않았습니다. 그러나 ΔFosB와는 대조적으로 FosB 단백질의 증가는 24 시간 후 NAc 껍질과 코어 모두에서 지속되지 못했지만, 잔류 증가 (38-52 %)는 CPu (F2,32 = 3.590, p <0.05). FosB 수준은 식염수자가 투여 동물의 수술 또는 테스트 절차에 영향을받지 않았습니다.

그림 3  

코카인 투여 직후 및 24h 및 3 주 WD에서 FosB의 조절. FosB의 단백질 수준 (46-50 kDa)은 처리되지 않은 홈 케이지 대조군으로부터의 평균 ± SEM 퍼센트 변화로 표현된다 (참조 그림 2 약어의 범례) ...

만성 코카인 후 ΔFosB 및 FosB mRNA 유도의 약화

정맥 코카인 투여의 4 h 에의 급성 노출은 NAc 쉘에서 ΔFosB mRNA에서 유사한 증가 (11-16 폴드)를 생성 하였다 (F3,19 = 15.82, p <0.001), NAc 코어 (F3,19 = 13.275, p <0.001 및 CPu (F3,11 = 5.78, p Saline SA 대조군과 비교할 때 = 0.03) (0 h WD, 4A). 그러나, NAc 쉘 (3-4 폴드), NAc 코어 (4 폴드) 및 CPu (3 폴드)에서 만성 코카인 투여 후 CY 및 CSA 그룹에서 이러한 반응이 강하게 억제되었다. 급성 IV 코카인 투여가 ΔFosB에 비해 FosB 단백질에서 더 큰 증가를 생성했다는 사실에도 불구하고, 급성 코카인 투여는 모든 4 선조 하위 영역에서 ΔFosB (9-11 폴드)보다 FosB (16-3 폴드)에 대한 mRNA의 상대적으로 더 낮은 증가를 유도했습니다 (그림 4B). 이 반응은 NAc 껍질에서 만성 코카인 후에 사실상 폐지되었습니다 (F3,19 = 26.22, p <0.001) 및 CPu (F3,11 = 4.24, p <0.05), NAc 코어의 CY 및 CSA 그룹에서 작지만 상당한 증가 (2 배)가 유지되었지만 (F3,19 = 11.10, p <0.001). AY 동물에서 ΔFosB 및 FosB 모두의 코카인 유도 증가는 동일한 식염수 SA 대조군과 비교했을 때 24 시간 WD 후에 유지되지 않았습니다. 0 시간 WD 시점에서 FosB 대 ΔFosB mRNA 수준의 비율에 대한 추가 분석은 코카인 투여가 NAc 쉘에서 FosB 대 ΔFosB mRNA의 상대적인 양을 현저하게 감소 시켰음을 보여주었습니다 (F3,19 = 4.79, p = 0.02), NAc 코어 (F3,19 = 4.49, p = 0.02) 및 CPu (F3,11 = 5.59, p = 0.03), ΔFosB 이소 형의 더 큰 형성 및 만성 투여 후 두 mRNA 모두에서 코카인-유도 된 반응에 대한 실질적인 내성에 관계없이 (4C). 코카인이자가 투여 또는 요크 주입에 의해 수동적으로 수령되었는지에 따라 이들 비율에서 유의미한 차이는 없었으며, FosB : ΔFosB의 상대 비율은 24h WD 시점에 의해 3 개의 모든 뇌 영역에서 정상으로 돌아왔다 (데이터는 나타내지 않음).

그림 4  

코카인 투여 직후 및 24 h WD에서 FosB 및 ΔFosB에 대한 mRNA의 조절. ΔFosB (A), FosB (B) 및 FosB / ΔFosB 성적표 (C)에 대한 성적표의 양적 RT-PCR은 평균 ± ...

NAc에서 코카인으로 유도 된 cFos에 대한 강화 관련 내성

수동적 또는 의학적 투여와 상관없이 코카인에 대한 약리학 적 반응을 나타내는 FosB 유전자 생성물의 조절과 대조적으로, NAc 소구역에서의 cFos의 조절은 수동 요크 주입에 의해 코카인을받는 동물과 비교할 때 코카인자가 투여의 맥락에 의해 크게 영향을 받았다. 코카인 노출은 AY 및 CY 그룹에서 급성 또는 만성 투여로 NAc 쉘 및 코어 둘 다에서 cFos 단백질 수준 (109-126 %)을 증가시켰다 (그림 5A-B). 그러나, 코카인 주입이자가-투여 동물에서 반응에 의존적 인 방식으로 전달 될 때,이 반응은 NAc 쉘에서 감소되었다 (55 %로).F4,60 = 9.14, p <0.001), NAc 코어에서 cFos를 크게 증가시키지 못했습니다 (F4,57 = 5.92, p <0.001). CPu에서 코카인 유도 cFos에 대한 내성은 만성 수동적 또는 의지 적 코카인 투여 (5C), AY 동물의 cFos 유도 (164 %)가 CY 및 CSA 그룹 모두에서 (45-57 %로) 감소했습니다 (F4,67 = 13.29, p <0.001), 3 개의 선조체 소 영역 모두에서 FosB 단백질의 유도에 대한 내성 발달과 유사합니다. 따라서, 코카인 유도 cFos에 대한 강화 관련 내성은 선조체의 중변 연계 영역에서 특히 발생했습니다. 3 개의 선조체 영역 모두에서 cFos의 증가는 식염수자가 투여 동물에서 발견되지 않았으며 24 시간 WD 후에도 지속되지 않았습니다.

그림 5  

코카인 투여 직후 및 24 h WD에서 cFos의 조절. 대조군 랫트 (Control, Saline SA), 수동 요크 코카인을 급성으로 (AY) 또는 만성적으로 (CY)받은 쥐에서, 그리고 생쥐에서 cFos (52-58 kDa)의 단백질 수준 ...

선조 소구역에서 코카인 섭취, cFos 및 ΔFosB의 관계

코카인자가 투여 량은 개별 동물과 요크 드 파트너에 따라 다양하기 때문에, 우리는 다중 선형 회귀 분석에 의해 코카인 섭취량과 cFos, FosB 및 ΔFosB 단백질 수준의 유도를 비교했습니다 (참조 보충 테이블 1 모든 잠재적 상관 관계의 결과). 수동 주입에 의해 급성 코카인 투여를받은 래트에서 코카인 섭취와 cFos 수준 사이에는 유의 한 상관 관계가 있었으며, 이러한 관계는 등쪽과 배쪽 선조 하부 영역에서 달랐다. NAc 코어에서, 급성 IV 코카인 투여의 4h 직후의 cFos의 유도는 코카인 섭취와 강하고 음의 상관 관계가 있었지만 NAc 쉘에서 유사하지만 미미한 관계가 발견되었다 (Fig. 6). 대조적으로, cFos의 유도는 CPu에서 코카인 섭취와 양의 상관 관계가 있었다. 임의의 선조 소구역에서 코카인 섭취 (활성 또는 수동)와 FosB 또는 ΔFosB의 단백질 수준 사이에는 유의 한 상관 관계가 없었다. 그러나 코카인 후 NAc 쉘 24 h에서 cFos와 ΔFosB의 수준 사이에는 강한 양의 상관 관계가 있었지만, 자발적 자기 관리를 통해 코카인을받은 동물에서만Fig. 7) 및 전체 cFos 수준이 24 h WD에서 변경되지 않았음에도 불구하고. 비슷한 트렌드 (p <0.07) cFos와 ΔFosB 단백질 사이의 양의 상관 관계에 대해 NAc 코어에서 코카인자가 투여 4 시간 후 즉시 그리고 처음으로 코카인을 투여받은 동물의 CPu (AY 그룹)에서 단백질 수준이 발견되었습니다.

그림 6  

급성 코카인 (AY) 후 코카인 섭취와 cFos 면역 반응성 사이의 지역별 상관 관계. cFos 면역 반응성 퍼센트 증가는 NAc 코어 (A)의 최종 세션에서 코카인 섭취와 음의 상관 관계가 있고 양의 상관 관계가있다 ...
그림 7  

자가-투여 동물에서 NAc 쉘에서 cFos와 ΔFosB 사이의 유의 한 상관 관계. cFos 면역 반응성 퍼센트 증가는 코카인자가 투여에서 24 h WD 후 ΔFosB 면역 반응성과 양의 상관 관계가있다 ...

토론

현재의 연구에서 NAc 쉘, NAc 코어 및 CPu striatal subregions에서 ΔFosB, FosB 및 cFos 수준의 규제에 급성 및 만성 정 맥 코카인 노출 또는 만성 자기 관리의 효과 조사했다. 이전 연구에 따르면 수동 IP 코카인 주사를 사용한 급성 코카인 투여 후가 아니라 반복 노출 후에 만 ​​ΔFosB가 증가하는 것으로 나타났습니다.소망 et al. 1994, NYE et al. 1995; 첸 et al. 1995). 유사하게, 우리는 만성 IV 코카인 노출이 의지 적이든 수동적이든 상관없이, 검사 된 모든 선조 소 영역에서 ΔFosB가 증가한다는 것을 발견했다. 그러나, 이전 연구와의 주요 차이점은 급성 코카인 투여는 NAc 코어 및 CPu 둘 다에서 ΔFosB 단백질 수준을 증가시키고 NAc 쉘에서 중요성에 접근한다는 점이다. (p <0.1). 이 차이에 대한 한 가지 가능한 설명은 AY 그룹의 쥐가 단일 4 시간 세션 동안 여러 IV 코카인 주입을 받았기 때문에 총 코카인 섭취량이 25.5 ~ 57.5 mg / kg 범위 였기 때문에 코카인 노출의 용량 및 / 또는 기간 일 수 있습니다. 단일 볼 루스 IP 주사로 일반적으로 사용되는 10-20mg / kg의 용량을 훨씬 초과하는 개별 동물 (소망 et al. 1994; 바람이 불어가는 쪽 et al. 2006). 또한 코카인은 더 직접적인 IV 투여 경로를 통해 투여되어 세션 내내 지속되는 코카인 및 도파민의 최고 피크 뇌 수준을 생성하는 반면, 이러한 효과는 일반적으로 IP 주사 후 1 시간 이내에 사라졌습니다 (브래드 베리, 2002). 따라서, 코카인에 대한 단일 급성 노출 후 축적되는 ΔFosB의 능력은 본 연구에 사용 된 코카인 자극의 강도 및 지속 기간 둘 다에 의존 할 가능성이있다. 어쨌든, 코카인에 단일 노출 후 ΔFosB가 축적 될 수 있다는 발견은 ΔFosB가 이전에 생각했던 것보다 더 빠르게 그 효과를 발휘할 수 있음을 나타냅니다.

흥미롭게도, ΔFosB 축적량은 만성 코카인 투여 과정에서 등쪽 및 배쪽 선조 영역간에 상이 하였다. NAc 코어에서, 만성 투여의 마지막 날 직후에 발견 된 ΔFosB의 양 (0 h WD)은 급성 투여 후 발견 된 양의 2 배를 초과하였고, NAc 쉘에서 더 작은 ΔFosB 증가는 만성 투여 후에 만 ​​유의성에 도달 하였다 코카인의자가 투여 여부 또는 수동적 인 요크 주입에 의한 수령 여부에 관계없이. 만성 코카인 투여에 따른 증가는 아마도 최종 노출 후 적어도 24 시간 동안 지속되기 때문에 매우 안정한 ΔFosB 단백질의 축적을 반영 할 것이다. 대조적으로, CPu에서 ΔFosB의 양의 큰 증가는 급성 또는 만성 노출과 다르지 않았으며, 이는 잠재적으로이 뇌 영역에서 급성 노출에 의해 생성 된 상한을 반영한다. 그러나 CPu에서도 ΔFosB 단백질의 축적은 만성 노출 후 만성 노출 후 ΔFosB 수준을 지속적으로 증가시키는 데 기여했을 가능성이 높으며, 이는 만성 투여를 갖는 모든 3 뇌 영역에서 ΔFosB에 대한 코카인-유도 mRNA에 대한 실질적인 내성이 발생했기 때문이다.

IV 코카인의 급성 투여는 또한 전체 길이 FosB 단백질 수준을 증가 시켰으며, NAc 코어보다 CPu 및 NAc 껍질이 더 많이 증가했습니다. 그러나 FosB에 대한 mRNA는 NAc 쉘에서 거의 10 배, CPu 및 NAc 코어에서 5 배 미만으로 유도되었습니다. 만성 투여로 FosB에 대한 mRNA와 단백질을 모두 유도하는 코카인의 능력에 대해 상당한 내성이 개발되었지만, FosB 단백질의 낮은 유도가 남아 있고 AP-1 결합 파트너에 대해 ΔFosB와 잠재적으로 경쟁 할 수 있습니다. FosB / ΔFosB mRNA의 상대적인 비율은 암페타민을 사용한 이전 보고서와 일치하는 ΔFosB의 상대적으로 더 큰 유도로 인해 급성 코카인 투여에 의해 감소되었습니다.알리바이 et al. 2007). 반복 된 암페타민 처리에 대한 이전의 발견과는 달리, 급성 코카인에 의한 FosB / ΔFosB mRNA의 상대적 비의 감소는 FosB보다 ΔFosB의 상대적으로 더 높은 잔류 유도를 반영하여, 만성 투여 후에도 유지되었다.

인간 정맥 내 약물 사용의보다 전형적인 패턴 및 투여 기간을 사용하여 급성 코카인 후에도 ΔFosB 수준이 증가한다는 사실은 중독 과정에 중요한 영향을 미친다. 따라서, ΔFosB는 적절한 용량이자가 투여되는 경우 초기 코카인 사용으로 AP-1 결합 활성에 기여할 수있다. 그러나, ΔFosB는 AP-1 결합 활성을 위해 FosB 및 cFos와 경쟁하여, 다운 스트림 유전자 발현 및 ΔFosB가 실질적으로 감소 된 cFos 및 FosB로 상승 될 때 만성 투여와 구별되는 다운 스트림 유전자 발현 및 신경 가소성을 초래할 것이다. 따라서, ΔFosB는 복부 선조에서의 더 큰 축적 및 등측 및 복부 선조에서의 AP-1 결합 파트너에 대한 경쟁 감소로 인해 만성 코카인 투여 후 더 큰 효과를 가질 수있다. ΔFosB의 striatal-specific over-expression은 코카인에 대한 동기를 증가시킵니다 (콜비 et al. 2003), 초기 코카인 노출과 함께 ΔFosB의 이러한 빠른 축적은 중독 과정의 초기 단계에서 코카인 사용을 영속시킬 수있다. 더욱이, 급성 노출을 갖는 선조체에 걸쳐 이러한 현저하고 널리 퍼진 ΔFosB 발현은 등쪽 선조 회로의 조기 교전을 통해 강박 습관의 형성을 촉진 할 수있는 방식으로 AP-1 결합 활성을 변화시킬 것이다 (Belin and Everitt, 2008).

ΔFosB 이소 형의 안정성을 고려하여, ΔFosB 수준은 마지막 정맥 코카인 투여 세션 후 만성 정맥 코카인 투여를 사용한 이전 연구와 일치하여 24 시간이 현저히 증가 된 상태로 유지되었다 (피치 et al. 1997; Perotti et al. 2008). IP 코카인 주사의 수동 실험자 투여를 사용한 다른 연구는 ΔFosB 축적이 1-2 주 동안의 철수 동안 지속될 수 있음을 발견 하였다 (소망 et al. 1994; 브렌 하우스와 스텔라, 2006; 바람이 불어가는 쪽 et al. 2006), 비록 코카인 투여 중단 3 주 후에 이러한 변화에 대한 증거를 찾지 못했지만. 함께, 이러한 연구는 ΔFosB 축적이 상대적으로 짧은 금단 기간 (<3 주) 동안 지속될 수 있고 지속적인 코카인 사용에 직접적으로 기여할 수 있지만 장기간 금단시 재발에 대한 더 큰 경향에 직접적으로 기여하지 않을 수 있음을 시사합니다. 그러나, ΔFosB 면역 반응성은 마우스에서 반복 된 코카인으로부터 1 일을 철수 한 후 D30 수용체 함유 선조 뉴런에서 검출되었습니다 (바람이 불어가는 쪽 et al. 2006). 이러한 세포-특이 적 샘플링은 본 연구에 사용 된 전체 조직 분석보다 잔류 ΔFosB 축적에 더 민감 할 수 있거나, 아마도 ΔFosB 변화는 단지 쥐에서보다 마우스에서 더 오래 지속될 수있다. ΔFosB가 D1가 함유 된 선조 뉴런에서 수지상 척추 형성과 같은 오래 지속되는 형태 학적 변화를 초래하는 일련의 전사적 사건을 유도 할 수도 있습니다.바람이 불어가는 쪽 et al. 2006; 미로 et al. 2010). 이와 관련하여, 만성 코카인 이후에 Cdk5 및 NFκB를 포함하는 몇몇 ΔFosB 표적이 증가되고, 이들 인자는 뉴런 구조 및 / 또는 기능의 변화를 통해 핵 축적 회로를 변형시킬 수있다 (앙 et al. 2001; Benavides 및 Bibb, 2004; 네슬러, 2008). 따라서, 철회 중 지속 된 ΔFosB 축적이 미래의 약물 복용 또는 추구하는 행동에 오래 지속되는 영향에 필요하지 않지만, 대신에 더 많은 것으로 전환하는 것을 용이하게하는 다중 세포 과정을 유발하는 "분자 전환"을 나타낼 수있다 중독 된 생물학적 상태 (네슬러 et al. 2001).

T그는 코카인 매개 ΔFosB 축적이 면역 조직 화학적 절차와 다중 약물 남용 약물을 사용한 이전 연구와 일치하는자가 투여 동물에서 코카인 섭취량의 조절에 의해 영향을받지 않음을 발견했습니다. (Perotti et al. 2008; 피치 et al. 1997). 이것은 ΔFosB 및 FosB의 코카인-유도 증가가 코카인 또는 모노 아 민성 수용체 신호 전달의 다른 다운 스트림 이벤트에 대한 약리학 적 반응과 관련이 있음을 나타낸다. ΔFosB와 달리 우리는 코카인으로 유도 된 cFos에 대한 내성의 발달이 실질적으로 CPc가 아닌 NAc에서 코카인 섭취에 대한 의지 제어에 의해 실질적으로 영향을받는 것을 발견 하였다. 따라서, NAc에서 코카인으로 유도 된 cFos에 대한 내성은 급성 요크 주입과 비교할 때 만성 요크 주입에 의해 수동으로 코카인을받는 동물에서 발생하지 않았다. 이러한 발견은 약물이 수동 IP 주사에 의해 제공 될 때 NAc에서 정신 자극제-유도 된 cFos에 대한 내성에 대한 수많은 보고서와 현저하게 다르다 (소망 et al. 1994; NYE et al. 1995; 첸 et al. 1995, 1997; 알리바이 et al. 2007). 코카인자가 투여 동물에서 cFos에 대한 내성이 반복되는 IP 주사에 대한 여러 연구와 유사하다는 점을 감안할 때, 만성 정맥 요크 투여와의 내성 부족은 여러 번 예측할 수없는 요크 코카인 주입과 관련된 스트레스와 관련이있을 수 있습니다 (Goeders 1997). 등쪽 선조체가 아닌 복부 내성 손실은 동기 및 정서적 반응에 관련된 변연계에 대한 선택적 효과와 일치합니다. 또한, cFos의 유도에 대한 내성이 동물 자체 투여 코카인에서 발생 하였지만, 최종 자체 투여 세션 직후 NAc 쉘에서 cFos 단백질의 실질적으로 ~ 50 % 증가 및 추세 (p <0.1) cFos의 경우 코어에서도 증가했습니다. 이 불일치의 이유는 위에서 논의한 바와 같이 4 시간 동안 IP 주입과 다중 IV 주입 간의 차이를 반영 할 가능성이 높습니다. 만성 코카인 자체 투여 후 NAc에서 cFos의 잔류 유도는 중독 과정에서 그 역할을 재고해야하는 새로운 발견으로, cFos, ΔFosB 및 FosB를 포함하는 AP-1 복합체는 모두 만성 노출 후 어느 정도 공존 할 것입니다. .

cFos가 등쪽 선조에서의 ΔFosB 축적에 의해 직접 하향 조절된다는 최근의 증거가 주어진다 (Renthal et al. 2008), CPu에서 코카인으로 유도 된 cFos가 급성 코카인 노출과 함께 ΔFosB의 증가와 유사하다는 것이 흥미 롭다. 한 가지 가능성은 급성 투여시 ΔFosB의 축적이 4 h 세션에서 너무 늦게 발생하여 cFos 유도에 영향을 미치지 않는 반면, 만성 치료 된 동물에서 코카인 후의 24 h의 존재는 후속 코카인 노출로 cFos의 유도를 방해한다는 것이다. 이 아이디어는 급성 코카인 투여 (0.067 h WD)를 갖는 CPu에서 cFos와 ΔFosB 수준 사이의 적당한 양의 상관 관계에 대한 경향 (p = 0)과 일치합니다. 이 개념은 또한 급성 요크 동물의 CPu에서 cFos 유도와 코카인 섭취 사이의 강한 긍정적 상관 관계와 일치합니다. 이러한 발견은 ΔFosB와 유사하게, cFos 반응이 수신 된 코카인의 용량을 반영 할 수 있음을 시사한다. 그러나, NAc에서, 만성 요크 코카인 투여에 의한 ΔFosB의 더 큰 축적은 이들 동물에서 cFos 반응에 대한 내성의 부족을 설명 할 수 없다. 더욱이, cFos 유도에 대한 내성이자가-투여 동물에서 명백하지만, 24 h 철수 후 NAc 쉘에서 잔류 cFos와 ΔFosB 수준 사이의 강한 양의 상관 관계는 복부 선조에서 cFos와 ΔFosB 사이의 부정적인 상호 작용을지지하지 않는다. CPu 데이터와의 또 다른 차이점은 NAc 코어의 cFos가 급성 코카인 투여 직후 코카인 섭취와 양의 상관 관계가 아니라 음의 상관 관계가 있었으며, 이는 복부 선조에서 더 높은 선량 노출로 발생하는 세션 내 타키 필락 시스를 반영 할 수 있습니다.

전반적으로, 본 연구로부터의 발견은 cFos, FosB 및 ΔFosB가 급성 및 만성 정맥 내 코카인 투여 후 뚜렷한 지역적 패턴 패턴을 겪는다는 것을 나타낸다. 이들 발현 패턴은 약물 노출의 지속 시간 및 양 둘 다에 유일하게 의존하고, 코카인-유도 cFos에 대한 내성은 의지 적 코카인 자기-투여에 크게 의존한다. 결과는 또한 정맥 주사에 ​​의해 ΔFosB가 급성 및 만성 코카인 투여와 함께 축적 될 수 있으며, ΔFosB 축적은 증가 된 코카인 추구 행동을 촉진하고 코카인 중독의 발달에 기여하는 초기 과정에서 중요 할 수 있다는 생각을지지한다. 궁극적으로, ΔFosB가 코카인 사용 및 초기 철회 기간 동안 유전자 발현에 대한 비교적 단기적인 영향을 통해 철회시 지속적 약물 갈망에 간접적으로 영향을 줄 수있는 방법을 이해하는 것이 중요합니다. 다양한 다운 스트림 표적 및 뉴런 형태 및 / 또는 기능에 대한 이들의 효과를 확인하려는 노력은 궁극적으로 중독성 행동의 발현에서 ΔFosB 및 다른 Fos- 관련 항원의 역할을 명확히 할 것이다.

보충 자료

공급 테이블 S1

보충 표 1. 선형 회귀 분석에 대한 전반적인 상관 관계 결과. 왼쪽 0.05 개 패널에는 코카인 섭취와 cFos (상단 패널), FosB (중간 패널) 또는 ΔFosB (하단 패널) 수준 간의 상관 관계가 포함되어 있습니다. 오른쪽 XNUMX 개 패널에는 cFos 및 ΔFosB (상단 패널), cFos 및 FosB (중간 패널), FosB 및 ΔFosB (하단 패널) 간의 상관 관계가 포함되어 있습니다. 상대 뇌 영역 및 WD 시점은 해당 r- 및 p- 값과 함께 각 개별 분석에 대해 표시됩니다. * p <XNUMX, T0.1> p> 0.05.

감사의

저자는이 연구와 관련하여 이해 상충을 선언하지 않습니다. 이 연구는 NIH 보조금 DA 10460 및 DA 08227와 Wesley Gilliland 생물 의학 연구 교수의 지원을 받았습니다.

사용 된 약어

  • CPu
  • 우두머리
  • NAc
  • 측쇄 핵
  • AY
  • 급성 멍에
  • CY
  • 만성 멍에
  • CSA
  • 코카인 자기 관리
  • WD
  • 철수
  • IV
  • 정맥
  • IP
  • 복강 내.

참고자료

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