Proc Natl Acad Sci US A. Apr 29, 2014; 111 (17) : 6455-6460.
온라인으로 게시 됨 Apr 15, 2014. doi : 10.1073 / pnas.1404323111
PMCID : PMC4036004
신경 과학
테루 코 단조,a 요시미 켄지,b 후나 부키 카즈오,a 사토시 야와 타,a 및 나게 니시 시게 타다a,1
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의미
복부 tegmental 영역 (VTA)에서 도파민 (DA) 뉴런은 대부분 일시적인 침묵에 의해 혐오적인 자극에 반응합니다. 이 반응이 직접 행동하는 마우스에서 혐오 반응을 직접 유도하는지 여부는 아직 명확하지 않습니다. 우리는 VTA에서 DA 뉴런을 optogenetically 제어 하여이 질문을 검사하고 DA 뉴런의 비활성화가 혐오 반응과 학습 결과로 나타났습니다. VTA DA 뉴런의 주요 산출 핵인 측위 핵 (NAc)은이 반응의 원인으로 생각되었으므로 NAc의 기본 경로 중 어느 것이 D1 또는 D2 수용체의 넉다운 (knockdown) D2 수용체 특이 적 경로가 이러한 행동에 결정적인 역할을한다는 것을 발견했다.
추상
복부 tegmental 영역 (VTA)에서 도파민 (DA) 전송 보람과 혐오 행동을 제어하는 것이 중요합니다. DA 신경 세포의 일시적인 침묵은 혐오적인 자극에 대한 반응 중 하나이지만, 혐오 반응과 학습에 대한 그 결과와 신경 메커니즘은 거의 파악하기 힘들다. 이리, 우리는 VTA DA 신경 세포의 광 유발 적 비활성화가 신속하게 DA 수준을 하향 조절하고 중추 신경계에서 신경 활동의 상향 조절을 유발한다고보고했다. (NAc)로 표시됩니다. 티DA 뉴런 발사의 그의 광학 유전학 억제는 이전에 선호되는 암실에 대한 반응을 즉각 회상 시켰고 광 형성 적 조건을 고려한 혐오스러운 학습을 유도했다. 중요한 것은,이 장소 혐오감은 도파민 D2 수용체의 녹다운에 의해 폐지되었지만 NAC에있는 D1 수용체의 폐렴에 의해서는 폐지되지 않았다. 따라서 VTA에서 DA 뉴런의 사일런 싱은 NAc에서 도파민 D2 수용체를 통한 혐오 반응 유도 및 학습에 필수적이었다.
mesolimbic dopaminergic system은 광범위한 동기 부여와 학습에 중추적 인 역할을 할뿐만 아니라 (1-3), 그러나 그것의 장애는 또한 파킨슨 병, 정신 분열증 및 약물 중독에서 예시 된 바와 같이 심한 정신 신경 장애에 연루되어있다. 복부 tegmental 영역 (VTA)에서 도파민 (DA) 뉴런은 위상 발사에 의해 보람있는 자극에 반응하고,이 발화의 주요 기능은 "보상 예측 오차"를 인코딩하기 위해 이론화됩니다. 예상 보상과 실제 보상 (4). 보람있는 자극에 대한 반응과는 달리, 혐오스러운 자극에 대한 반응은 상동에서 멀다. 즉, 일부 DA 뉴런은 혐오적인 자극에 반응하여 활성화되는 반면, 대부분의 DA 신경 세포는 일시적으로 발화를 억제함으로써 반응합니다 (5-9). 사실, 최근의 연구에 따르면 GABA 신경계의 광학 기전 활성화와 DA 뉴런의 불 활성화가 보상 소비를 억제하고 혐오 반응을 유도한다는 것을 밝혀냈다.10, 11). 그러나 VTA에서 DA 뉴런의 비활성화에 따른 혐오 학습의 획득 및 행동 반응이 보상 소비를 억제하고 혐오 행동을 유도하는쪽으로 어떻게 조절되는지에 관해서 신경 회로의 어떤 메커니즘이 필수적인지는 거의 알 수 없다.
축적 된 증거에 따르면 긍정적이고 부정적인 자극에 반응하는 동기 부여 및인지 학습은 크게 기저핵을 포함한 신경 회로에 의해 조절된다 (12), midbrain에서 다량의 dopaminergic 투상을 받는다. striatum에서, 두 개의 기본적인 신경 회로는 특정 중형 spiny neurons (MSNs)에 의해 구성되며, 각각은 독특한 수용체 DA 수용체를 발현한다13).
- 하나의 회로는 직접적인 경로로서, 기저핵의 출력 핵에 직접적으로 돌출되어있는 MSNs, substantia nigra pars reticulata (SNr), 그리고 주로 도파민 D1 수용체 (D1Rs)를 발현한다..
- 다른 하나는 간접 경로로서, 간접적으로 globus pallidus를 통해 SNr에 투영되고 주로 도파민 D2 수용체 (D2Rs)를 발현하는 MSN으로 구성됩니다.
중뇌의 DA 신호는 D1Rs와 D2Rs를 통해 반대 방향으로이 두 개의 평행 경로를 동적으로 변조하며,이 변조는 동기 학습을 촉진하기로되어 있습니다 (3, 14).
- 보람있는 자극에 관해서 보람있는 신호에 의해 유도 된 DA 수준의 상향 조정은 D1R을 활성화시키는 것으로 여겨지며, 따라서 주 교관 핵 (NAc)에서 직접 경로를 촉진시킨다..
- 반면에, 혐오적인 자극에 대한 반응으로 DA 뉴런 발사의 억제는 NAc의 DA 수준을 감소시킨다. 이 반응은 활성화 된 D2Rs를 통한 간접적 인 경로에서의 신호 전달을 특이 적으로 촉진하기로되어있다.
약리학 적 전략과 RNB (reversible neurotransmission blocking) 방법을 사용한 연구가 NAc에서 이러한 조절 메커니즘을 뒷받침했지만 (15, 16), DA 신경 세포 발화의 억제가 간접 경로의 활동을 촉진시키고 후속 적으로 회피 행동을 유도하는지 여부는 알려지지 않았다. 이 연구에서, 우리는 막 과분극 아치 단백질을 optogenetically 조작하여 VTA에서 DA 뉴런을 선택적으로 비활성화 하여이 문제를 해결 (17VTA에서 DA 뉴런의 억제가 NAC에서 DA 수준을 감소시키고 혐오 반응 및 학습을 유도한다는 것을 명시 적으로 입증 하였다. 또한, 우리는이 반응의 조절 메커니즘을 조사하고,이 혐오 반응이 NAc의 D2R에 의해 구체적으로 조절된다는 것을 공개했다.
결과
DA 뉴런의 Optogenetic 불 활성화는 암실 선호도를 차단합니다.
DA 뉴런의 발사를 선택적으로 불 활성화하기 위해 우리는 Arch-eGFP (AAV-double-floxed inverted reading frame (DIO) -Arch)를 암호화하는 Cre 유도 성 아데노 관련 바이러스 구조를 주사했다17)을 성인 티로신 히드 록 실라 제 (TH) -Cre 마우스의 VTA 내로 일방적으로18)와 야생형 (WT)의 동종 어미와 광섬유를 VTA 위에 놓았다.무화과 S1 A 및 C). 수술 2 주 후, Arch-eGFP는 VTA에서 제한적으로 검출되었다 (무화과 S1B). 우리는 전기 생리 학적 기록에 의한 Arch 단백질의 과분극 효과를 시험하고 AAV-DIO-Arch를 주사 한 TH-Cre 마우스의 VTA의 광학 자극 효과를 측정 하였다. 마취 된 TH-Cre 마우스의 VTA로부터의 생체 내 전기 생리 학적 기록은 추정 적 DA 뉴런의 광학 자극이 그들의 발화를 억제 함을 나타내었다무화과 S2), 이는 광학적 자극이 아치를 발현하는 DA 세포의 막 전위를 충분히 과분극시키고 따라서 이들의 자연 발화를 억제한다는 것을 나타낸다.
이러한 마우스를 사용하여, 우리는 다음 VTA에서 DA 뉴런의 광학 불활 화가 행동 학습에 대한 혐오적인 신호로 작용할 수 있는지 여부를 조사했습니다. 마우스는 어두운 환경을 선호하는 타고난 경향을 가지고 있습니다 (19). 우리는 마우스가 자유롭게 어두운 방을 탐색하고 밝은 공간을 열 수있는 행동 장치를 설계했습니다 (Fig. 1A). 요법 후, WT 마우스는 암실에서 광학 자극이 있거나없는 상태에서 암실에서 우선적으로 머물렀다 (무화과 S1D), 광학 자극 자체가 어두운 방을 선호하는 행동에 영향을 미치지 않도록 보장합니다. 우리는 DA 신경 세포의 광학적 불 활성화가 그들의 행동에 미치는 영향을 시험하기 위해 동물의 행동 실험을 계획했다.무화과 S1E). 요법과 예비 검사 후 암실에 머물렀을 때 VTA에서 DA 뉴런을 광학적으로 자극하여 마우스를 조절했습니다. 컨디셔닝의 첫 번째 5 분 동안조차도, TH-Cre 마우스는 이전에 선호했던 어두운 방에서 벗어나 컨디셔닝을 통해 암실을 연속적으로 피했습니다 (Fig. 1B). TH-Cre 마우스는 사후 검사에서 광학적 자극을받지 않았지만 암실에 대한 회피를 되돌려주지 않았다.Fig. 1C). 이 데이터는 DA 뉴런의 과분극은 일시적인 혐오 행동을 유도 할뿐만 아니라 암실에 대한 혐오적인 학습을위한 신호 역할을하며 또한 DA 뉴런의 불 활성화가 일시적인 혐오 행동과 장기간의 혐오적인 학습 모두에서 인과 적 역할을했다는 것을 입증합니다.
NA에서 NA 수준의 Optogenetic Down-Regulation.
우리는 다음 VTA에서 DA 뉴런의 불 활성화가 주요 표적 영역 인 NAc에서 DA의 농도를 실제로 변형 시켰는지 조사 하였다. AAV-DIO-Arch를 VTA에 주입 한 마취 된 TH-Cre 마우스에서 빠른 스캔 순환 전압 법 (FSCV)으로 NAc에서 DA 수준을 측정했습니다. NAc의 DA 수준은 VTA의 전기 자극에 의해 즉각적으로 상승하였고, evoked DA 방출은 VTA의 동시 광학 자극에 의해 유의하게 감소되었다 (무화과 S3). 우리는 VTA의 광학 자극이 NAc의 토닉 DA 수준을 감소시킬 수 있는지 여부를 테스트했다. 동일한 실험 환경에서, 우리는 NAc의 DA 수준이 VTA의 광학 자극의 20s에 의해 일시적으로 감소 함을 관찰했다 (Fig. 2), 이것은 혐오 적 자극에 대한보고 된 FSCV 반응과 일치한다 (20). 이 데이터는 VTA의 광학 자극이 VTA DA 뉴런을 불 활성화시키고 행동 실험 동안 NAc의 DA 수준을 감소시키기에 충분하다는 것을 입증한다.
VTA에서 DA 뉴런의 광학 불 활성화에 의한 Fos 유전자 발현의 상향 조절
VTA에서 DA 뉴런의 조건화 된 불 활성화에 의해 야기 된 행동 변화는 광학적 자극이 신경 활동을 직접 변화시키고 행동 수행의 변화를 가져온다는 것을 시사했다. 그래서 우리는 다음에 즉각적인 초기 유전자 인 Fos의 발현을 조사하여 DA 뉴런의 조건부 불 활성화에 의해 신경 활동이 상승 된 영역을 조사했습니다. 컨디셔닝이 암실 테스트에서 수행 된 직후, 정량 in situ 하이브리드 화 분석에 의해 Fos 발현 양을 결정하기 위해 마우스를 신속하게 처리 하였다 (Fig. 3 및 무화과 S4). VTA로부터 도파민 계 투사를 많이받는 영역 인 NAc는 TH-Cre 마우스에서 Fos 발현 양이 유의하게 증가했다 (Fig. 3). 이러한 상향 조절은 광학 자극의 대 측부에서도 발견되었는데, 이는 그쪽으로 약간의 바이러스 감염이 원인 인 것으로 추정된다. 그러나 상향 조절은 반대쪽에서 광학 자극의 대 측부보다 훨씬 더 높았으며 이는 DA 뉴런의 광학적 불 활성화가 NAc의 신경 활동을 직접적으로 조절한다는 것을 시사한다. 증가 된 Fos 발현은 중격, striatum의 뇌실 주위, basolateral amygdala (BLA), lateral hypothalamus를 포함하여 다른 뇌 영역에서도 관찰되었지만, 외측 habenula 또는 내측 전두엽 피질 (mPFC; 무화과 S4). 이러한 결과는 DA 뉴런의 광학적 불 활성화에 의해 활성화 된 영역이 VTA DA 뉴런의 직접 표적 영역에 국한되지 않고 오히려 신경 회로 의존적 방식으로 간접적으로 활성화 될 수있는 영역을 포함한다는 것을 나타낸다. 이 관찰은 DA 뉴런의 광학적 불 활성화가 회로 전체의 신경 세포 활동을 변형 시켰으며 혐오 반응을 유발할뿐만 아니라 불안, 공포 및 스트레스 반응과 같은 몇 가지 다른 뇌 기능을 유발할 수 있음을 시사한다21).
D2R을 통한 DA 신호 전달은 Optogenetically 유발 된 조건부 혐오감에 중요합니다.
VTA의 도파민 신호의 대부분은 DA 수용체 인 D1R과 D2R을 통해 NAc의 MSN로 전달됩니다. D1R은 물질 P (Tac1 유전자에 의해 코딩 됨) 표현 MSN에서 거의 독점적으로 발현되고, D2R은 엔케팔린 (Penk 유전자에 의해 코딩 됨) 표현 MSN에서 주로 발현된다. MSN의 각 유형은 NAc에서 각각 직접 및 간접 경로를 구성합니다 (3). DA에 대한 친 화성이 D2R (nM 순서)보다 D1R (μM 순서)에 비해 훨씬 높기 때문에22, 23), DA 수준의 감소는 G의 불 활성화를 초래한다고 생각된다i- 결합 된 D2R 그러나 D1R에 대한 상당한 효과가없는 (3, 24), 이로써 간접적 인 경로에서 특히 신경 활동을 상향 조절한다. 더욱이, Fos 활성화는 Tac2- 또는 Drd2a (D1R) 발현 세포에서보다 Penk- 또는 Drd1 (D1R) 발현 세포에서 더 두드러지게 관찰되었다무화과 S5). 이러한 관찰에 기초하여, 우리는 D2R을 통한 DA 신호가 관찰 된 혐오 컨디셔닝에서 중요한 역할을 할 수 있다고 가정했다.
이 가설을 테스트하기 위해 우리는 3- 챔버 조건부 혐오 (CPA) 테스트를 수행했다 (무화과 S6). 우리는 사실상 동일한 환경과 하나의 작은 회랑이있는 2 개의 챔버를 포함하는 행동 장치를 준비했습니다. CPA 테스트에서 이러한 편견없는 환경 조건은 VTA DA 뉴런의 불 활성화가 암실 선호도를 차단할뿐만 아니라 혐오 반응과 학습을 유도 할 수 있는지 여부를 더 조사 할 수있게 해줍니다. 동물이 전체기구를 자유롭게 움직일 수있게되었을 때, 대부분의 동물은 사전 검사에서 전형적인 행동 상 차이없이 두 개의 방에 머물렀다. 광학 조절은 광학 자극을 하나의 고정 된 챔버와 쌍으로하여 수행되었다. 챔버 중 하나가 컨디셔닝을 위해 사용 되더라도, TH-Cre 마우스는 컨디셔닝 및 사후 테스트에서 광학적으로 컨디셔닝 된 챔버에 머무르는 것을 지속적으로 및 현저하게 회피했다 (무화과 S6 B-E). 통계 분석 결과, WT 마우스의 체류 시간과 비교하여 사후 테스트에서 광학적으로 조절 된 챔버에서의 TH-Cre 마우스의 체류 시간이 크게 감소 함이 확인되었습니다 (무화과 S6F).
그런 다음 우리는 DA 수용체의 각각을 특이 적으로 억제함으로써이 혐오 행동에 관여하는 DA 수용체 아형을 지정하려고 시도했다 (Fig. 4 및 무화과 S7). 우리는 mCherry의 구성 적 발현으로 각 DA 수용체에 특이적인 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)를 함유 한 렌티 바이러스 벡터를 설계하고 검증했다. 렌티 바이러스를 NAc에 주사 한 지 3 주 후에, mCherry의 강력한 발현이 NAc에 국한되었다 (Fig. 4B). 각 수용체의 mRNA 발현의 효과적인 knockdown은 정량적 실시간 PCR 분석에 의해 확인되었다 (Fig. S7A). 웨스턴 블 랏팅을 통해 단백질 수준을 측정 한 결과 각 렌티 바이러스의 주사는 DA 수용체의 다른 아형의 발현에 영향을 미치지 않고 표적 단백질 생성물을 선택적으로 감소시켰다Fig. 4C 및 무화과 S7 B-G). shD1R- 및 shD2R- 발현 렌티 바이러스는 대조군 바이러스의 수준과 비교하여 각각 목표 단백질 수준을 46.2 ± 1.1 % 및 38.4 ± 4.9 %로 감소시켰다 (Fig. 4C). 이러한 결과는 D1R 및 D2R에 특이적인 shRNA를 발현하는 렌티 바이러스 벡터가 표적 RNA를 선택적으로 충분히 억제하고 각 단백질 산물의 양을 하향 조절 함을 입증 하였다. 우리는 또한 lentivirus-mediated shRNA가 VTA에 직접적으로 영향을 미칠 가능성을 제외하고, mCherry의 바이러스 매개 된 발현이 VTA에서 검출되지 않았 음을 확인했다.
shRNA를 포함하는 이러한 렌티 바이러스를 사용하여, 우리는 DA 뉴런의 광 유발 불 활성화에 의해 유발 된 혐오 행동을 담당하는 DA 수용체 유형을 시험 하였다. 우리는 shRNA 함유 렌티 바이러스 또는 렌티 바이러스를 양측 NAc에 AAV-DIO-Arch와 함께 TH-Cre 마우스의 왼쪽 VTA에 주입했다. 광섬유는 또한 VTA 위에 삽입되었습니다 (Fig. 4A). 3-CPA 검사가 수술 후 3 주에 수행되었을 때, lenti : shD1R-mCherry를 주사 한 TH-Cre 마우스는 광학 자극 - 쌍을 이루는 챔버에 대해 명백한 CPA를 나타내었고 THA-Cre 마우스는 컨트롤 렌티 바이러스 (lenti : mCherry). 대조적으로, lenti : shD2R-mCherry를 주사 한 TH-Cre 마우스는 컨디셔닝 중에 명백한 CPA를 나타내지 못했다 (Fig. 4D). lenti : shD2R-mCherry를 주사 한 TH-Cre 마우스의 독점적 학습 결핍은 사후 검사에서 혐오 학습 분석에 의해 입증되었다Fig. 4E). 이 결과는 DA 뉴런 불 활성화에 의해 조절 된 장소에 대한 혐오적인 행동이 NAc에서 D2R을 통해가 아니라 D1R을 통해 구체적으로 유도되었음을 보여줍니다.
토론
선조체에서 연구 결과에 따르면 Gs- 결합 된 D1R은 점화를 촉진하는 반면, Gi- 결합 된 D2R은 소성 효율을 감소시킵니다 (25). AcDA 수용체 발현의 특이성에 따라, DA 뉴런의 위상 발동은 주로 D1R을 통한 직접 경로를 활성화시키는 반면, DA 뉴런 발작의 일시적인 감소는 주로 D2R을 통한 간접적 경로 능력을 촉진시킨다 (3, 26). 이러한 조절 기전에 기초하여, 혐오 적 자극에 반응하여 DA 뉴런의 사일런 싱이 주로 간접 경로를 통해 처리되어 혐오적인 행동을 일으킨다 고 제안되었다 (3). 최근의 연구에 따르면 간접 경로의 시냅스 전달 차단은 전기 쇼크에 의해 유발 된 혐오 성 행동의 획득을 방해합니다 (15) 그리고이 장애가 D2R 매개 신호 전달의 저해에 의해 야기된다는 것 (16). 나는또한 간접적 인 경로에서 D2R을 발현하는 MSN의 광학 발생 상향 조절은 행동 회피를 유발한다 (27). 그러나, DA 신경 세포는 혐오 자극에 반응하여 강화 된 발화 및 억제 된 발화를 나타내며, 다른 충격 관련 감각 정보가 뇌에서 동시에 처리되기 때문에, DA 뉴런의 사일런 싱이 혐오 반응 및 학습을 직접 유발할 수 있는지, 이 반응이 간접적 인 경로에서 D2R- 표현 MSN을 통해 조절되는지 여부에 따라 달라진다.
이 연구에서는 두 가지 행동 테스트에서 DA 뉴런 발사의 광 생성 조절을 사용했다 : 암실 선호도 테스트와 3 챔버 CPA 테스트. 우리의 optogenetic manipulation은 VTA에서 DA 뉴런 발사를 효율적으로 억제하고 NAc에서 DA 수준의 하향 조절을 보였다. 조건부 챔버에 동물들이 머물렀던 기간 동안에 만 DA 신경 세포 발사가 우리의 정확한 optogenetic 불활 화는 혐오 반응과 학습을 명시 적으로 유발하여 일시적인 DA 침묵이 수동적 회피 행동을 직접 일으킨다는 것을 보여줍니다. 더욱이,이 연구는 D2R 매개 신호 처리가이 혐오 반응과 학습의 유도에 중요한 결정자임을 밝혀냈다.
우리의 데이터에 따르면 D1R은 CPA를 유발하는 행동 실험에 아무런 영향을 미치지 못한다는 사실이 입증되었지만 공포 반응과 혐오 적 학습을 위해서는 DA 뉴런의 위상 발사가 필요하다는 여러 연구가있었습니다28, 29). 이 차이는 실험적인 설정 때문입니다. 즉, 우리의 optogenic 접근은 DA 신경 세포를 비활성화시키는 것이 혐오 행동과 학습을 유도하기에 충분하다는 것을 나타내는 혐오 행동을 유발하기 위해 활성화 된 DA 뉴런을 통한 신호 전달의 가능성을 배제했다. 혐오적인 자극에 의해 유발 된 활성화 된 DA 발화의 기능과 신호 처리는 여기서 연구 된 것들로부터 혐오적인 행동에 다른 기여를 할 것이고, 미래에 명확히 할 필요가있다.
DA 뉴런은 또한 mPFC, 편도체 및 해마를 비롯한 여러 다른 지역으로도 프로젝트를 진행합니다. 최근 연구에 따르면 VTA에서 DA 뉴런에 투영되는 측부 habenula 뉴런의 광 유발 적 활성화는 혐오적인 행동을 유도 할 수 있으며, 이러한 DA 뉴런은 주로 mPFC를 타겟으로한다 (30), 그들의 optogenetic 컨디셔닝은 전체 조건 세션에 대한 그들의 optogenetic 자극이 연장되었습니다로서, 우리의 현재 연구에서 다른 있었지만. mPFC에 대한 dopaminergic 입력은 혐오적인 자극에 의해서뿐만 아니라 만성 스트레스에 의해서도 활성화되기 때문에31, 32), mPFC 투사 DA 뉴런의 계속적인 활성화가 매우 스트레스가 많은 환경에서 신호로 인식 될 가능성이 있습니다; 스트레스가 많은 컨디셔닝의 축적 결과로 동물들은 컨디셔닝 된 챔버에 혐오적인 행동을 보일 것입니다. 대조적으로, 우리는 조건부 챔버에 동물들이 머물고있는 동안에 만 DA 뉴런의 발사를 억제했다. 타이밍 매칭 컨디셔닝을 사용한 우리의 행동 실험 결과는 DA 신호의 갑작스런 억제가 갑작스러운 혐오적인 입력으로 인식되어 빠른 억압 반응을 일으킨다는 것을 나타냈다.
DA 뉴런은 또한 공포 반응에 크게 기여하는 편도체에 투사합니다. 실제로, 편도체에 대한 DA 신호는 공포 반응과 공포 기억의 획득에 관여되어왔다 (33, 34). 우리의 연구에서, VTA에서 DA 뉴런을 라벨링하는 것은 BLA에 투사하는 DA 뉴런 세트를 확인했지만, 이러한 예측의 범위는 NAc에 투사하는 것보다 훨씬 낮았다. 관찰 된 혐오적인 행동에 amygdala가 계획 한 DA 시그널링의 미묘한 영향을 배제 할 수는 없지만, DA 뉴런의 우리의 광 생성 불 활성화의 주된 효과는 NAc에서의 D2R의 특이적인 knockdown에 대한 실험이 급격히 감소했기 때문입니다 혐오스러운 행동. 표적 특이 적 DA 신호를 다루는 미래의 연구는 DA 신경 세포의 전반적인 수정이 억압 자극과 공포 조절에 미치는 영향을 명료하게 요구한다.
재료 및 방법
과목.
Tyrosine hydroxylase :: IRES-Cre (TH-Cre) 노크 - 쥐 (EM : 00254) (18)는 European Mouse Mutant Archive에서 입수했다. 모든 실험 동물은 57 세대 이상 동안 C6BL / 10J 균주에 복귀 교잡되었다. 생쥐를 C57BL / 6J WT 마우스와 교배시키고 표준 12-h light / 12-h 암주기 및 주어진 음식과 물을 자유롭게 제공했습니다. Cre+ 및 Cre- 동일한 깔짚 (3-6 개월)의 마우스를 실험에 사용 하였다. 모든 동물 실험은 오사카 바이오 사이언스 연구소의 동물위원회에서 동물 실험 지침에 따라 승인되었습니다.
행동 테스트.
모든 행동 테스트 동안 마우스는 광섬유와 연결되어 전체 장치를 따라 움직일 수있었습니다. 생쥐의 움직임을 모니터링하여 머리에 광섬유가 연결되어 있어도 장애물이없이 움직일 수있었습니다. 마우스의 위치는 행동 장치 위에 매달려있는 비디오 카메라로 감지하고 Labview 소프트웨어를 사용하여 맞춤형 프로그램으로 분석했습니다.
어두운 방 환경 테스트.
시험에 사용 된 맞춤형 행동 장치는 어두운 방 (15 × 9.5 cm)과 밝은 열린 공간 (15 × 11 cm)으로 구성되었습니다. 어두운 방에는 벽, 바닥 및 지붕이 있었으며 모두 검은 색으로 열려 있고 열린 밝은 공간에 입구가있었습니다 (4.5 cm 길이). 열린 밝은 공간은 타원형이었고 지붕이없는 깨끗한 벽과 금속 격자 바닥이있었습니다. 시험 전에, 모든 마우스를 장치에서 10 분 동안 숙취시켰다. 이 테스트는 3 회의 세션으로 구성되었습니다. 1 (초기 테스트 : 5 분) 초반에 마우스는 전체 장치를 탐색 할 수있었습니다. 1 일 후반에서 4 일까지 (조절 : 총 35 분), 암실에 머물렀을 때 마우스는 광학 자극을 받았다. 5 일에, 암실 선호도는 광학 자극없이 시험되었다 (사후 검사 : 5 min; 무화과 S1E).
3 챔버 CPA 테스트.
테스트에 사용 된 맞춤형 3 챔버 조건부 환경 설정 / CPA 장치는 두 개의 챔버 (10 × 17 cm)와 연결 복도로 구성되었습니다. 테스트는 세 가지 세션으로 구성되었습니다. Day 1 (pretest : 15 min) : 마우스는 전체 장치를 자유롭게 탐색 할 수있었습니다. 한 챔버에서 1.5 시간 동안 다른 챔버보다 길게 머물렀던 마우스는 테스트에서 제외되었습니다. Days 2 및 3 (컨디셔닝 : 15 분) : 마우스는 라이트 페어가 된 챔버에 머물러있을 때 광학 자극을받습니다. 광 - 쌍을 이루는 챔버의 선택은 평형을 이룬다. 일 4 (사후 테스트 : 15 분) : 테스트는 사전 테스트와 동일한 조건하에 수행되었습니다무화과 S6A).
컨디셔닝 세션에서 마우스가 어두운 방에서 30 위에 지속적으로 머물렀거나 과열을 피하기 위해 밝은 쌍으로 된 챔버에서 30에 대해 광학 자극을 중단했습니다. 모든 동작 테스트에서 레이저 출력은 광섬유 끝에서 대략 5 mW가되도록 제어되었습니다.
In Vivo Fast-Cyclic Voltammetry.
FSCV 실험은 이전 연구에서 기술 된 방법을 사용하여 수행되었다 (35-37). 마우스를 케타민 / 자일 라진 혼합물로 마취시키고 SI 재료 및 방법 stereotaxic 프레임에 배치. 아치 - 발현 DA 뉴런을 자극하기 위해 사용 된 광섬유는 자극 전극에 근접하게 위치되었다. 그 후 자극성 혈장을 VTA (전 - 후방, -3.2 mm, 외측, 0.5 mm 및 등측 배측, 3.5 mm)에서 VTA에 넣고 0.25-mm 간격으로 낮추었다. voltammetric 녹음을위한 탄소 섬유 microelectrode (300 μm의)는 NAc (bregma에서 : 전후방, 1.0 mm, 측면, 1.0 mm 및 지느러미 - 복부, 3.5 mm)로 낮추었다. Voltammetric 측정은 탄소 섬유 미세 전극에 삼각형 파형 (-100 V에서 + 0.4 V에서 -1.3 V 대 Ag / AgCl, 0.4 V / s에서)을 적용하여 매 400 ms마다 측정했습니다. 파형 절연 및 전류 증폭을 위해 주문형 포 텐셔 스탯이 사용되었습니다. DA 방출은 24- 펄스 자극 (100 μA, 5 ms 지속 시간, 30 Hz)을 사용하여 DA 뉴런의 전기적 자극에 의해 유발되었다. 전기 자극이 시작되기 전에 532을 시작하는 5에 대해 DA 뉴런 (광섬유 팁에서 10 nm, ~5 mW 전력)의 광 자극을 적용했습니다. 탄소 섬유 마이크로 전극은 알려진 농도의 DA (0.2 μM, 0.5 μM 및 1.0 μM)가있는 용액에서 보정되었습니다. 모든 전압계 데이터는 Labview 및 Matlab 소프트웨어를 사용하여 맞춤형 프로그램으로 분석되었습니다. 광학 자극에 의한 DA 수준의 감소는 전기 VTA 자극으로부터 얻어진 주형 DA 파형을 사용하여 주요 성분 분석으로 도파민 신호를 분리하여 해결되었습니다 (35, 36).
통계 분석.
통계 분석은 GraphPad PRISM 5.0 (GraphPad Software)를 사용하여 수행되었습니다. 데이터를 반복 측정 ANOVA (도 2 1B, , 4D,4D및 무화과 S6 D 및 E) 또는 일원 분산 분석 (도 2 1C, , 3D,3D, 4 C 및 E및 도 2 S4 K-M, S6F및 S7A), 사후 분석은 Bonferroni 테스트를 사용하여 수행되었다. 모든 마크 / 컬럼 및 막대는 각각 평균 및 ± SEM을 나타냈다.
바이러스 준비 및 주사, 전기 생리 학적 기록, 면역 조직 화학 및 mRNA 분석과 같은 다른 실험 절차는 SI 재료 및 방법.
감사의
우리는 Arch 건설을위한 E. Boyden, lentivirus 생산 및 정제에 대한 기술적 자문을 담당하는 R. Matsui, 데이터 분석 프로그램의 기술적 조언에 대한 Y. Hayashi에게 감사드립니다. 이 연구는 문부 과학성에서 연구 보조금 22220005 (SN에), 23120011 (SY와 SN에), 24700339 (TD에), 25871080 (SY에)에 의해 지원되었다. 일본의 기술과 다케다 과학 재단 (SN)의 보조금.
각주
저자는 아무런 이해 상충을 선언하지 않습니다.
이 기사에는 온라인에서 지원 정보가 들어 있습니다. www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1404323111/-/DCSupplemental.
참고자료
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