기저 Ganglia 기능 장애는 비만 (2016)에있는 육체적 인 비 활동에 공헌한다

사용 가능한 온라인 29 December 2016

하이라이트

• 비만은 신체 활동이없는 것과 관련이 있습니다.

• 비만 마우스는 선조체 D2R 결합이 적기 때문에 비활성 상태를 설명 할 수 있습니다

• G 복원_i iMSNs의 신호가 뚱뚱한 생쥐의 신체 활동 수준을 구출

• 신체 활동이없는 이유는 체중 증가의 원인보다 더 중요합니다.

요약

비만은 체중 증가의 건강상의 결과를 악화시키는 신체 활동과 관련이 있습니다. 그러나이 연관성을 중재하는 메커니즘은 알려져 있지 않습니다. 우리는 도파민 신호의 결핍이 비만의 신체 활동 부족에 기여한다는 가설을 세웠다. 이를 조사하기 위해 우리는 마른 체중과 뚱뚱한 생쥐에서 도파민 신호 전달의 여러 측면을 정량화했습니다. 우리는 D2 형 수용체 (D2R)가 D1 형 수용체 결합 또는 도파민 수준이 아닌 선천성 쥐에서 결합이 비만 마우스에서 감소한다는 것을 발견했다. striatal medium spiny 뉴런에서 D2R을 유 전적으로 제거하면 마른 생쥐에서 운동 활성을 감소시키기에 충분했다. 반면 G_i 이 뉴런의 신호는 비만 마우스에서 활동을 증가시켰다. 놀랍게도 D2R 수치가 낮은 마우스는 덜 활동적 이었지만 대조 마우스보다식이 요법으로 인한 체중 증가에 더 취약하지 않았습니다. 우리는 선조체 D2R 신호의 결핍이 비만의 신체 활동 부족에 기여하지만 비 활동은 비만의 원인보다 더 중요한 결과라고 결론 내리고 있습니다.

그래픽 요약

그림 옵션

비만;
도파민;
신체 활동;
운동;
D2;
줄무늬 체;
뚱뚱한;
체중 감소

개요

비만은 신체 활동과 관련이 있습니다 (Brownson et al., 2005 및 Ekkekakis et al., 2016), II 형 당뇨병 및 심혈관 질환의 건강에 부정적인 영향을 끼친다 (de Rezende et al., 2014 및 Sharma 외, 2015 년). 이러한 연관성의 기초가되는 메커니즘은 알려져 있지 않다. 비만인 집단의 신체 활동 수준을 변화시키는 효과적인 개입의 부족에 반영된 사실이다.Ekkekakis et al., 2016). 흥미롭게도, 비만은 선조체 도파민 (DA) 신호 전달의 변화와 연관되어있어 비만에서 보상 기능 장애의 가설을 이끌어 냈다.Blum 외, 2011, 케니, 2011 및 Volkow and Wise, 2005). 선조체 DA가 운동량과 밀접하게 관련되어 있지만,식이 유도 성 도파민 작용이 신체 활동이없는 경우에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 연구 된 연구는 거의 없습니다. 우리는 선조체 DA 신호가 비만에서 손상되고 이것이 신체 활동이없는 것으로 생각한다는 가설을 세웠다. 신체 활동이없는 생물학적 원인을 이해하면 비만 환자의 건강 증진 및 활동 증진에 효과적인 개입이 될 수 있습니다.

선조직 검사는 운동 조절에 결정적인 역할을합니다. 이것은 중뇌에서 도파민 성 신경 세포의 죽음과 선조체 DA의 결과 손실을 특징으로하는 파킨슨 병과 같은 운동 장애에서 분명합니다 (Hornykiewicz, 2010). DA에 의해 조절 된 선조체 투영 뉴런의 두 개체군은 직접 및 간접 매개 성 중배 신경 뉴런 (dMSNs 및 iMSNs)으로 알려져있다 (Alexander and Crutcher, 1990, DeLong, 1990 및 Gerfen et al., 1990). dMSN은 G를 표현한다._s(D1R)을 합성하고 globus pallidus의 흑색질과 내부 절편으로 투사하는 반면, iMSNs는 G_i- 연결 D2R 및 globus pallidus (GPe)의 외부 세그먼트에 프로젝트 (Gerfen et al., 1990, 르 모인과 블로흐, 1995 및 Levey 등, 1993). iMSNs에서 D2Rs의 유전 적 제거 또는 iMSNs의 광 생성 자극으로 운동 감소에 충분하다.Kravitz et al., 2010 및 Lemos 외, 2016). D2R 기능 장애와 비만 사이의 연관성을 토대로, 우리는 비만 동물이 iMSN 산출물을 변경하여 육체적 활동이없는 것으로 가정했다.

여기에서는 희박하고식이 요법을받은 비만 마우스에서 DA 신호 전달의 여러 측면을 조사했습니다. 비만 마우스에서는 D2R 결합이 감소하는 반면, D1R 결합 및 세포 외 DA 수준은 변하지 않았다. 비만 생쥐도 선조체 발화 장애를 보였으며 운동이 감소했습니다. iMSN에서 D2R을 유 전적으로 제거하면 마른 생쥐에서 활동이 감소하는 반면 G_i iMSNs의 신호는 비만 마우스에서 활동을 증가시켰다. 이 결과는 iMSN에서 D2R 신호가 양방향으로 신체 활동을 조절할 수 있음을 입증합니다. 우리는 낮은 D2R 신호를 가진 쥐가 저지방 때문에 고지 방식의 체중 증가에 더 취약한지를 물었다. 이를 위해 우리는 선조체 D2R의 유전 적 제거가있는 생쥐뿐만 아니라 생쥐들 사이의 D2R 결합의 자연적 변화에 대한 체중 증가를 조사했다. D2R 수치가 낮은 쥐는 신체 활동 수준이 낮았지 만 손상되지 않은 D2R이있는 쥐와 같은 속도로 체중이 증가했습니다. 이것은 신체 활동과 체중 증가 사이의 강한 인과 관계에 반대한다. 우리는 D2R 신호의 손상이 비만의 신체 활동 부족에 기여하지만 비활성으로 인해 체중이 늘지는 않는다고 결론 내리고 있습니다.

결과

다이어트로 유발 된 비만이 신체 활동이없는 것과 연관되어 있음

C57BL6 / J 수컷 생쥐 (3 ~ 4 개월)에게 8 주 동안 표준 사료 (무 지방, n = 8) 또는 고지 방식 (비만, n = 18)을 먹였습니다 (그림 S1ㅏ). 2 주에 시작하여 18 주까지 지속 된 비만 마우스는 마른 마우스보다 훨씬 더 높은 체중과 체지방량을 가졌습니다 (p <0.0001; 피규어 1A 및 S1비). 희박한 물질은 현저히 변화되지 않았다 (그림 S1씨). 우리는 2 주 동안 18 주마다 열린 필드에서 활동 수준을 측정했습니다 (Ethovision; Noldus Information Technologies). 비만 생쥐는 4 주차부터 18 주차까지 지속되는 마른 생쥐보다 낮은 활동을 보였습니다 (p <0.0001; 피규어 1B 및 1C). 18 주차에 비만 마우스는 움직이는 시간이 적고 (p = 0.005), 움직임이 적고 (p = 0.0003), 움직이는 동안 속도가 느 렸습니다 (p = 0.0002; 그림 1D). 양육과 정리는 크게 변경되지 않았습니다 (그림 1디). 비만 마우스는 또한 가정용 케이지 주행 바퀴에 접근 할 때 마른 마우스보다 적게 실행했습니다 (p = 0.0005; 그림 1이자형). 우리는 운동 부족이 비만군에서 체중 증가와 상관 관계가 있는지 여부를 테스트했습니다. 체중 증가는 고지 방식의 칼로리 섭취와 관련이 있었지만그림 1F), 그것은 열린 장에서의 운동 수준이나 고지방식이 기간 동안 소비 된 에너지와 상관 관계가 없었다 (피규어 1G 및 1H). 흥미롭게도, 실험의 첫 주에 음식물 섭취량을 조사했을 때 이와 같은 상관 관계가 유지되었습니다 (피규어 1I-1K), 고지 방식 섭취량의 초기 수준 (운동이나 에너지 소비는 아님)이 나중에 체중 증가를 예측한다는 것을 나타냅니다.

그림 1.

만성 고지방 규정 식 육체적 인 비 활동에지도 한

(A) 고지 방식을 먹인 쥐는 2 주에 시작하여 18 (F_(18,252) = 62.43, p <0.0001).

(D) 고지 방식이 18 주 후, 비만 마우스는 이동하는 시간을 줄였습니다 (t₍₁₄₎ = 3.32, p = 0.005), 이동 빈도 감소 (t₍₁₄₎ = 4.74, p = 0.0003), 이동 중 속도 감소 (t₍₁₄₎ = 4.69, p = 0.0002). 비만 마우스는 또한 사육 감소 경향을 보였다 (p = 0.07).

(E) 홈 케이지의 바퀴 달린 바퀴에 접근 할 때, 뚱뚱한 생쥐는 마른 생쥐에 비해 휠 회전 수가 적었다.₍₁₄₎ = 4.55, p = 0.0005).

(F–H) 총 체중 증가는 실험 과정에서 (F) 에너지 섭취와 유의 한 상관 관계를 형성했지만 (r = 0.74, p = 0.04), (G) 에너지 소비는 아닙니다 (r = 0.52, p = 0.19). (H) 오픈 필드 속도 (r = 0.19, p = 0.65).

(I–K) 총 체중 증가는 첫 주 동안 (I) 평균 에너지 섭취량과 유의 한 상관 관계를 형성했지만 (r = 0.88, p = 0.004), (J) 에너지 소비량은 아니 었습니다 (r = -0.19, p = 0.66). , 또는 (K) 오픈 필드 속도 (r = 0.36, p = 0.38).

통계 분석. (A와 C) 양방향 반복 측정 ANOVA와 Benjamini-Hochberg false discovery rate를 사용한 post hoc t test; (D 및 E) unpaired 스튜던트 t 테스트; (F-H) 선형 회귀; ^*p <0.05, ^※※p <0.01, ^***p <0.0001 대 린. (I–K) 선형 회귀; ^***p <0.001 대 마른 마우스.

그림 옵션

비만은 도파민 D2R 바인딩의 감소와 관련되었다

신체 활동이없는 메커니즘을 확인하기 위해 우리는 마른 체중과 비만 마우스에서 DA 신호의 여러 측면을 계량화했습니다. 설치류의 이전보고와 일치하여, D2R 유사 수용체 결합 ( ³H- 스피 페론 (이후 D2R 결합이라고 함)은 마른 마우스에 비해 비만 마우스에서 더 낮았습니다 (p <0.0001; 피규어 2A 및 2B), 0.004 개의 선조 세분 모두에서 유의 한 발견 (등쪽 : p = 0.0001; 등쪽 : p <0.001; 복부 : p <XNUMX; 피규어 S2A 및 S2B). 그러나 D2R 결합은 마른 또는 비만 그룹에서 체지방과 상관 관계가 없었습니다 (둘 다에 대해 p> 0.55; 그림 2C), D2R 결합과 지방 저장은 모두 만성 고지 방식으로 변화되지만, 이러한 변수는 서로 인과 관계가 없을 수 있음을 시사한다.

그림 2.

뚱뚱한 규정 식 손상 한 Striatal Dopamine D2R 바인딩

(A)를 통해 측정 된 선조체 D2R 결합의 이미지 ³H-spiperone 오토 라디오.

(B) 선조체 D2R 결합은 마른 생쥐에 비해 비만에서 감소했다 (t₍₂₅₎ = 5.02, p <0.0001).

(D-F) (D) 선조체 D1R 결합 (t₍₂₄₎ = 1.31, p = 0.20), (E) 총 도파민 함량 (DA; t₍₁₃₎ = 0.85, p = 0.41) 및 (F) 티로신 하이드 록 실라 제 (TH) 밀도 (t₍₁₄₎ = 0.48, p = 0.64)는 식단 그룹간에 차이가 없었습니다.

통계 분석. 개별 마우스를 의미합니다. n = 8 ~ 19 마리 마우스 / 그룹; 스튜던트 t 검정 (B 및 D–F) 또는 선형 회귀 (C); ^*p <0.01.

그림 옵션

우리는 D2R 결합에서 비만 중재 감소의 기전을 확인하려고 시도했다. 이렇게하기 위해 Google은 Drd2 mRNA (인 시츄 혼성화를 통해) 그리고 0.92 개의 선조 부분 모두에서 변하지 않음을 발견했습니다 (등쪽 : p = 0.90; 등쪽 : p = 0.34; 복부 : p = XNUMX; 그림 S2씨). 우리는 총 D2R 단백질 수준을 정량화하기 위해 웨스턴 블롯을 수행했으며 D50R의 다른 글리코 실화 상태를 나타내는 것으로 생각되는 70- 또는 2-kDa 밴드에서 변화가 없음을 확인했습니다 (둘 다 p> 0.95, 피규어 S2D 및 S2E) (존슨과 케니, 2010). 마지막으로, 우리는 희박 및 비만 마우스에서 대사 기능 장애의 표지를 평가하여 이전에보고 된 바와 같이 D2R의 감소와 관련이 있는지 알아 보았습니다 (Dunn et al., 2012). 비만 마우스는 공복 콜레스테롤 (p <0.0001), 렙틴 (p <0.0001), 포도당 (p = 0.0002), 인슐린 (p = 0.001), 저항 기반 항상성 모델 평가 (HOMA-IR) (p <0.001)를 가졌습니다. , 그러나 트리글리세리드 또는 유리 지방산은 제외 (피규어 S1D-S1J). 그러나, 이들 인자 중 어느 것도 비만 마우스에서 D2R 결합과 상관 관계가 없었다 (데이터는 나타내지 않았다).

D1R과 같은 결합 (autoradiography를 통한 ³H-SCH23390 (이후 D1R 결합이라고 함)은 비만 마우스와 마른 마우스간에 차이가 없었습니다 (p = 0.20; 그림 2디). 선조 조직 펀치의 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)를 통해 측정 한 선조 DA 함량에도 차이가 없었습니다 (p = 0.41; 그림 2E) 또는 티로신 하이드 록 실라 제 면역 표지 (p = 0.64; 그림 2에프). 비만 마우스에서 기저 DA의 차이에 대한 여러보고에 비추어 (Carlin et al., 2013, Davis et al., 2008, Vucetic et al., 2012 및 Wang et al., 2014), 우리는 no-net flux microdialysis (new mice, n = 6 per group)를 사용 하여이 점을 추가로 조사했습니다. 우리는 다시 세포 외 DA (p = 0.99) 또는 3,4 개의 대사 산물 인 0.85-dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) (p = 0.68)와 homovanillic acid (HVA) (p = XNUMX, 그림 S3),이 방법으로 비만은이 실험에서 세포 외 DA 색조의 감소와 관련이 없음을 나타냅니다.

비만 생쥐에서 운동 관련 선천적 발진이 중단되었다.

우리는 감소 된 선조체 D2R 결합이 선조체 신경 출력을 변경하여 운동 감소에 기여하는 방법을 조사하기 위해 생체 내 전기 생리학을 수행했습니다. 우리는 마른 마우스와 비만 마우스의 등면 선조체에서 기록했습니다 (n = 그룹 당 3 마우스, 조직학 그림 3에프). 비만 마우스가 전체적으로 덜 움직 였지만 실행 된 움직임의 속도는이 그룹간에 차이가 없었습니다 (p = 0.55; 그림 3A), 마른 마우스와 비만 마우스 사이의 움직임 관련 발사를 비교할 수 있습니다. 기저 다중 단위 스파이 킹 속도는 마른 마우스와 비만 마우스간에 차이가 없었습니다 (마른 마우스, 2.1 ± 0.4Hz, 비만, 2.0 ± 0.7Hz, p = 0.93). 그러나 이동 활성화 유닛의 보급률 (그림 3B) 비만 마우스에서 현저히 낮았다 (p <0.0001; 그림 3씨). 이것은 "운동 활성화"단위의 통계적 정의에 의존하지 않았습니다. 또한 비만 대 마른 마우스에서 기록 된 모든 단위의 평균 반응에서 움직임 주변의 스파이 킹 감소를 관찰했기 때문입니다 (ANOVA에 의한 상호 작용, p <0.0002; 피규어 3D 및 3E). 우리는 striatum에서 총 spiking 속도는 다르지 않았지만, 운동 주위 스파이크의 조직은 비만 마우스에서 중단되었다고 결론 지었다.

그림 3.

Striatum에서의 운동 관련 발화가 뚱뚱한 생쥐에서 중단되었다.

(A) 운동 이벤트는 마른 체중과 비만 체중에서 비슷한 속도를 보였다.

(B) 선조체 뉴런에서 운동 활성화 및 비 반응 발화의 예.

(D) 기록 된 모든 뉴런의 평균 운동 관련 발사.

(E) 운동 관련 발화는식이 노출 (식이 × 운동 상호 작용, F_(1,171) = 14.77, p <0.0002).

(F) 도식 프랭클린과 팍시 노스, 1997) 마른 및 비만 기록 마우스 (각 n = 3)의 전극 어레이 배치를 설명합니다.

통계 분석. (C) 피셔의 정확한 검사. (D와 E) 양방향 반복 측정 ANOVA.

그림 옵션

비만 한 쥐의 iMSN 산출물 복원 활동 수준 저해

iMSN의 출력 감소가 비만 마우스의 움직임을 증가시킬 수 있는지 여부를 테스트하기 위해 억제 G를 표현하기 위해 Cre-recombinase (Cre) 의존 전략을 사용했습니다_i- 결합 된 수정 된 카파 오피오이드 수용체 디자이너 수용체는 비만 마우스의 iMSN에서 디자이너 약물 (KOR-DREADD)에 의해 독점적으로 활성화 됨그림 4에이). 아데노신 2A 수용체 Cre (A2A-Cre) 마우스가 이전에 Cre 염색이 선조체 IMSN에 특이 적이라는 것을 증명하기 위해 면역 염색으로 검증되었지만Cui et al., 2013 및 Lemos 외, 2016), 우리는 이중 형광 현장 하이브리드 화로이 라인의 추가 검증을 수행했습니다. 거의 모든 뉴런 (98.7 개 계산 뉴런의 0.6 % ± 1,301 %)은 Cre 및 Drd2 mRNA는 거의 (1.3 % ± 0.6 %) Cre or Drd2 mRNA 뿐이며, A2A-Cre 라인이 iMSNs를 충실히 표적으로한다는 것을 확인했다. 그림 S4).

그림 4.

DRIADD를 매개로하는 비만 쥐의 신체 활동을 회복시킨 iMSNs 억제

(A) KOR-DREADD 표현의 사진과 개략도 프랭클린과 팍시 노스, 1997) A2A-Cre 마우스의 모든 코어 드라드 (KOR-DREADD)의 바이러스 주입 부위를 보여주는; 불투명도는 주어진 위치에서 바이러스를 발현하는 마우스의 수를 나타냅니다.

(B) DMSO와 비교하여 SalB로 주사했을 때 비만 한 마우스가 더 많이 움직였다 (t₍₇₎ = 3.056, p = 0.02).

(C-G) SalB 투여 후 비만 마우스는 DMSO를 투여했을 때와 비교하여 운동 빈도 (C), 평균 운동 지속 시간 (D) 및 운동 속도 (E)에서 유의 한 변화를 보이지 않았다. (F) Sal-B 투여는 사육 빈도를 증가시켰다 (t₍₇₎ = 3.116, p = 0.02), 그러나 (G)는 그루밍 빈도를 크게 변경하지 않았습니다.

(H) DMSO에 비해 SalB를 주사 할 때 희박 마우스가 더 많이 움직였다 (t₍₉₎ = 3.3, p = 0.01).

(I) SalB는 KOR-DREADD를 발현하지 않는 야생형 마우스의 움직임에 영향을 미치지 않았다 (p = 0.77).

통계 분석. (B–I) 짝을 이룬 학생의 t 테스트; 개별 마우스를 의미합니다. n = 6–10 마우스 / 그룹.

그림 옵션

KOR-DREADD 작용제 살비 노린 -B (SalB)의 주사는 KOR-DREADD를 발현하는 비만 마우스가 이동하는 거리를 증가시켰다 (p = 0.02; 그림 4비). SalB는 또한 사육 빈도를 증가 시켰습니다 (p = 0.02; 그림 4F), 주파수 증가 경향을 보였다 (t₍₇₎ = 1.64, p = 0.12), 이동 시간이나 속도는 아님 (피규어 4C–4E). SalB 주사는 또한 마른 마우스의 움직임을 증가 시켰습니다 (p = 0.01; 그림 4H), 그러나 KOR-DREADD를 발현하지 않은 야생형 마우스에서는 그렇지 않다 (p = 0.73; 그림 4나는). iMSN의 생산량을 줄이는 것이 마른 동물과 비만 동물 모두의 운동 수준을 높이기에 충분하다고 결론지었습니다.

낮은 D2R 수치로 동물을 미래의 체중 증가로 예측할 수 없음

마지막으로, 우리는 D2R 신호의 선재 차이가 개별 쥐의식이 유도 성 비만에 영향을 줄지 여부를 조사했다. 이 문제를 해결하기 위해 마이크로 양전자 방출 단층 촬영 (마이크로 PET)을 ¹⁸고지방식이 노출 전에 기본 D2R 효용성을 측정하기위한 F- 프라이드 프라이드 (그림 5에이). 우리는 생쥐들 사이에 D2R 결합 잠재력의 높은 수준의 변화가 있음을 지적했다.Constantinescu et al., 2011). D2R 가용성의 개인차는 열린 필드에서의 움직임과 양의 상관 관계가있었습니다 (p = 0.045; 그림 5B), 이동에서 D2R의 역할과 일치합니다. micro-PET 스캔 후, D18R이 낮은 마우스가식이로 인한 체중 증가에 더 취약한 지 여부를 테스트하기 위해 동물을 2 주 동안 고지 방식이로 유지했습니다. 놀랍게도 우리는 긍정적인 이 실험에서 초기 D2R 가용성과 체중 증가 사이의 관계 (p = 0.10; 그림 5기음). 이 상관 관계는 중요하지 않지만 낮은 D2R 유용성 또는 낮은 신체 활동 부족이 동물을 체중 증가에 더욱 취약하게한다는 가설에 반대합니다. 이것은 또한 기초 야외 활동이나 전체 실험에서의 야외 활동이 체중 증가와 상관 관계가 없다는 사실과 일치했다 (피규어 1F-1K).

그림 5.

기본 D2R 바인딩은 미래의 체중 증가를 예측하지 못했습니다.

(A) striatum과 cerebellum의 D2R micro-PET 이용률 곡선의 예 ¹⁸F- 프라이드 프라이드.

(B 및 C) (B) 기저 개방 장 운동 (r = 0.56, p = 0.045)과 상관 관계가있는 결합 가능성 (r = 0.50, p = 0.10) 및 (C) 고지 방식이 유도 체중 증가 (r = 12, p = 14, n = XNUMX–XNUMX 마우스).

(D) 손상되지 않은 D2R (상단) 및 iMSN-Drd2-KO 생쥐 (아래).

(E 및 F) (E) iMSN-Drd2-KO 생쥐는 열린 필드에서 신체 활동이 감소했습니다 (t₍₈₎ = 2.99, p = 0.02) 및 (F) 홈 케이지 러닝 휠 (p = 0.01, n = 5–19 마우스 / 그룹).

(G) iMSN-Drd2-KO 마우스 및 Drd2-floxed littermate 대조군은 고지 방식 (F_(5,70) = 1.417, p = 0.23; n = 6-10 마리 마우스 / 그룹).

(H–J) (H) iMSN-D0.60R-KO간에 정규화 된 에너지 섭취 (p = 0.47), (I) 에너지 소비 (p = 0.17) 또는 (J) RER (p = 2)에는 유의 한 차이가 없었습니다. 생쥐 및 한배 동물 대조군.

통계 분석. (B와 C) 선형 회귀; (E, F 및 H-J) unpaired Student 's t test; (G) 양방향 반복 측정 ANOVA, ^*p <0.05.

그림 옵션

기존의 활동 수준과 체중 증가의 차이를 더 자세히 알아보기 위해 우리는 유전자 모델 마우스를 이용하여 Drd2 유전자 (iMSNs) (iMSN-Drd2-KO)하지만 다른 세포 유형에서는 보존 된 발현 ( Dobbs et al., 2016 및 Lemos 외, 2016). 이전에보고 된 바와 같이, iMSN-Drd2-KO 마우스는 열린 필드에서 한배 대조군보다 적게 움직였습니다 (p = 0.02; 그림 5E) 및 홈 케이지 러닝 휠 (p = 0.01; 그림 5에프). 위의 실험과 일관되게, iMSN-Drd2-KO 마우스는 고지 방식이를했을 때 한배 대조군보다 더 많은 체중을 얻지 못했습니다 (p = 0.23; 그림 5지). 에너지 사용을보다 면밀히 조사하기 위해 간접 열량 측정 실험을 수행하여 iMSN-Drd2-KO 마우스는 대조군을 littermate합니다. 에너지 섭취 (p = 0.60), 에너지 소비 (p = 0.47) 또는 호흡 교환 비율 (RER) (CO의 비율)에서 유의 한 차이를 발견하지 못했습니다.₂ O에 생산₂ 소비 [VCO₂/ VO₂], p = 0.17) iMSN-Drd2-KO 마우스와 한배 새끼 대조군 사이에서 IMSN-Drd2-KO 마우스의 움직임 감소가 에너지 사용의 변화로 해석되지 않았 음을 나타냅니다 (피규어 5H-5J). 마지막으로, 우리는 선천성 D2R (비만 마우스에서 관찰 된 것)의 감소가 운동량과 체중 증가를 조절할 수있는 정도를 조사했다. 이렇게하려면 줄 선에서 30 % -40 % 감소시키는 마우스 라인을 사용했습니다. Drd2 mRNA (iMSN-Drd2-Het) ( Lemos 외, 2016). 이 마우스는 또한 감소 된 움직임을 보였으며, D2R의 부분적 녹다운이 운동 적자 (p = 0.04; 그림 S5ㅏ). iMSN-Drd2-KO 마우스와 유사하게, iMSN-Drd2-het 마우스는 고지방식이로 인한 체중 증가에 더 민감하지 않았습니다 (p = 0.89; 그림 S5비). 우리는 선조체 D2R의 변화가 생쥐에서 칼로리 밸런스 또는 체중이 아닌 운동을 변화시키기에 충분 함을 결론 지었다.

토론

비만은 체중 증가에 기여한다고 종종 믿어지는 신체 활동이없는 것과 관련이 있습니다. 또한, 증가 된 비만도는 비만인의 낮은 활동 수준에 기여할 것으로 가정된다 (Ekkekakis와 Lind, 2006 및 Westerterp, 1999),이 아이디어는 직접 테스트하기는 어렵지만. 흥미롭게도 다이어트를 통해 체중을 줄이는 사람들 (de Boer et al., 1986, de Groot et al., 1989, Martin et al., 2007 및 Redman et al., 2009) 또는 bariatric 수술 (Berglind et al., 2015, Berglind et al., 2016, Bond et al., 2010 및 Ramirez-Marrero 외, 2014) 그들의 활동 수준을 증가시키지 말고, 비 활동을 유발하는 비만의 무게에 대해 논하십시오. 여기에서 우리는식이 유도 성 비만이 선조체 DA 전달의 결손을 통해 신체 활동을 유발한다는 가설을 조사했다. 이전 연구와 일치하여 만성 고지 방식은 선조체 D2R 결합을 감소 시켰으며Hajnal et al., 2008, Huang et al., 2006, Narayanaswami et al., 2013, van de Giessen et al., 2012 및 van de Giessen et al., 2013). 우리는 또한 뚱뚱한 생쥐에서 선조체 뉴런의 운동 관련 발화에 적자를 관찰했다. G로 금지 된 iMSN_iDREADD는 뚱뚱한 쥐의 활동을 구조했고, 과도한 비만증을 가진 쥐는 기초 신경절 출력이 회복되었을 때 정상적으로 움직일 수 있음을 보여 주었다. 그러나 놀랍게도 근본적인 D2R 측정이나 신체 활동은 체중 증가와 상관 관계가 없었으며 여러 실험에서 관찰되었습니다. 이것은 종이나 실험적인 차이를 반영하는 쥐 연구와는 대조적입니다 (Michaelides et al., 2012). 우리는 D2Rs의 감소와 그 이후의 신체 활동이 비만의 결과라고 결론을 내렸지 만 인과 관계에서 마우스의 추가 체중 증가와 반드시 인과 관계가있는 것은 아닙니다.

변경된 D2R 신호 전달과 비만 사이의 연관성은 인간에서 처음 발견되었으며 처음에는 다른 사람들에 의해 복제되었습니다 (de Weijer et al., 2011, Kessler et al., 2014, Volkow et al., 2008 및 Wang et al., 2001). 그러나 최근의 연구 결과에 따르면이 발견은 의문의 대상이되었습니다 (Caravaggio et al., 2015, Cosgrove et al., 2015, Dunn et al., 2012, Guo et al., 2014, Karlsson 외, 2015, Karlsson 외, 2016, Steele et al., 2010 및 Tuominen et al., 2015). 임상 연구에서 관찰 된 불일치를 이해하기 위해서는 추가 연구가 필요하지만 임상 연구 및 PET 이미징에 내재 된 복잡성을 반영 할 수 있습니다. 예를 들어, 많은 연구에서 사용되는 라디오 리간드 인 raclopride는 내인성 DA에 의해 대체 될 수 있으며, 따라서 결합은 기저 DA 톤의 차이에 의해 영향을받을 수 있습니다 (Horstmann et al., 2015). 또한, D2R 수준과 비만의 관계는 D2R의 변화가 서로 다른 수준의 비만 환자에서 발생할 수 있도록 비선형적일 수 있습니다 (Horstmann et al., 2015). 마지막으로 수면 지속 시간 (Wiers et al., 2016) 및 카페인 섭취량 (Volkow et al., 2015)도 D2R 결합에 영향을 줄 수 있으며, 대부분의 임상 연구에서는보고되거나 통제되지 않습니다. 이러한 차이의 원인은 D2R mRNA의 감소에 대한 일관된 그림을 그려주는 동물 연구에서 완화 될 수 있습니다 (Mathes et al., 2010 및 Zhang et al., 2015), 단백질 (Adams et al., 2015 및 존슨과 케니, 2010), 수용체 결합 (Hajnal et al., 2008, Huang et al., 2006, Narayanaswami et al., 2013, van de Giessen et al., 2012 및 van de Giessen et al., 2013). 우리의 연구는 DA 신호의 다른 측면이 D2R의 감소가있는 경우조차도 비만 마우스에서 변하지 않은 것으로보고함으로써이 문헌을 확대합니다. 또한 D2R 결합의 감소가 관찰 된 경우 ³H-spiperone, 총 D2R 단백질의 변화 없음 또는 Drd2 우리는 D2R에 대한 변경이 수용체 내재화와 같은 번역 후 변화를 포함 할 수 있다고 생각합니다. 우리의 데이터에 따르면 D2R 결합이 감소하면 비만의 신체 활동을 감소시키기에 충분하지만 신체 활동은 유전학 및 환경을 비롯한 여러 요인에 의해 영향을받습니다 ( Bauman et al., 2012). 우리는 D2Rs가 비만의 신체 활동이없는 유일한 신경 학적 변화라고는 생각하지 않습니다. 예를 들어, 그렐린 (ghrelin), 렙틴 (leptin), 인슐린 (insulin)과 같은 순환 호르몬의 변화는 도파민 성 신경 세포에 작용하여 활동에 영향을 줄 수 있습니다Murray et al., 2014). 마지막으로 우리는 D1R의 변화를 관찰하지는 않았지만 신체 활동에도 영향을 줄 수있는 직접 경로 뉴런의 발사 변화를 배제 할 수는 없습니다.

D2R 유용성의 변화가 개인의 체중 증가에 영향을 줄지는 확실하지 않습니다. 인간과 Drd2 Taq1A 대립 유전자는 D2R 효용성을 감소시키고 비만 위험을 증가시킵니다 ( Blum 외, 1996, Carpenter et al., 2013, Noble et al., 1991, Stice et al., 2008 및 Thompson et al., 1997). 또한, D2R을 세계적으로 결실시킨 쥐는 고지 방식으로 더 쉽게 체중이 늘었는데, 이는 신체 활동이없는 경우 (Beeler et al., 2015). 대조적으로, 선조체 D2R에서의 개별 변이 (자연적 또는 유 전적으로 유도 된)는 우리 연구에서 활동 수준과 상관이 있었으나 체중 증가와 상관 관계가 없었다. 우리의 연구에서 중요한 차이점은 우리의 유전 모델이 D2R을 iMSN에서만 제거했다는 것입니다. 또한, 음식 섭취량과 에너지 소비에 대한 신중한 측정 결과에 따르면이 뉴런에서 D2R을 조작해도 에너지 균형이 바뀌지 않았다. 따라서 D2R 기능과 에너지 균형 사이의 연관성을 보여주는 연구는 D2R이 다른 세포 유형에 미치는 영향을 관찰 할 수 있습니다. 우리의 실험은 신체 활동이 비만의 결과라는 결론을 뒷받침하지만 체중의 변화를 일으키는 데 충분하지 않다는 결론을지지합니다.

신체 활동이 심혈관 건강 개선 및 여러 다른 만성 질환의 위험 감소와 관련되어 있다는 증거가 증가하고 있음에도 불구하고 신체 활동은 비만 환자 (Ekkekakis et al., 2016). 신체 활동 수준을 높이기위한 효과적인 개입의 부족은 비만 한 개인의 신체 활동이없는 세포 및 분자 메커니즘에 대한 이해 부족으로 반영됩니다. 여기서는 신체 활동이없는 상태를 기초 신경절 기능의 변화와 연결하여 비만 환자의 신체 활동 부족에 대한 생물학적 설명을 제공합니다.

실험 절차

과목 및 다이어트

모든 연구에서 마우스는 표준 조건 (12 시간 명 / 암주기, 21–22 ° C)에서 개별적으로 수용되었으며 음식과 물에 자유롭게 접근 할 수있었습니다. 마우스에게 표준 사료 (5001 설치류 식단, 3.00 kcal / g, 단백질에서 29 % 에너지, 지방에서 13 %, 탄수화물 56 %, LabDiet) 또는 고지방 식단 (D12492, 5.24 kcal / g, 단백질에서 20 %, 지방에서 60 %, 탄수화물에서 20 %, 연구 다이어트). 모든 절차는 국립 당뇨병 및 소화기 및 신장 질환 연구소의 동물 관리 및 사용위원회의 지침에 따라 수행되었습니다.

형질 전환 조건부 녹아웃 iMSN-Drd2-KO 생쥐는 아데노신 2A 수용체 유전자의 조절 요소에 의해 구동되는 Cre을 발현하는 마우스를 교차시킴으로써 생성되었다 (Adora2a조건부를 갖는 마우스 (B6.FVB (Cg) -Tg (Adora2a-Cre) KG139Gsat / Mmucd; GENSAT; 036158-UCD) Drd2 null 대립 유전자 B6.129S4 (FVB) -Drd2^{tm1.1Mrub / J}, JAX020631 (Bello et al., 2011).

신체 구성 및 에너지 지출 계산

신체 조성은 격주로 ¹1H-NMR 분광법 (EchoMRI-100H; Echo Medical Systems). 에너지 소비는 에너지 균형 계산을 사용하여 결정되었다 (Guo et al., 2009 및 Ravussin et al., 2013):

Energyexpenditure = Metabolizableenergyintake- (Δfatmass + Δfat-freemass).

MathJax 켜기

열린 필드 활동

오픈 필드 테스트는 PhenoTyper 케이지 (30 × 30cm, Noldus IT)에서 수행되었으며 EthoVision 비디오 분석 소프트웨어 (버전 11, Noldus IT)를 사용하여 테스트 내내 마우스를 추적했습니다.

홈 케이지 휠 러닝

휠 러닝은 로우 프로파일 무선 러닝 휠 (Med Associates)을 마우스의 집 케이지에 72 주마다 3 시간 (다이어트 유발 비만 실험) 또는 지속적으로 (iMSN-Drd2-KO 실험).

혈액 측정

희생 된 동물의 안구 정맥혈을 4-hr 후 혈청 대사 산물 및 호르몬 분석에 사용했습니다.

Dopamine Receptor Autoradiography

오른쪽 반 절단은 선조체의 수준 (-0.22, 0.14, 0.62 및 1.18 mm, bregma에서 선조체의 전체 범위를 덮음)에서 12mm 섹션으로 냉동 절편되었습니다. 슬라이드를 해동하고 분석 완충액 (20mM HEPES, 154mM NaCl 및 0.1 % 소 혈청 알부민 [BSA]; pH 7.4)에서 20 ° C에서 37 분 동안 사전 인큐베이션했습니다. D1R 결합은 1.5 nM 삼중 수소 표지 된 SCH-23390 (Perkin-Elmer) 및 100 nM 케탄 세린을 포함하는 분석 완충액에서 60 ° C에서 37 분 동안 인큐베이션함으로써 평가되었습니다. D2R 결합은 600 ° C에서 100 분 동안 100pM 삼중 수소 표지 된 spiperone (Perkin-Elmer) 및 37nM 케탄 세린으로 슬라이드를 배양하여 평가했습니다. 적절한 방사성 리간드와 함께 배양 한 후, 슬라이드를 세척 완충액 (10mM Tris-HCl, 4mM NaCl)에서 10 ° C에서 154 분 동안 0 회 세척 한 다음 물 (7 ° C)에 담근 다음 밤새 건조되도록 두었습니다. 그런 다음 슬라이드를 1 일 (D11R 결합) 또는 2 일 (DXNUMXR 결합) 동안 인광체 이미징 플레이트에 노출시키고 포스 포 이미 저 (Cyclone; Perkin-Elmer)를 사용하여 개발했습니다. 분석을 위해 Optiquant 이미지 분석 소프트웨어 (Perkin-Elmer)를 사용하여 관심 영역을 설명하고 분석했습니다.

웨스턴 블 랏팅

Western anti-D2DR 항체 (1 : 500; Santa Cruz; sc-5303) 또는 마우스 항 -GAPDH 항체 (1 : 1,000; Santa Cruz; sc-32233) HRP (1 : 1,000, 산타 크루즈, sc-2005). 향상된 chemiluminescence 웨스턴 블로 팅 검출 시약 (Bio-Rad)을 사용하여 Chemiluminescence 신호를 생성하고 Chemidoc Imaging System (Bio-Rad)으로 시각화했습니다.

In Situ 하이브리드 화

RNAscope 멀티 플렉스 형광 분석 키트는 in situ hybridization (Advanced Cell Diagnostics)에 사용되었습니다. 간단히 말해서, 포르말린 고정 절편을 에탄올에서 탈수시킨 다음 프로테아제 노출시켰다. 그런 다음 섹션을 RNAscope 올리고 뉴클레오티드 프로브와 혼성화했습니다. Drd2. 프로브 하이브리드 화 후, 슬라이드를 RNAscope 프로토콜에 따라 신호 증폭기와 함께 배양했다. 이어서, 슬라이드를 RNAscope 세척 완충액으로 세척 하였다. 마지막으로, 슬라이드는 DAPI 대조 염색제로 장착 하였다.

전기 화학 검출을 이용한 고성능 액체 크로마토 그래피

왼쪽 절편을 전기 화학적 검출 (HPLC-EC)을 이용한 역상 고속 액체 크로마토 그래피를 사용하여 DA의 검출을 위해 처리 하였다Kilpatrick 등, 1986).

티로신 히드 록시 라 아제 면역 조직 화학

슬라이드 장착 섹션을 10 % 중성 완충 포르말린에 고정하고 0.1 M TBS (pH 7.5)로 헹구고 3 % 정상 당나귀 혈청, 0.3 % Triton X-100 및 토끼 항 티로신 하이드 록 실라 제 항체를 포함하는 1 차 항체 용액에서 배양했습니다. (1,000 : 152; Millipore; MAB23) 3 ° C에서 밤새. 다음날, 조직 절편을 TBS에서 헹구고 0.3 % 정상 당나귀 혈청, 100 % Triton X-555 및 Alexa Fluor 132 (Millipore; AQXNUMXF)에 접합 된 염소 항 토끼를 포함하는 XNUMX 차 항체 용액에서 배양했습니다. 각 마우스에 대해 조직 또는 이미지 품질이 좋지 않아 하나의 섹션 만 분석 된 XNUMX 개의 마우스 (HFD XNUMX 개, Chow XNUMX 개)를 제외하고 XNUMX 개의 선조 섹션을 분석했습니다.

마이크로 PET

마우스에게 ¹⁸이소 플루 란 마취하에 꼬리 정맥을 통해 2.5 μL의 부피에서 0.34 ± 130 mCi / nmol의 특정 활성을 가진 F-fallypride. micro-PET 스캔은 2 시간 동안 수행되었으며, 분석을 위해 25 개의 프레임이 획득되었습니다. 시간-활동 곡선 ¹⁸AFNI 소프트웨어를 사용하여 관심 영역 (ROI)의 F- 프라이드를 추출 하였다 (https://afni.nimh.nih.gov/afni) 및 운동 매개 변수는 D2R 바인딩 잠재력을 결정하기 위해 (주문 조직으로 사용되는 소뇌와) 사용자 정의 MATLAB 스크립트를 사용하여 4 구획 모델에 맞게되었다Lammertsma 및 흄, 1996).

생체 내 전기 생리학

등면 선조체 (전방 / 후방 [A / P] : +32; 내 / 측 [M / L] : +35 ; 등 / 배쪽 [D / V] : 브레 그 마당 -0.8 mm), 상용 소프트웨어 (Offline Sorter 및 Neuroexplorer, Plexon)로 처리되었습니다.

Stereotaxic 바이러스 벡터 삽입

마우스를 이소 플루 란 노출을 통해 간단히 마취시켰다. 깊이 마취되면 정중선을 따라 단일 절개를하고 두개골을 노출시키고 양측 개두술을 수행했습니다 (A / P : +0.5; M / L : 브레 그 마당 ± 1.5 mm). 억제 성 KOR-DREADD (Syn-DIO-hKORD-IRES-mCit-WPRE; 0.5 μL)를 포함하는 바이러스 벡터를 등쪽 선조체 (D / V, 두개골 상단에서 -2.8 mm)에 양측으로 주입하고 실험 9 주 전.

No-Net Flux 미세 투석 및 도파민 분석

마우스의 등쪽 선조체에서 기저 세포 외 DA, DOPAC 및 HVA의 측정은 no-net flux microdialysis 접근법에 의해 수행되었습니다. 일방적 인 2-mm 프로브 (18-kDa 막 컷오프)는 샘플 수집 전 1 시간 동안 1 μL / min에서 인공 뇌척수액 (aCSF)의 연속 관류로 캐뉼라 이식 4 주 후 정위 이식되었습니다 (참조 : 보충 실험 절차). 세포 외 DA 수준을 측정하기위한 No-net 플럭스 실험은 투석 프로브를 통해 aCSF에서 0 가지 다른 농도의 DA (2.5, 5, 10, 20, 40 및 30 nM)를 무작위로 관류하여 수행되었습니다. 각 DA 농도를 2 분 동안 관류 한 다음 10μL의 2.5mM HCl + 100mM EDTA에 1 x 80 분 샘플을 수집하여 카테콜아민 분해를 방지하고 -4 ° C에서 냉동했습니다. 신경 화학적 분석을 위해 전류 측정과 결합 된 등용 매 HPLC 시스템 (HPLC-EC; BASi LC-XNUMXC)이 사용되었습니다. 적절한 프로브 배치가있는 마우스 만 분석에 포함되었습니다 (그림 S3이자형).

통계

GraphPad Prism (버전 6.07, GraphPad 소프트웨어)을 사용하여 통계 분석을 수행했습니다. 명시되지 않는 한, 양측 스튜던트 t 검정이 사용되었습니다. 그렇지 않으면 양측 쌍체 t 검정, 단방향 반복 측정 ANOVA 또는 양방향 반복 측정 ANOVA가 적절하고 명시된대로 사용되었습니다. ANOVA에 이어 사후 비교를위한 t 테스트가 이어졌습니다. 결과는 p <0.05의 알파에서 또는 적절한 경우 Bejamini-Hochberg FDR (false discovery rate) 보정에 의해 결정된 알파에서 중요한 것으로 간주되었습니다.

작성자 기여

DMF, KD, TJO, MS, AK, IPSGRVAA, MR, KDH 및 AVK가 실험을 설계했습니다. DMF, KD, TJO, MS 및 AVK는 행동 실험을 수행하고 분석했습니다. IP는 웨스턴 블로 팅 실험을 수행했습니다. DMF 및 AVK는 생체 내 전기 생리 학적 데이터를 수행하고 분석했습니다. DMF, J.-SL, JG 및 AVK는 micro-PET 실험을 수행하고 분석했습니다. DMF, KD, TJO 및 AVK가 원고를 썼습니다. 모든 저자는 결과에 대해 논의하고 원고에 대해 논평했습니다.

감사의

이 연구는 NIH의 내막 연구 프로그램, 국립 당뇨병 학회 및 소화기 및 신장병 (NIDDK)에 의해 지원되었습니다. 우리는 NIDDK의 Mouse Metabolism Core를 도파민 미세 투석 실험 설계에 도움을 준 Andres Buonanno와 Kristin Dupre 박사와 Dr. 도파민 조직 함량 분석. 우리는 또한 그의 실험실 장비 사용과 구속력있는 연구에 도움을 주신 Dr. Scott Young에게 감사드립니다. 실험 디자인과 원고의 신중한 독서에 대한 의견을 주신 AVK 연구소, Marc Reitman 및 Nick Ryba 회원에게도 감사드립니다.

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