Proc Natl Acad Sci USA. 2009 Nov 24; 106 (47) : 20016-20020.
2009 Nov 9 온라인 게시. doi : 10.1073 / pnas.0908789106
PMCID : PMC2785284
피에트로 코튼,a,b,c,d,1,2 발렌티나 사비 노,a,b,c,d,1 마리사 로베르토,a,c,d 미할 바 조,e 라라 포크 로스,a 제니퍼 B. 프리 하프,a,c,d,f 에바 M. 페케 테,a,c,d 루카 스탈도,g 케너 C. 라이스,h 디미트리 그 리그 리아 디스,i 브루노 콘티,d,e 조지 F. 코브,a,c 및 Eric P. Zorrillaa,c,d,2
추상
체중 조절을위한식이 요법은 음식물 섭취를 막아 먹는 것을 막아 먹는 것을 막을 수 있습니다. 본 연구는 맛있을 수있는 음식에 간헐적으로 접근하는 것을 중단 한 쥐가 새로 접근 할 때 맛있은 음식을 과식하고 corticotropin-releasing factor-1 (CRF)을 특징으로하는 정서적 인 철수와 비슷한 상태를 나타냄을 보여줍니다1) 수용체 길항제 - 가려움증, 덜 맛있는 음식을 얻기위한 동기 적 결핍 및 불안 발작과 같은 행동을 포함한 가역적 인 행동. 금단 증상은 CRF 발현의 증가와 CRF의 증가를 동반했다.1 편도의 중심 핵에서 전기 생리 학적 반응성. 우리는 반 보수 시상 하부 CRF-CRF1 학대당한 약물로 인한 금욕과 유사한 맛좋은 음식에서 철수하는 동안 시스템은 맛있는 음식의 강박적인 선택을 촉진하고, 건강한 대안의 증상을 저해하며, 맛좋은 음식의 섭취가 예방 될 때 부정적인 감정 상태를 유발할 수 있습니다.
약물 중독과 유사한 비만 및 섭식 장애의 형태는 금단기 (즉, 금지 된 식욕을 돋우는 음식을 피하기위한식이 요법)와 재발 (예 : 강박, 때로는 통제 할 수없는 고혈압의 식사)을 반복하는 만성 재발 조건으로 개념화 할 수 있습니다. 맛좋은 결과에도 불구하고 계속되는 맛있는 음식)1). 입맛에 맞는 식품의 긍정적 인 강화 특성은 잘 알려져 있지만2, 3), 그들의 부정적인 보강 특성에 덜주의를 기울였다 (4-6), 즉 혐오 자극 (예 : 부정적인 감정 상태를 완화시키기위한 맛있는 음식물 섭취)에 의한 행동 반응의 확률 증가. 간헐적 인 약물 남용의 주기적 간헐적 인 순환은 "정서적 의존성"으로 점차적으로 갈수록 정서적 인 정점을 유지하기위한 더 높은 그리고 / 또는보다 규칙적인 양의 약물뿐만 아니라 중단시 부정적인 감정 상태를 유지할 필요성으로 관찰됩니다 약물 섭취량7, 8). 이러한 정서적 인 철수는 약물 사용을 계속하고 다시하는 부정적인 강화 특성을 통해 사용을 유지하고 재발을 동기 부여 할 수 있습니다 (7, 8).
extrahypothalamic corticotropin-releasing factor (CRF) 뇌 스트레스 시스템은 약물 사용에서 의존으로의 전환에 관련되어 있으며, 그 동안 학대 약물의 섭취는 이러한 긍정적 인 보강 메커니즘보다는 부정적인 메커니즘에 의해 점점 더 동기 부여됩니다. CRF는 알코올, 니코틴, 코카인, 아편 제, 암페타민 및 테트라 하이드로 칸 나비 놀을 포함한 모든 주요 약물 남용에 대한 금단 증상에 동기 부여 적으로 중요한 역할을합니다 (7, 8). 유사하게, 간식 성이 높고 맛이 좋은 음식에 대한 연장 된 접근의 반복 된 사이클은 약물 의존 모델에서 볼 수있는 것과 유사한 CRF 시스템의 신경 적응을 유도한다고 가정되었다 (4, 5, 9).
결과
맛좋은 음식에 대한 간헐적 인, 장기간의 접근은 맛좋은 음식을 이용할 수 없을 때 덜 선호되는 식단의 감소로 이어지고 재 접근시 맛있는 음식의 과식에 이르게됩니다 (10-12). CRF 가설을 검증하기 위해1 시스템은 이러한 수유 적응을 매개하는데, 수컷 Wistar 쥐 (n = 20)는 매주 매일 차우 식단 (Chow / Chow)을 제공 받았거나 5 일 (C 기)에 2 일 동안 자유롭게 먹을 수있게 제공되었으며 (X 단계) (P 단계) (Chow / Palatable ) ( 무화과 S1 다이어트 일정 및 무화과 S2 식이 섭취량과 체중에 대한식이 요법 일정에 대한 영향). 7 주간의 식사 사이클 후, 래트는 비 펩타이드 CRF1 수용체 길항제 R121919 (0, 5, 10 및 20 mg / kg, sc)13). 처리는 맛있은 규정 식에서 채식으로 전환하거나 식초에서 맛좋은 식단으로 전환하기 전에 1 h로 지정되었습니다. R121919은 용량 의존적으로식이 요법 섭취를 줄이고 Chow / palatable 쥐에서식이 섭취량을 증가시켰다 (Diet Phase × Diet Schedule × Drug Dose : F3,54 = 7.25, P <0.001), 차우 컨트롤의 섭취를 변경하지 않고. R121919는 맛있게 먹을 수있는 음식에 대한 접근이 재개되었을 때 매우 맛있게 먹는 식단의 섭취를 줄였습니다 (P 단계) (Fig. 1A). 독립적 인 테스트에서 CRF1 수용체 길항제는 입맛이 가중 된식이 (C 단계)에서 벗어난 차우 / 관절염 흰쥐에서 덜 맛있는 차우의 섭취를 증가시켰다 (Fig. 1B). 따라서, 차우 hypophagia와 맛있은 음식의 과식을 둔화시킴으로써, R121919는 섭취량 사이클링의 진폭을 감소 시켰습니다 (첫 번째 맛있는 P 단계 동안의 섭취와 C 단계에 대한 첫 번째 철수 사이의 차이 : 다이어트 일정 × 약물 투여 량 : F3,54 = 7.25, P <0.001) (Fig. 1C). CRF-CRF의 진보적 모집 지원1 시스템은 급성식이 요법에 의한 것이 라기보다는식이 병력에 의한 것이 었습니다. R121919은식이 요법에 단 한번 노출 된 후에도 맛있은식이 섭취량을 감소시키지 않았으며 맛좋은 음식에서 첫 번째 철수하는 동안 식욕 섭취를 늘리지 않았습니다무화과 S3).
간헐적 인 식욕을 유발하는 음식물에 대한 접근성을 일시적으로 중단하면 불안과 같은 행동이 증가 할 수 있습니다 (11). CRF 가설을 검증하기 위해1 (121919, 0 mg / kg, SC, 20-h 전처리)를 투여하고 고지 플러스 미로에서 피험자 간 디자인을 테스트 한 결과14), 5-9 h. 차량 처리 Chow / Palatable 쥐는식이 요법 사이클의 7 주에서 철수하는 동안 불안 발작과 같은 효과를 반영하여 chow-fed 대조군보다 개방 시간이 짧았다 (Fig. 2A), 단지 2 회의 회수 사이클 후에 아직 보이지 않는 효과 (무화과 S4). R121919 (20 mg / kg,식이의 과식과 과식을 조절하는 복용량)은 chow 대조군에서 플러스 미로 행동을 변화시키지 않는 용량으로 Chow / Palatable 쥐에 의한 열린 팔 탐험의 감소를 막았다. 다이어트 일정 × 복용량 : F1,43 = 7.25, P <0.02; Fig. 2좌파). R121919 투여는 닫힌 팔 입구로 측정 된 일반적인 활동을 변경하지 않았습니다. 따라서 R121919은 컨트롤의 행동을 변경하지 않고 간헐적으로 식욕을 돋우는 음식에 대한 접근을 중단하고 CRF를 모집한다는 제안과 함께 증가 된 불안과 유사한 행동을 차단했습니다1 시스템.
간헐적으로 식욕을 자극하는 음식물로의 접근을 중단하면 덜 선호하는 식단을 얻기위한 동기 부여 적자가 생기고, hypohedonic-like 행동의 잠재적 지표가된다 (10). 유사하게, 보강제의 점진적 비율 계획 (progressive-ratio schedule of reinforcement) 하에서 덜 선호되는 미각 강화제에 대한 반응은 이전에 마약 퇴치 동안 관찰 된 동기 적 결핍의 지표로 사용되었다15). CRF의 참여를 결정하기 위해1 우리는 R121919이 누진 률의 계획하에 덜 선호되는 음식을 얻기 위해식이 순환 된 쥐의 수행에 미치는 영향을 시험했다. 이전 조사 결과 확인 (10), 비히클 처리 Chow / Palatable 쥐는 덜 맛좋은 chow를 얻기 위해 노력하는 동기 부여가 감소하였고, 중단 점이 감소하고 Chow / Chow 쥐와 비교하여 방출 된 총 반응이 감소 함을 나타냈다.10()무화과 S5). R121919 전처리 (20 mg / kg, chow hypophagia 증가에 효과가있는 투여 량, 맛있은 음식 과다 식욕 감소 및 불안 발작과 같은 행동 감소)은 음식 컨트롤에 영향을주지 않는 용량으로식이 요법 순환 쥐에서 점진적 비율 성능의 결핍을 선택적으로 둔화시켰다 (중단 점 : 다이어트 일정 × 약물 : F1,15 = 8.17, P <0.02; 총 응답 : 다이어트 일정 × 약물 : F1,15 = 9.14, P <0.01; Fig. 2B, 왼쪽). R121919은 Postingestive 포화를 감소시킴으로써 Chow / Palatable 쥐에서의 수행을 촉진 시켰지만, R121919은 5 분만큼 빨리 반응하는 적자를 막았다 (Diet Schedule × Drug : F1,15 = 2.55, P <0.05) (Fig. 2B 권리). 따라서, CRF1 수용체 길항제는 간헐적 인, 고도로 맛좋은 음식에 대한 연장 된 접근으로부터 제거 된 동물에서 보이는 덜 바람직한 미각 강화제에 반응하는 진행성 비율의 동기 적 결핍을 둔화시켰다.
식욕을 유발하는 음식물로부터의 금단 현상이 스트레스 관련 비경막 CRF 시스템을 활성화시킬 수 있다는 가설을 검증하기 위해 편도선의 중심 핵에서 CRF mRNA와 펩타이드의 수준을 각각 정량적 실시간 PCR과 RIA로 측정했다. 쥐는 7 주 동안식이 요법을 반복하거나 먹이를 지속적으로 섭취했습니다. 마취와 목이 마비 된 후에 편도체의 중앙 핵으로부터 두뇌 펀치 (brain punch)가 수집되었다. Chow / Palatable 랫트에서 맛있은 음식을 철회하면 Chow / Chow 쥐와 비교하여 편도체의 중심 핵에서 CRF mRNA 발현이 5 배 증가했다 (Fig. 3A). 반대로, CRF mRNA는 맛좋은 음식에 대한 재 접근을 통해 대조군 수준으로 되돌아 갔다 (F2,19 = 6.97, P <0.01). 편도체의 중심핵에서 CRF mRNA 발현은 Chow / Palatable 쥐가 한 번만 순환되었을 때 변하지 않았으며 (Chow / Chow vs. Chow / Palatable : 5.5 ± 2.2 vs. 6.3 ± 1.7 ns), CRF-의 점진적 모집을 지원합니다. CRF1 시스템은식이 요법의 급성적 인 영향보다는식이 병력에 의한 것입니다. 또한, CRF mRNA 발현은 측위 핵, 전두엽 피질 또는 섬피 피질에서 변화하지 않았으며, 결과의 지역 특이성을지지했다 (무화과 S6). 흥미롭게도 CRF mRNA 발현은 시상 하부의 방실 핵 또는 순환 식 코르티코 스테로이드에서 Chow / Palatable rat에서 같은 철회 시점에서 관찰되지 않았다 (도 2 S6 및 S7), hypothalamic보다는 amygdalar의 변화가 CRF 스트레스 시스템이 행동 적응을 근본적으로 뒷받침한다는 가설을 제안했다. 더욱이, 맛있은 식단에서 제거 된 동물의 편도의 중심 핵에서 CRF 펩티드 면역 반응성은 먹은 동물에서보다 70 % 높았으나 맛있는 식단에 대한 접근으로 chow-fed 대조군 수준으로 돌아갔다 (F2,24 = 4.01, P <0.01) (Fig. 3B). 따라서, 맛있는 음식을 꺼내면 편도의 중심 핵에서 스트레스 관련 CRF 펩타이드 시스템이 활성화되어 약물 및 에탄올 회수 모델의 결과와 유사하게 나타납니다 (7, 8). 맛있을 수있는 음식에 대한 새로운 접근은 CRF 활성화가 불안과 관련되어있는 편도의 중심 핵에서 시상 하부의 CRF 시스템 활성화를 감소 시켰기 때문에16), 현재 결과는 또한 맛있은 음식이 금욕의 부정적 정서적 결과를 완화함으로써 음의 보강 성질을 획득 할 수 있음을 시사한다 (17).
맛좋은 음식에서 뽑힌 쥐가 CRF에 대한 민감성을 증가시킬 수 있다는 가설을 시험하기 위해1 에탄올 철수 동안 일어나는 편도체의 중심 핵에서의 γ- 아미노 부티르산 (GABA) 신호 전달의 길항제 조절18), 우리는 슬라이스 준비에서 편도 신경 세포의 중앙 핵의 GABA를 전송에 R121919의 효과를 조사했다. 수컷 Wistar 쥐 (n = 14)은 7 주 동안식이 요법으로 순환되었고 덜 맛있는 음식으로 바꾼 후에 희생되었다. 편도선 시냅스의 중심 핵에서의 기저 GABA 반응은식이 병력과 관련이 없었다 (n = 23 세포)를 자극하여 GABA 억제 후 postsynaptic potentials (IPSP)를 나타냅니다. 그러나, R20 (121919 μM)을 사용한 1 min superfusion은 유도 된 GABA의 더 큰 감소를 유도했습니다A-IPSP는 Chow / Palatable 랫드의 편도 신경 세포의 중심 핵에 존재한다 (M ± SEM : 30 ± 6 % n = 9 세포)보다 더 높았다 (M ± SEM : 12 ± 6 %, P 0.05 미만, n = 11 셀) (Fig. 4). 30 분 세척 기간 후, 두 그룹의 IPSP는 유사한 기준선 수준으로 돌아왔다. 따라서, 편도선 CRF-CRF의과 활성화와 일치하여1 에탄올 회수 중에 나타나는 시스템 및 효과 (18),식이 순환 된 래트는 CRF의 억제 효과에 대해 증가 된 민감성을 보였다1 수용체 길항제가 편도 GABA 반응성 전달의 중심 핵에 존재한다.
토론
총괄적인 결과는 맛있은 음식에 대한 간헐적이고 확장 된 접근의 역사가 스트레스 관련 시상 하부 CRF-CRF에서 진보적이고 동기 부여 적으로 관련된 신경 적응증을 유도한다는 기능적 증거를 제공합니다1 시스템. 특히, 선택적 CRF1 수용체 길항제 R121919은식이 순환 쥐의식이 요법에 차별적으로 그리고 선택적으로 영향을 미치고 정기적 인 음식 섭취를 늘리고 환자가 재 접근 할 때 맛있는 음식 섭취를 줄인다. CRF1 수용체 길항제는 또한 맛있은 식단에서 철수하는 동안 보였던 덜 선호되는 채소에 대한 반응에서 증가 된 불안과 같은 행동과 동기 적 결핍을 선택적으로 차단했다. 식이 요법에 대한 접근을 철회하면 편도의 중심 핵에서 CRF 유전자와 펩타이드 발현이 증가했으며, 이러한 접근은 새로운 접근으로 제거되었습니다. 또한,식이 순환 래트는 CRF의 억제 효과에 대한 민감도가 증가 함을 보여 주었다1 수용체 길항제가 편도체의 중심 핵에서의 GABA 작동 성 전달에 영향을 미치고, 편도선 CRF-CRF1 체계. 갱신 된 접근시 맛있은 음식의 과식은 방금 완료된 철수 기간의 증가 된 CRF 시스템 활성화, CRF의 증가 된 발현 및 CRF에 대한 전기 생리 학적 민감성으로 보여 질 수있다1 편도체의 중심 핵에서 수용체 봉쇄. CRF1 맛있은 음식 접근 바로 직전에 길항제 전처리가 처음에는 여전히 존재하는 CRF-CRF에 반대하는 것으로 해석된다1 탈퇴의 시스템 과잉. 치료받지 않은 동물에서 과식하는 과식 가능한 음식의 짧은 시간 경과 (10)은 현재 연구에서 볼 수 있듯이 맛이 좋은 음식에 대한 접근이 회복되면 CRF 펩타이드의 발현, 방출 및 효과가 정상화되는 시간 경과를 반영 할 수 있습니다. 따라서 간헐적으로식이 요법을하는식이를 섭취하면 뇌 보상 시스템에 알로 스테 틱 변화가 유발 될 수 있으며, 이는 보상 보상 CRF-CRF1 편도의 중심 핵에있는 체계.
이러한 결과는 강박 적 식습관뿐만 아니라 일반적으로 동기 부여에도 영향을 미칩니다. 헤도 닉 시스템의 반복 된 활성화는 두뇌에서 상대적인 과정을 유도했다 (즉, CRF 모집1 회로)를 포함하고, 이는 보상 전달 시스템에서 기능의 단순한 손실과 구별된다. 그러한 시스템 간 신경 적응 (19) 또한 모든 주요 약물 남용에 대한 전이 과정에서 발생합니다 (7, 8). 본 연구에서 비 약물 자극에 대한 일반화는 시간이 지남에 따라 쾌락 자극의 강도가 반복적으로 대조되는 개인에서 동기 부여 과정이 혼란스럽게 될 수 있음을 시사한다20). 적응 적으로, 그러한 과정은 음식을 추구하고 완성하는 행동을 에너지 밀도가 높고 보상이 높은 음식으로 전환 할 수 있으며, 에너지가 덜하고 보상이 낮은 음식 (또는 비 음식)을 얻기위한 노력을 평가 절하하는 한편, 채집 비용 (예 : 포식자 노출, 제한된 시간 및 에너지 자원). 그러나 오늘날의 환경에서 동일한 과정은 덜 맛있지 만 아마도 더 영양가있는 대안을 희생시키면서 비만을 촉진하는 음식 섭취를 유도 할 수 있습니다.
따라서 중독과 같은 CRF 변화1 시스템은 운전을 도울 수 있습니다 (i) 에너지가 풍부한 맛있는 음식 섭취, (ii)보다 건강한 대안의 소비를 줄이고, (III) 맛있는 음식에 대한 접근이 방지 될 때 발생하는 부정적 감정적 상태4, 5, 10-12, 17). CRF 시스템 활성화는 인간의 상태로 전환되어 비만 및 관련 섭식 장애뿐만 아니라 맛있은 음식에서 주기적 금욕의 다른 부정적인 동기 후유증을 유발할 수 있습니다.
재료 및 방법
과목.
수컷 Wistar 쥐 (n = 155, 180-230 g, 45 일 이전)을 찰스 리버로부터 얻었고 19 h : 10.5 h 역광 사이클 (8 × 12 × 12 인치)의 와이어 케이싱 플라스틱 케이지 (10 × 00 × 60 인치) : 22 h는 꺼짐), 습도 - (485 %) 및 온도 조절 식 (7012 ° C) 동물 사육장. 래트는 옥수수 기반의 설치류 음식 (Harlan Teklad LM-65 Diet 13 : 21 % (kcal) 탄수화물, 341 % 지방, 100 % 단백질, 신진 대사 에너지 1 cal / 85 g)과 23 주 실험 시작. 실험 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 국립 보건원 지침 (NIH 출판물 번호 1996-XNUMX, 개정 된 XNUMX) 및 "실험 동물 관리 원칙"(http://www.nap.edu/readingroom / bookslabrats) 스크립스 연구소 (Scripps Research Institute)의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다.
약제.
R121919은 문헌 [Chen et al. (21). R121919은 높은 친 화성 (Ki = 3.5 nM) 선택적인 CRF1 많은 다른 CRF보다 우수한 물리 화학적 성질을 갖는 길항제1 길항제 (예, logP 및 logD의 감소, 수용성 증가) (13). 시험을 위해 R121919을 1 M HCl (최종 부피의 10 %)에 먼저 가용화 한 다음 20 % (wt / vol) 2- 히드 록시 프로필 -β- 시클로 덱스트린 (Sigma-Aldrich)의 최종 비히클로 희석하여 NaOH에서 pH 4.5로. R121919 용액에 2 mL / kg의 부피로 sc (sc)를 투여했다.
광고 Libitum 다이어트 교대.
순응시킨 후, 래트를 이전 3-4 일 동안의 음식 섭취량, 체중 및 사료 효율에 맞는 두 그룹으로 나누었다. 한 그룹에는 주당식이 요법 ( "차우 (Chow)")이 주어졌고, 두 번째 그룹은 매주 7 일 동안 자유로웠다. 두 번째 그룹은 매주 5 일 동안 자유로웠다. , 초콜렛 맛을 낸 고 - 자당 식단 ( "Palatable", Chow / Palatable). 맛있는 식사는 영양가있는 완전 초콜렛 맛이 나는 높은 수크로오스 (2 % kcal), AIN-50A 기반 식단으로 다량 영양소 비율과 에너지 밀도가 식단과 비슷합니다 [TestDiet; 초콜렛 맛을내는 공식 76TUL : 5 % (kcal) 탄수화물, 66.8 % 뚱뚱한, 12.7 % 단백질, 물질 대사 가능한 에너지 20.5 kcal / g; 그 선호도를 높이기 위해 3.48-mg 정밀 식품 알약으로 제형 됨 (22, 23)]. 간단히하기 위해, 매주 첫 5 일 (chow 만)과 마지막 2 일 (실험군에 따라 chow 또는 palatable)은 C 및 P 단계로 모든 실험에서 참조됩니다. 식이 요법을 동시에 사용할 수 없었습니다. Chow 다이어트는 Harlan Teklad LM-485 다이어트 7012 [65 % (kcal) 탄수화물, 13 % 지방, 21 % 단백질, 대사 에너지 341 cal / 100 g] 또는 5- 4-g 압출 펠렛 [5 % (kcal) 탄수화물, 65.5 % 지방, 10.4 % 단백질, 대사 가능한 에너지 24.1 cal / 330 g; TestDiet]를 선택합니다. 이전의 연구와 마찬가지로, Harlan Teklad LM-100 chow를 먹이기 및 플러스 미로 상승 실험에 사용했습니다 (11), TestDiet 5TUM chow (10)를 진행성 비, CRF mRNA, CRF 펩타이드 함량, 코르티 코스 테론 RIA 및 전기 생리 학적 실험에 사용 하였다.
이전에 게시 된 것처럼10), 두 번째식이 요법과 관련하여 첫 번째 식단의 일일 섭취량 (kcal)의 백분율로 계산 된 상대식이 선호도는 다음과 같았다 : 5TUL 초콜릿 다이어트 (설탕 맛의식이 가능) 대 Harlan LM-485식이 (M ± SEM 선호도 90.7 ± 3.6 %) 및 5TUM 초식 (5TUM) 91.2TUM식이 요법 (M ± SEM 선호도 3.7 ± XNUMX %).
상승 된 플러스 미로.
승수 미로 시험은 Cottone et al. (24). Chow / palatable 랫트를 최소 7 주 동안식이 순환시킨 다음, 비히클 또는 20 mg / kg R121919 (-1 h, sc)로 전처리하고 맛이 좋은 식단에서 차우로 전환 한 후 5-9 h를 시험했다 (P → C 상). 차우 / 차우 (Chow / Chow) 대조 쥐를 피험자 간 디자인에서 동시에 시험 하였다n = 47). Chow 다이어트는 테스트 할 때까지 자유롭게 사용할 수있었습니다. 자세한 내용은 SI 텍스트.
식품 보강의 점진적 비율 계획.
식품 보강의 점진적 비율 계획은 Cottone et al. (10). 달리 명시되지 않는 한 동물들은 실험을 통해 가정집에 임의로 A / I chow (5 g extruded pellets)를 받았다. 식품 보강제는 45-mg chow 정밀 펠렛으로 압출 홈 케이지 음식과 조성이 동일합니다. 세션은 피험자가 14 분에 대한 비율을 완료하지 않았을 때 끝나고 마지막 완료 비율은 중단 점으로 정의됩니다. Chow / palatable 랫트는 적어도 7 주 동안식이 요법을 반복 한 다음 맛있은 식단에서 차우 (P → C 기)로 전환 할 때 R121919 (-1 h, sc)로 전처리 하였다. 차우 / 차우 (Chow / Chow) 대조 쥐를 피험자 간 디자인에서 동시에 시험 하였다n = 17). R121919 (0, 20 mg / kg 체중, SC)의 투약량은 피험자 내에서 2 회의 식사주기에 걸쳐 균형 잡힌 디자인으로 주어졌습니다. 자세한 내용은 SI 텍스트.
정량적 실시간 PCR.
쥐n = 20) 두 가지식이 조건 (매주주기의 7 일 및 5 일) 동안 7 주 동안식이 요법을하고, 마취하고, 목을 베었다. 뇌는 신속하게 제거되어 뇌 매트릭스에서 관상으로 슬라이스되었으며, 편도체의 중심핵, 축축 핵, 섬모 피질 및 전두엽 피질 펀치는 얼음처럼 차가운 단계에서 수집되었습니다. 동물 조직에서 RNA를 추출하기위한 표준 프로토콜을 사용하여 각 뇌 펀치에서 총 RNA를 준비했습니다. 총 RNA (1μg)는 제조업체의 지침에 따라 Oligo (dT) 20의 존재하에 역전사되었습니다. 정량적 RT-PCR 반응은 20μM 프라이머와 0.5mM MgCl을 사용하여 4μL 부피로 수행되었습니다.2. 결과는 이차 미분법에 의해 분석되었고 참조 유전자 CypA의 발현 수준으로 표준화 된 임의 단위로 표현되었다. 주어진 서열에 대한 모든 RT-PCR 반응은 동일한 작업 내에서 수행되었다. 자세한 내용은 SI 텍스트.
펩타이드 산 추출 및 CRF RIA.
쥐n = 25)을 최소 7 주 동안식이 순환시키고, 마취시키고, 두 가지식이 조건 (각 주간주기의 5 및 7) 동안 절단 하였다. 뇌를 신속하게 제거하고 뇌 매트릭스에서 관상 동맥으로 슬라이스하고, 편도체의 중심핵을 얼음으로 차게 한 단계에서 수집 하였다. 펩타이드 산 추출은 이미 확립 된 절차 (25). 조직 CRF 유사 면역 반응성은 Zorrilla et al.로부터 적응 된 민감하고 특정한 고상 RIA로 정량화되었다. (26). 자세한 내용은 SI 텍스트.
코르티 코스 테론 RIA.
쥐n = 12) 적어도 7 주 동안식이 순환되었고, 꼬리 혈액은 두식이 조건 (매주주기의 5 일 및 7 일) 동안 샘플링되었습니다. 코르티 코스 테론 유사 면역 반응성의 혈장 수준은 제조업체의 지침 (MP Biomedicals, Inc.)에 따라 시판되는 RIA 키트를 사용하여 결정되었습니다.26). 자세한 내용은 SI 텍스트.
전기 생리학 연구
슬라이스 준비.
편도체의 중앙 핵은 이전에 기술 된 바와 같이 준비되었다 (27, 28) 쥐에게서 (n = 7 / 그룹)을 섭취하였고, 마취가 가능하고 식욕을 잃은 음식에서 꺼내어 7-2을 처치 하였다. 뇌를 신속히 제거하고 3 % O로가 공된 얼음처럼 차가운 인공 뇌척수액 (aCSF)2 및 5 % CO2. 절편을 잘라내어 30 분 정도의 인터페이스 구성으로 배양하고 따뜻하게 가스 처리 된 aCSF로 완전히 수세하고 연속적으로 흘려 보냈습니다. superfusate에서 알려진 농도를 얻기 위해 원액으로부터 aCSF에 약물을 첨가했다. 사용 된 2-4 mL / min superfusion rate에서 약물 농도는 90 min 이내의 저장고 농도의 2 %에 도달합니다.
전기 생리학.
우리는 불연속 전압 또는 전류 클램프 모드를 사용하여 날카로운 micropipettes와 편도체 뉴런의 중심 핵을 기록했다. 우리는 휴지기 막 잠재력 근처에서 대부분의 뉴런을 유지했습니다. 전치 증폭기로 데이터를 수집하고 pClamp 소프트웨어를 사용하여 나중에 분석을 위해 저장했습니다. 약리학 적으로 분리 된 GABAA 수용체 매개 저해 postsynaptic 잠재력 (GABAA-IPSP)는 양극성 자극 전극을 통해 편도의 중심 핵 내에서 국소 적으로 자극함으로써 유발되었으며, 반면 글루타메이트 수용체 차단제 인 CNQX 및 APV 및 GABAB 수용체 차단제 CGP 55845A. 각 셀의 응답 매개 변수를 결정하기 위해 입출력 프로토콜을 수행했습니다. 최대 진폭을 이끌어 내기 위해 필요한 전압까지 IPSP를 끌어내는 데 필요한 임계 전류에서 시작하여 전류 범위가 적용되었습니다. 우리는 1-3 ×와 같은 단계 (임계 값, 최대 최대 값 및 최대 값)의 3 가지 자극 강도를 표준화했습니다. 과전류 및 탈분극 전류 단계 (200-pA 증가, 750-ms 지속 시간)도 전압 - 전류 (VI) 곡선을 생성하기 위해 적용되었습니다. Clampfit 소프트웨어를 사용하여 유발 된 IPSP 진폭과 VI 반응을 정량화했습니다. 모든 측정은 선택적인 CRF로 충수를 채우기 전에 이루어졌다.1 수용체 길항제 R121919 (1 μM), 그것의 superfusion 동안 (20 분), 그리고 다음 washout (30 분). 자세한 내용은 SI 텍스트.
통계.
그룹 비교는 학생의 t(2 그룹 비교) 또는 분산 분석 (ANOVA) (적어도 3 그룹 비교), 후자는 간단한 주 효과 분석 또는 뉴먼 - 쿨스 비교에 의해 상당한 옴니버스 효과 후에 해석 됨.P <0.05). 섭식 실험의 데이터는 개체 간 요인으로식이 일정을 사용하고 개체 내 요인으로 투여 량 및식이 단계를 사용하는 5 원 혼합 ANOVA로 분석되었습니다. 상승 된 플러스-미로 실험의 데이터는 개체 간 요인으로 다이어트 일정 및 용량을 사용하는 양방향 ANOVA로 분석되었습니다. 강화 실험의 점진적 비율 일정을 위해, 중단 점 및 총 반응은 개체 간 요인으로 다이어트 일정과 개체 내 요인으로 투여 량을 사용하는 양방향 혼합 ANOVA로 분석되었습니다. 처음 3.0 분 동안 반응하는 시간 과정은 개체 간 요인으로 다이어트 일정을 사용하고 개체 내 요인으로 용량 및 시간을 사용하는 4.0 원 혼합 ANOVA에 의해 분석되었습니다. 전기 생리 학적 연구의 데이터는 적절한 경우 반복 측정을 통해 개체 간 ANOVA 또는 개체 내 ANOVA로 분석되었습니다. 개체 간 요인으로 다이어트 일정과 개체 내 요인으로 다이어트 단계를 사용하여 양방향 혼합 ANOVA로 분석 한 코르티 코스 테론 RIA의 데이터입니다. 사용 된 통계 패키지는 Instat 11.0, Prism 11.5 (GraphPad), Systat XNUMX 및 SPSS XNUMX (SPSS)였습니다.
감사 인사.
Mike Arends는 행정 보조를 위해 Mary Gichuhi, 기술 지원을 위해서는 Bob Lintz, Jeanette Helfers, Stephanie Dela Cruz 및 Molly Brennan에게 감사드립니다. 이 연구는 국립 당뇨병 학회 및 소화기 및 신장 질환 보조금 DK70118, DK26741 및 P30DK56336에 의해 지원되었습니다. 약물 남용에 대한 국립 연구소 그랜트 DA023680; 알코올 남용 및 알코올 의존에 관한 국립 연구소 보조금 AA016731 및 AA015566; 국립 신경 장애 학회 및 뇌졸중 그랜트 IT32NS061847-01A2; 노화에 대한 국립 연구소 그랜트 AG028040; 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소 그랜트 HL088083; 엘리슨 의학 재단; 알콜 중독 및 중독 연구를위한 피어슨 센터. 이 연구의 일부는 국립 약물 남용 연구소 (National Institute for Drug Abuse)의 교내 연구 프로그램과 알코올 남용 및 알콜 중독에 관한 국립 연구소 (National Institute for Alcohol Abuse and Alcoholism)에 의해 지원되었습니다. 이것은 스크립스 연구소 (Scripps Research Institute)의 원고 번호 19807입니다.
각주
저자는 아무런 이해 상충을 선언하지 않습니다.
이 기사는 PNAS 직접 제출입니다.
이 기사에는 온라인에서 지원 정보가 들어 있습니다. www.pnas.org/cgi/content/full/0908789106/DCSupplemental.
참고자료
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