당뇨병 학. 2017; 60 (8) : 1502-1511.
온라인 2017 5 월 20 게시. doi : 10.1007/s00125-017-4305-4
PMCID : PMC5491592
코 주카 치사요,1 타다시 카나메,2 치구사 시미즈 - 오카베,3 타카야마 치토시,3 Masato Tsutsui,4 마사유키 마쓰시타,5 케이코 아베,6,7 및 히로아키 마사 자키
1
추상
목적 / 가설
식이 지방의 과식은 사람과 설치류에서 비만을 일으 킵니다. 인간과 설치류에 대한 최근의 연구에 따르면 지방 중독은 두뇌 보상 시스템의 기능 장애와 관련하여 알코올, 니코틴 및 마약 중독과 공통된 메커니즘을 공유하고 있음이 입증되었습니다. 고지 방식 (HFD)이 두뇌 보상 시스템의 중추적 인 조절자인 striatum에서 도파민 D2 수용체 (D2R) 신호를 약화시켜 쾌락 과식을 초래한다는 것이 강조되었습니다. 우리는 이전에 현미 특이 생리 활성 성분 인 γ- 오리자놀이 시상 하부 조절을 통한 HFD에 대한 선호를 약화 시켰다고보고했다. 따라서 우리는 γ- 오리자놀이 생쥐에서 뇌 보상 시스템의 기능을 조절할 가능성을 탐구했다.
행동 양식
HFD를 먹인 수컷 C57BL / 6J 마우스를 γ- 오리자놀로 구강 투여하고 D2R 신호 전달에 관여하는 분자의 선조체 수준을 평가했다. γ-oryzanol이 D2R promoter의 DNA 메틸화에 미치는 영향과식이 지방에 대한 선호도의 변화가 조사되었다. 또한, DNA 메틸 전이 효소 (DNMTs)의 강력한 억제제 인 5-aza-2'- 데 옥시 시티 딘이 음식 선호도, D2R 신호 및 선조체 내 DNMT 수준에 미치는 영향을 조사 하였다. DNMT의 활성에 대한 γ- 오리자놀의 억제 효과를 시험 관내에서 효소 적으로 평가 하였다.
결과
HFD를 먹인 생쥐의 줄무늬 체에서 D2R의 생산은 D2R의 프로모터 부위의 DNA 메틸화 증가를 통해 감소했다. γ- 오리자놀의 경구 투여는 DNMT의 발현 및 활성을 감소시킴으로써 선조체에서 D2R의 수준을 회복시켰다. 5-aza-2-deoxycytidine에 의한 DNMT의 약리학 적 억제는 또한식이 지방에 대한 선호도를 개선시켰다. 이러한 발견과 일치하여, 효소 적 시험 관내 분석은 γ- 오리자놀이 DNMT의 활성을 저해한다는 것을 입증했다.
결론 / 해석
우리는 γ- 오리자놀이 생쥐의 선조체에서 D2R의 프로모터 영역의 HFD- 유도 된 DNA과 메틸화를 개선한다는 것을 증명했다. 우리의 실험 패러다임은 γ- 오리자놀을 새로운 epigenetic 변조자인 별개의 특성을 가진 유망한 항 비만 물질로 강조합니다.
전자 보충 자료
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개요
비만 한 개인의 몫에서 과식하는 것은 적어도 부분적으로 알코올, 니코틴 및 마약에 중독 된 일반적인 메커니즘 [1]. 시상 하부와 호르몬의 식욕 조절뿐만 아니라 특히 뇌 기능 보상제 인 도파민 수용체 신호 전달은 중독성 또는 쾌락 성의 섭식 행동과 밀접한 관련이있다 [2]. 쥐에 대한 이전의 연구는 lentivirus-mediated short hairpin interfering RNA에 의한 선조체 도파민 D2 수용체 (D2R)의 녹다운이 중독과 같은 보상 적자와 강박적인 음식 찾기를 빠르게 유발한다는 것을 보여 주었다 [3]. 감소 된 D2R 밀도 때문에, 비만 한 선조체는 비만 한 인간과 설치류의 희박한 대조군에 비해 음식 보상에 덜 반응합니다 [3-5]. 이 개념에 따라, TaqIA 유전자의 대립 유전자 ANKK1 선조체 D2R 생성을 감소시키는 유전자좌 (DRD1 / ankyrin 반복 및 2을 함유하는 키나아제를 암호화 함)는 인간의 비만 표현형과 관련이있다 [6], bariatric 수술 후 체중 감소의 효과는 증가 된 선조체 D2R 밀도와 관련이있다 [7]. 이 자료는 비만 치료를위한 새로운 치료 표적으로서 선조체 D2R의 중요성을 강하게 시사한다. 그러나 뇌 보상 시스템에 영향을 미치는 일부 약물은 심각한 정신병 적 문제를 포함하여 상당한 부작용을 유발하여 결국 클리닉에서 철수하게되었습니다 [8].
후 성적 변형은 발달과 분화뿐만 아니라식이 및 생활 습관을 비롯한 환경 변화의 결과로 발생하기 때문에 중요합니다 [9]. DNA 메틸화는 유전자 발현의 안정성을위한 주된 후 성적 사건이다 [9]. 쥐에서는 고지방식이 요법 (HFD)에 대한 산모의 노출이 새끼의 중앙 보상 시스템 내에서 전 세대에 걸쳐 DNA 메틸화를 변화 시키므로 새끼에 의한 HFD의 과량 소비로 이어진다 [10]. 특히, DNA 메틸 전이 효소 (DNMT)는 섭식 행동과 신체 활동의 조절에 중요한 역할을한다 [10, 11], DNMT가 비만 - 당뇨병 증후군의 치료를위한 유망한 치료 표적이 될 수 있음을 시사한다. 중요한 것은 caffeic acid와 epigallocatechin을 포함한 일부 천연 식품 유래 물질이 DNMT 억제제 역할을하는 것으로 알려져 있습니다 [12, 13].
우리는 최근에 생리 활성 현미 성분 인 γ-oryzanol (ferulic acid ester와 여러 phytosterols의 혼합물)이 시상 하부 소포체 (ER) 스트레스의 감소를 통해식이 지방에 대한 선호를 약화 시킨다는 것을 보여 주었다 [14]. 생쥐와 토끼에서 경구로 투여 된 γ- 오리자놀은 장에서 빠르게 흡수되어 주로 뇌에 분포 하였다 [15, 16]. 이러한 결과를 종합 해 볼 때, 중추 신경계에 작용하는 천연 식품 유래 제품은 비만 환자의 영양 장애 행동을 안전하게 개선 할 수있는 대안이 될 수 있습니다. 이러한 맥락에서 우리는 γ- 오리자놀이 뇌 보상 시스템에서 DNA 메틸화 상태를 변화시켜 쥐에서 HFD에 대한 선호도를 약화시킬 것이라는 가설을 시험했다.
행동 양식
동물
Charles River Laboratories Japan (일본 가나가와)에서 얻은 57 주령 수컷 C6BL / 3J 마우스를 4 시간 / 24 시간 조명 아래 12 ° C에서 특정 병원체가없는 조건에서 수용했습니다 (케이지 당 12-8 개). 어두운주기. 5352 주일의 순응 후, 5718 주령 마우스를 체중을 맞추고 5943 ~ XNUMX 개의 그룹으로 나누어 각 실험을 수행했습니다. 생쥐는 음식과 물에 자유롭게 접근 할 수있었습니다. 모든 동물 실험은 류큐 대학 동물 실험 윤리위원회 (Nos. XNUMX, XNUMX, XNUMX)의 승인을 받았습니다.
γ- 오리자놀 및 5-aza-2'- 데 옥시 시티 딘의 투여
HFD에 대한 선호도를 평가하기 위해, 이전에 기술 된 바와 같이, 음식 선택 시험 동안 γ- 오리자놀 (와코 퓨어 케미칼 인더스트리 즈, 일본, 오사카)을 8- 주 된 마우스에 위관 영양법으로 투여 하였다 [14, 17]. 다른 실험에서는 12079 % γ-oryzanol을 함유 한 HFD (D0.4B; Research Diets, New Brunswick, NJ, USA)를 펠렛으로 제조했다. 식단의 구성 요소는 전자 보충 자료 (ESM) 표에 나와 있습니다. 1. 수유 12 주 후 선조체와 시상 하부에서 조직을 채취했습니다. 쥐의 평균 음식 섭취량으로부터 추정 된 γ-oryzanol의 일일 섭취량은 약 320 μg / g 체중이었습니다. γ-oryzanol의 용량은 이전에 설명한대로 결정되었습니다.14]. 5-aza-2'-deoxycytidine (5-aza-dC; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)을 0.25 주 동안 주 12 회 복강 주사 (XNUMX μg / g 체중) 하였다 [18].
식이 지방 선호도 추정
식이 지방에 대한 선호도를 평가하기 위해 음식 테스트를 통해 이전에 설명한대로식이와 HFD (D12450B 및 D12451; Research Diets)14]. 다이어트의 구성 요소는 ESM 표에 나와 있습니다. 1. 간단히 말해서, 마우스는 차우와 HFD에 자유롭게 접근 할 수 있도록했다. 차우와 HFD 섭취량을 매주 측정하고식이 지방 선호도의 변화를 분석했습니다. HFD 선호도는 다음 공식에 따라 계산되었습니다. HFD 선호도 = [(HFD 섭취량 / 총 음식 섭취량) × 100].
DNA methylation을위한 Bisulphite 시퀀싱
DNA는 DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Tokyo, Japan)를 사용하여 정제되었습니다. DNA 용액을 새로 준비한 3 mol / l NaOH와 혼합하고, 37 ° C에서 15 분 동안 인큐베이션하고 5.3 mol / l 요소, 1.7 mol / l 중아 황산나트륨 및 4.9 mmol / l 하이드로 퀴논에 첨가했습니다. 용액을 15 ° C에서 95 초 동안 30 회 변성시키고 50 ° C에서 15 분 동안 배양 하였다 [19]. Kapa HiFi HotStart Uracil + ReadyMix PCR 키트 (KAPA Biosystems, Woburn, MA, USA)를 사용하여 PCR로 증폭시키고 D2R의 프로모터 영역의 CpG 부위 주변의 프라이머 . 프라이머 서열은 다음과 같다 : 정방향 프라이머, 5'-GTAAGAATTGGTTGGTTGGAGTTAAAA-3 '; 역방향 프라이머, 5'-ACCCTACCCTCTAAAACCACAACTAC-3 '. 다음으로, Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, CA, USA)를 사용하여 어댑터 서열을 첨가하고 정제 하였다. 샘플을 풀링하고 GS Junior (Roche Diagnostics, Tokyo, Japan)에로드하여 제조자의 프로토콜에 따라 시퀀싱 하였다. 메틸화 수준은 모든 시토신 잔기에서 메틸화 된 시토신의 백분율로 나타내었다.
DNMT 활성 분석
DNMT 효소 활성 분석은 EpiQuik DNA Methyltransferase Activity / Inhibition Assay Kit (Epigentek Group, Brooklyn, NY, USA) 및 EPIgeneous Methyltransferase Assay kit (Cisbio Japan, Chiba, Japan)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 수행되었습니다.
DNA 메틸화에 대한 각 화합물의 저해 활성을 평가하기 위해, S-아데노 실 -20- 호모시스테인 (SAH)은 각 화합물 (스크리닝 분석을 위해 XNUMXμmol / l)의 존재하에 측정되었으며, S-아데노 실 메티오닌 (SAM; 10μmol / l) 및 DNMT 기질 (4ng / μl), 37 ° C에서 90 분 동안. Michaelis-Menten 역학을 평가하기 위해 DNMT1 (20μmol / l)을 γ-oryzanol, SAM (5μmol / l) 및 표시된 농도의 poly dI-dC와 함께 37 ° C에서 90 분 동안 배양했습니다. DNMT3a (100μmol / l) 및 DNMT3b (100μmol / l)를 γ-oryzanol, SAM (5μmol / l) 및 표시된 농도의 poly dG · dC와 함께 37 ° C에서 120 분 동안 배양했습니다. 분석은 0.75 회 수행되었다. 추출 된 단백질 (5 mg / ml)을 SAM (5 μmol / l), poly dI-dC (5 μg / ml) 및 poly dG · dC (40 μg / ml)와 함께 120 ° C에서 XNUMX 분 동안 배양하고 SAH 형성이 측정되었습니다.
에스트로겐 관련 수용체 -γ 활성 분석
에스트로겐 관련 수용체 -γ (ERRγ)에 대한 γ- 오리자놀의 잠재적 인 길항 활성은 제조업체의 프로토콜에 따라 인간 에스트로겐 관련 수용체 감마 리포터 분석 시스템 (INDIGO Bioscience, State College, PA, USA)을 사용하여 평가되었습니다. 간단히 말해서, 활성 ERRγ를 구성 적으로 발현하는 비인간 포유류 리포터 세포를 각 화합물의 표시된 농도에 24 시간 동안 XNUMX 회 노출시켰다.
웨스턴 블 랏팅
이것은 이전에 기술 된 [20] D2R (1 : 500, 토끼), 도파민 수송 체 (DAT; 1 : 500, 토끼), 티로신 하이드 록 실라 제 (TH; 1 : 1000, 토끼) (AB5084P, AB1591P 및 AB152, Merck Millipore, Billerica, MA, USA), 신호 변환기 및 전사 활성 자 3α (STAT3α; 1 : 1000, 토끼), DNMT1 (1 : 1000, 토끼), DNMT3a (1 : 1000, 토끼) (번호 8768, 5032 및 3598; Cell Signaling Technology, 일본 도쿄), DNMT3b (1μg / ml, 토끼), ERRγ (1 : 1000, 토끼) 및 β- 액틴 (1 : 10,000, 마우스) (ab16049, ab128930 및 ab6276; Abcam, Cambridge, MA, USA).
정량 실시간 PCR
유전자 발현은 이전에 기술 된 바와 같이 조사되었다 [14]. mRNA 수준은 Rn18s (18S rRNA). 정량적 실시간 PCR 분석에 사용 된 프라이머 세트는 ESM 표 2.
통계 분석
데이터는 평균 ± SEM으로 표현됩니다. 일원 분산 분석 및 반복 측정 분산 분석에 이어 다중 비교 테스트 (Bonferroni–Dunn 방법)가 해당되는 경우 사용되었습니다. 재학생 t 테스트는 두 그룹 간의 차이를 분석하는 데 사용되었습니다. 차이점은 p <0.05.
결과
5-aza-dC에 의한 DNMT의 약리학 적 억제는 생쥐에서식이 지방에 대한 선호를 약화시켰다
HFD를 먹인 생쥐에서 선조체의 D2R의 프로모터 부위의 DNA 메틸화는 음식을 먹은 생쥐와 비교하여 유의하게 증가 하였다 (Fig. (그림 .1a) .1에이). 반면에, D2R의 프로모터 영역에서의 시상 하부 DNA 메틸화는 식습관 하에서 줄무늬 체에서의 것보다 명백하게 더 높았다 (p <0.01) (그림. (그림 .1a, 1a, f) HFD에 의해 변경되지 않았다. (그림 .1f) .1에프). HFD를 먹인 마우스에서 선조체의 D2R의 프로모터 영역에서 증가 된 DNA 메틸화는 강력한 DNMT 억제제 인 5-aza-dC로 정상화되었다 (Fig. (그림 .1a) .1에이). 대조적으로, 시상 하부의 D2R의 프로모터 영역에서의 DNA 메틸화는 5-aza-dC로 처리함으로써 유의 적으로 변화하지 않았다. (그림 .1f) .1에프). 20 주 동안 HFD를 먹인 12 주령 수컷 마우스의 선조체에서 D2R의 mRNA와 단백질 수준이 현저하게 감소했습니다 (그림 XNUMXa). (그림 .1b, 1b, k, l). 대조적으로, 도파민 D1 수용체 (D1Rs, Drd1)는 adenylyl cyclase 및 cAMP 매개 성 세포 내 신호 전달에 대한 D2Rs와는 반대되는 방식으로 변화하지 않았다 (Fig. (그림 .1c) .1기음). 또한 mRNA 및 / 또는 단백질 수준에서 TH 및 DAT와 같은 D2R 신호 전달과 관련된 다른 분자의 수준에는 변화가 없었다 (Fig. (그림 .1d, 1d, e, k, m). 한편, 시상 하부에서는 D2R을 포함하여 명백한 변화가 관찰되지 않았다 (Fig. (그림 .1g-m) .1g-m). 주목할 만하게, 시상 하부의 D2R과 TH의 단백질 수준은 striatum의 그것보다 훨씬 낮았다. (도 11, 1l, m)아마도 시상 하부에 비해 뇌 보상 시스템에서 도파민 수용체 신호 전달의 상대적 중요성을 반영합니다.
D2R의 프로모터 부위의 DNA 메틸화가식이 지방 선호도를 변화시키는 지 여부를 조사하기 위해 5-aza-dC 처리 마우스의 섭식 행동을 분석했습니다. 예상대로, 5-aza-dC는 HFD를 먹인 마우스의 선조체에서 D2R의 mRNA와 단백질 수준을 유의하게 증가시켰다 (Fig. (그림 .1b, 1b, k, l). 반면에, 수준에 영향을 미치지 않았다. Drd1, Th 및 Slc6a3 (DAT를 암호화하는) 선조체에서, 또는 Drd2, Drd1, Th 및 Slc6a3 시상 하부에서 (Fig. (도 1c-e, 1c-e, g-m). 비히클 처리 된 마우스가 HFD를 선호하는 반면, HFD에 대한 선호도는 5-aza-dC- 처리 마우스에서 유의 적으로 감소 하였다 (비히클 - 처리 된 마우스에 대한 값의 88 %). (그림 .1n) .1엔). 결과적으로, 5-aza-dC로 처리하면 체중 증가가 감소했다 (Fig. (그림 .11영형).
γ-oryzanol은 HFD를 먹인 생쥐의 줄무늬 체에서 DNMT 수치를 감소시킨다.
우리가 이전에보고했듯이 [14gavage에 의한 수컷 마우스에 γ- 오리자놀의 경구 투여는 HFD (비히클 - 처리 된 마우스에 대한 값의 93 %)에 대한 선호를 현저하게 감소시켰다 (도 1). (도 2a), 2a), 체중 증가의 겉보기 감쇠를 초래한다 (Fig. (그림 .2b) .2비). 따라서 우리는 striatum에서 D2Rs의 epigenetic 변조에 γ - oryzanol의 잠재적 인 영향을 탐험.
포유 동물에는 세 가지 주요 DNMT-DNMT1, 3a 및 3b가 있습니다. DNA 메틸화를 유지하는 DNMT1 기능, DNMT3a 및 3b가 de novo DNA 메틸화를 촉진하는 역할을 함 [21]. 생체 내에서 DNMT에 대한 γ- 오리자놀의 잠재적 영향을 조사하기 위해 HFD를 먹인 생쥐의 뇌에서 DNMT의 수준을 평가했습니다. HFD 그 자체는 striatum이나 시상 하부에서 DNMT의 mRNA와 단백질 수준에 아무런 영향을 미치지 않았지만, γ- oryzanol을 보충하면 striatum에서는 DNMT의 수준이 유의하게 감소했지만 시상 하부에서는 그렇지 않았다 (Fig. (도 2c-e, 2c-e, g-1, k-n)를 생성한다. 이러한 데이터는 γ- 오리자놀이 줄무늬 특이 적 방식으로 DNMT의 수준을 조절할 가능성을 높입니다. 비슷한 방식으로, 5-aza-dC는 striatum에서 DNMT3a와 3b의 mRNA 수준을 유의하게 감소시켰다 (ESM Fig. 1광고).
DNMT1의 mRNA 수준이 적어도 부분적으로 핵 수용체 ERRγ에 의해 긍정적으로 조절된다는 이전의 연구에 기초하여 [22]에서 ERRγ 활성에 대한 γ- 오리자놀의 잠재적 효과를 조사했다. 활성 ERRγ를 구성 적으로 발현하는 비 - 인간 포유 동물 세포에서, ERRγ의 강력한 역작용 제인 4- 하이드 록시 타목시펜은 ERRγ 활성을 현저하게 감소시켰다. 주목할 점은 γ- 오리자놀은 ERRγ 활성을 부분적으로 감소시켰다 (원래 값의 약 40 % 감소). (그림 .3a) .3에이). 중요한 것은 ERRγ가 striatum에서는 높게 발현되었지만 시상 하부에서는 그렇지 않았다 (Fig. (그림 .3b-d) .3b-d). striatum에 대한 상황과는 달리 γ- oryzanol은 시상 하부에서만 DNMT1의 단백질 수준을 유의하게 증가시켰다 (Fig. (그림 .2k, 2k, l). 이러한 결과는 적어도 부분적으로 DNMT3 수준의 양성 조절 인자 인 STAT1α [23]는 시상 하부에서 풍부하게 발현되었지만 선조체에서는 그렇지 않았다 (Fig. (그림 .33e-g).
생체 내에서 DNMT의 활성에 대한 γ- 오리자놀의 영향을 더 평가하기 위해 HFD를 먹은 γ- 오리자놀 처리 마우스에서 DNA 메틸화의 부산물 인 SAH의 형성과 DNMT의 강력한 억제제를 평가했다. HFD 사료와 쥐를 먹인 생쥐 사이의 선조체 또는 시상 하부에서 SAH 형성에 유의 한 변화는 없었다 (Fig. (도 .2f, 2f, j). 현저하게, γ-oryzanol은 줄무늬 체에서 SAH 형성을 유의하게 감소시켰다 (Fig. (Fig.2f) 2f) 시상 하부에는 없다. (Fig.2j), 2j), 이는 γ- 오리자놀이 HFD- 공급 쥐에서 줄무늬 특이 적 방식으로 DNMT의 활성을 억제 할 수 있음을 시사한다.
체외에서 DNMT에 대한 γ- 오리자놀의 억제 특성에 대한 효소 분석
우리는 체외에서 DNMT의 활동에 대한 γ- 오리자놀의 영향을 다음으로 평가했다. γ-oryzanol, ferulic acid, 5-aza-dC, haloperidol (대표적인 D2R 길항제), quinpirole (대표 D2R agonist) 및 DNHT에 대한 SAH의 억제 효능을 평가 하였다. 양성 대조군으로서 SAH는 용량 의존적으로 DNMT의 활성을 강하게 약화시켰다 (Fig. (그림 .4a-f) .4a-f). 예상대로, haloperidol과 quinpirole은 DNMT의 활성에 영향을 미치지 않았다 (ESM Fig. 2). 현저하게, γ- 오리자놀은 DNMT1 (IC50 = 3.2μmol / l), 3a (IC50 = 22.3μmol / l) 및 3b (최대 억제 57 %) (그림. (그림 .4d-f) .4d-f). 대조적으로, γ- 오리자놀의 대사 산물 인 페룰 산의 억제 활성은 γ- 오리자놀의 대사 활성보다 훨씬 낮았다. (그림 .44d-f).
우리는 DNMTs에 대한 γ- 오리자놀의 억제 성질을 더 조사했다. 체외에서 DNMT에 대한 γ- 오리자놀의 억제 활성을 평가하기 위해 SAH의 형성을 측정 하였다. DNMT 매개 DNA 메틸화 동안의 SAH 형성에 대한 데이터는 γ- 오리자놀의 존재 및 부재 모두에 대한 마이클리스 - 멘텐 (Michaelis-Menten) 동역학의 포화 가능 패턴을 나타낸다 (Fig. (그림 .4g-i) .4미군 병사). DNMT1 매개 DNA 메틸화에서, Eadie-Hofstee 분석은 γ- 오리자놀이 V 최대 SAH 형성 (비히클, 597 pmol / min; γ-oryzanol 2 μmol / l, 619 pmol / min; γ-oryzanol 20 μmol / l, 608 pmol / min), γ-oryzanol은 K m (차량, 0.47 μg / ml; γ-oryzanol 2 μmol / l, 0.67 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.89 μg / ml) (그림 .4j) .4j). 이러한 결과는 γ- 오리자놀이 적어도 부분적으로 경쟁적으로 DNMT1을 억제한다는 것을 시사한다. 반면에, DNMT3a- 및 3b- 매개 DNA 메틸화의 경우, γ- 오리자놀은 V 최대 SAH (DNMT3a : 비히클, 85.3 pmol / min; γ-oryzanol 2 μmol / l, 63.1 pmol / min; γ-oryzanol 20 μmol / l, 42.5 pmol / min; DNMT3b : 비히클, 42.3 pmol / min; γ -oryzanol 2 μmol / l; 28.0 pmol / min, γ-oryzanol 20 μmol / l, 15.0 pmol / min) 및 유사하게 K m 이 반응에 대해 (DNMT3a : 비히클, 0.0086 μg / ml; γ- 오리자놀 2 μmol / l, 0.0080 μg / ml; γ- 오리자놀 20 μmol / l, 0.0058 μg / ml; DNMT3b : 비히클, 0.0122 μg / ml; γ- oryzanol 2 μmol / l, 0.0097 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.0060 μg / ml) (그림. (그림 .4k, 4k, l). 이러한 결과는 γ- 오리자놀이 적어도 부분적으로 비 경쟁적 방식으로 DNMT3a 및 3b를 억제한다는 것을 시사한다.
γ-oryzanol은 HFD를 먹인 쥐의 줄무늬 체에서 D2R의 수치를 증가시킨다.
우리는 다음으로 γ- 오리자놀이 DNMT의 억제를 통해 선조체 D2R 함량을 증가시킬 가능성을 시험했다. HFD를 먹인 생쥐에서 γ- 오리자놀의 경구 투여는 D2Rs의 프로모터 부위에서 선조체 DNA 메틸화를 유의하게 감소시켰다 (Fig. (도 5a), 5a), 시상 하부에서는 그렇지 않았다. (그림 .5f) .5에프). 이러한 결과에 따라 D2R의 mRNA와 단백질 수준은 상호 증가되었다 (Fig. (그림 .5b, 5b, g, k, l). 5-aza-dC로 처리 한 데이터와 유사합니다 (그림. (Fig.1), 1), RNA 및 단백질 수준에 대한 뚜렷한 효과는 없었다 Drd1, Th 및 Slc6a3 (striatum)에서의 DAT (DAT) 및 Drd1, Th 및 Slc6a3 시상 하부에서 (Fig. (도 5c-e, 5c-e, h-k, m).
이전의 연구에 따르면 D2R과 DNMT1의 수준은 적어도 부분적으로 NF-κB를 통해 ER 응력과 염증에 의해 조절된다는 것이 밝혀졌습니다 [17, 24, 25]. 따라서 우리는 ER 스트레스 관련 유전자와 염증 관련 유전자의 수준을 조사했다. 이전에 입증 된 바와 같이 [26], HFD는 TNF-α를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시켰다 (Tnfa), 단핵구 화학 유인 물질 단백질 -1 (MCP-1) (Ccl2), C / EBP 동종 단백질 (절단), ER- 국소화 된 DnaJ 4 (ERdj4) (Dnajb9) 및 X-box 결합 단백질 1의 스 플라이 싱 된 형태 (Xbp1s)는 시상 하부에서는 있지만 striatum에서는 그렇지 않다 (Fig. (그림 .6) .6). 특히, HFD를 γ- 오리자놀로 보충하면, Ccl2, 절단, Dnajb9 및 Xbp1s 배타적으로 시상 하부에서는 나타나지만 줄무늬 체에서는 그렇지 않다 (Fig. (그림 .66).
토론
본 연구의 주요 발견은 γ- 오리자놀이 생쥐의 선조 세포에서 강력한 DNMT 억제제로서 작용함으로써 선조체 D2R의 후성 조절을 통해 HFD에 대한 선호를 적어도 부분적으로 약화시키는 것이다. HFD를 먹인 생쥐의 줄무늬에서는 D2R의 수치가 유의하게 감소하는 반면, D1R, TH 및 DAT의 수치는 변화가 없었다. (도 1b-e, 1b-e, k-m)을 생성한다. 이 데이터는 선천성 D2R의 조절 장애가 HFD에서 음식 보상의 인식에 중요한 역할을한다는 것을 의미하며, 비만 동물에서 HFD의 쾌락 과소 소비로 이어진다 [3]. 본 연구에서 HFD를 먹인 생쥐를 5-aza-dC로 처리하면 선조체 D2R의 수준이 유의하게 증가했다 (Fig. (그림 .1b, 1b, k, l) D2R의 프로모터 영역에서의 DNA 메틸화 수준의 감소를 통해 가능하다. (도 1a), 1a), 결과적으로식이 지방에 대한 선호를 약화시켰다 (Fig. (그림 .1n) .1엔). 이 발견은 또한 HFD에서 음식 보상의 인식에서 선조체 D2Rs의 중요한 역할을 지원합니다.
우리의 in vitro 분석은 DNMT에 대한 γ- 오리자놀의 억제 활성이 대사 산물 인 ferulic acid의 것보다 명백하게 더 강력 함을 보여 주었다. (도 .4d-f), 4d-f), 이는 DNMT에 대한 억제 작용에 대한 γ- 오리자놀의 완전한 구조의 중요성을 시사한다. HFD 사료 마우스에서 경구 투여 후 γ- 오리자놀은 완전한 구조로 뇌에 도달하고 줄무늬 체에서 DNMT의 수준과 활성을 우선적으로 감소 시키며 결과적으로 프로모터 부위의 DNA 메틸화가 감소 함을 시사한다 선조체의 D2R. 또한, 우리의 시험 관내 연구는 γ- 오리자놀이 주로 DNMT1 생산에 대한 양성 조절 자로 작용하는 ERRγ에 대한 부분적 길항제로서 작용한다는 것을 증명했다 [22], 결과적으로 DNMT1의 활성은 감소 하였다 (Fig. (그림 .3a) .3에이). 주목할 점은 ERRγ가 striatum에서는 높게 발현되었지만 mice에서는 시상 하부에서는 그렇지 않았다 (Fig. (그림 .3b) .3비). 이러한 데이터는 γ- 오리자놀은 적어도 부분적으로 ERRγ의 저해를 통해 DNMT1의 mRNA 수준을 감소시킬 수있는 가능성을 제시한다. striatum과는 달리, γ- 오리자놀은 HFD를 먹인 생쥐의 시상 하부에서 D2R의 수준에 영향을 미치지 않았다 (Fig. (그림 .5g, 5g, k, l).
반면에, 우리는 γ- 오리자놀이 시상 하부에서 DNMT1의 수준을 유의하게 증가 시켰지만 선조체에서는 그렇지 않음을 보여 주었다. (그림 .2k, 2k, l). STAT3은 악성 T 림프종 세포에서 DNMT1의 함량을 증가시키는 것으로 나타났습니다 [23]. 특히 우리는 이전에 γ- 오리자놀이 HFD를 먹인 생쥐에서 시상 하부에서 렙틴에 의한 STAT3 인산화를 유의하게 증가 시켰다는 것을 증명했다 [14]. 또한 STAT3α는 시상 하부에서 실질적으로 발현되었지만 생쥐의 선조체에서는 나타나지 않았다는 것을 유의해야한다 (Fig. (그림 .3e-g) .3e-g). 이러한 데이터는 우리가 시상 하부와 striatum 사이 DNMT1의 수준에 γ - oryzanol의 효과의 명백한 차이가 적어도 부분적으로 마우스의 뇌에서 STAT3α 및 ERRγ의 지역 특정 콘텐츠에 기인 한 것으로 추측하도록 유혹합니다 ( 무화과. (그림 .3b-g) .3b-g). 총체적으로 생쥐의 줄무늬와 시상 하부 사이에 ERRγ와 STAT3α의 상호 패턴이있는 것으로 보인다. 따라서 우리의 결과를 토대로, ERRγ 생산이 풍부한 striatum에서 γ- oryzanol은 ERRγ의 음성 조절 인자 인 DNMT1의 mRNA 수준과 효소 활성을 우선적으로 감소시킬 수 있다고 추측하는 것이 합리적이다. 대조적으로, 시상 하부에서 STAT3α 생산이 우세한 경우, γ- 오리자놀은 DNMT1의 수준을 우선적으로 증가시킬 수있다.
최근 연구에 따르면 HFD에 의해 유도 된 선조체 D2R 신호 전달의 감쇠가 수유 거동을 조절하지 못한다는 것이 밝혀졌다 [3], 비만 치료를위한 선조체 DNMT의 억제의 잠재적 중요성을 제시한다. 반면에, 이전의 연구는 특정 시상 하부 핵에서 발현 된 melanocortin 수용체 4 유전자의 DNA 메틸화 상태가 agouti 생존 가능한 황색 마우스의 전이 형태의 비만을 조절할 수 있다는 가능성을 보여 주었다 [27]. 근본적인 기전을 밝히기위한 추가 연구가 필요하지만,이 연구는 HFD로 인한 비만의 병태 생리학에서 조직, 유전자 및 서열 특이 적 DNA 메틸화의 중요성을 시사한다.
우리는 최근 HFD가 쥐의 췌장 섬에서 D2R의 수준을 증가 시킨다고보고했다 [17, 24]. D2R의 프로모터 영역에 몇 가지 NF-κB 반응 요소가 있기 때문에 이러한 증가는 NF-κB를 통한 ER 스트레스와 염증에 의해 부분적으로 중재 될 가능성이있다 [17, 24]. 또한, 최근 연구에 따르면 TNF-α와 IL-1β가 HFD를 먹인 생쥐의 지방 조직에서 DNMT1의 수준과 활성을 증가시키는 것으로 나타났습니다 [25]. 중요하게, 본 연구는 HFD가 시상 하부에서 ER 스트레스와 염증을 우선적으로 유도 하였지만 striatum에서는 그렇지 않음을 보여 주었다. (그림 .6) .6). 우리의 실험 패러다임에서 조직, 부위 및 부위 특이 적 DNA 메틸화 및 탈 메틸화에 대한 심층적 인 메커니즘이 추가 조사를 기다려야합니다.
γ- 오리자놀이 생쥐에서 ER 스트레스의 시상 하부 조절을 통해 HFD에 대한 선호를 약화 시킨다는 것을 보여주는 우리의 이전 보고서와 함께 [14], γ- 오리자놀은 또한 섭식 행동의 쾌락 성 및 대사성 불일치를 완화시키는 독특한 성질을 나타낸다. 개발 된 일부 항 비만 약물은 심각한 부작용을 일으키는 것으로 알려져 있기 때문에 [8], 뇌 보상 시스템에 대한 자연 식품 기반 접근법은 비만 - 당뇨병 증후군을 안전하게 치료할 것으로 기대된다 [16]. 이 패러다임에서, γ- 오리자놀은 후 성적 변조기라는 별개의 특성을 가진 유망한 항 비만 후보 물질이다.
감사의 글
우리는 원고를 검토 한 S. Okamoto (일본 류큐 대학)에게 감사드립니다. 히라 타 (M. Hirata), 카네시로 (Kaneshiro), 아사토 (I. Asato) 및 노구치 (C. Noguchi, 일본 류큐 대학) 비서직에 감사드립니다.
약어
| 5-aza-dC | 5-aza-2'- 데 옥시 시티 딘 |
| D1R | 도파민 D1 수용체 |
| D2R | 도파민 D2 수용체 |
| DAT | 도파민 운반체 |
| DNMT | DNA 메틸 전이 효소 |
| ER | 소포체 |
| ERR | 에스트로겐 관련 수용체 |
| HFD | 고지방 다이어트 |
| 사흘 | S- 아데노 실 -1- 호모 시스테인 |
| SAM | S- 아데노 실 메티오닌 |
| STAT3α | 신호 변환기 및 전사 활성화 제 3α |
| TH | 티로신 히드 록 실라 제 |
노트
데이터 가용성
현재 연구 중에 생성 및 / 또는 분석 된 데이터 세트는 합리적인 요청으로 해당 작성자에게 제공됩니다.
기금
이 연구는 일본 학술 진흥회 (JSPS, 가흥 보조금 15K19520 및 24591338), 과학 기술 혁신위원회 (CSTI), 각료 사 전략 혁신 촉진 프로그램 (SIP) '차세대 농림 수산 기술', 롯데 재단, 일본 원자력 연구소, 신 에너지 산업 기술 진흥기구 (NEDO), 생명 과학 네트워크 형성 사업 (Okinawa Prefecture, Japan) 및 일본 오키나와 현의 의학 클러스터링 추진 프로젝트 (Okinawa Prefecture, Japan)와 함께 오키나와 현 (Okinawa Prefecture)으로부터의 보조금을 받았다.
관심의 이중성
저자는이 원고와 관련된 관심의 이중성이 없다고 선언합니다.
기부금 명세서
CK와 HM이 연구를 설계했습니다. CK와 TK는 실험을 수행하고 데이터를 분석했다. TK, CS-O, CT, MT, MM 및 KA는 데이터의 해석에 기여했습니다. CK와 HM이 원고를 썼다. 모든 저자는 데이터 해석에 기여했습니다. 모든 저자는 원고를 수정하고 최종본을 승인했습니다. HM은이 저작물의 보증인이며 모든 데이터에 대한 완전한 액세스 권한을 가지며 데이터 무결성 및 데이터 분석의 정확성에 대한 전적인 책임을집니다.
각주
전자 보충 자료
이 기사의 온라인 버전 (doi : 10.1007 / s00125-017-4305-4)에는 피어 리뷰를 포함하지만 편집되지 않은 보충 자료가 포함되어 있으며 이는 인증 된 사용자가 사용할 수 있습니다.
참고자료
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