전방 내분비놀(로잔). 2017; 8 : 216.
온라인 2017 Aug 29 게시. doi : 10.3389 / fendo.2017.00216
PMCID : PMC5581815
추상
산모가 에너지 밀도가 높은 음식을 섭취하면 어린이의 비만 위험이 높아집니다. 이는 쾌락적 특성 때문에 소비되는 맛있는 음식의 과소비와 관련이 있습니다. 주산기 산모의 식단과 자손의 지방 선호를 연결하는 기본 메커니즘은 아직 잘 알려져 있지 않습니다. 이 연구에서 우리는 임신과 수유 동안 산모의 고지방/고당 식이요법[서구식 식단(WD)]이 출생부터 성성숙까지 쥐 새끼의 섭식을 조절하는 보상 경로에 미치는 영향을 연구하는 것을 목표로 합니다. 우리는 세 가지 중요한 기간(어린 시절, 청소년기, 성인기)에 WD 및 대조 자손에 대한 종단적 추적 조사를 수행하고 (i) 지방 선호도, (ii) 유전자 발현 프로파일에 대한 주산기 노출이 맛있는 식단에 미치는 영향을 조사하는 데 중점을 두었습니다. 및 (iii) 중변연계 도파민 네트워크의 신경해부학적/구조적 변화. 우리는 주산기에 제한된 WD 수유가 항상성 및 쾌락 뇌 회로의 조직에 분명하고 오래 지속되는 영향을 미치지만 지방 선호에는 영향을 미치지 않는다는 것을 보여주었습니다. 우리는 특정 뇌 분자 특성과 상관 관계가 있는 지방 선호의 특정 진화를 입증했습니다. WD를 먹인 댐의 자손에서 우리는 어린 시절에 도파민(DA) 시스템과 관련된 주요 유전자의 더 높은 발현과 관련된 지방 선호의 존재를 관찰했습니다. 청소년기에는 두 그룹 모두에 대한 고지방 선호가 WD 그룹에 대한 3일 테스트 동안 점진적으로 감소했으며 WD 그룹의 DA 시스템에 관련된 주요 유전자의 발현 감소와 관련되어 이를 보호하기 위한 보상 메커니즘을 제안할 수 있습니다. 추가적인 고지방 노출로부터; 마지막으로 성인기에 지방에 대한 선호는 대조군 쥐와 동일하지만 γ-아미노부티르산 네트워크, 세로토닌 수용체 및 폴리시알산-NCAM 의존 시상하부 리모델링과 관련된 주요 유전자의 심오한 변형과 관련이 있었습니다. 종합적으로, 이러한 데이터는 주산기에 국한된 산모의 WD가 섭식 행동과 관련된 시상하부 항상성 및 보상 경로의 강력한 리모델링이 발생했음에도 불구하고 나중에 에너지 항상성과 지방 선호도에 지속적인 영향을 미치지 않는다는 것을 보여줍니다. 이러한 회로 리모델링의 관련성을 이해하려면 추가 기능 실험이 필요합니다.
개요
초기 생활 환경과 사건은 이제 나중에 인생의 건강과 질병 소인에 기여하는 것으로 잘 알려져 있습니다.1-3). 대사 각인의 개념은 주산기 동안 영양 및 호르몬 환경의 변화가 어떻게 자손에게 나중에 비만 및 이와 관련된 병리를 유발하는 경향이 있는지 설명하기 위해 제안되었습니다. 우리 서양 생활 방식의 중요한 문제는 에너지 밀도가 높은 음식을 섭취한 결과로 인한 영양 과잉입니다. 실제로, 산모가 이러한 종류의 음식을 섭취하는 개인은 비만과 대사증후군이 발생할 위험이 더 높습니다.4, 5). 많은 연구에서 임신과 젖먹이를 통한 산모의 고지방식(HFD)이 자손의 신진대사에 장기적인 영향을 미치는 것으로 나타났습니다.6-8). 대사 조절과 관련된 경로 외에도 뇌 보상 시스템도 섭식 행동에 중요한 역할을 합니다.9, 10). 보상과 중독의 맥락에서 집중적으로 연구된 중변연계 도파민(DA) 신경전달은 두 인간 모두에서 식이 유발 비만에서 변화됩니다.11-13) 및 동물 (14-16). DA 예측은 대부분 출생 후 발달합니다(17), 따라서 이들의 발달은 초기 식단에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 지난 몇 년 동안 설치류를 대상으로 한 실험에서는 어미의 HFD 섭취가 자손의 쾌락적 섭식을 향상시킨다는 사실이 입증되었습니다.18, 19). 이 관찰에는 DA 시스템 기능의 일부 변경이 포함되었지만(20-22), 개체 발생과 초기 생애 동안 보상 경로의 리모델링에 관한 제한된 데이터를 이용할 수 있습니다(21). 또한 GABA(γ-아미노부티르산) 시스템과 같은 보상 시스템의 비DA 신호 전달 부분이 주산기 영양 스트레스에 의해 영향을 받을 수 있는지 여부와 방법이 문서화되어 있지 않습니다. 실제로 GABA 뉴런은 보상과 혐오에 중요한 역할을 하는 것으로 보입니다. 복부피개영역(VTA) GABA 뉴런은 서로 다른 뇌 영역으로부터 유사한 패턴의 입력을 받습니다.23), 그리고 최근의 광유전학 기반 행동 연구는 조건화된 장소 혐오에서 VTA GABA의 주요 역할을 강조합니다(24) 그리고 완전한 행동에 대한 보상(25). 측좌핵(NAc)은 주로 GABA성 중간 가시 뉴런의 투영으로 구성되며 변연계에서 발생하는 신호를 통합하여 이를 동작으로 전환하는 변연-운동 인터페이스 역할을 합니다. 를 통해 복부 담창(VP) 및 기타 운동 효과기로의 출력(26). 그리고 마지막으로 LH의 수많은 GABA 연결로 구성되는 시상하부(27) 및 아치형 핵은 배고픔과 포만감의 신호를 통합합니다 (10).
이 연구는 태어날 때부터 성적으로 성숙할 때까지 쥐의 모체 서양식 식단(WD) 섭취가 (i) 지방 선호도에 미치는 영향, (ii) DA 시스템, GABA성 시스템 및 시상하부 가소성의 유전자 발현 프로파일에 미치는 영향을 확인하는 것을 목표로 합니다. , 그리고 (iii) 같은 기간 동안 중변연계 도파민 네트워크의 신경해부학적/구조적 변화에 대해. 따라서 우리는 종단적 연구(이유, P25부터 성적 성숙, P45 및 성인기, P95까지)에서 이유 후 정기적인 먹이를 섭취하는 자손의 체중 증가 및 지방 조직 발달에 대한 산모의 WD의 영향을 평가했습니다. 동시에 우리는 지방 선호도 테스트를 수행한 후 음식 섭취, 선택 및 동기 부여 규제 시스템에 대한 마커 선택에 대한 전용 전사체 분석 및 후속 주성분 분석(PCA)을 수행했습니다. 우리의 결과는 DA 시스템의 영양 프로그래밍에 초점을 맞춘 최근 결과를 크게 강화했습니다.
재료 및 방법
윤리 강령
모든 실험은 지역 동물 복지 위원회, EU(지침 2010/63/EU), Institut National de la Recherche Agronomique(프랑스 파리) 및 프랑스 수의학과(지침 XNUMX/XNUMX/EU)의 지침에 따라 수행되었습니다.A44276). 실험 프로토콜은 기관 윤리 위원회의 승인을 받았으며 APAFIS 8666 참조로 등록되었습니다. 각 일련의 실험에 사용되는 스트레스와 동물의 수를 최소화하기 위해 모든 예방 조치가 취해졌습니다.
동물과 다이어트
동물은 음식과 물을 사용하여 12 ± 12°C에서 22시간/2시간 명/암 주기로 유지되었습니다. 광고 무제한. 임신 240일(G290)에 1마리의 암컷 Sprague-Dawley 쥐(체중: 1-5g)를 Janvier(프랑스 Le Genest Saint Isle)에서 직접 구입했습니다. 그들은 개별적으로 수용되었고 임신 기간과 수유 기간 동안 0마리에게는 대조 식단(CD)(16% 쇠고기 지방과 21% 자당)을 먹였고 30마리에게는 WD(16% 쇠고기 지방과 XNUMX% 자당)를 먹였습니다. (표 참조 Table1 : 1: 네덜란드 ABdiet Woerden의 다이어트 구성(kcal 백분율). 출생 시 한배 새끼 수는 수컷 대 암컷 비율이 1:1로 한배당 12마리의 새끼로 조정되었습니다. 우리는 각 그룹당 수컷 16마리와 암컷 4마리로 구성된 한 배의 어미 4마리 중 21마리를 키웠습니다. 이유(PXNUMX) 시 CD 및 WD 어미에서 태어난 새끼는 실험이 끝날 때까지 표준 사료를 먹였습니다(그림 (그림 1A,B).1A, B). 새끼의 체중은 출생 시부터 기록되었으며 그 이후에는 P10(이유)까지 매일 오전 00시에 기록되었습니다. 젖을 뗀 후 실험이 끝날 때까지 21일마다 쥐의 체중을 측정했습니다. 우리는 남성 자손에 대해서만 데이터를 제시합니다. 암컷 쥐는 또 다른 연구에 사용되었습니다(그림 (그림 11).
행동(XNUMX병 선택 테스트)
세 가지 중요한 발달 기간이 연구되었습니다(P21~P25: 청소년, P41~P45: 청소년기, P91~P95: 청년기). 수컷 새끼 24마리(n = 그룹당 12개)을 무작위로 선택하여 개별 케이지에 배치하여 XNUMX병 선택 무료 테스트를 수행했습니다(그림 (그림 1A,B)1A,B) (28-30). 본 시험은 지방맛에 대한 매력을 단맛과 분리하고 칼로리 섭취에 따른 대사효과를 최대한 분리하여 구체적으로 연구하기 위해 사용되었다. 실제로 1% 옥수수유 용액 소비는 0.09kcal/ml만 섭취하는 것과 관련이 있습니다. 2개의 병이 있는 상태에서 하루 동안 습관화시킨 후 P25에서는 4일, P41과 P91에서는 XNUMX일에 걸쳐 시험을 진행하였다(그림 (그림 1A) .1ㅏ). 구체적으로 이유시(P21)에는 24마리의 새끼를 2일 동안 개별적으로 사육하였다(그림 (그림 1A):1A): 1일차, 습관화 단계, 2일차, 쥐에게 1% 잔탄검에 0.3% 옥수수유를 섞은 에멀젼(Sigma Aldrich, St. Quentin Fallavier, France)과 잔탄검 용액(Sigma Aldrich, St. Quentin Fallavier, France) 중에서 0.3병을 자유롭게 선택할 수 있도록 했습니다. 41%). P91 및 P24에서는 1마리의 새끼가 사용되었으며 11일 연속으로 00병 무료 선택이 제안되었습니다. 잔탄검 용액과 미각 용액(옥수수유 3%)의 소비량을 45일 동안 매일 오전 95시에 기록했습니다(P24 및 PXNUMX). 위치 선호 편향을 방지하기 위해 두 병의 위치가 매일 반전되었습니다. 지방 선호도 점수는 XNUMX시간 동안 소비된 총 부피에 대한 소비된 "지방 용액" 부피의 비율로 계산되었습니다. 모든 쥐는 행동 테스트 전반에 걸쳐 표준 식단을 유지했습니다.
조직 수집 및 혈액 샘플링
XNUMX병 자유 선택 테스트 마지막 날 다음 날, 쥐의 절반(n = 그룹당 6마리)는 CO에 의해 오전 09시에서 00시 사이에 급속히 안락사되었습니다.2 흡입. 혈액을 EDTA(Laboratoires Léo SA, St Quentin en Yvelines, France) 튜브에 수집하고 2,500°C에서 원심분리했습니다. g 15°C에서 4분 동안. 혈장은 -20°C에서 동결되었습니다. 장기와 개별 후복막 지방 저장소를 해부하고 무게를 측정했습니다. 뇌를 신속하게 제거하여 뇌 매트릭스(WPI, Sarasota, FL, USA 쥐 300-600g)에 넣었습니다. 먼저 시상하부를 해부했습니다[Paxinos의 아틀라스 좌표에 따라: Bregma에서 -1.0 ~ -4.5mm(31)] 그런 다음 각 쥐에 대해 NAc 수준에서 2mm 두께의 두 개의 관상 절편과 VTA 수준에서 또 다른 하나를 얻었습니다. 두 개의 서로 다른 생검 펀치(Stiefel Laboratories, Nanterre, France)(NAc의 경우 직경 4mm, 직경 3mm)를 사용하여 오른쪽 및 왼쪽 NAc와 오른쪽 및 왼쪽 VTA 샘플(동물당 총 80개의 샘플)을 신속하게 얻었습니다. 복부 중뇌의 경우). 샘플을 액체 질소에 급속 냉동하고 TaqMan 저밀도 어레이(TLDA)를 통한 유전자 발현의 후속 측정을 위해 -XNUMX°C에 보관했습니다.
다른 쥐들(n = 그룹당 6명)을 펜토바르비탈(150 mg/kg ip)로 깊게 마취시키고 경심 생리 식염수 관류 후 얼음처럼 차가운 4% 파라포름알데히드(pH 7.4) 인산 완충액(PB)을 주입했습니다. 뇌를 신속하게 제거하고 동일한 고정액에 1°C에서 4시간 동안 담근 후 최종적으로 25% PB 수크로스에 24~48시간 동안 보관했습니다. 그런 다음 뇌를 -60°C의 이소펜탄에서 동결시키고 최종적으로 사용할 때까지 -80°C에서 보관했습니다. NAc, 시상하부 및 VTA는 저온 유지 장치(Microm, Microtech, Francheville, France)를 사용하여 20μm 연속 관상 섹션으로 절단되었습니다. 각 뇌 영역에 대해 10~4개의 섹션을 포함하는 6개의 유리 슬라이드로 구성된 200~XNUMX개의 시리즈가 수행되었습니다. 각 유리 슬라이드에 대해 직렬 섹션의 간격은 XNUMXμm입니다(그림 (그림 66).
생화학적 혈장 분석
P25, P45 및 P95 쥐에서 수집된 EDTA 혈장을 사용하여 혈장 포도당, NEFA(비에스테르화 지방산), 인슐린 및 렙틴을 측정했습니다. 포도당과 NEFA는 특정 키트(포도당 및 NEFA PAP 150 키트, BioMérieux, Marcy-l'Etoile, 프랑스)를 사용한 비색 효소 반응을 사용하여 측정되었습니다. 인슐린 및 렙틴에 대한 제조업체의 지침(쥐/마우스 인슐린 ELISA 키트, 쥐 렙틴 ELISA 키트, Linco Research, St. Charles, MO, USA)에 따라 특정 ELISA 키트를 사용하여 호르몬을 분석했습니다.
면역 조직 화학
일련의 VTA 및 NAc 섹션이 포함된 유리 슬라이드를 먼저 3~4시간 동안 차단한 후 다음 항체의 혼합물과 함께 4°C에서 밤새 배양했습니다: 마우스 항-NeuN(1:500; IgM; Millipore Bioscience Research Reagents, Merk, 미국) 및 토끼 항-TH(1:1,000; Millipore Bioscience Research Reagents, Merk, USA). 488차 항체와 함께 배양한 후 PB로 세척한 후 섹션을 568차 항체의 혼합물에서 배양했습니다: Alexa 1 접합 당나귀 항-마우스 IgM 및 Alexa 500 접합 당나귀 항-토끼 IgG(2:XNUMX; Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham) , MA, USA) XNUMX시간 동안. 절편을 superfrost plus gold 슬라이드(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)에 장착하고 공기 건조시킨 후 ProLong™ Gold 안티페이드 시약(Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)으로 커버슬립했습니다.
VTA의 TH 뉴런 수
각 쥐에 대해 TH 양성 세포는 이전에 설명한대로 계산되었습니다 (32) VTA의 세 가지 서로 다른 rostrocaudal 수준에서: 세 번째 신경의 출구 수준(Bregma에 대한 거리: -5.3mm), 이 수준의 입쪽 200μm 및 꼬리 200μm(그림 (그림6A).6ㅏ). 왼쪽과 오른쪽의 경우, NanoZoomer-XR 디지털 슬라이드 스캐너의 40배 배율을 사용하여 액세서리 터미널 관에서 중뇌의 측면 경계까지 전체 VTA로 구성된 디지털 사진을 얻었습니다. C12000 (일본 하마마츠). 각 섹션의 VTA 주변에 선이 그려졌습니다. 경계는 세포의 모양을 조사하고 Paxinos와 Watson 지도책을 참조하여 선택되었습니다. 도파민성 뉴런은 핵이 명확하게 보이는 NeuN(+)/TH(+) 면역반응 세포체로 정의되었습니다. NIH Image J 소프트웨어(세포 계수기 플러그인)를 사용하여 NeuN(+)/TH(+) 세포는 동물 그룹에 대한 지식이 없는 두 명의 다른 사람에 의해 계산되었습니다. 분할 셀 계산 오류는 Abercrombie의 공식을 사용하여 수정되었습니다(32), 어디서 N = n[t/(t + d)] (N = 총 셀 수; n = 계산된 셀 수; t = 단면 두께; 그리고 d = 셀 직경), 이 보정 계수는 0.65입니다. 데이터는 평균 [왼쪽 및 오른쪽 VTA의 NeuN(+)/TH(+)] ± SEM으로 표시됩니다.
TH 섬유 밀도(NAc)
NAc의 도파민 신경 말단의 TH 단백질 함량은 TH 면역표지된 부분의 해부학적 농도계 분석에 의해 추정되었습니다. TH 섬유 밀도는 NAc(Bregma 2.20, 1.70 및 1.20mm)의 rostrocaudal 축을 따라 세 가지 임의 수준에서 정량화되었습니다(그림 (Figure6B) .6비). 간단히 말하면, NanoZoomer-XR 디지털 슬라이드 스캐너의 40배 확대를 사용하여 얻은 전체 선조체와 NAc로 구성된 디지털화된 사진입니다. C12000 (일본 하마마츠 소재)을 획득하였다. 주어진 NAc에 대해 전체 핵 주위에 선을 그려 광학 밀도(OD) 측정 영역을 정의했습니다(그림 (Figure6B) .6비). 얻은 값은 NIH Image J 소프트웨어를 사용하여 동일한 단면의 뇌량(TH 면역화학에 대해 염색되지 않은 영역)에 그려진 원형 영역에서 측정된 OD 값으로 정규화되었습니다. 데이터는 OD 비율(XNUMX개 섹션의 말뭉치에 있는 NAc/OD 값의 OD 값) ± SEM의 평균으로 표시됩니다.
TLDA 및 TaqMan을 통한 유전자 발현
NucleoSpin RNA/단백질 키트(Macherey-Nagel, Hoerdt, France)를 사용하여 스냅 냉동 NAc, VTA가 풍부한 샘플 및 시상하부로부터 RNA를 분리했습니다. 제조업체의 지침에 따라 총 RNA를 DNase 분해에 제출하고 양을 260/280 nm UV 흡광도로 추정하고 Agilent 2100 Bioanalyzer System을 사용하여 품질을 평가한 다음 RNA 무결성 지수(RIN)를 계산했습니다. RIN이 8 미만인 샘플은 폐기되었습니다. 총 RNA 10 마이크로그램을 고용량 RT 키트(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 총 XNUMX µl의 cDNA로 역전사시켰습니다.
이전에 설명한대로 (33), TLDA는 384개의 동시 실시간 PCR이 수행될 수 있는 384웰 미세유체 카드입니다(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). 우리는 가소성 및 음식 섭취 조절과 관련된 다양한 유전자군을 다루기 위해 특별히 설계된 TLDA를 사용했습니다. 각 맞춤형 카드는 2 x 4 반응 챔버를 포함하는 2 x 48 샘플 로딩 라인으로 구성되었습니다(참조: 96a). 92개 유전자 세트(표 S1 보충 자료) 및 18개의 하우스키핑 유전자(2S, Gapdh, Polr7900a 및 Ppia)를 연구했습니다. 실시간 PCR은 Life Technologies TaqMan 시약을 사용하여 수행되었으며 ABI Prism 2.3HT 서열 검출 시스템(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)에서 실행되었습니다. 원시 형광 데이터는 SDS XNUMX 소프트웨어(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 PCR을 통해 수집되었으며, 기준선과 임계값을 자동으로 결정하여 임계값 사이클 Ct를 추가로 생성했습니다. 비정상적인 PCR 실행을 구별하기 위해 ThermoFisher 클라우드 앱(ThermoFisher, USA)을 사용하여 필터링한 후 샘플당 어세이는 다음과 같습니다. n = 6 (n = P5에서 WD 그룹의 경우 25). 그런 다음 상대 정량을 위해 ThermoFisher Cloud App(ThermoFisher, USA)을 사용하여 데이터를 분석했습니다. 유전자 발현(RQ)의 상대 정량화는 방정식 RQ = 2를 사용하는 비교 Ct 방법을 기반으로 했습니다.-ΔΔCt여기서 하나의 유전자 표적에 대한 ΔΔCt는 교정기 샘플에서 빼고 내인성 대조군으로 표준화된 자체 Ct 변이입니다. 정확하게 geNorm 알고리즘(ThermoFisher Cloud App RQ, ThermoFisher, USA)을 사용하여 가장 안정적인 하우스키핑 유전자를 결정했습니다. 10개의 하우스키핑 유전자 중에서 Gapdh는 NAc와 시상하부의 내인성 대조군으로 정의되었고, VTA의 경우 Ppia는 분석된 세 기간의 모든 샘플에 해당되었습니다. 유전자 발현의 그래픽 표현은 CD 그룹에 비해 유전자 발현의 XNUMX% 증가에 대해 하나의 색상을 할당하도록 수동으로 설계되었습니다. 비모수 Wilcoxon 부호 순위 테스트를 사용한 유의미한 변동은 별표로 표시되었습니다.
통계 분석
결과는 표와 그림에서 평균 ± SEM으로 표시됩니다. Mann-Whitney 비모수적 테스트는 면역조직화학에서 얻은 다양한 시점의 체중, 지방 선호도 및 OD 비율 분석에 사용되었습니다.
3일간의 지방 선호도의 중요성을 평가하기 위해 우리는 매일 열 통계 분석을 수행했습니다. 각 그룹에 대해 비모수 Wilcoxon의 부호 순위 테스트를 사용하여 지방 용액 및 대조 용액의 소비를 테스트했습니다. 선호도 평균값을 가상값 50%(빨간 점선)와 비교했습니다. 빨간색 별표로 상당한 변화가 나타났습니다. qPCR RQ 값 분석에 동일한 테스트를 사용했습니다. 평균 RQ 값을 가상 값 1과 비교했습니다. 유의미한 변동은 별표로 표시되었습니다(그림 (그림 44).
혈장 샘플 분석을 위해 비모수적 Mann 및 Whitney 테스트를 수행했습니다. TH 양성 세포의 수는 양방향 ANOVA로 분석되었으며 p 값이 계산되었습니다. 구현된 테스트의 다양성으로 인해 Bonferroni는 사후 수정은 이 테스트 후에만 적용되었습니다. 통계 분석은 Prism 6.0 소프트웨어(GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA)를 사용하여 수행되었습니다.
감독되지 않은 PCA는 데이터 세트의 일반 구조를 시각화하기 위해 각 뇌 생검 펀치(VTA, NAc 및 시상하부)에 대해 서로 다른 시점에서 130개의 매개변수(TLDA, 행동 및 혈장 데이터)에 대해 처음 수행되었습니다(즉, XNUMX개의 글로벌 PCA 시점별로). PCA는 투영된 데이터의 분산이 하위 공간에서 최대화되도록 데이터를 저차원 선형 공간에 직교 투영하는 것으로 정의할 수 있습니다. 먼저 발현되지 않거나 약간 발현되는 유전자를 걸러냈습니다(그림 (그림 5) .5). CD 공급 댐과 WD 공급 댐의 자손에 대한 값은 개별 PCA 플롯에서 서로 다른 색상으로 나타나 이 두 실험 그룹이 감독되지 않은 PCA 구성 요소에 의해 잘 분리되어 있는지 시각화합니다. 이 분석은 두 자손 그룹 간에 차별적으로 발현되는 유전자 그룹을 분리합니다. 그 후, 가소성(세포 부착, 세포골격, 신경영양 인자, 시냅스 생성 및 전사 조절), DA 경로, GABA성 경로, 후생적 조절자(히스톤 데아세틸라제 및 히스톤 아세틸 트랜스퍼라제)와 같은 다양한 mRNA 마커 클러스터에 집중된 PCA가 수행되었습니다. 이러한 집중된 PCA를 통해 산모의 식단과 일부 마커 간의 상관관계 및 특정 가족 유전자 간의 상관관계를 동시에 시각화할 수 있습니다. PCA 및 집중 PCA 분석을 위해 정성적 척도가 사용되었습니다. +++: 매우 우수한 분리; ++: PCA 분리의 반대쪽에 쥐 한 마리가 있는 양호한 분리; +: 두 마리의 쥐(각 그룹당 한 마리)가 반대쪽에 있는 매우 좋은 분리, -: 명확한 분리가 없음.
결과
체중과 성장
임신 중(G1에서 G21까지) 모체의 WD 섭취는 출생 시 새끼의 체중에 영향을 미치지 않았습니다(그림 (그림 2) 2) (CD: 6.55 ± 0.07g 대 WD: 6.54 ± 0.05g p = 0.9232) (수치 (그림 2A,B).2A, B). 출생부터 이유까지의 체중 증가는 CD 댐에서 태어난 자손보다 WD 댐에서 태어난 자손에서 21% 더 높았으며, WD 댐에서 태어난 자손의 이유 시 체중이 상당히 높았습니다(36.19 ± 0.90 g 대 47.32 ± 1.48 g). p <0.001) (그림 (Figure2C) .2씨). 젖을 떼는 순간부터 실험이 끝날 때까지(P95), 쥐에게 표준 사료를 먹였고 체중은 CD 댐 자손보다 WD 댐 자손의 경우 더 높게 유지되었습니다. 세부사항: 청소년기(P39) (그림 (그림 2A,D),2A,D), CD: 176.8 ± 3.3g 대 WD: 192.2 ± 3.3g p = 0.0016 및 P93(청년)에서(그림 (그림 2A,E)2A,E) CD: 478 ± 9.9g 대 WD: 508.6 ± 10.3g p = 0.0452.
다양한 기간의 호르몬 및 대사 지표
혈장 렙틴, 인슐린, 포도당 및 NEFA 농도는 P25, P45 및 P95에서 측정되었습니다. 모든 연령대에서 WD 자손의 혈장 포도당, NEFA 및 렙틴 수준은 CD 자손과 통계적으로 다르지 않았습니다(표 (테이블 2,2, n = 그룹당 6개). 우리는 P25에서만 WD를 먹인 댐의 자손에서 지방 침착(후복막 지방 질량 비율)이 크게 증가하는 것을 관찰했습니다(p = 0.0327, Mann 및 Whitney 테스트).
이유식부터 성인기까지의 지방 선호도에 대한 주산기 WD의 영향
지방 선호도에 대한 WD의 영향을 조사하기 위해 우리는 성장 중 세 가지 다른 시점에서 25병 선택 패러다임을 사용했습니다. 이 테스트는 섭취로 인한 대사 효과를 최대한 피함으로써 지방 맛에 대한 선호도를 구체적으로 연구하는 데 사용되었습니다. 우리는 병의 "추가" 칼로리 섭취량(P45, P95 및 PXNUMX에서)의 차이가 통계적으로 유의하지 않다는 것을 보여주었습니다. 그룹 간(그림 S1보충 자료의 A–C). 더욱이 1% 옥수수유 용액 소비의 차이로 인해 WD 쥐의 경우 P1에서 칼로리가 25% 증가하고(WD: 4.9% 대 CD: 섭취된 칼로리의 3.9%) P0.5에서 CD 쥐의 경우 45%(WD: 2% 대 CD: 섭취된 칼로리의 2.5%) (수치 S1보충 자료의 D–F). P25에서 CD 댐의 새끼는 지방을 선호하지 않습니다(44.87 ± 9.8%, p = 0.339); 반대쪽 WD 쥐에서는 지방을 선호합니다(75.12 ± 8.04%, p = Wilcoxon 부호 순위 테스트에 따른 0.039, 빨간색 별표). 게다가 두 그룹 사이에는 통계적으로 차이가 있습니다. p = 0.0347(Mann 및 Whitney 테스트, 검정색 해시 태그)(그림 (그림 33에이).
P45와 P95에서 두 그룹은 지방에 대한 선호도가 상당히 높았습니다. 즉, 이론치인 50%와 크게 다릅니다(P45에서, CD: 80.68 ± 2.2%). p = 0.0005 및 WD: 78.07 ± 3.25% p = 0.0005; P95에서 CD: 74.84 ± 8.4% p = 0.0425 및 WD: 69.42 ± 8.9% p = Wilcoxon 부호 순위 테스트에 따른 0.109, 빨간색 별표)(그림 (그림 3A) .3ㅏ). 두 그룹의 값은 맛 발표 하루 후(P45에서) 구별할 수 없었습니다. p = 0.7857 및 P95에서 p = 0.9171 Mann-Whitney 검정) (그림 (그림 33에이).
시간이 지남에 따라 쥐가 지방 소비를 어떻게 조절하는지 알아보기 위해 우리는 P45와 P95에서 XNUMX일 연속 지방 제시를 반복했습니다(그림 (그림 3B,C).3기원전). 흥미롭게도 P45에서는 WD 댐의 수컷만이 지방 용액에 대한 선호도를 점차 잃었습니다(그림 (그림 3B) 3B) (셋째날: 53.12 ± 8.36% p = Wilcoxon 부호 순위 테스트에 따른 0.851). 그러나 P95(성인 연령)에서는 모든 동물이 3일간의 테스트 동안 진화가 없는 지방을 선호했습니다(그림 (그림 33기음).
요약하면, 이 모델에서 우리는 초기 단계(어린 시절)에서 청소년기 동안 시간이 지남에 따라 점진적인 무관심과 함께 WD 댐을 먹인 쥐의 지방에 대한 선호를 관찰했습니다. 우리는 성인기에 두 그룹의 쥐 사이에 차이가 없음을 관찰했습니다.
시상하부 및 보상 경로에서 뇌 가소성과 GABA 회로 리모델링의 분자적 특성
임신 및 수유 중 산모의 WD 섭취가 자손의 시상하부 및 보상 경로에 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위해 우리는 뇌 가소성, 뇌 모델링 및 음식 섭취 및 후성유전과 관련된 신경 회로 마커의 몇 가지 주요 요소의 상대적 발현을 측정했습니다. 규제 기관. 우리는 TLDA를 사용하여 다양한 뇌 영역(즉, 시상하부, VTA 및 NAc)에서의 풍부함을 분석했습니다(표 S1 보충 자료에서) 세 가지 기간에. P25, P45, P95에서 XNUMX병 선택 테스트를 거친 후 스크리닝을 실시했습니다(그림 (그림 1) 1) WD를 먹인 댐에서 태어난 수컷 XNUMX마리와 CD를 먹인 댐에서 태어난 수컷 XNUMX마리에 대한 연구입니다.
시상하부의 P25에서 20개 다른 범주의 40개 유전자는 주로 가소성 마커와 WD를 먹인 댐의 새끼에서 -5%(Gfap)에서 -2%(Gabra1) 범위의 GABA 마커에서 상당히 낮은 mRNA 발현 수준을 나타냈습니다. CD 공급 댐. 보상 경로 생검(VTA 및 NAc)에서 두 유전자는 통계적으로 더 높은 mRNA 발현 수준(D2R 및 Gabra2), 즉 DA 신호 전달 및 GABA 수용체를 나타냈고 한 유전자는 NAc에서 더 낮은 발현(Hcrtr2)(즉, orexin 1 수용체)을 나타냈습니다. 반면, 1개의 유전자는 VTA에서 상당히 높은 mRNA 발현 수준(Map2, GabaraXNUMX, HcrtrXNUMX 및 HcrtrXNUMX)(즉, 가소성 마커, GABA 수용체 및 세로토닌성 수용체)을 나타냈습니다(그림 (그림 44).
시상하부의 P45에서 20개 다른 범주의 50개 유전자는 CD를 먹인 댐의 쥐와 비교하여 WD를 먹인 댐의 새끼에서 -45%(Fos)에서 -2%(FosB) 사이의 낮은 mRNA 발현 수준을 나타냈습니다. 보상 경로 생검의 P5에서 2개의 유전자는 NAc에서 더 높은 mRNA 발현 수준(Gfap, Dat, CckXNUMXr 및 KatXNUMX)을 나타냈고 XNUMX개의 유전자는 더 낮은 발현(Fos 및 FosB)을 보인 반면 XNUMX개의 유전자는 더 낮은 mRNA 발현 수준(Arc, FosB 및 Th)와 VTA에서 더 높은 수준의 유전자(GabrgXNUMX)가 있습니다.
시상하부의 P95에서 20개 범주의 20개 유전자는 +40~+4%(Syt2~Gjd3) 범위의 더 높은 mRNA 발현 수준을 나타냈고, 1개 유전자는 WD의 새끼에서 더 낮은 mRNA 발현(FosB, D1r 및 Gabarb95)을 나타냈습니다. CD를 먹인 댐의 쥐와 댐을 먹인 쥐의 비교. 보상 경로 생검의 P12에서 20개 유전자는 +40~+1%(Syn1~Hcrt1) 범위의 더 높은 mRNA 발현 수준을 나타냈고, 6개 유전자는 NAc에서 더 낮은 발현(Th)을 나타냈고, 1개 유전자는 더 높은 mRNA 발현 수준(Ncam1)을 나타냈습니다. , Gja2, Gjd5, Gabra1, Htr1a 및 Htr6b) 및 1개 유전자는 VTA에서 더 낮은 mRNA 발현 수준(Cntf, Igf3, Fos, Socs2, Gabrb3 및 HdacXNUMX)을 나타냈습니다.
그런 다음 모든 정량화된 매개변수(즉, 혈장 투여량, 행동 데이터 및 mRNA 발현 변형)를 사용하여 세 가지 뇌 생검에 해당하는 세 가지 감독되지 않은 PCA를 수행했습니다. NAc와 VTA에 대해서는 P95에서만 두 그룹의 명확한 분리가 이루어졌습니다(표 (테이블 33).
PCA 상관 관계 서클과 TLDA 데이터(이 PCA에 포함된 변수의 대부분을 나타냄)에 따라 우리는 분리를 담당할 수 있는 유전자 패밀리를 정의하고 집중적인 PCA를 수행했습니다(그림 (그림5A,B,5예를 들어 A, B). 집중된 PCA는 P25에서 NAc의 DA 마커와 시상하부의 가소성 마커가 두 그룹의 자손을 분리할 수 있음을 보여주었습니다(표 (테이블 33 요약을 위해). P45에서는 그러한 차별이 발생하지 않았습니다. 그러나 P95에서의 동일한 분석에서는 NAc와 시상하부에서 GABA 시스템의 다양한 마커와 가소성 마커(시상하부, NAc 및 VTA) 및 후생적 조절자(NAc에서만)가 두 그룹의 동물을 분리하는 데 기여한다는 사실이 밝혀졌습니다. 수치 (그림 5; 5; 표 Table33).
이 분석은 GABAergic 마커뿐만 아니라 섭식 행동과 관련된 항상성 및 보상 경로 모두에서 가소성 및 후성유전학적 마커에 대한 주산기 식단의 장기적인 영향을 보여줍니다.
TH 세포의 면역조직화학으로 전사체 분석 확인
우리는 다양한 발달 기간에 NAc와 VTA에서 TH mRNA의 약간의 변화를 관찰했기 때문에 이러한 결과를 TH 면역염색과 연관시키는 것을 목표로 했습니다. TH/NeuN 양성 세포의 수는 도파민 세포체가 위치한 VTA에서 분석되었으며 TH 면역표지의 OD는 NAc에 위치한 신경 말단에서 정량화되었습니다. TH(+) 세포는 P45에서만 CD 쥐에 비해 WD의 VTA에서 덜 풍부했습니다(그림 (그림 6A,C,E;6에이스; 수치 S2보충 자료의 A). 세 기간(P25)에서 섹션 수준과 TH/NeuN 정량화 간에는 유의한 상호 작용이 없었습니다. p = 0.9991, P45 p = 0.9026 및 P95 p = 0.9170). P45에서만 두 자손 그룹 간에 통계적 차이가 얻어졌습니다(p = 0.0002) (그림 (Figure6E) .6이자형). 또한, 우리는 두 그룹 사이의 P25와 P45에서 NAc의 TH 면역 염색의 OD에 차이가 없음을 관찰했습니다(P25의 OD 비율 값: CD에서 1.314 ± 0.022 대 WD에서 1.351 ± 0.026, p = 0.2681; P45의 OD 비율 값: CD의 1.589 ± 0.033 대 WD의 1.651 ± 0.027, p = 0.1542). 그러나 P95에서 WD 그룹의 NAc에서 TH 신경 종말의 OD가 크게 감소한 것으로 나타났습니다(p95의 OD 비율 값: CD에서 1.752 ± 0.041 대 WD에서 1.550 ± 0.046, p = 0.0037) (수치 (그림 6B,D,F;6B,D,F; 수치 S2보충 자료의 B).
토론
이 연구에서 우리는 산모의 주산기 영양 과잉이 에너지 항상성, 음식 선택 및 자손의 음식 섭취와 관련된 보상 경로 개발 프로그램에 영향을 미칠 것이라는 가설을 세웠습니다. 우리는 유년기부터 성인기에 이르기까지 자손의 특정 뇌 영역(VTA, NAc 및 시상하부)의 GABA, 세로토닌 및 DA 경로에 대한 출생부터 이유까지 산모의 WD 섭취가 미치는 영향을 광범위하게 조사했습니다. 우리의 결과는 주산기에만 엄격하게 제한된 지방과 단맛이 풍부한 식단의 사용이 유전자 발현 프로필의 변화와 중변연계의 신경해부학적/구조적 변화와 상관관계가 있는 자손의 초기 지방 선호도(어린 시절)에 영향을 미친다는 것을 시사합니다. 도파민성 네트워크. 그러나 자손에게 먹이를 줬을 때, 우리는 WD를 먹인 청소년 쥐에서 지방에 대한 매력이 점진적으로 상실되는 것을 관찰했는데, 이는 DA 시스템의 유전자 발현 감소와 VTA의 TH 양성 뉴런의 약간의 감소와 관련이 있었습니다. . GABA성 네트워크와 시상하부의 에너지 항상성 네트워크의 중요한 가소성이 WD를 먹인 댐의 쥐에서 확인되었음에도 불구하고 나중에 인생에서 지방 선호도는 그룹 간에 다르지 않았습니다(그림 (그림 77).
이 연구에서 우리가 관찰한 주산기 WD 섭취의 첫 번째 영향은 이유 시 새끼의 체중 증가이지만 출생 시에는 차이가 없다는 것입니다. 실제로, WD 그룹의 동물은 빨기 기간이 끝날 때 CD보다 체중이 21% 더 증가합니다. 이전 연구에서는 WD를 먹인 댐에서 태어난 자손의 출생 체중 변화와 관련하여 상충되는 결과를 제공했습니다.19, 34), 더 낮은 체중 (18, 21, 35) 또는 차이 없음(6, 22). 우리의 데이터는 최근 메타 회귀 분석(36)는 산모의 HFD 노출이 자손의 출생 체중에 영향을 미치지 않지만 수유기 말에 체중 증가를 유발한다는 결론을 내린 171개의 실험 간행물에 대해 수행되었습니다. WD 자손의 더 높은 체중은 아마도 이전 출판물에서 설명된 우유 구성 및/또는 우유 생산의 변화를 반영할 것입니다.37, 38). 체중이 높을수록 WD 자손의 후 복막 지방 비율은 젖먹이 기간이 끝날 때 CD 자손의 비율보다 유의하게 높았습니다 (P25, 표 표2),2), 이는 이전 연구와도 일치합니다 (18, 21). 그러나 P45와 P95에서는 더 높은 비만도가 지속되지 않았으며 인슐린, NEFA 및 포도당 혈장과 같은 다른 대사 매개 변수는 그룹간에 차이가 없었습니다. 우리의 결과는 임신과 수유 기간 동안 산모의 비만이 명백하지 않은 경우, 식이 자체로는 자손에게 지속적인 대사 효과를 유도하기에 충분하지 않다는 것을 보여주었습니다.22, 39, 40).
주산기 HFD 섭취는 자손이 맛있는 음식을 선호하는 것과 양의 상관관계가 있는 것으로 보고되었습니다.41). 우리 연구에서 우리는 정기적으로 먹이를 먹는 새끼에게 지방 선호도를 테스트하는 것을 목표로 하는 종단적 연구를 수행했습니다.
주산기 WD가 아동기에 미치는 영향( 이유 후)
설치류 새끼는 출생 후 19~20일에 고형 음식을 먹습니다.42) 대뇌 보상 경로가 아직 성숙되지 않은 경우(17). 따라서 지방에 대한 초기 선호도를 연구하고 이러한 초기 선호도를 뇌 전사 분석과 연관시키는 것은 매우 흥미로웠습니다. 이유 직후, 우리는 CD 쥐에서는 입증되지 않은 WD 자손의 지방에 대한 선호를 관찰했습니다. 이는 대조군 쥐의 주산기 영양실조와 맛있는 음식 선호도, 어린 나이에 지방 선호도 사이의 연관성을 보여주는 다른 보고서와 일치합니다.43).
글로벌 PCA는 해당 연령의 모체 식단과 관련하여 새끼 그룹을 차별하는 것을 허용하지 않았습니다. 그러나 DA 마커로 제한된 표적 PCA를 수행했을 때 그룹이 잘 분리되었습니다. 실제로 WD 새끼의 NAc에서 D2 수용체 mRNA 발현이 현저하게 증가했습니다. NAc에서 이러한 시냅스 후 D2 과발현은 부분적으로 지방에 대한 더 높은 동기 부여에 관여할 수 있습니다.44). NAc 및 VTA에서 알파 1 GABAA 서브유닛의 증가 및 시상하부에서 알파 5 GABAA 서브유닛의 감소와 같은 CD 새끼와 비교하여 WD 새끼에서는 이러한 핵에서 GABAA 수용체의 재구성을 암시하는 다른 전사물이 거의 수정되지 않습니다.
주산기 WD가 청소년기에 미치는 영향
P45에서 우리는 발표 첫날 두 그룹 모두에서 유사한 고지방 선호를 관찰했지만 흥미롭게도 WD 쥐는 반복 발표 후 점차 지방에 대한 관심을 잃었습니다. 청소년기는 평생 인지 처리에 필요한 신경행동 재구성의 중요한 시기입니다.45), 다양한 연구에서는 지방 다이어트가 인지에 해로운 영향을 미치는 것으로 나타났습니다.46-48). 이 결과는 Muhlhausler 그룹의 이전 연구와 명백히 모순됩니다.21, 35) 어린 쥐(6주)는 정크 푸드에 대한 명확한 선호를 보였습니다. 그러나 그들의 출판물에서는 쥐가 젖을 떼는 순간부터 희생될 때까지(6주) 표준 음식과 정크푸드 모두에 자유롭게 접근할 수 있었기 때문에 실험 패러다임이 달랐습니다.
동시에 우리는 NAc에서 Dat mRNA의 증가와 VTA에서 Th mRNA의 감소를 측정했는데, 이는 WD 쥐의 VTA에서 감소된 TH(+) 세포 수를 나타내는 면역조직화학에 의해 확인되었습니다. 이유 시 DA 시스템의 전사 활성이 증가한 후 P45의 활성 감소는 WD 쥐에서 관찰된 맛있는 음식에 대한 관심이 낮은 것을 설명할 수 있습니다. 또한 우리가 분석한 다양한 핵에서 Fos 및 FosB mRNA 발현의 체계적인 감소는 산모의 WD 노출 후 감소된 대뇌 활동의 표시일 수 있다는 점에 유의해야 합니다.
청소년기 WD 쥐는 이전 행동과 반대되는 지방에 대한 더 빠른 무관심을 보여주었습니다. 어린 시절의 "정상적인" 식단을 사용하면 청소년기에 과도한 지방 선호를 방지하는 것으로 보입니다. 반대로 쥐가 이유 후 정크 푸드에 자유롭게 접근할 수 있는 경우에는 Ref. (21, 35), 그들은 청소년기에 지방에 대한 강한 선호를 보여줍니다. 이 결과는 이유 후 3주간의 식단이 회로를 다시 프로그래밍하여 청소년 자녀가 급성 지방 문제에 덜 민감하게 만들 수 있음을 시사합니다.
주산기 WD가 성인에 미치는 영향
성체 쥐는 이미 설명한 바와 같이 반복적으로 지방을 제시한 후에도 더 이상 지방에 대한 선호도의 차이를 보이지 않았습니다.22, 35). 동시에 우리는 NAc에서 Th mRNA와 단백질의 감소와 VTA에서 Dat mRNA의 발현 감소 경향을 관찰했습니다. 네프와 동료(20)는 이미 주산기에 HFD를 먹인 성체 쥐에서 미세 투석으로 측정된 암페타민에 대한 DA 반응이 둔화되고 지방 보상에 대한 동기가 증가하는 등 DA 시스템의 낮은 활동을 보고했습니다(이 모델에 대한 최근 qPCR 데이터를 요약한 표 참조, 테이블 S2 보충 자료에서). NAc에서 TH 정량화(mRNA 및 면역조직화학)의 한 가지 한계는 NAc 세포가 Th mRNA와 단백질도 발현할 수 있고 그런 다음 DA 섬유 정량화를 편향시킬 수 있다는 사실에서 비롯됩니다.49, 50). 그러나 NAc에서 TH 면역염색을 사용하면 주로 중뇌 DA 뉴런(VTA 및 SNc)에서 나오는 조밀한 축삭 말단이 드러났습니다. 일반적으로 선조체와 NAc에서 TH를 발현하는 뉴런은 고도로 DA 병변이 있는 동물에서만 식별될 수 있습니다.51) 따라서 우리의 면역 섹션에서는 거의 감지할 수 없습니다. 이 연구에서 우리는 또한 다른 모델을 사용하는 다른 그룹이 초기에 HFD에 노출된 쥐의 복부 선조체(수유 및 임신 기간 동안)에서 발현 감소를 보인 경우 NAc에서 뮤 오피오이드 수용체의 강력한 증가를 관찰했습니다.19, 21) 또는 변경 없음(35). mRNA 수준에서만 측정된 이러한 변형은 더 높은 오피오이드 민감도와 관련된 DA 회로의 약간의 활동 저하를 반영할 수 있습니다.52) 아마도 우리가 수행한 행동 테스트에 영향을 미치기에는 충분하지 않을 것입니다. 이러한 가정은 기능적 접근 방식을 사용하여 확인되어야 합니다. 유사한 모델을 사용한 최근 논문에서 Romani-Perez 등은 HFD 자손을 위한 조작적 조건화 상자에서 동기가 크게 증가하는 것을 관찰할 수 없었지만 활주로 테스트 패러다임에서 골 상자에 도달하는 데 걸리는 대기 시간이 더 짧은 것을 관찰했습니다(22). 실험 조건에서 오래 지속되는 지방 선호가 없음에도 불구하고 우리는 주산기 산모의 WD 섭취가 주로 NAc 및 시상하부에서 GABA 리모델링에 의해 매개되는 다른 대뇌 회로에 오래 지속되는 효과가 있음을 발견했습니다. NAc는 완성된 행동을 위한 "감각적 파수꾼"으로 간주됩니다(52). 최근 연구에 따르면 GABA 방출 LH 뉴런의 억제로 인해 음식 섭취가 억제되는 것으로 나타났습니다.53). O'Connoret al. NAc D1R 뉴런(GABAergic 돌출 뉴런)이 LH VGAT 뉴런을 선택적으로 억제하여 음식 섭취를 중단한다는 것을 보여주었습니다.54). 이 실험은 행동 반응 제어를 담당할 수 있는 GABA 회로(NAc/시상하부)를 공개합니다. 이 복부 선조체-시상하부 시스템은 GABA 방출 VGAT 투사 뉴런을 글루타메이트 방출 V글루 LH 뉴런으로 연결하고 LH v글루2의 직접적인 억제를 통해 섭식을 유도하는 말단 핵 줄무늬와 관련된 또 다른 회로를 보완합니다.55). NAc 껍질과 관련된 식욕 조절 회로의 또 다른 중요한 구성 요소는 VP에 대한 GABA 방출 억제 투사입니다.56). 이러한 데이터는 시상하부와 NAc 사이의 상호 작용에서 섭식을 촉진하는 GABA 신호 전달의 중요한 역할을 강조합니다. 우리 연구에서 우리는 GABA 리모델링과 관련된 뉴런 집단과 이러한 수정이 네트워크를 어떻게 변경할 수 있는지 구별할 수 없었습니다. 그러나 GABA 회로의 중심 역할은 더 많은 관심을 받을 가치가 있습니다. 특히, 전기생리학적 접근법을 사용하여 이러한 GABA 회로의 추가 기능적 실험을 수행하는 것은 매우 흥미로울 것입니다.57). 우리는 또한 연구된 5개의 핵에서 1HT5a 및 1HTXNUMXb 수용체에 대한 mRNA 전사체의 전반적인 상향 조절을 관찰했습니다. 돌출된 세로토닌 섬유의 대부분은 등쪽 솔기 핵(DRN)과 중앙 솔기 핵(MRN)에서 나옵니다. 최근 데이터 생체내에서 녹음 및 영상 연구는 보상에서 5HT의 긍정적인 역할을 보여주었습니다.58). DRN의 5HT 섬유는 충동성 제어에 관여합니다(59). VTA 및 NAc의 5HT1a 증가는 충동성을 제어할 수 있는 보상 메커니즘이 될 수 있습니다. 시상하부에서 약리학적 연구는 5HT1a 수용체 아형이 세로토닌 자극에 의해 유도된 섭식 행동을 억제할 수 있음을 시사합니다.60, 61). 시상하부에서 5HT1a 및 b 수용체의 증가는 세로토닌의 섭식 억제 작용을 강화할 수 있으므로 보상 메커니즘을 구성할 수 있습니다. 이러한 가정은 적절한 기능적 실험을 수행하여 검증되어야 합니다.
이러한 네트워크 변화는 Ncam mRNA와 같은 가소성 마커의 수정과 관련이 있습니다. 성인 쥐의 시상하부에서 우리는 폴리시알산(PSA) 신호 전달의 증가와 제안하는 Ncam1 및 St8sia4 전사체의 증가를 관찰했습니다. PSA는 세포 간 상호작용을 조절하는 세포 표면 글리칸입니다. 세포 접착 단백질의 폴리시알릴화는 중추 신경계의 다양한 시냅스 가소성 의존 과정에 관여하며 급성 양성 에너지 균형 동안 공급 회로의 적응성 시냅스 가소성에 필요한 것으로 보고되었습니다.33, 62). 게다가 세포 상호작용과 시냅스 생성의 다른 조절인자들도 이러한 시상하부 가소성에 관여할 수 있습니다.
결론적으로 (그림 (그림 7), 7), 산모의 WD 섭취는 자손의 식습관을 조절하는 항상성 및 쾌락 회로의 구성에 오랫동안 지속적인 영향을 미칩니다. 세 가지 중요한 기간을 분석함으로써 우리는 특정 뇌 분자 특징과 상관관계가 있는 지방 선호도에 대한 명확한 진화를 보여줄 수 있었습니다. 어린 시절 지방에 대한 선호는 DA 시스템의 더 높은 활동과 관련이 있을 수 있습니다. 지방 선호의 역전을 특징으로 하는 청소년기는 보상 메커니즘을 암시하는 DA 시스템 마커의 낮은 발현과 관련이 있습니다. 매우 흥미로운 점은 이 모델에서 이유 후 균형 잡힌 식단이 사춘기 쥐의 지방에 대한 욕구를 줄여 해로운 먹이 습관으로부터 보호할 수 있다는 것입니다. 성인기에 두 그룹은 지방에 대한 선호도가 비슷했지만 WD를 먹인 댐의 쥐는 GABA 회로의 심오한 리모델링을 보여주었습니다. 이 지속적인 가소성의 결과는 무엇입니까? 청소년기의 과장된 비만 유발 식단 섭취가 이 무뎌진 보상 시스템을 다시 활성화할까요? 이러한 질문은 서구화된 국가에서 신생아와 성장한 어린이의 영양 추적 조사와 관련이 있을 수 있습니다.
윤리 강령
모든 실험은 지역 동물 복지 위원회, EU(지침 2010/63/EU), Institut National de la Recherche Agronomique(프랑스 파리) 및 프랑스 수의학과(지침 XNUMX/XNUMX/EU)의 지침에 따라 수행되었습니다.A44276). 실험 프로토콜은 기관 윤리 위원회의 승인을 받았으며 APAFIS 8666 참조로 등록되었습니다. 각 일련의 실험에 사용되는 스트레스와 동물의 수를 최소화하기 위해 모든 예방 조치가 취해졌습니다.
작성자 기여
JP와 PB는 실험을 진행하고 토론과 집필에 참여하였다. TM은 PCA를 수행하고 토론과 집필에 참여했습니다. SN은 실험 설계에 기여하고 토론에 참여했습니다. PP는 실험 설계에 기여하고 토론에 참여했으며 원고를 작성했습니다. VP는 실험을 설계 및 수행하고, 데이터를 분석하고, 원고를 작성했습니다.
감사의
저자는 연구 전반에 걸쳐 동물을 돌봐준 Guillaume Poupeau와 Blandine Castellano, mRNA 추출 및 TLDA에 도움을 준 Anthony Pagniez, 혈장 샘플 분석에 도움을 준 Isabelle Grit, 그리고 Alexandre Benani와 Marie-Chantal Canivenc에게 감사를 표하고 싶습니다. 유용한 토론과 TLDA 설계에 감사드립니다.
각주
자금. 이 연구는 지역 des pays de la Loire 보조금 PARIMAD(VP), LCL 재단 보조금(VP 및 PP), SanteDige 재단(VP) 및 INRA Metaprogram DIDIT(SN, VP, PP)의 지원을 받았습니다.
보충 자료
이 기사의 보충 자료는 온라인에서 찾을 수 있습니다 http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fendo.2017.00216/full#supplementary-material.
그림 S1
옥수수유가 담긴 병에서 섭취한 총 에너지량입니다. (A) 서양식 식단(WD)을 먹인 댐의 새끼와 대조 식단(CD)을 먹인 댐의 새끼에서 P24에서 25시간 동안 옥수수유 병에서 칼로리를 섭취합니다. (B) P24(병 테스트 45일째)에 XNUMX시간 동안 옥수수유 병에서 칼로리를 섭취합니다. (C) P24(병 테스트 95일차)에서 XNUMX시간 동안 옥수수유 병에서 칼로리를 섭취합니다. 패널용 (A–C), 데이터는 평균 ± SEM으로 표시되며 통계적 차이는 없습니다(p > 0.05)는 Mann과 Whitney의 비모수적 테스트에 따라 모든 연령층에서 관찰되었습니다. (D) 옥수수유 병에서 섭취하는 칼로리의 백분율은 WD 새끼 및 CD 새끼의 P24에서 25시간 동안 총 칼로리 섭취량(옥수수유 병 + 표준 사료 다이어트)과 비교됩니다. (E) WD 새끼 및 CD 새끼의 P24(병 테스트 45일째)에 XNUMX시간 동안 옥수수기름 병의 칼로리 섭취량 비율을 총 칼로리 섭취량(옥수수기름 병 + 표준 사료 다이어트)과 비교합니다. (F) 옥수수유 병의 칼로리 섭취율은 WD 새끼 및 CD 새끼의 P24(병 테스트 95일차)에 XNUMX시간 동안 총 칼로리 섭취량(옥수수유 병 + 표준 사료 다이어트)과 비교됩니다. 패널용 (D,E), 데이터는 총 칼로리 섭취량의 백분율로 표시되며 통계적 차이는 없습니다(p > 0.05)은 Yates의 보정을 사용한 카이제곱에 따라 모든 연령대에서 관찰되었습니다.
그림 S2
세 가지 다른 시점에서 측좌핵(NAc) 및 복부 피개 영역(VTA)에서 TH 면역염색의 대표적인 현미경 사진. (A) Bregma에서 -5.30mm의 VTA 수준에서 TH/NeuN 면역염색의 현미경 사진. 빨간색 라벨은 NeuN용이고 녹색 라벨은 TH용입니다. 흰색 화살표는 세 번째 신경의 출구를 보여줍니다. (B) Bregma에서 +1.70mm인 NAc 수준의 TH 면역염색 현미경 사진. 녹색 라벨링은 TH용입니다. 흰색 화살표는 전방 교합을 나타냅니다.
테이블 S2
도파민 경로 전사체 발현에 관한 발표된 데이터 요약. 빨간색 문자는 유년기, 파란색 문자는 청소년기, 검은색 문자는 성인기에 해당합니다. =: 그룹 간의 유사한 전사 발현에 해당하고, +: 고칼로리 식단[정크 푸드, 서양식 식단(WD) 또는 고지방 식단(HFD)]을 먹인 댐의 새끼에서 더 높은 전사 발현에 해당하며, -: 고칼로리 식단(정크 푸드, WD 또는 HFD)을 먹인 댐의 새끼에서 더 낮은 전사 발현에 해당합니다.
참고자료
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