DAT 유전자 발현을 바꾸지 않고 도파민 재 흡수를 감소시키는 장기간의 고지방 다이어트 (2013)

  • 잭슨 제이 콘,
  • Elena H. Chartoff,
  • 데이비드 엔 포터,
  • 스테파니 알에 브너,
  • 미첼 F. 로이트 만

추상

식이 유발 비만 (DIO)의 개발은 도파민 수송 체 (DAT) 발현 및 도파민 재 흡수를 포함하여 도파민 신호 전달의 여러 측면을 강력하게 변경할 수있다. 그러나,식이 유발 된 DAT 발현 및 기능의 시간 경과 및 그러한 변화가 DIO의 발달에 의존하는지 여부는 여전히 해결되지 않고있다. 여기, 우리는 2 또는 6 주 동안 쥐에게 고 (HFD) 또는 저 (LFD) 지방을 먹였습니다. 식이 노출 후, 래트를 우레탄으로 마취시키고, 배쪽 테그먼트 영역 (VTA)에서 도파민 세포체를 전기적으로 자극하고 빠른 스캔 순환 전압 전류 법을 사용하여 배쪽 선조에서 도파민 농도의 결과 변화를 기록함으로써 선조 적 DAT 기능을 평가 하였다. 우리는 또한 같은 다이어트 프로토콜에 노출 후 쥐의 별도 그룹에서 striatal 세포 분획에 막 관련 DAT에 HFD의 효과 정량화. 특히, 우리의 치료 그룹 중 체중에 차이가 없었습니다. 우리는 6 후 다이어트 노출의 2 후가 아닌 LFD 래트에 비해 HFD 래트에서 도파민 재 흡수율의 결핍을 발견했다. 또한, 코카인의 약리학 적 도전에 따른 유발 도파민의 증가는 LFD 랫트에 비해 HFD에서 상당히 약화되었다. 웨스턴 블롯 분석은 총 DAT 단백질에 대한식이의 영향이 없음을 나타내었다. 그러나, HFD 노출의 6주는 시냅 토좀 막-관련 분획에서 50 kDa DAT 이소 형을 유의하게 감소 시켰지만, 엔도 솜을 재순환시키는 분획에서는 그렇지 않았다. 우리의 데이터는 DAT 생산의 변화와 무관하게 도파민 재 흡수의식이 유발 변화에 대한 추가 증거를 제공하며 그러한 변화가 DIO의 발달없이 나타날 수 있음을 보여줍니다. 

인용 : Cone JJ, Chartoff EH, Potter DN, Ebner SR, Roitman MF (2013) 연장 고지방식이는 DAT 유전자 발현을 변경하지 않고 도파민 재 흡수를 줄입니다. ONE 8 (3) : e58251를 선택하십시오. doi : 10.1371 / journal.pone.0058251

에디터 : Sidney Arthur Simon, Duke University Medical Center, 미국

수신 : 10 월 26, 2012; 수락 : 2 월 5, 2013; 게시 : 2013 년 3 월 13 일

저작권 : © 2013 Cone et al. 이 문서는 Creative Commons Attribution License의 조항에 따라 배포되는 공개 문서로서, 원본 작성자와 출처가 인정 된 경우 모든 매체에서 제한없이 사용, 배포 및 복제 할 수 있습니다.

기금 : 기술 된 프로젝트는 NIH (National Institutes of Health) 보조금이 생물 의학 신경 과학 훈련 프로그램 (JJC)으로부터 DA025634 (MFR) 및 T32-MH067631를 지원합니다. 그랜트 UL1RR029877 (JJC)와 시카고 바이오 메디컬 컨소시엄 (JJCC)의 Searle Funds의 지원을 통해 National Research Research Center for National Research Center and NIH (National Translations for Advancing Translation Sciences, NIH)의 추가 지원이 제공되었습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIH 또는 Chicago Biomedical Consortium의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 연구자들은 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할을하지 않았습니다.

경쟁 관심: 저자는 경쟁적 이익이 없다고 선언했다.

개요

과체중과 비만은 미국과 전세계 인구의 점점 더 큰 비율을 나타냅니다 [1], [2]. 비만에 대한 많은 경로가 있지만 건강한 체중에 대한 가장 큰 위협 중 하나는 맛이 좋고 밀도가 높은 열량 식품의 보급 및 소비입니다. [3]. 실제로 음식의 에너지 밀도 (kcal / g)는 성인의 과체중과 비만에 강력하게 기여합니다 [4], [5]. 맛좋은 음식은 인간과 비인간 동물의 선조체에서 도파민 방출을 유발합니다 [6], [7], [8], [9] 음식의 주관적 평가는 복부 선조체의 신경 반응 강도와 양의 상관 관계가 있습니다. [10]. 따라서, 도파민과 선조체는 에너지 밀도가 높은 식품에 대한 선호에 기여하는 것으로 보인다. 최근에,식이의 차이는 선조체 회로와 음식 지향적 행동에 동시 변화를 일으킬 수 있음이 밝혀졌습니다 [11]. 그러나 섭취 된 음식의 차이, 특히 지방에 대한 차이가 세속적 인 도파민 신호에 대한 피드백과 변화를 가져올 수 있다는 증거가 점점 더 높이 평가되지는 않을 것입니다.

Striatal 도파민 신호 전달은 효소 티로신 하이드 록 실라 제, 시냅스 후 및 도핑 후 도파민 수용체, 및 시냅스 전 도파민 수송 체 (DAT)에 의한 도파민 생성을 포함하여 여러 요인에 의해 조절된다. [12], [13]. DAT 수 또는 기능의 변경은 방출 된 도파민의 영향 범위 및 결과적으로 선조 기능을 변경할 수 있습니다 [14], [15]. 섭취 한 음식에 반응하여 방출 된 인슐린은 DAT 기능에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다 [16], [17]. 따라서 DAT는식이 요법의 영향을받을 수있는 후보 중 하나입니다.

최근에, 비만과 DAT 이용 가능성 사이의 상관 관계 및식이 유발 된 DAT 기능의 변경이 탐구되었다. 체질량 지수 (BMI)는 사람 선조체의 DAT 가용성과 음의 상관 관계가 있습니다 [18]. 고지방식이 (HFD)를 섭취 한 생쥐에서 DAT 결합 및 그에 따른 가용성이 감소 [19]. HFD- 유도 비만 (DIO)은 래트에서 DAT에 의한 도파민 재 흡수율 감소와 관련이있다 [20]. 종합하면, 이러한 연구는 HFD 소비에 의해 확립 된 비만이 도파민 신호 전달의 중요한 시냅스 전 조절제, 특히 DAT에 강력하게 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. 그러나, 도파민 신호 전달에서의식이-유도 된 변경의 시간 과정 및 DIO의 발달이 명백한 변화에 필요한지 여부는 알려져 있지 않다. 우리는 복 부 선조에서 도파민 방출을 불러오고 빠른 스캔 순환 전압 전류 법을 사용하여 쥐의 재 흡수 속도를 정량화하여 DAT 기능을 분석했습니다. 감소 된 도파민 재 흡수가 감소 된 DAT 유전자 발현에 의해 유발되었는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 실시간 qRT-PCR을 사용하여 복부 Tegmental Area 및 Substantia nigra에서 DAT mRNA를 측정 하였다. 또한, 우리는 생시 냅 스 소포 및 endosomal 막에 striatal DAT 수준을 분석하기 위해 생 화 학적 분류 절차 및 웨스턴 오 점 분석을 사용했습니다. 래트는 2 또는 6주의 고지방 또는 저지방식이를 가졌지 만 모든 측정은 DIO가없는 상태에서 이루어졌다. 우리의 결과 DIO와 독립적 인 HFD의 연장 된 소비 DAT 식 감소없이 복 부 선조에서 도파민 재 흡수 속도 감소를 제안합니다.

재료 및 방법

윤리 강령

이 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 실험 동물의 관리 및 사용을위한 가이드의 권장 사항에 따라 엄격하게 수행되었습니다. 이 프로토콜은 시카고 일리노이 대학의 동물 관리위원회에 의해 승인되었습니다. 모든 수술은 우레탄 마취하에 수행되었으며, 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였습니다.

주제

도착했을 때 대략 67 개월령이고 체중이 2-225 g 인 표준 수컷 스프 라구-돌리 래트 (n = 275)를 사용 하였다. 동물을 26.5∶50 h 경 : 암 사이클 (20∶22에서 점등)의 온도-(30 ° C) 및 습도-(12 %) 제어 환경에서 플라스틱 케이지 (12 × 07 × 00 cm)에 개별적으로 수용했습니다. h). 1 주일 동안 시설에 적응시킨 쥐 광고 무제한 표준 실험실 차우 및 물에 대한 접근.

음식 섭취 및 체중 측정

순응 후, 랫트를 칭량하고 초기 체중에 대해 균형을 맞춘 1 그룹의 4에 무작위로 할당 하였다. 저지방식이 요법 (LFD; Research Diets, New Brunswick, NJ; D12450B; 10 % kilocalory from fat (3.85 kcal / g))에서 두 그룹이 유지되었다. 다른 2 그룹은 HFD (연구식이; D12492; 지방의 60 % 킬로 칼로리 (5.24 kcal / g))에서 유지되었다. 각식이에 대해, 래트를 2 또는 6 주 (주) 동안 유지시켰다. 따라서 4 그룹은 LFD-2 wk (n = 18), HFD-2 wk (n = 16), LFD-6 wk (n = 16) 및 HFD-6 wk (n = 17)입니다. 모든 그룹은 광고 무제한 물에의 접근. 음식 섭취 및 체중 측정은 주당 3 회 수행되었으며, 데이터는 볼타 메트릭 기록 또는 DAT 단백질 / 메시지 분석을받는 래트에 대해 개별적으로보고된다.

수술 절차 및 도파민 측정

식이 노출 후, 체중이 다르지 않은 쥐의 하위 집합을 전압 전류 측정 기록 (LFD-2 주 (n = 8), HFD-2 주 (n = 6), LFD-6 주 (n = 6))을 위해 준비했습니다. , 및 HFD-6 wk (n = 7)) 우레탄 (1.5 g / kg) 마취하에 [9,21에서와 같이]. 가이드 캐뉼라 (Bioanalytical Systems, West Lafayette, IL)를 복부 선조체 (전방 1.3mm, 브레 그마에서 측면 1.5mm) 위에 배치하고, 염소 처리 된 은선 (Ag / AgCl) 기준 전극을 반대측 피질에 이식하고 둘 다 스테인리스 스틸 나사와 치과 용 시멘트로 두개골에 고정되었습니다. 탄소 섬유 전극 (CFE)을 포함하는 미세 조작기를 가이드 캐뉼라에 삽입하고 전극을 복부 선조체로 낮추었습니다. CFE와 기준 전극을 헤드 스테이지에 연결하고 CFE의 전위를 -0.4 ~ + 1.3V (vs. Ag / AgCl) 및 백 (400V / s, 10Hz)에서 스캔했습니다. 양극성 자극 전극 (Plastics One, Roanoke, VA)을 5.2 mm 단위로 점차적으로 복부 피개 영역 / 흑질 (substantia nigra pars compacta) (VTA / SNpc; 후방 1.0 mm, 측면 7.0 mm 및 처음에는 bregma에서 0.2 mm 복부)으로 낮추었습니다. . 각 증분마다 전류 펄스 열 (60 펄스, 펄스 당 4ms, 60Hz, 400µA)이 전달되었습니다. 자극 전극이 VTA / SNpc에 있고 CFE가 선조체에있을 때 자극은 주성분 분석을 사용하여 전압 전류 측정 데이터에서 추출 된 도파민 방출을 안정적으로 유발합니다. [9], [22]; 각 CFE가 각각의 실험에 따라 유량 주입 시스템에서 보정 된 후 농도로 변환 [23]. 자극 전극의 위치는 최대 방출을 위해 최적화되었다. 이어서 실험을 시작하기 전에 CFE를 10 분 동안 평형화시켰다. 도파민 방출은 VTA / SNpc의 전기 자극 (상기와 동일한 파라미터)에 의해 유발되었고, 도파민 농도의 결과적인 변화는 자극에 대해 -5에서 10로 계산되었다. 자극 직후, 래트에 0.9 % 식염수 (10 mg / kg ip)에 용해 된 코카인 히드로 클로라이드를 주사하고, 10 분 후에 자극을 반복 하였다. 적용 전압, 데이터 수집 및 분석은 LabVIEW로 작성된 소프트웨어 (National Instruments, 미국 텍사스 주 오스틴)를 사용하여 수행되었습니다. [22].

도파민 재 흡수

도파민 재 흡수는 Demon Voltammetry Analysis Software (24; Wake Forest University, Winston-Salem NC)를 사용하여 모델링되었습니다. 여기 우리는 붕괴 상수 타우를 도파민 재 흡수율의 척도로서보고한다. Tau는 대부분의 도파민 제거 곡선을 포함하는 지수 곡선 피팅에서 파생되며 K와 높은 상관 관계가 있습니다 (r = .9899).mDAT에 대한 도파민의 명백한 친화력 [24]. 피크 도파민 농도에 대한 코카인의 효과를 결정하기 위해, 투여 전후에 얻은 값을 비교 하였다 (% 변화).

조직학

각각의 기록 후, 스테인레스 스틸 전극 (AM Systems #571500, Sequim, WA)을 CFE와 동일한 깊이로 낮추고 병변 (10 µA, 4 s)을 만들어 기록 위치를 표시 하였다. 뇌를 제거하고 10 % 포르말린에 저장 하였다. 광학 현미경을 사용하여 선조를 통한 관상 섹션 (50 µm)의 병변 위치를 식별했습니다. 여기에보고 된 모든 기록은 복부 선조에서 이루어졌습니다 [25].

Striatal 조직의 세포 내 분획

쥐 (LFD-2 wk, HFD-2 wk, LFD-6 wk, 및 HFD-6 wk; n = 10 / 그룹; 체중 차이 없음)는 참수로 사망했습니다. 생화학 적 분류는 [26]약간 수정되었습니다. 뇌를 신속하게 제거하고, 이소 펜탄에서 냉동시키고, 선조에 도달 할 때까지 저온 조절기 (HM505E, Microm, 독일 월 도프, -20 ℃)에서 슬라이스 하였다. 양자 1-mm3 복부 선조를 통한 펀치 (평균 조직 중량 : 15.2 mg)를 20 ml 빙냉 TEVP (0.8 mM Tris 염기, 10 mM NaF, 5 mM Na)에서 1에 대해 균질화3VO41 mM EDTA, 1 mM EGTA, pH 7.4) + 320 mM 슈 크로스 완충액. 총 균질 액 (H)의 100 μl 분취 량을 저장 하였다. 나머지 H를 800 ℃에서 10 분 동안 4xg에서 원심 분리 하였다. 펠렛 (P1, 핵 및 큰 잔해물)을 0.2 ml TEVP 완충액에 재현 탁시키고 저장 하였다. 상청액 (S1)을 제거하고 얼음의 깨끗한 튜브에 넣었다. S1를 9200 ℃에서 15 분 동안 4xg에서 원심 분리하여 펠렛 (P2, 미정 제 시냅 소좀 막) 및 상청액 (S2)을 생성 하였다. P2를 TEVP + 35.6 mM 슈 크로스 완충액에서 한 번 헹구고 0.25 ml의 TEVP + 35.6 mM 슈 크로스 완충액에 재현 탁시키고, 3s에 대해 부드럽게 볼 텍싱하고 30 분 동안 얼음 상에 샘플을 유지함으로써 저 삼투압 용해시켰다. 상청액 (S2)을 수집하고 165,000h 동안 2xg에서 회전시켜 TEVP (3 ml)에 재현 탁되어 저장되는 펠렛 (P0.1, 가벼운 막, 재순환 엔도 솜)을 생성 하였다. 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동이 이루어질 때까지 모든 샘플을 -80 ℃로 유지 하였다.

겔 전기 영동 및 웨스턴 블로 팅

단백질 함량은 Bio-Rad DC Protein Assay 키트 (Hercules, CA)를 사용하여 결정되었으며 각 샘플의 농도는 0.3mg / ml 단백질로 조정되었습니다. NuPAGE LDS (리튬 도데 실 설페이트) 샘플 버퍼 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 및 50 mM 디티 오 트레이 톨을 70 ° C에서 10 분 동안 가열하기 전에 각 샘플에 첨가했습니다. 각 분획에 대해 동등한 양의 단백질을로드하기 위해 겔 전기 영동으로 분리하기 위해 각 샘플의 3 µg을 NuPAGE Novex 4-12 % Bis-Tris 겔 (Invitrogen)에로드했습니다. 이어서 단백질을 폴리 비닐 리덴 플루오 라이드 막 (PVDF) (PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA)으로 옮겼다. 비특이적 결합 부위를 차단 완충액 (PBS 중 2 % 무 지방 분유 및 5 % Tween 0.02 [PBS-T])에서 실온에서 20 시간 동안 차단 하였다. 블롯은 1 차 항체 (3000∶2 마우스 단일 클론 항 -NR05B [# 920–1, Millipore], 5000∶2231 토끼 항 -DAT [# AB1, Millipore] 및 1000∶13 마우스 단일 클론 항 트랜스페린 수용체 ( TfR) [# 6800–3, Invitrogen]. 블롯은 높은 (> 97kDa), 중간 (46–97kDa) 및 낮은 (<46kDa) 중량의 2 개 부분으로 절단되었고 각 부분은 인식 된 항체로 프로브되었습니다. 사용 된 항체의 겉보기 분자량은 다음과 같습니다. NR180B, 75 kDa; DAT, 64, 50 및 95 kDa; TrfR, 62.5 kDa. DAT에 대한 중간 중량 범위 블롯을 조사한 후, 항체를 인큐베이션으로 제거했습니다. 2 ° C에서 100 분 동안 스트리핑 버퍼 (6.8mM Tris, 15 % SDS, 50mM β- 메르 캅토 에탄올, pH 2)를 사용합니다. 블롯을 이후에 다시 차단하고 anti-TfR로 프로브했습니다. SeeBlue Plus XNUMX (Invitrogen) 분자량 추정을 위해 염색 된 표준을 실행했습니다.

단백질 면역 블롯을 Carestream Molecular Imaging Software 5.0를 사용하여 분석 하였다. 순 강도 (관심 대역 내의 픽셀의 합에서 배경 픽셀의 합을 뺀 값)가 각 대역에 대해 결정되었다. 블롯들 간의 비교를 허용하기 위해, 데이터는 2 및 6 wks에서 LFD 대조군으로 정규화되었다. 데이터는 LFD ± SEM과 비교하여 평균 배수 유도로 표현된다.

정량적 실시간 역전사 효소 중합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR)

웨스턴 블롯 분석을위한 선조체 펀치의 수집 후, 냉동 된 뇌는 VTA / SN에 도달 할 때까지 마이크로톰에 대해 관상 적으로 절편 화되었다. 양자 1-mm3 VTA 및 SN 조직의 펀치 (평균 조직 중량 = 15.0 mg)를 만들고 PureLink RNA Mini Kit (Invitrogen)를 사용하여 RNA를 추출 하였다. RNA 품질 및 양은 Agilent Bioanalyzer 6000에서 RNA 2100 Nano Chip (Agilent, Santa Clara, CA)을 사용하여 평가되었다. RNA 무결성 번호 (RIN)는 모든 샘플에서 7를 초과하여 고품질을 나타냅니다. 1 마이크로 그램의 총 RNA를 사용하여 ThermoHybaid iCycler (Thermo Scientific)에서 iScript cDNA 합성 키트 (BioRad)를 사용하여 cDNA를 합성 하였다. DAT (Slc6a3; 정방향 프라이머 : GGAAGCTGGTCAGCCCCTGCTT, 역방향 프라이머 : GAATTGGCGCACCTCCCCTCTG), β- 액틴 (Nba; 정방향 프라이머 : AGGGAAATCGTGCGTGACAT; 역방향 프라이머 : AAGGAAGGCTGGAAGAGAGC); : GCTCCTGTGCACACCATTTTCCC 유전자 (Genbank 접근 번호 NM_012694, NM_031144 및 NM_001004198)는 NCBI Primer-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) 및 Integrated DNA Technologies (아이오와 주 코럴 빌)에서 구입했습니다. 용융 곡선 분석 및 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동으로 프라이머의 특이성을 확인 하였다. DAT, β- 액틴 및 Tbp 앰플 리콘은 각각 길이가 266, 182 및 136 염기쌍이다.

Q-PCR 키트 (iQ SybrGreen Supermix, BioRad)가 사용되었습니다. 20 μL의 2 μL 순방향 및 역방향 프라이머 및 3 μL cDNA 샘플로 희석 된 4 1로 10 μl의 부피로 MyiQ 단일 색상 실시간 PCR 검출 시스템 (BioRad)에서 반응을 수행 하였다. PCR 사이클링 조건은 95 분 동안 5 ℃이고; 40는 94s의 경우 15 ° C, 60s의 경우 15 °, 72s의 경우 15 ° C에서 순환합니다. 앰플 리콘 용융 온도를 기준으로 84에 대한 15 ℃의 판독 온도에서 데이터를 수집 하였다. 모든 처리 군으로부터의 cDNA의 동일한 혼합을 포함하는 마스터 cDNA 스톡을 연속 희석 (1.00, 0.2, 0.04 및 0.008- 배)하여 각 프라이머 세트에 대해 표준 희석 곡선을 생성 하였다. 일지10 희석 값의 표준값을 표준 곡선에 대한 임계 값 사이클 값에 대해 플롯 팅 하였다. MyiQ 광학 시스템 소프트웨어 (BioRad)를 사용하여 데이터를 분석했습니다. cDNA 주형을 함유하지 않는 샘플 및 역전사 효소를 함유하지 않은 cDNA 반응으로부터의 샘플을 각각 게놈 DNA의 오염 및 증폭에 대한 대조군으로서 수행 하였다. 보고 된 값은 각 샘플에 대한 내부 표준 ß-actin 및 Tbp의 평균 값으로 정규화되었습니다. 데이터는 DAT / 내부 표준 mRNA ± SEM의 평균 상대 수준으로 표현된다.

통계 분석

DAT 표현은 두 사람의 수명주기 동안 동적으로 변경됩니다 [27] 쥐 [28], [29]. 또한 어린 쥐가 성숙함에 따라 코카인에 대한 도파민과 행동 반응도 변화합니다 [30]. 따라서, DAT의 측정은 연령에 따라 변할 수 있고 2 wk 그룹과 6 wk 그룹 간의 의미있는 비교를 금지 할 수 있습니다. 따라서, 음식 섭취, 체중, 피크 도파민 농도, 타우, % 변화 및 상대 유전자 발현에 대한 그룹 수단을 스튜던트의 짝을 이루지 않은 t- 검정을 사용하여 2 및 6 wk 그룹에 대해 개별적으로 비교 하였다. 웨스턴 블롯 분석의 경우, 표준화 된 DAT 밴드 강도의 그룹 차이는 양방향 반복 측정 ANOVA (dietXfraction)를 사용하여 2 및 6 wk 그룹에 대해 별도로 비교되었습니다. 모든 통계 분석은 Graph Pad 5 (Prism Inc.)에서 수행되었다.

결과

HFD는 증가 된 뚱뚱한 소비를 승진시킵니다

식이 노출이 시작되기 전에 2 wk (LFD : 275.22 +/- 4.1 g; HFD : 280.87 +/- 4.8 g; p = 0.37) 또는 6 주 (LFD : 287.31 +/− 4.9g; HFD : 289.44 +/− 5.1g; 6 주 p = 0.97) 그룹. 매우 다른 구성의 식단을 섭취 했음에도 불구하고 2 주 또는 6 주 후 식단 그룹간에 체중 차이가 없음을 발견했습니다 (그림 1a–b; 둘 다). 다이어트 노출의 2 및 6 wks 모두에 따라 그룹 간 소비 된 총 kcals에는 차이가 없었습니다.그림 1c–d; ns). 그러나 HFD 쥐는 지방에서 훨씬 더 많은 kcal을 섭취했습니다.그림 1e–f; 2 주 : t (32) = 25.59; 6 주 : t (31) = 27.54; p두 다이어트 기간 모두 <0.0001).

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그림 1. 음식 섭취 및 체중 측정.

최종 체중에서 HFD와 LFD 사이에는 차이가 없었습니다 (a–b) 또는 총 킬로 칼로리 소비량 (CD)를 2 또는 6주의식이 노출 후. (e–f) HFD 쥐는 2 주와 6 주 조건에서 LFD 쥐보다 지방에서 크게 더 많은 킬로 칼로리를 소비했습니다 (***p

http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0058251.g001

연장 된 HFD로 DA 재 흡수율 감소

복측 선조체에서 전압 전류 기록이 이루어졌습니다 (그림 2). 그림 3 도 1은식이 6 wks 후에 래트로부터 획득 된 도파민 농도의 대표적인 전기 유발 변화를 보여준다. 기준선에서, 유발 된 도파민의 크기는식이 군과식이 기간에 따라 다르지 않았다 (그림 4a–b, 두 ns). 그러나 개별 사례를 조사한 결과, 6식이 요법 노출 후식이 그룹마다 피크 도파민 농도에 따른 붕괴율이 다르다고 제안했습니다.그림 3 예를 들어, a–b). 붕괴 속도는 주로 DAT에 의한 도파민 제거에 기인한다 [31]타우를 결정하기 위해 단일 위상 지수로 모델링했습니다. 식이 노출 2 주 후식이 군간에는 차이가 없었습니다.그림 4c). 그러나식이 노출 6 주 후, LFD-6 주에 비해 HFD-6 주 쥐에서 타우가 유의하게 더 높았다 (그림 4d; t (11) = 2.668; p<0.05). 따라서 6 주간의 HFD는 LFD를 섭취 한 동물에 비해 복부 선조체에서 도파민 청소율을 감소시킵니다.

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그림 2. 재 흡수 분석을위한 기록 장소의 조직 학적 검증.

LFD 급식 쥐에 대한 기록 부위는 회색 삼각형으로 코딩되고 HFD 쥐의 경우 검은 원으로 코딩된다. 숫자는 Bregma 앞쪽의 거리를 mm 단위로 나타냅니다. Paxinos 및 Watson 2006에서 수정 된 그림.

http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0058251.g002

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그림 3. VTA / SNc의 전기적 자극은 도파민 농도에서 위상 스파이크를 일으킨다.

6주의식이 노출 후 획득 한 데이터의 대표적인 예. a) 백그라운드에서 차감 된 컬러 플롯은 VTA / SNc의 전기 자극 (STIM) 전 (-5에서 0로 시작) 및 이후에 전극의 다른 전위에서의 전류 변화를 보여줍니다. 시간은 가로 좌표이고, 전극 전위는 세로 좌표이며, 전류 변화는 가색으로 인코딩됩니다. 도파민 [산화 (+ 0.1 V; 녹색) 및 감소 (-10 V; 청색) 특징으로 식별]은이 LFD-0.6 wk 쥐의 자극에 반응하여 일시적으로 증가했습니다. b) HFD-6 wk 쥐를 제외하고 a)와 동일합니다. c) 시간의 함수로서 도파민 농도는 a)의 컬러 플롯으로부터 추출되고 타우는 곡선 맞춤을 통해 식별된다. 타우에 도달 한 시점에서 2 개의 적색 점이 피크 및 도파민 농도를 표시한다. 타우가 오른쪽에 표시됩니다. d) c)와 동일하지만 b)에서 데이터가 추출됩니다.

http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0058251.g003

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그림 4. 6주의 고지방식이는 도파민 재 흡수 속도를 줄이고 코카인에 대한 도파민 반응을 약화시킵니다.

2 다음에 VTA / SNpc 자극에 의해 유발 된 평균 피크 도파민 농도 (a) 또는 6 주 (b코카인 주입 전 다이어트 노출). CD) 2 이후의 평균 타우 (c) wks 또는 6 wks (d) 다이어트 노출. 타우는 LFD-6 wk 쥐에 비해 HFD-6 wk 쥐에서 유의하게 더 컸습니다 (*p e–f) 2에 대한 코카인 주사 후 피크 유발 도파민 농도의 변화 백분율 (e) 및 6 (f)식이 노출의 주. LFD-6 wk 쥐에 비해 HFD-6 wk에서 변화율이 유의하게 작았습니다 (**p

http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0058251.g004

연장 된 HFD는 코카인에 대한 DA 반응을 감소시킵니다

DAT에서식이 유발 된 변화를 추가로 조사하기 위해, 래트에 DAT 차단제 코카인을 주사 하였다. 전기 자극 후 피크 도파민 농도는 도파민 방출에 의해 야기되지만 DAT에 의한 도파민의 동시 제거에 의해 제한된다 [21]. 우리는 약전 값 (% 변화)에 대한 유발 도파민의 크기 변화를 계산함으로써 도파민 전달에 대한 코카인의 효과를 특성화했다. HFD의 2 개의 wks는 LFD에 대한 % 변화에 영향을 미치지 않았다 (그림 4e; ns). 그러나,식이 노출의 6 wks 후에, LFD에 비해 HFD에서 % 변화가 크게 둔화되었다 (그림 4f; t (10) = 4.014; p<0.01). 우리의 결과는 HFD 노출이 6 주가 아닌 2 주가 코카인에 대한 도파민 반응을 감소 시킨다는 것을 시사합니다.

연장 된 HFD 노출은 시냅 소좀 막에서 DAT 단백질 발현을 감소시킨다

연장 된 HFD의 효과가 DAT 수의 변화에 ​​기인 하는지를 결정하기 위해, DAT 단백질 수준을 총 조직 균질 물 (H 분획), 시냅 소좀 막 (P2 분획) 및 세포 내 재순환 엔도 솜 (P3 분획)에서 정량화 하였다. DAT는 N단백질이 성숙함에 따라 글리코 실화 수준의 증가로 인해 50와 80 kDa 사이의 겉보기 분자량을 갖는-연결된 당 단백질 [32]. 시냅 소좀 막 분획에서 NMDA 수용체 및 엔도 솜 분획에서 트랜스페린 수용체의 NR2B 서브 유닛의 풍부한 발현에 의해 분별이 확인되었다 (예를 들어, 블롯 참조). 그림 5b). 다이어트 노출의 2 및 6 wks 후 총 DAT 단백질에 차이가 없음을 발견했습니다 (데이터는 표시되지 않음). DAT 단백질의 분수 별 차이를 테스트하기 위해 양방향 반복 측정 ANOVA (dietXfraction)를 사용했습니다. 전압 전류 법 실험과 일치하게,식이 노출의 2 wks는 P2 또는 P3 분획에서 DAT 이소 형의 수준을 변경하기에 불충분했습니다 (Fig. 5. c, e, g; 모든 ns). 그러나,식이 노출의 6 주 후, 상당한 dietXfraction 상호 작용이 있었다 (F(1,18) = 8.361, p<0.01); 그림 5d)는 DAT의 50 kD 이소 형에 해당합니다. 따라서, 연장 된 HFD는 P50 분획에서 DAT의 2 kD 이소 형을 유의하게 감소시키고 P3 분획의 증가 경향을 야기시켰다. 우리는 64 kD에식이 요법이나 분수 효과가 없음을 발견했습니다.그림 5f; ns) 또는 70 kD (그림 5h; ns) DAT 이소 형.

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그림 5. 고지방식이를 섭취하면 복부 선조에서 막 관련 DAT 단백질이 감소합니다.

a) 복부 선조에서 취한 (2) 1 x 1 mm 조직 펀치를 나타내는 대표적인 이미지는 DAT 단백질 분석을 위해 결합되었다. VStr = 복부 선조; DStr = 등쪽 선조; cc = 말뭉치; ac = 전방 커미션. b) c.h에 제시된 데이터의 대표적인 서양 얼룩. L = LFD; H = HFD; TfR = 트랜스페린 수용체; NR2B = NMDA 수용체의 NR2B 서브 유닛. c) 50 주식이 노출 후 P2 또는 P3 분획에 대한 2 kD DAT 단백질에는 차이가 없었다. d) 50kD DAT 단백질은 P2에서 현저하게 감소합니다 (* = p<.05), 그러나 LFD-3 wk 래트에 비해 HFD-6 wk에서 복부 선조 조직의 P6 분획은 아니다. 64kD DAT 단백질은 2 개 (e) 또는 6 주 (f) 다이어트 노출. 70 다음에 2 kD DAT 단백질에는 차이가 없었습니다 (g) 또는 6 주 (h) 다이어트 노출.

http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0058251.g005

P2 분획에서 감소 된 DAT 단백질 수준이 부분적으로 DAT 전사 감소로 인한 것인지를 결정하기 위해, VTA / SNc DAT mRNA 수준을 상기와 동일한 랫트에서 측정 하였다 (그림 6a 예를 들어). 다이어트 노출의 2 또는 6 wks 후 midbrain DAT mRNA에서 다이어트 그룹 사이에 차이가 관찰되지 않았습니다.그림 6b–c; 둘 다). 따라서, 복부 선조체 내의 DAT 단백질 수준의 차이는 DAT 생산의 결핍으로 인한 것 같지 않다.

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그림 6. 고지방식이 섭취는 DAT mRNA 수준을 변화시키지 않습니다. 에이)

VTA / SN에서 취하여 DAT mRNA 분석을 위해 결합 된 1 × 1 mm 조직 펀치를 나타내는 대표적인 이미지. cp = 뇌성 penduncle; pc = 후퇴; MM = 내측 유방 핵. 2 주 후에 상대적인 DAT mRNA 수준에는 차이가 없었습니다 (b) 또는 6주의식이 노출 (c).

http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0058251.g006

토론

장기간의 HFD 소비는 중추 신경계 내에서 DIO 및 가소성을 유발할 수 있습니다. 도파민 뉴런 및 선조 도파민 수용체는 HFD 및 비만인 사람에 의해 영향을받는 CNS 표적의 한 세트 인 것으로 보인다 [11], [13], [33]. 여기 우리 HFD 복 부 선조에서 도파민 재 흡수 속도 감소 보고이 효과 노출 기간에 의존했다. 중요한 것은 DAT 기능이없는 상태에서 DAT 기능에 대한 HFD의 영향이 발생했다는 것입니다. 우리는이 연구에서 신체 지방의 마커를 직접 측정하지는 않았지만, 동물은 전통적으로 HFD에 노출 된 후 체중 증가만을 기준으로 DIO 또는식이 저항성으로 분류되었습니다 [34]. 연장 된 HFD는 DAT를 방해하는 코카인의 능력을 현저하게 약화시켜 도파민 방출의 크기를 강화시켰다. 본 발명자들은 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 복부 선조체에서 DAT 단백질 수준을 정량화 하였다 – 세포막 분획 내에서 국부 화 된 DAT를 원형질 막 또는 재순환 엔도 솜으로 농축시키는 것을 구별 하였다. 우리는 원형질 막과 관련된 DAT의 미성숙 이소 형에서 현저한 감소를 발견했다. 따라서, 연장 된 HFD는 DAT 트래 피킹 또는 성숙을 방해 할 수 있지만 DAT 유전자 발현 또는 DAT mRNA 안정성을 감소시킴으로써 DAT를 통한 도파민 재 흡수 속도를 감소시키는 것으로 보인다. 또한, HFD에 2-6 주 노출 된 기간은 DAT에 대한식이 유발 소성에 대한 가장 빠른 팁 포인트 인 것으로 보인다.

비만은 두 사람 모두에서 DAT 이용 가능성을 포함하여 선조체 도파민 신호의 여러 측면과 관련이 있습니다. [18] 및 마우스 [19]. 그러나 최근에야 DIO의 발달이 쥐의 도파민 재 흡수 속도를 변화시키는 것으로 나타났습니다 [20]. 이 연구는 4 주 HFD 후 외 인적으로 적용된 도파민에 이어 손상된 도파민 재 흡수를 보여 주었지만, HFD에서 유지 된 동물은 초기 체중 증가에 기초하여 선택되었으며, 따라서 고유 한 집단을 나타낼 수있다. 이러한 견해에 따라, HFD 동물은 LFD 대조군에 비해 더 많은 칼로리를 계속 섭취하고 체중이 증가했습니다. 최근의 다른 연구에 따르면 교배 쥐에서 12 주 동안 HFD 후 도파민 재 흡수 장애가보고되었습니다 [35]. 그러나, 재 흡수 측정이 이루어질 때 표준 실험실 차우식이에 대해 HFD를 공급 한 동물들 사이에 체중의 상당한 차이가 있었다. 따라서, 도파민 재 흡수 장애가 DIO 개발의 직접적인 결과인지 또는 선행인지에 대해서는 확실하지 않다. 이 최근 보고서와 달리 재 흡수 측정을 할 때식이 그룹간에 체중 또는 총 kcal 소비에 차이가 없음을 발견했습니다. 우리가 6가 아닌 2 후 도파민 재 흡수의 차이를 발견했지만, HFD의 주들은 도파민 재 흡수의식이 유발 변화가식이 성분의 만성이지만 급성이 아닌 변화에 대한 반응임을 시사합니다. 또한, 우리의 결과 비만 결과 대신 DAT의 다이어트 유발 변경 질병의 발전에 기여할 수 있습니다 것이 좋습니다. 미래의 연구는 DIO에 차별적으로 영향을받는 동물 개체군을 다룰 필요가있을 것이다 [34] DAT 발현 / 기능에 기존의 차이가 있거나 DAT의식이 유발 된 변화에 차별적으로 영향을 받는다.

우리가 아는 한, 이것은 HFD가 코카인에 대한 도파민 반응을 감소 시킨다는 것을 보여주는 첫 번째 연구입니다. 약물 보상에서 도파민의 역할을 감안할 때, 우리의 결과는 약 6 주 동안 HFD를 먹인 쥐가 통제식이를 먹은 동물보다 코카인 자체 투여를 얻는 데 느리다는 것을 보여주는 이전 연구와 일치합니다 [36]. 중요하게도이 효과는 DIO 개발과 무관합니다. 추가로, DIO에 대한 감수성을 위해 선별 적으로 사육 된 랫트는 코카인의 선호도가 감소되어 코카인의 보람 특성이 이들 동물에서 둔화됨을 시사한다 [37]. HFD-6 wk 쥐에서 관찰 된 코카인에 대한 감소 된 반응은 감소 된 선조 DAT 이용 가능성에 기인 할 수있다. 그러나, 코카인은 또한 비 -DAT 의존적 메카니즘을 통한 도파민 신호 전달을 증가시킨다. 특히, HFD는 예비 도파민 소포의 코카인 유발 동원을 손상시킬 수있다 [38]. 코카인은 또한 VTA 내에서 도파민 뉴런으로 GABA 전달을 약화시킵니다 [39] 도파민 세포체의 발사 속도에서 진동을 유발합니다 [40]. 이러한 프로세스 중 일부 또는 전부가 HFD의 영향을 받았을 수도 있습니다. 향후 연구는 HFD가 코카인의 보람적인 측면 및 / 또는 약물 유발 신경 적응의 가능성을 수정하는 방법의 기본 메커니즘을 다루어야합니다. [18]. HFD의 소비는 행동을 모두 약화시킵니다 [41] 도파민 반응 [20], [42] 암페타민, DAT를 방해합니다. 중요하게도, HFD 섭취가 조절식이를 섭취 한 쥐의 칼로리와 열적으로 일치하는 쥐는 DIO를 개발하지는 않지만 여전히 암페타민 조건부 선호도를 개발하지 못합니다 [41]. 여기에 제시된 데이터와 함께, HFD의 소비는 정신 자극제에 대한 반응을 둔화시키는 것으로 보입니다. 모든 남용 약물은 도파민 시스템에 영향을 미치며 약물로 인한 도파민 신호 전달 강화는 중독의 발달에 중요한 것으로 생각됩니다 [43]. 따라서, HFD 랫트에서 코카인에 대한 감소 된 반응은 비만인 인간이 물질 남용 장애를 일으킬 위험이 상당히 낮다는보고와 일치한다 [44]. 장래의 연구는 코카인 보상의 주관적인 등급이 비만 환자에서 정상 체중 조절과 비교하여 다른지 여부를 해결해야합니다.

우리의 웨스턴 블롯 분석은 HFD의 연장 된 소비가 총 선조 DAT 단백질에 영향을 미치지 않지만 대신 글리코 실화되지 않은 50 kDa DAT 이소 형의 시냅 토솜 막으로의 통합을 감소 시킨다는 것을 제안한다. DAT 글리코 실화는 도파민 수송 속도를 향상시키고 막 표면 안정성을 증가시킨다 [45], [46], [47], 인간으로부터의 당화되지 않은 DAT [45], [46] 쥐뿐만 아니라 [47] 도파민을 쉽게 운반합니다. 추가로, 면역 표지 실험은 비-당화 DAT의 수준이 원숭이와 인간 둘 다의 등쪽 선조와 비교하여 복부에서 더 높은 것으로 밝혀졌다 [47]. 종합하면, 이들 연구는 50 kDa DAT의 감소 된 막 수준이 6 wk HFD 랫트에서 관찰 된 재 흡수 결핍에 기여할 수 있음을 시사한다. 우리의 데이터는 HFD 소비가 생쥐의 복부 선조에서 DAT 가용성을 감소시키는 것을 보여주는 이전 연구와 일치합니다 [19]. 그러나,이 연구는 다른 세포 내 구획에서 DAT 위치를 측정하지 않았다. 또한, 우리의 연구 결과 DIO 쥐의 선조에서 세포 표면 DAT 감소를 보여주는 연구와 일치 [20]. 이 연구는 또한 총 DAT 단백질 수준이 DIO 모델의식이에 영향을받지 않았다고보고했다. 우리는 총 DAT 단백질이 교외 쥐에서 HFD에 의해 영향을받지 않음을 보여주기 위해이 발견을 확장합니다. 따라서, HFD의 장기간 소비는 DAT 발현을 변화시키지 않지만 DAT 트래 피킹 또는 성숙을 방해 할 수있다.

HFD 노출의 2 또는 6 wks 후 VTA / SNpc DAT mRNA 수준의 차이의 부족은 전반적인 DAT 수준이 우리의식이 조작에 의해 영향을받지 않았다는 개념을 추가로지지한다. 이 결과는 17 주 동안 HFD 소비 후 마우스 VTA에서 감소 된 DAT mRNA를 보여주는 이전 보고서와 대조된다 [12]. 그러나,이 연구에서, 다이어트 그룹이 12 주 동안 체중이 다른 후에 DAT mRNA 수준이 측정되었다. 따라서 결과는 DIO에 대한 후기 단계 적응을 나타냅니다. 요약하면, 본 발명의 데이터는 HFD 에의 노출이 총 DAT 발현을 변경하지 않고 막-관련 DAT를 감소시킴으로써 선조체 도파민 재 흡수의 기능적 변화를 초래한다는 강력한 증거를 제공한다. 중요하게도, 우리는 DAT의식이 유발 장애가 DIO가 발병하기 전에 발생할 수 있다고보고하며, 이러한 변화가 비만의 발달에 기여할 수 있음을 시사합니다.

우리의 데이터는 도파민 기능의 조절에식이 요법을 암시하는 증가하는 문헌에 추가하고,식이 유도 된 DAT 발현의 변화가 도파민 신호 전달의 기능적으로 관련된 변화를 초래한다는 추가 증거를 제공한다. DAT를 통한 선조체 도파민 신호 전달의 역학에서의식이-유도 된 변화는 급식 행동에 영향을 줄 수있다. 음식 관련 자극은 striatal dopamine의 phasic 증가를 일으킨다 [9], [48], [49]식품 관련 행동을 강화하고 강화할 것 [50]. 여기 우리는 HFD 소비의 6 주 도파민 기능이 음식 섭취에 필수적인 선조의 영역에서 막 관련 DATs를 감소시켜 phasic 도파민 방출 기간을 연장한다는 것을 보여줍니다 [51]. DAT의식이-의존적 변경은 음식 자극에 의해 유발 된 연장 된 도파민 신호가 접근 거동에 중요한 낮은 친 화성 선조체 도파민 D1 수용체의 활성화를 증가시키는 피드-포워드 메커니즘을 촉진 할 수있다. [52], [53], [54]. 시간이 지남에 따라, 연장 된 선조체 도파민의 상승은 도파민 D2 수용체 (D2R)의 하향 조절과 같은 적응을 촉진 할 수 있으며, 이는 인간 및 설치류 비만 모델에서 입증되었다 [11], [33]. 우리의 연구는 비만의 발달이 도파민 재 흡수를 변경하는 데 필요한 것은 아니라고 제안합니다. 따라서, 막 DAT의식이 관련 감소가 HFD 소비 과정에서 발생하는 D2R 하향 조절, 비만 및 강박식이 행동의 시작에 기여할 수있다 [11].

감사의

우리는 Drs에게 감사를 표합니다. Jamie D. Roitman과 James E. McCutcheon은 이전 버전의 원고에 대한 유용한 의견을 제공합니다. 본 백서의 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIH 또는 Chicago Biomedical Consortium의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

작성자 기여

실험을 생각하고 설계했습니다 : JJC EHC MFR. 실험 수행 : JJC DNP SRE. 데이터 분석 : JJC EHC SRE MFR. 논문 작성 : JJC EHC MFR.

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