Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2011 Apr; 300 (4) : R876-R884.
온라인 2011 Feb 9 게시. doi : 10.1152 / ajpregu.00655.2010
PMCID : PMC3075076
1,2 추상
우리는 이전에보고 된 바에 따르면, 시상 하부의 아치형 핵으로의 인슐린 투여가 쥐의자가 관리 업무에 의해 평가 된 수 크로스에 대한 동기를 감소 시킨다는 것을보고 한 바 있습니다. 본 연구에서는 수크로오스 자체 투여와 관련된 중추 신경계 (CNS) 활성화의 패턴이 평가되지 않았기 때문에, c-Fos의 발현을 신경 세포 활성화의 지표로 측정 하였다. 우리는 처리 된 대조군에서 c-Fos 발현과 비교하여 CNS에서 c-Fos 면역 반응의 고정 된 비율 (PR) 또는 진보적 인 비율 (PR) 스케쥴 및 매핑 된 표현에 따라 수크로오스에 대해 바 - 프레스하도록 쥐를 훈련시켰다. 우리는 PR 성능의 발현 및 외측 시상 하부 및 하 핵에서의 c-Fos의 발현과 관련하여 내측 시상 하부 (아치형, 방실 상형, 복식 배아, 배 측근 및 흉벽 핵)에서 c-Fos의 독특한 발현을 관찰 하였다 FR 성능의 발현과 관련하여 스트레스 종말의 발생 c-Fos 발현은 FR 및 PR 랫트 모두의 측벽 핵에서 증가 하였다. 우리의 연구는 시상 하부의 에너지 항상성 회로와 변연 회로의 중요성을 강조하여 음식 보상 작업을 수행합니다. 우리의 연구는 에너지 균형의 조절에서 시상 하부의 역할을 감안할 때,이 회로가 에너지 항상성의보다 큰 맥락에서 보상 조절에 기여할 수 있음을 시사한다.
복부 tegmental 영역 (VTA)과 striatum과 피질 사이트에 투영을 포함한 mesolimbic dopaminergic (DA) 회로는 약물 남용의 약물의 다양한 클래스의 동기 부여 또는 보람 측면에서 중요한 역할을하는 것으로 확인되었습니다13, 22-24, 26, 48). 우리 실험실과 다른 연구자들의 최근 연구는이 회로가 마찬가지로 음식의 동기 부여 또는 보람 측면에서 중요한 역할을한다는 것을 시사합니다. 에너지 항상성을 조절하는 회로와의 기능적 및 해부학 적 상호 작용은 동물의 영양 상태에 의한 음식 보상의 조절에 대한보고에 의해 제안된다 (10, 14, 16, 43). 영양 또는 대사 상태에 의한 음식 보상을 포함하는 보상의 조절은 신경 및 내분비 신호에 의해 강하게 영향을받으며, 인슐린 (15), 렙틴 (11, 18, 21, 30, 32), 그렐린 (35), 멜라닌 농축 호르몬 (MCH) (45), orexin (5, 7) : 중추 신경계 (CNS)에서 수용체의 존재, 생화학 적 및 세포 효능 및 이들 신호의 생체 내 또는 행동 적 효능이 최근에 풍부하게 입증되었다.
연장 된 변연 회로 (limbic circuitry)는 먹이 및 식량 보상에있어 역할을하는 것으로 나타났다.2, 19, 28). 그러나 추가로 기여하는 CNS 사이트가 있습니다. 특히, 시상 하부 (lateral hypothalamus, LH)는 오랫동안 수유 및 자기 자극 행동을 매개하는 부위로 알려져왔다4, 31). LH에서의 Orexinergic 뉴런과 렙틴 신호는 먹이와 음식 보상에 중요한 것으로 확인되었습니다 (5, 29, 30). 우리는 최근에 제 3 대뇌 심실 또는 시상 하부의 아치형 핵 (ARC)에 투여 된 인슐린이 자당자가 투여를 감소시킬 수 있지만 VTA 또는 인큐베이터의 인슐린 투여가이 특정 보상 패러다임에 아무런 영향을주지 않음을 관찰했다15). 따라서 여러 개의 시상 하부 부위가 동기 유발 된 음식 탐색과 획득에 중요한 역할을하는 것으로 보이며, 일관되게 이것은 시상 하부 영역이 음식 자체 투여와 관련하여 실질적으로 활성화된다고 가정 할 것이다. 이 가설을 시험하기 위해, 우리는 고정 비율 (FR) 훈련 후 또는 점진적 비율 (PR) 훈련 후에 더 엄격한 과제 인 자당자가 투여 패러다임으로 훈련 된 쥐의 CNS에서 c-Fos 발현을지도 화했다 동기 부여를 평가하기위한20).
대상 및 방법
과목.
대상은 Simonsen (Gilroy, CA)의 수컷 알비노 쥐 (325-425g)였다. 래트는 임의의 사료로 유지되었다. 그들은 오전 12시에 불이 켜진 상태에서 12 : 6-h 명암 주기로 유지되었고 식후 및 흡수 후 조건에서 오전 7 시부 터 정오까지 훈련되고 테스트되었습니다. 쥐에 대해 수행 된 모든 절차는 국립 보건원의 동물 관리 지침을 따르고 VA Puget Sound Health Care System의 연구 개발위원회의 동물 관리 및 사용 소위원회의 승인을 받았습니다.
자당자가 관리.
절차는 게시 된 방법론을 기반으로했습니다 (15), 급여 된 래트에서 수행되었다. 이 실험은 Richardson과 Roberts의 PR 알고리즘을 사용하여 훈련, FR 훈련 및 점진적 비율 (PR) 훈련을 시작하기위한 자영업 (autoshaping),38). PR 알고리즘에는 1, 2, 4, 6, 9, 12, 16, 20, 28, 36, 48, 63, 83, 110, 145, 191, 251, 331, 437, 575, 759, 999, 999, XNUMX이 필요합니다 등) 레버 프레스 세션에서 후속 전달 배달 (38). 쥐들은 액체 방울 용기에 전달 된 5 % sucrose (0.5 ml 보상액)를자가 투여하도록 훈련 받았다. Med Associates (Georgia, VT) 시스템에 의해 제어되는 operant box에는 두 개의 레버가 있었지만 하나의 레버 (활성, 수축 식 레버) 만 주입 펌프를 작동 시켰습니다. 다른 레버 (비활성, 고정 레버)의 프레스도 기록되었습니다. 앞서 살펴본 바와 같이 비활성 레버의 프레스 수는 매우 낮습니다 (10 프레스 / 세션 미만). 자당 용액은 구강 섭취를위한 액체 방울 용기로 전달되었다 (Med Associates, St. Albans, VT). 초기 훈련은 지속적인 강화 계획하에 1-h 세션에서 수행되었습니다 (FR1 : 각 레버 프레스가 강화되었습니다). 각 세션은 활성 레버를 삽입하고 전체 세션 동안 계속 남아 있던 백악관 조명을 밝히는 것으로 시작되었습니다. 5-s의 색조 (배경 위에 2900 Hz, 20 dB) 및 빛 (활성 레버 위의 7.5 W 백색광) 개별 화합물 큐는 각 보상 전달에 수크로오스 전달로 시작하는 20-s 시간 초과와 함께 표시됩니다. FR 훈련은 10 일 동안 수행되었습니다. 안정적인 응답은 다섯 번째 세션에서 이루어집니다. PR 교육은 3 일 동안 가능한 최대 10 h / 일 동안 수행되었습니다. PR 세션은 액티브 레버가 작동하지 않는 30 분이 끝난 후 종료되었습니다.이 시점에서 하우스 표시등이 자동으로 꺼지고 활성 레버가 수축되었습니다. 쥐를 방에서 꺼내어 집에 되찾았다. "중지 시간"은 표 2 시스템이 꺼진 시간을 나타냅니다. 따라서 마지막 활성 레버 누름은 정지 시간 이전에 30 분이 발생했을 것입니다. 행동 데이터 (표 2)는 세션 6-10 FR 훈련을 위해, 그리고 세션 1-9 PR 훈련. 대조군 처리 쥐를 수납실에서 꺼내어 수술실 내 60 분 동안 집안의 조명이있는 깨끗한 수술실에 놓아서 쥐자가 관리 수 크로스의 취급 및 실내 경험을 시뮬레이션했습니다. 그들은 operant 상자에있는 동안 먹거나 마실 것이 아무것도 주어지지 않았고, 레버에 접근 할 수 없었다.
마지막 날에, 쥐를 훈련 일에 따라 챔버에 배치하고 90 분 동안 챔버에 보관 한 후 마취, 관류 및 후속 면역 조직 화학을 위해 제거했습니다. 대조군 쥐도 마찬가지로 시술 실로 가져와 훈련 일에 따라 90 분 동안 깨끗한 작동 실에 보관 한 후 마취하고 관류했습니다. 마지막 90 분 세션 직후, 쥐를 이소 플루 란 흡입으로 깊이 마취하고 0.9 % NaCl로 관류 한 다음 차가운 4 % 파라 포름 알데히드 용액을 주입했습니다. 마취 및 안락사시기는 사건 후 90 ~ 120 분에 c-Fos 단백질의 최고 발현 시간 경과에 근거했습니다. 따라서 c-Fos 발현은 동물이 작업을 경험하고 자당을 섭취 한 결과가 아니라 행동 작업이 시작될 때 CNS의 활성화를 반영합니다. 뇌를 제거하고 파라 포름 알데히드에서 며칠 동안 후 고정시켰다. 그 후 20 % sucrose-PBS에 넣은 후 30 % sucrose-PBS 용액에 넣었다. 뇌는 면역 조직 화학을 위해 저온 유지 장치 (Leica CM 3050S 저온 유지 장치)에서 절편 화되었습니다.
c-Fos 면역 조직 화학 및 정량.
우리는 우리의 확립 된 방법론을 사용하여 뇌 절편에서 면역 반응성 c-Fos 단백질을 정량화했습니다12). 전체 뇌의 초기 정성 스크린은 c-Fos 발현을 위해 수행되었다. 슬라이드 마운트 된 12-μm 전 뇌관 절편을 PBS (Oxoid, Hampshire, UK)에서 3 번 세척 하였다. 이어서 1 % 정상 염소 또는 당나라 혈청이 함유 된 PBS로 실온에서 5 h 동안 차단 하였다. 그런 다음 절편을 PBS로 여러 번 세척하고 PBS로 만든 1 차 항체 용액에서 4 ° C에서 밤새 배양했다. 절편을 PBS로 3 회 세척 한 후 1 h PBS로 만든 2 차 항체 용액에서 실온에서 어두운 곳에서 배양 하였다. 이어서, 절편을 다시 PBS로 세척하고 장착하고 베타 실드 하드 세트 실장 배지 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) 장착 매질로 미끄러지게 하였다. Optiphot 카메라에 연결된 Nikon Eclipse E-800 형광 현미경을 사용하고 Image Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) 소프트웨어를 사용하여 섹션의 디지털 이미지를 획득했습니다.
결과적으로, 조건 사이의 명확한 차이, 정량화 및 신경 세포 표현형에 대한 제한된 수의 영역에 초점을 맞추었다. 특히, 우리는 중추 신경핵과 껍데기 (NAc)에 중점을 두었습니다. 종양 말단의 전방 및 후방 핵 (aBNST, pBNST); (VMH), 시상 하부 (DMH), 방실 핵 (PVN), retrochiasmatic area (RCh), 및 ARC]; 배측 및 시상 하부 및 주변부 (peF) 영역을 포함하는 외측 시상 하부 (lateral hypothalamus, LH); VTA; 두뇌 줄기 [열등한 올리브, 독방의 hypoglossal (nXII) 핵, 옆 망상 핵 및 C1 / A1 아드레날린 / 노르 아드레날린 핵]. Atlas 일치 12-μm 섹션은 Paxinos와 Watson의 아틀라스를 기반으로 일치하는 섹션과 지역에서 c-Fos 표현과 정량을 평가했습니다 (34). 참조하십시오 표 1 특정 stereotaxic 좌표. 분석의 주요 초점은 각각의 행동 과제를 각각의 대조군과 비교하는 것이 었습니다 (PR 대 PRC, FR 대 FRC). 행동 대 통제 조건에 기반하여 가능한 차이를 최적화하기 위해 PR 및 FR 그룹의 최고 성과자를 분석 대상으로 선정했습니다. 따라서, 4 / 12 PR 및 3 / 12 FR 래트를 분석 하였다 : 이들 래트는 각각의 행동 그룹에 대해 평균보다 1 표준 편차 이상 큰 활성 레버 누름 숫자 (주요 행동 종료점)를 가졌다. 대조군 쥐 (5 PRC 및 3 FRC 쥐, FR 또는 PR 쥐와 동시에 프로 시저 룸에 존재)의 하위 코호트도 분석 하였다. PR 젃약 ( "FRext")을 통해 추가 핚 세 쥐 그룹을 채취하여 PR 젃차의 지속 기간을 모방 (즉, PR 쥐가 FR을 거쳐 PR로 이어지는 20 일 동안)하여 FR과 PR의 차이는 행동 과제 또는 절차의 지속 기간 때문이었습니다. FRext 두뇌는 체계적으로 분석 및 선별되지 않았지만, 구체적 결과에 명시된 바와 같이, 비교 정량을 허용하기 위해 관심있는 특정 부위를 다른 네 그룹과 함께 분석 하였다.
정량 분석을 위해 (40 × 배율), 아틀라스 일치 영역을 선택했습니다. ImagePro Plus 소프트웨어 (Media Cybernetics)를 사용하여 원하는 영역의 이미지를 캡처했습니다. 계산을 위해 영역을 정하고 양성 세포 수에 대한 임계 값을 설정했습니다. 각 실험 그룹의 섹션에 대해 동일한 영역과 배경 (임계 값)을 사용했으며, 배경 설정에서 세션 간 변경을 방지하기 위해 모든 실험 그룹에 대해 동일한 세션에서 양성 세포의 소프트웨어 카운팅 (정량)을 수행했습니다. 통계 분석을 위해, 각 영역을 통해 상응하는 또는 완전한 절 ( 표 1)가 가능했다. 특정 지역에 대한 데이터는 해당 지역에 대한 불완전한 양측 대표가있는 경우 쥐에게서 취해지지 않았다.
정 성적 이중 표지 면역 형광 분석.
이중 표지 된 면역 조직 화학을 위해 c-Fos가 정량화 된 래트에서 뇌 절편을 취 하였다. 동물의 행동 성능을 방해하고 싶지 않았기 때문에 펩티드 신경 전달 물질의 시각화를 최적화하기 위해 콜히친으로 전처리하지 않았습니다. 따라서자가 관리 작업과 관련하여 활성화 된 신경 표현형의 시각화가 제한되었습니다. 그러나 여러 CNS 위치에서 활성화 된 뉴런의 표현형 평가를 시작하기 위해 디지털 이미지 (위 섹션에서 설명한대로 획득)를 20 배, 40 배 또는 60 배 (그림 범례에 표시됨) 배율로 촬영했습니다. . GAD (glutamate decarboxylase), TH (tyrosine hydroxylase), CRF, neuropeptide Y (NPY), Agouti 관련 펩타이드 (AgRP) 및 tryptophan hydroxylase에 대한 이중 염색 절차는 c-Fos- 면역 반응 분석과 비슷했습니다 c-Fos-Ab와 다른 4 차 항체 중 하나의 혼합물이 1 ° C에서 밤새 배양하는 데 사용 된 것을 제외하고는 자신의 것입니다. 마찬가지로, 두 20 차 항체는 동일한 용액에 있었으며 실온의 암실에서 50 시간 동안 배양되었습니다. 차단 단계 전에 1 분 500 % 에탄올 세척을 오렉신 분석에 사용했습니다. 52 차 항체의 적절한 희석을 결정하기 위해 초기 최적화 분석을 수행했습니다. 사용 된 1 차 항체는 토끼 항 -c-Fos (800 : 1) (sc-1,000) 및 마우스 항 -c-Fos (1 : 500) (둘 다 캘리포니아 주 산타 크루즈 소재의 산타 크루즈 바이오 테크놀로지 제품); 마우스 항 -GAD (1 : 500), 마우스 항-티로신 하이드 록 실라 제 (1 : 1,000) 및 양 항-트립토판 하이드 록 실라 제 (모두 캘리포니아 주 테메 큘라 소재의 케미 콘 소재); 토끼 항 -CRF (1 : 1,000) (Dr. Wylie Vale, Salk Institute, CA로부터의 선물); 토끼 항 -NPY (1 : 5,000), 토끼 항 -AGRP (3 : 488) 및 염소 항-오염 소 A (1 : 500)는 모두 Phoenix Pharmaceutical (미주리 주 세인트 조셉)에서 제공합니다. 사용 된 1 차 항체는 Cy2,500- 접합 염소 항 토끼 또는 항 마우스 (Jackson Immunoresearch; West Grove, PA), Alexa Fluor 488 염소 항 마우스 또는 항 토끼 또는 당나귀 항 양 IgG (Molecular Probes, Eugene, OR)였습니다. ; 모든 1 차 항체는 500 : 5으로 희석되었습니다. c-Fos / MCH 이중 면역 염색은 연속적으로 분석되었다; 첫째, Alexa-1-goat anti-rabbit (500 : 3) 이차 항체가있는 MCH (20 : 50 XNUMX 차 항체, Millipore)의 경우. 슬라이드를 XNUMX % 정상 염소 혈청으로 재 차단하고 XNUMX 차 항체로 anti-c-Fos (XNUMX : XNUMX) 및 cyXNUMX-goat anti-rabbit에 대해 염색했습니다. 차단 단계 전에 XNUMX 분 XNUMX % 에탄올 세척을 MCH 분석에 사용했습니다.
통계 분석.
그룹 데이터는 텍스트, 표 및 그림에서 평균 ± SE로 표시됩니다. 의의는 다음과 같이 정의됩니다. P ≤ 0.05. 통계적 비교는 실험 그룹 (FR 대 PR) 또는 실험 그룹과 해당 대조군 (PR 대 PRC, FR 대 FRC) 사이에서 페어링되지 않은 Student 's를 사용하여 이루어집니다. t-테스트. Mac OS 버전 용 StatPlus : mac LE 통계 분석 프로그램을 사용하여 활성 레버 프레스와 서로 다른 뇌 영역에서의 c-Fos 발현 간의 Pearson 상관 계수와 동일한 실험 조건에서 다양한 뇌 영역 간의 c-Fos 발현의 상관 관계를 계산했습니다. 2009 년 AnalystSoft. 선형 상관 관계를 테스트했습니다 (Pearson 's R 통계치)를 다른 CNS 영역에서 c-Fos 발현간에 비교 하였다. 우리는 또한 다른 활성화 된 CNS 지역에서의 c-Fos 발현과 행동 사이의 상관 관계를 조사했다. 이러한 상관 관계에 대해 c-Fos 정량을 수행 한 쥐의 FR 및 PR 데이터가 사용되었습니다.
결과
c-Fos 정량 분석.
앞서 살펴본 바와 같이, 활성 레버 프레스의 수는 PR 대 FR 성능에서 유의하게 더 컸다 (표 2), 자당 보상의 수는 FR 성능 동안 더 컸다. PR 쥐의 세션 길이는 약 90 분 (중지 시간 - 30)이었습니다. 표 3 정량화가 수행 된 모든 CNS 영역에서 c-Fos 면역 반응 세포 수를 나열합니다. FR 및 PR 쥐에 대한 c-Fos 발현의 패턴은 Fig. 1. 시상 하부 (medial hypothalamus)의 중대한 활성화가 있었다 (MH어린 아이, ARC, PVN, RCh, DMH 및 VMH의 복합체)를 포함하지만, 각각의 대조군에 비해 FR 레버가 수크로오스 프레싱에 관여하는 래트에서는 전반적으로 활성화되지 않았다. PR 래트의 시상 하부 내에서, 이러한 활성화는 PVN, ARC 및 VMH에서 일어났다 (Fig. 2). PR 레버를 누르는 것이 아닌 FR 레버를 누르는 것은 LH 내에서 중요한 활성화와 관련이 있습니다 (주로 perifornical 영역 내에서 활성화에 기반 함). 능동 레버 프레스 및 시상 하부 c-Fos 발현 모두 FRext 및 FR 그룹 사이에서 유사 하였다 (MH어린 아이, 946 ± 26 및 911 ± 118; ARC, 176 ± 18 및 186 ± 10; LH어린 아이, 468 ± 79 및 378 ± 34; LHpeF, 200 ± 31 및 173 ± 15), 이는 FR과 PR 그룹 간의 발현 양상의 차이가 훈련 / 경험의 지속 기간이 아니라 도구 작업의 성격과 관련이 있음을 시사한다. FR 그룹의 경우 aBNST와 pBNST 모두에서 관찰 된 BNST에서 c-Fos 발현이 유의하게 증가했다. FR 및 PR 레버 누름은 NAc 껍질에서 증가 된 c-Fos 면역 항진 성 뉴런과 관련이있다; c-Fos 수는 FR 레버를 가압 한 래트의 NAc 코어에서 유의하게 증가하였으며, PR 레버를 누르는 래트에서 c-Fos 발현의 증가는 유의하지 않은 경향을 보였다. FR 과제에서는 VTA에서 c-Fos가 증가하지 않았지만 증가 추세는 유의하지 않았다. 마지막으로, c-Fos는 뇌경색 (뇌 신경 XII) 핵에서 유의하게 증가했다.
편도 및 대뇌 피질을 포함하는 다른 CNS 영역에서 c-Fos 발현이 관찰되었다 (Fig. 3). 그러나 PR 및 FR 과제와 관련하여뿐만 아니라 조절 조건에서도 발현이 관찰되었는데 이는 절차의 비특이적 측면 (절차실로의 취급, 이동)이 이러한 활성화를 초래했을 수도 있음을 시사한다. 이 지역의 정량은 수행되지 않았다. 마찬가지로, nXII 이외의 뇌간 영역 내에서의 활성화가 관찰되었지만, 대조 및 업무 관련 조건과 관련하여 발생하였으며, 또한 비 특이 각성 또는 행동 활성화에서 역할을 암시한다.
우리는 다른 CNS 지역에서 c-Fos 발현 사이의 상관 관계를 테스트했습니다. 레버 누르기 그룹의 데이터를 결합하여 LH와 VMH에서 c-Fos 발현 사이에 음의 상관 관계를 발견했습니다. 따라서 VMH의 활성화는 LH (Pearson 's R, -0.7986; t = -3.7534; P = 0.0056). 또한 LH와 VTA (Pearson 's)의 주변부에서 c-Fos 발현간에 유의 한 양의 상관 관계를 관찰했습니다. R, 0.7772; t = 3.493; P = 0.0082),이 두 영역 사이의 알려진 단일 시냅스 연결성과 일치합니다 (참고 문헌의 토론 참조). 2 및 13). FR 성능에 대해 개별적으로 테스트했는지 여부에 관계없이 VTA와 NAc- 쉘에서 c-Fos 발현간에 유의 한 음의 상관 관계를 발견했습니다 (Pearson 's R, -0.9262; t = -4.9125; P = 0.008) 또는 PR 성능 (Pearson 's R, -0.9897; t = -9.7624; P = 0.0103), 선조체와 흑질 사이의 알려진 상호 입력과 일치하여 (VTA2, 13). 우리는 또한 다른 CNS 지역에서 c-Fos 발현과 행동 간의 상관 관계를 테스트했습니다. 레버 프레스 그룹의 데이터를 결합하여 ARC의 c-Fos와 활성 레버 프레스 (Pearson 's R, 0.8208; t = 3.8017; P = 0.0067).
자당 섭취와 자당에 대한 동기 부여로 활성화 된 뉴런의 동정.
뇌 줄기에서, c-Fos 양성 뉴런은 에피네프린 및 노르 에피네프린 (및 도파민)에 대한 속도 제한 효소 인 TH에 대해 양성 면역 염색을 나타내지 않았다; 따라서 이러한 카테콜아민 성 뉴런은 FR 또는 PR 작업에 의해 활성화 된 것으로 보이지 않았다. 그러나 일부 c-Fos 양성 뉴런은 트립토판 hydroxylase에 대한 양성 면역 염색을 보였으며, 세로토닌 뉴런 집단이 활성화되었음을 나타냈다. 도시 된 바와 같이 Fig. 4ARC에서 c-Fos 양성 세포체는 AGRP로 염색 된 섬유로 둘러싸여 있었으며 NPY 섬유 / c-Fos 면역 염색에 대한 비슷한 패턴이 관찰되었다 (표시되지 않음). PVN에서 c-Fos 양성 뉴런은 CRF 양성 뉴런을 둘러싸고있는 것처럼 보였으 나 동시 발현은 관찰되지 않았다 (데이터는 표시되지 않음). Fig. 5 LH에서 orexin과 MCH 모두에 대한 면역 염색을 보여줍니다. Orexin 뉴런은 dLH와 peLH 모두에서 발견되었습니다. 우리는 peLH에서 MCH 양성 뉴런을 관찰했지만, LH의 그 영역에서 본질적으로 c-Fos와의 공 동화는 없었다. 그러나, 우리는 peLH 내에서 orexin 양성 뉴런에서 c-Fos colocalization을 관찰했다 (Fig. 6, 상단), vLH에서 MCH와의 매우 제한된 c-Fos 동시 화 (Fig. 6, 바닥). 랫트는 콜히친으로 전처리되지 않았기 때문에 CRH와 같은 펩타이드 신경 전달 물질에 대해 c-Fos와의 국소화 및 공 동화가 과소 평가 될 수 있다는 점을 재 강조해야한다. 마지막으로, 핵 내에서 코어와 쉘 (Fig. 7), 신경 전달 물질 인 GABA의 합성 효소 인 GAD를 이용한 c-Fos 동시 면역 염색이 FR 및 PR 쥐 모두에서 관찰되었다. VTA 내에서 TH에 대한 강한 염색이있었습니다; 그러나, c-Fos 양성 뉴런은 거의 관찰되지 않았고, TH와 단독으로 공존하는 것처럼 보이지 않았다.
토론
현재 연구에서, 우리는 비교적 초기 단계의 유전자 (c-Fos)의 발현을 사용하여 자당 투여 시작과 관련된 급성 중추 신경 활성화의 패턴을 상대적으로 어려운 과제 (FR) 또는 자당과 같은 보상을 추구하는 동기를 반영하고 변연 회로를 강하게 포함하는 점진적으로 더 도전적인 과제 생각 (22, 24, 49) (PR). 시상 하부의 활성화 패턴은 두 작업간에 차이가 있었는데, FR 과제에서 우세한 LH / 변연 활성화와 PR 작업에서 우세한 내측 시상 하부 / 변연 활성화가 차이가났다. Fig. 1). 이에 대한 몇 가지 이유가 있습니다. 첫째, 이러한 패러다임은 CNS에서 질적으로 다른 경험으로 "매핑"될 수 있습니다. FR 성능 훈련을받은 래트는 쉽고 높은 보상을 기대합니다. 보람있는 음식을 기대하는 것은 FR 쥐에서 관찰되는 c-Fos 패턴에 크게 영향을 미쳐야합니다. 뚜렷한 활성화 패턴의 질적 차이는 PR 동물이 단순히 경험에 대한 경험이 많을 가능성이 적음을 시사하며 20 FR 세션을받은 쥐의 시상 하부에서 c-Fos를 측정 한 결과 , 이는 PR 그룹이 아닌 FR 그룹과 비슷한 활동을 보였다. 이 두 가지 가능성은 체계적으로 FR 훈련의 어려움을 증가시키고 CNS 활성화의 변화를 평가함으로써 시험 될 수 있는데,이 경우 CNS 활성화의 변화 패턴을 활성화 패턴의 질적 변화를 예측할 수 있습니다. 그러나 훈련 경험의 수는 CNS 활성화 패턴을 설명하지 못할 수도 있지만 세션에서 자당 보상의 평균 수는 다음과 같을 수 있습니다. PR 작업은 단순히 "덜 보람있는"경험으로 학습 될 수 있으며 이것은 LH 활성화의 부족. 따라서 세션 시작시 CNS 활성화 패턴은 조건부 패러다임과 같은 인터셉트 상태를 반영 할 수 있습니다. 변연 회로 내 활성화 강도는 학습과 동기 부여와 관련되어 있습니다. 우리는 FRC 동물의 시상 하부에서 c-Fos 발현의 다양성을 관찰했다. 특히 PVN 내에서, 이러한 가변성은 FR 쥐에서 증가 된 c-Fos 대 FRC 쥐에 대한 경향이 관찰되는 (즉,표 3). 그러나 전반적인 내측 시상 하부 활성화는 FR과 FRC 동물간에 차이가 없었다.
우리의 목표는 행동의 시작에 기여하는 CNS 사이트를 확인하는 것이었지만 시간적 해결은 다소 고려 사항이라는 점에 유의해야합니다. 아래에 설명 된 바와 같이, 도구 또는 operant 행동의 다른 하위 구성 요소가 뉴런의 다른 인구의 활성화에 의해 중재된다는 것을 알게되었습니다 (13, 23, 33, 49). 매우 즉각적인 바 누르기 나 보상의 핥기로 인한 활성화가 우리가 관찰 한 활성화 패턴에 어느 정도 기여했을 수도 있다는 것을 완전히 배제 할 수 없습니다. 우리의 연구 결과는자가 관리 업무의 여러 측면 또는 구성 요소에서 특정 CNS 사이트의 역할에 대한 추가 조사의 기초를 제공하고 그러한 연구를 위해 다른 "켜짐"및 "꺼짐"시간 경과와 함께 다른 즉각적인 초기 유전자를 측정합니다 (36) 매우 유용 할 것입니다.
서로 다른 두뇌 영역 사이에서 c-Fos 발현에서 발견 된 상관 관계는 LH와 VMH 사이, LH 주변 영역과 VTA와 같은 특정 보상 과제에 대한 시상 하부 및 원 발적 변연계의 알려진 기능적 연결성을 지원합니다 (참고 문헌의 토론 참조). 2 및 13). 우리는 또한 다른 활성 영역에서의 c-Fos 발현과 행동 사이의 상관 관계를 조사했다. ARC와 활성 레버 프레스의 c-Fos 사이의 상관 관계는 음식물 섭취에있어 ARC 활동의 명확한 역할에 적합합니다 (1); ARC에 대한 인슐린 주사가 자당 자체 투여를 감소 시킨다는 이전 관찰과 함께15); 코카인 자체 투여 (coocaine self-administration)의 획득 및 수행에서 ARC 및 그의 엔도 포르 민성 뉴런의 결정적인 역할에 대한 이전의보고40-42); 그리고 ARC에서 NAc까지의 확인 된 투영과 함께17). 따라서 ARC는 음식을 비롯한 여러 종류의 보람있는 자극을 찾고 획득하려는 동기 부여 된 행동에서 중요한 역할을 할 가능성이 큽니다. 마지막으로, 우리는 PR sucrose-seeking의 발병과 함께 PVN과 VMH의 중요한 활성화를 관찰했다. 이것은 음식물 섭취의 조절, ARC와의 직접적인 시냅스 연결성 및 변연 회로와의 연관성을 확인하는 데있어 이러한 시상 하부 핵의 잘 특징 지어진 역할과 일치합니다 (1, 27, 37).
우리는 VTA에서 NA-shell까지의 c-Fos 발현과 FR 또는 PR 성능을 테스트 한 결과간에 유의 한 음의 상관 관계를 발견했다. 더 강한 VTA 활성화가 PR 또는 FR 자당 자체 투여 (각각의 대조군)와 관련하여 관찰되지 않았다는 것은 다소 놀랍다. 아마도이 발견은 우리의 측정 시점을 반영하며, 작업이 시작될 때 활성화 된 잠재적 인 CNS 사이트에 초점을 맞추고 있습니다.이 CNS 사이트는 이러한 동물에 대해 잘 훈련 된 것입니다. 이것은 슐츠 (Schultz)의 관찰과 논문과 일치 할 것이다.44), 도파민 신경 세포의 활성화가 예기치 못한 자극이나 보상의 지표 역할을하며, 이러한 활성화는 훈련과 관련하여 감소합니다. 그러나, 훈련 된 동물에서 자당 복용 중 선조체 도파민 방출은 매우 정확하고 시간적으로 분리 된 사건으로 나타났다39). 따라서 우리가 관찰 한 경향은 더 큰 연구 그룹 (즉, 더 많은 통계적 힘)으로 매우 중요 할 수 있습니다. 우리는 FR 및 PR 자당 복용 개시와 관련하여 NAc 활성화를 관찰 하였다. NAc 뉴런의 활성화와 억제는 도구의 보상 성과와 관련하여보고되었으며, 활성화 / 활동의 패턴은 훈련과 환경에 따라 달라지며 행동의 다른 구성 요소와 관련이있다 (예 : 방향, 접근, 섭취).6, 33, 50). 상기 논의 된 바와 같이, c-Fos의 측정은 그러한 특정 활성을 포획하지 않을 것이다. Carlezon은 "보상"이 NAc 뉴런의 활동 감소, 즉 중년의 가시 뉴런 (nucleus spiny neurons)의 감소와 주로 관련되어 있다고 제안했다3). 이것은 중성 가시 뉴런 (GABA 신경 전달 물질)의 활성화와 일치하는 GAD와 함께 colocalized 처리 컨트롤 및 c-Fos 양성 뉴런과 비교하여 우리의 관측과 일치하지 않습니다 - NAc 신경 세포의 억제를 특별히 평가하지는 않았습니다 ". NAc 활성화 및 억제는 해부학 적 및 시간적 특이성을 모두 갖춘 도구 작업 동안 발생할 수 있습니다. 이 연구의 관점에서 볼 때, NAc는 도구 적 자당 복용의 개시에 관여하며 NAc 코어는 운동 활성화에 기여하고 NAc 셸은 운동의 모티브 및 동기 부여 측면에 기여한다고 결론 지을 수있다.
우리는 또한 FR 쥐의 BNST (전방 및 후방)의 주요 부위의 활성화를 관찰했다. BNST는 반복적 인 자극 경험에 대한 신경 내분비 반응을 조절하는 변연 회로의 일부입니다 (8, 9), 그리고 더 큰 의미에서, 재발 성 자극에 관한 학습과 관련되어있다. BNST는 반복적 인 스트레스 경험과 관련하여 그 역할이 가장 포괄적으로 밝혀졌지만, BNST는 반복적 인 긍정적 인 스트레스 자극뿐만 아니라 반복적 인 스트레스 자극에 대한 CNS 반응을 조절할 수 있습니다. 우리는 PR의 시작 시점에서 이러한 활성화를 관찰했으나 PR 성과는 관찰하지 않았기 때문에 BNST 모집은 FR 훈련의 증가 된 자당 보상에 연결될 수 있습니다. CRF 뉴런의 직접적인 활성화에 대한 우리의 관찰은 수크로오스에 대한 도구 적 반응은 주요한 스트레스 요인이 아님을 시사한다. 그러나, 다른 PVN 뉴런의 c-Fos 발현은 스트레스 회로의 조절과 일치한다 (46). 사실 울리히 라이 (Ulrich-Lai) 연구팀은 다른식이 요법 / 섭식 패러다임을 사용하여 자당 섭취가 PVN 기능을 조절한다고보고했다47). 마지막으로 우리는 PR과 관련하여 hypoglossal 신경의 핵 활성화를 관찰 하였지만 FR 성능은 관찰하지 않았다. 이것의 중요성은 오직 추측 될 수 있습니다. 하나의 가능성은 자당 보상의 섭취량이 적은 쥐에서 자당의 맛 관련성이 높아질 수 있다는 것입니다.
자당 찾기 및 자당 복용은 섭취가 자당의 칼로리 함량과 관련된 말초 신호뿐만 아니라 요법 및 세션 내 alliesthesia를 초래할 수 있으므로 시간에 역동적 인 다 모드 경험으로 간주되어야합니다 (25). 우리의 연구가 말초 내분비 신호, 즉 인슐린과 렙틴의 영향에 초점을 맞추어 식품 보상을 조정하는 동안, 그 효과는 단기적 또는 장기적으로 역할을하는 송신기 및 신경 펩타이드에 의해 중앙에서 직접 매개 될 수 있습니다 먹이 또는 식량 보상 (Ref. 14). 현재의 연구는 이에 대한 통찰을 제공한다. 우리는 orexigenic 두 neuropeptides, MCH 또는 orexin 중 하나를 표현 뉴런의 일부 활성화를 관찰했다. 이러한 결과는 실제로 콜히친이 아닌 쥐에서 면역 세포 화학이 두 신경 펩타이드의 시각화를 제한하지 않으므로 음식 보상에서 MCH 또는 orexin의 역할을 과소 평가할 수 있습니다. LH에서 활성화 된 orexin 뉴런의 동정은 먹이에 대한 orexin 뉴런, 음식 보상 및 좀 더 일반화 된 자극 보상 (예 : 5, 7, 29)과 관련된 수많은 연구와 전반적으로 일치합니다. 우리는 peFLH orexin 뉴런의 활성화를 관찰했습니다. 애스턴 존스 (Aston-Jones)와 동료5)는 보상 행동에서 LH orexin 뉴런의 다른 집단의 역할을 해부하고 보상 그 자체와는 반대로, 흥분 상태의 peFLH orexin 뉴런을 연루시켰다. 따라서 우리의 연구 결과는 자극적 인 LH orexin의 역할과 자당 복용에 대한 활성 레버 또는 신호에 대한 방향을 제시합니다.
미래의 배려의 가치가있는 것은 보람있는 자극으로서의 자당의 유일성 또는 일반화 가능성입니다. 우리가 여기서보고 한 조기 중추 신경 활성화의 패턴이 자극으로 음식에 특유한 것인지 아니면 다른 보람있는 자극으로 일반화 될 것인지에 대해서는 아직 결정이 남아 있습니다. 상기에서 언급 한 바와 같이, 특히 FR 과제에서 언급 된 바와 같이, 많은 자당 보상 섭취는 호르몬 방출 (예 : 콜레시스토키닌, 그렐린, 인슐린)의 조절 및 말초 및 CNS 신경 활성화의 변화와 함께 대사 결과를 가질 것으로 예상된다. 이러한 변화는 우리가 측정 한 초기 CNS 활성화 패턴에서 직접적인 역할을 할 것으로 기대되지는 않지만 훈련 중 자당 보상에 대해 학습하는 데 중요한 역할을 할 수 있습니다. 다시, orexin과 같은 neuropeptides는 비판적으로 연루 될 수 있습니다.
우리의 연구는 우리의 지식에 따라 항상성과 스트레스 반응성에 관여하는 PVN과 에너지 항상성에 결정적인 ARC를 포함하여 자당자가 투여가 시작될 때 특정 시상 하부 핵의 활성화에 대한 첫 번째 증명을 나타낸다. 영양 감각, 음식물 섭취 조절. 중요한 것은, 우리는 시상 하부 및 NAc의 활성화가 PR 개시와 관련하여 관찰 됨으로써, 항상성 및 일부 변연 사이트가 자당자가 투여의 개시에 역할을한다는 것을 시사한다. 추가 limbic 회로 사이트는 작업의 나중 시점에 모집 될 수 있습니다.
전망과 의의
역사적으로 동기 부여 및 보상 행동에 대한 연구가 CNS 변연 회로를 가장 강하게 암시하는 반면, 변연계와 에너지 항상성 회로 사이의 중요한 기능적 상호 작용을 강조하는 많은 증거가 발생했습니다. 현재 연구는 자당에 대한 동기 부여 작업에서 특정 시상 하부 핵의 중요성을 제시합니다. 이 연구에서 외삽 해보면, 앞으로의 연구는 시상 하부의 역할이 필수적인지 여부와 그 활성화가 학대 약물과 같은 다른 보상을 찾는데 동기 부여되는지 여부를 평가할 수 있습니다. 또한,이 연구의 발견은 비만과 같은 변화된 내측 시상 하부 생리와 함께 상황에서 동기 부여 된 행동의 변화를 연구하기위한 이론적 근거를 제공한다.
보조금
이 연구는 National Institutes of Health Grant DK40963에 의해 지원되었습니다. Dianne Figlewicz Lattemann 박사는 워싱턴 시애틀의 Puget Sound Health Care System의 재향 군인 문제 담당 부서의 선임 연구 경력 과학자 인 생물 의학 연구소 연구 프로그램입니다. Sipols 박사는 과학 라트비아 공의회 04.1116의 지원을받습니다.
감사의 글
우리는 Drs. Yavin Shaham, Stephen Benoit, Christine Turenius 및 JE Blevins에게 조언과 도움이되는 토론을 제공합니다.
참조
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