정면 정신과. 2018; 9 : 81.
온라인 2018 Mar 12 게시. doi : 10.3389 / fpsyt.2018.00081
PMCID : PMC5858605
PMID : 29593587
추상
배경
인터넷 및 온라인 게임의 중독성 사용은 인터넷 게임 장애(IGD)라고 하는 잠재적인 정신 장애입니다. 변경된 마이크로RNA(miRNA) 발현 프로필이 특정 정신 장애가 있는 환자의 혈액 및 뇌 조직에서 보고되었으며 바이오마커로 제안되었습니다. 그러나 IGD에서 혈액 miRNA 프로필에 대한 보고는 없습니다.
행동 양식
IGD 관련 miRNA를 발견하기 위해 TaqMan 저밀도 miRNA 어레이를 사용하여 51개 샘플(IGD 25개 및 대조군 26개)의 miRNA 발현 프로파일을 분석했습니다. 검증을 위해 36개의 독립적인 샘플(20개의 IGD 및 16개의 컨트롤)로 정량적 역전사 PCR을 수행했습니다.
결과
발견 및 독립적 검증을 통해 우리는 IGD 그룹에서 상당히 하향 조절된 200개의 miRNA(hsa-miR-3c-26p, hsa-miR-5b-652p, hsa-miR-3-22p)를 확인했습니다. 95가지 miRNA 변형이 모두 있는 개인은 변형이 없는 사람보다 IGD의 위험이 훨씬 더 높았으며 [odds ratio (OR) 2.29, 211.11% CI 2–2], OR은 변형된 miRNA의 수에 따라 복용량이 의존적으로 증가했습니다. XNUMX개의 miRNA의 예측된 표적 유전자는 신경 경로와 연관되었습니다. 우리는 웨스턴 블롯을 통해 XNUMX개의 다운스트림 표적 유전자의 단백질 발현을 조사했으며 GABRBXNUMX 및 DPYSLXNUMX의 발현이 IGD 그룹에서 유의하게 더 높았음을 확인했습니다.
결론
우리는 hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p 및 hsa-miR-652-3p의 발현이 IGD 환자에서 하향 조절되는 것을 관찰했습니다. 우리의 결과는 IGD의 병리 생리학을 이해하는 데 도움이 될 것입니다.
개요
인터넷 및 인터넷 기반 게임의 중독성 사용은 광범위한 인터넷 액세스 인프라를 갖춘 국가에서 발생하는 사회적 현상일 뿐만 아니라 인터넷 게임 장애(IGD)라고 하는 잠재적인 정신 장애입니다.1-3). 역학 보고서에 따르면 청소년의 IGD 유병률은 국가별로 0.8~26.7%로 다양합니다(4). 특히, 한국, 중국, 대만, 홍콩, 싱가포르 등 많은 아시아 국가에서 청소년의 유병률이 10% 이상이라는 연구 결과가 있습니다.4). IGD는 인지, 심리 사회적 관계 및 일상 생활의 손상과 관련이 있습니다. 예를 들어, 학업 또는 직업 수행 능력 저하(4-7). IGD는 현재 정신 장애 진단 및 통계 편람(DSM-V) XNUMX차 개정판의 섹션 III(추가 연구를 위한 조건)에 포함되어 있습니다.8). 그러나 임상 사회적 중요성에도 불구하고 IGD의 분자 유전 메커니즘에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다.
최근의 대규모 쌍둥이 연구는 IGD에 대한 유전적 배경을 제시했습니다.9, 10). Vinket al. 네덜란드 Twin Register에서 5,247명의 일란성 및 이란성 청소년 쌍둥이를 대상으로 강박적인 인터넷 사용의 개인차를 조사했으며 그 차이의 48%가 유전적 요인에 의해 설명되었다고 보고했습니다.9). Li et al. 825쌍의 중국 청소년 쌍둥이를 관찰하고 유전적 요인이 차이의 58~66%를 설명한다고 보고했습니다.10). 따라서 도파민 수용체 D2 유전자와 같이 신경전달, 인지, 주의에 관여하는 유전자의 다형성(DRD2), 카테콜아민-O-메틸트랜스퍼라제 유전자(COMT), 세로토닌 수송체 유전자(5HTTLPR), 콜린성 수용체 니코틴성 알파 4 유전자(CHRNA4)은 인터넷 중독과 상당한 관련이 있는 것으로 보고되었습니다(11-13). 최근에는 Kim et al. 차세대 시퀀싱 분석을 통해 신경전달물질의 생산, 작용 및 대사와 관련된 100개 이상의 후보 유전자 변이체를 선별하여 rs2229910의 NTRK3 유전자는 IGD(14).
유전적 요인 외에도 microRNA(miRNA)를 포함하는 non-coding RNA에 의해 신경행동 표현형이 후생유전학적으로 조절된다는 것도 잘 알려져 있다.15, 16). miRNA는 작은 비코딩 단일 가닥 RNA 분자(약 20-23개 뉴클레오티드 길이)로, mRNA를 분해하여 단백질 코딩 유전자의 발현을 부정적으로 조절하고 다양한 질병의 병태생리학적 과정에서 중요한 역할을 합니다.17). miRNA가 인간 중추신경계(CNS)에 풍부하고 중추신경계의 발달과 성숙에 관여하는 표적 유전자의 발현 수준을 미세 조정하는 역할을 한다는 증거가 있습니다.15). 실제로, 최근 연구에서는 miRNA 발현 프로필이 정신 장애가 있는 환자의 뇌 조직에서 변경되어 그들의 발현 프로필이 정신 장애에 대한 바이오마커가 될 수 있음을 시사합니다.15, 16, 18). 예를 들어 사후 분석을 통해 Lopez et al. 주요 우울증 환자의 전두엽 피질 조직에서 대사성 글루타메이트 수용체-1202 유전자의 발현을 조절하고 항우울제에 대한 반응을 예측하는 miR-4의 발현이 하향 조절된다고 보고했습니다.19). 바이오마커 스크리닝 측면에서 이 접근법은 스크리닝을 위한 CNS 조직의 생검을 수행하는 것이 불가능하기 때문에 분명한 한계가 있습니다. miRNA는 혈액(혈장 또는 혈청)에서 검출될 수 있기 때문에 순환하는 miRNA는 신경정신병 장애에서 비침습적 바이오마커로서 확실한 이점이 있습니다. 그러나 지금까지 IGD에서 순환하는 miRNA 프로필에 대한 연구는 없었습니다. 순환하는 miRNA 발현 프로파일에 대한 더 나은 이해는 IGD 개발 메커니즘을 명확히 하고 임상 번역을 용이하게 하는 데 도움이 될 수 있습니다.
이 연구에서 우리는 IGD와 대조군 사이에서 차별적으로 발현되는 혈장 miRNA를 관찰하여 IGD 관련 miRNA 마커를 확인하고 생물학적 의미를 탐구했습니다.
재료 및 방법
연구 주제
DSM-V IGD 점수를 사용하여 3,166명의 청소년(12~18세)을 대상으로 설문조사를 실시했습니다. 이중 251명(남성 168명, 여성 83명)이 DSM-V 기준에 따라 IGD로 진단되었다.8). 총 91명의 개인(49명의 IGD 및 42명의 대조군)이 이 연구에 대해 정보에 입각한 동의를 제공했습니다. 이 중 제외 기준에 따라 87명이 제외되었다. 마지막으로, 45명의 개인(42명의 IGD 피험자와 51명의 건강한 대조군 개인)이 이 연구에 등록되었습니다. 그 중 25명의 참가자(IGD 환자 26명과 대조군 2014명)가 2016년부터 36년까지 발견 세트로 모집되었습니다. 나머지 20명의 참가자(IGD 환자 16명과 대조군 2016명)는 XNUMX년부터 독립적인 검증 세트로 모집되었습니다. 모든 참가자는 서울성모병원(서울, 대한민국)과 서울대학교 보라매병원(서울, 대한민국)에 등록된 한국인이었습니다. 모든 참가자는 Korean Kiddie Schedule for Affective Disorders and Schizophrenia (K-SADS-PL)에 따라 정신과 의사의 구조화된 인터뷰를 받았습니다.20). 모든 참가자는 Korean-Wechsler Intelligence Scale for Children, 4th edition (K-WISC-IV)의 Block Design and Vocabulary 하위 검사를 완료했습니다.21). 충동성은 BIS(Barratt Impulsiveness Scale)로 평가했습니다(22). 성격 차원을 평가하기 위해 BInS(행동 억제 시스템) 및 BAS(행동 활성화 시스템) 척도를 측정했습니다(23). 제외 기준에는 과거 또는 현재의 주요 의학적 장애(예: 당뇨병), 신경 장애(예: 발작 장애, 두부 손상), 정신 장애(예: 주요 우울 장애, 불안 장애), 정신 지체 또는 모든 물질 남용(예: 담배, 대마초, 알코올)이 포함됩니다. 연구 대상의 일반적인 특성은 표에 요약되어 있습니다. Table1.1. 이 연구는 가톨릭대학교 의과대학 임상심사위원회(MC16SISI0120)의 승인을 받았습니다. 모든 참가자와 부모는 서면 동의서를 제출했습니다.
표 1
연구 주제의 일반적인 특성.
| 발견 | 검증 | 결합 | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Control | IGD | P-값 | Control | IGD | P-값 | Control | IGD | P-값 | |
| N | 26 | 25 | 16 | 20 | 42 | 45 | |||
| 연령 (세) | |||||||||
| 중앙값(최소–최대) | 13 (12-17) | 13 (12-15) | 0.759 | 15 (13-18) | 14.5 (12-18) | 0.628 | 14 (12-18) | 14 (12-18) | 0.509 |
| 주간 인터넷 게임 시간(h) | |||||||||
| 중앙값(최소–최대) | 5.25 (2-17) | 18 (6-46) | 1.27E-6a | 5.5 (2-23) | 8 (1-112) | 0.374 | 5.5 (2-23) | 14 (1-112) | 1.63E-5a |
| 월가계소득(백만원) | |||||||||
| 중앙값(최소–최대) | 5 (1-9) | 3 (1-9) | 0.588 | 4 (4-4) | 2 (2-2) | 1.000 | 5 (1-9) | 3 (1-9) | 0.460 |
| 교육 (년) | |||||||||
| 중앙값(최소–최대) | 8 (7-9) | 8 (7-9) | 0.584 | 12 (12-12) | 6 (6-13) | 0.305 | 8 (7-12) | 8 (6-13) | 0.269 |
| K-WISC: 블록 설계 | |||||||||
| 중앙값(최소–최대) | 10.5 (4-17) | 10 (4-16) | 0.544 | 10 (3-16) | 12.5 (4-15) | 0.125 | 10 (3-17) | 11 (4-16) | 0.598 |
| K-WISC: 어휘 | |||||||||
| 중앙값(최소–최대) | 9 (5-17) | 7 (5-13) | 0.174 | 9.5 (8-15) | 11.5 (5-15) | 0.595 | 9 (5-17) | 9 (5-15) | 0.527 |
| KS | |||||||||
| 중앙값(최소–최대) | 24 (17-36) | 37 (22-51) | 3.81E-6a | 29 (17-34) | 59 (22-108) | 1.2E-5a | 25 (17-36) | 40 (22-108) | 2.05E-10a |
| BIS | |||||||||
| 중앙값(최소–최대) | 63 (35-75) | 67.5 (45-81) | 0.080 | 61 (45-79) | 63 (32-82) | 0.835 | 62 (35-79) | 65 (32-82) | 0.240 |
| BAS | |||||||||
| 중앙값(최소–최대) | 31 (15-40) | 31 (13-51) | 0.558 | 36.5 (22-48) | 34 (27-52) | 1.000 | 32 (15-48) | 34 (13-52) | 0.637 |
| 쓰레기통 | |||||||||
| 중앙값(최소–최대) | 18 (10-26) | 17.5 (13-27) | 0.642 | 18.5 (12-25) | 20 (13-21) | 0.138 | 18 (10-26) | 19 (13-27) | 0.302 |
IGD, 인터넷 게임 장애 환자; KS, 한국 인터넷 중독 성향 척도; BIS, Barratt 충동성 척도; BAS, 행동 활성화 시스템; BInS, 행동 억제 시스템; KRW, 한국 원.
aP < 0.05(Mann-Whitney-Wilcoxon 검정).
TaqMan 저밀도 miRNA 어레이(TLDA) 실험
혈액 세포 용해를 최소화하기 위해 각 참가자로부터 말초 혈액을 채취하여 4시간 이내에 실험실로 옮겼습니다. 시료를 실온에서 3,000분 동안 10 rpm으로 원심분리하였다. 그 다음, 혈액 세포를 오염시키지 않고 상등액(혈장층)을 수집하였다. 제조사의 지시에 따라 TaqMan miRNA ABC 정제 키트(Human Panel A; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 순환 miRNA를 추출했습니다. 간단히 말해서, 혈장 시료 50µL와 ABC 완충액 100µL를 혼합했습니다. 표적 특이적 항-miRNA 자기 비드와 혼성화한 후, 경계가 있는 순환 miRNA를 100μL의 용출 완충액으로 비드에서 용출했습니다. 발견 단계에서 제조업체의 지침에 따라 TaqMan miRNA ABC Purification Kit(Human Panel A; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 381개의 혈장 샘플(51개의 IGD 및 25개의 대조군)에서 26개의 miRNA를 검사했습니다. Megaplex 역전사 및 사전 증폭 반응은 MegaplexPreAmp Primers Human Pool A 및 TaqManPreAmp Master Mix(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 miRNA 발현 분석을 위한 cDNA의 양을 증가시키기 위해 수행되었습니다. TLDA 패널 A v2.0(Thermo Fisher Scientific)을 ViiA7 실시간 PCR 시스템(Thermo Fisher Scientific)에서 실행하여 miRNA의 발현을 평가했습니다. 각 miRNA에 대한 Ct 값을 결정하기 위해 ExpressionSuite Software v1.0.4(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 원시 데이터를 처리했습니다.
TLDA용 데이터 분석
먼저 각 miRNA의 역치 주기(Ct 값)를 측정했습니다. Ct 값이 >35인 miRNA는 감지할 수 없는 것으로 간주되어 후속 분석에서 제외되었습니다. 모든 Ct 값은 인간 혈장에서 순환하는 가장 안정적으로 발현되는 miRNA 중 하나인 miR-374b의 Ct 값(ΔCt 값)으로 정규화되었습니다.24). 발현의 log2 배수 변화 비율(ΔΔCt 값)은 Bioconductor(25). 각 miRNA 표적의 상대 정량화(RQ)는 2로 정의되었습니다.-ΔΔCt. 두 그룹 간의 발현 차이에 대한 가상 테스트를 위해 대리 변수 분석(SVA)을 적용하여 실험에서 배치 효과와 같은 이질성을 포착했습니다. 수바 Bioconductor의 패키지(26). 를 가진 miRNA P-값 <0.05는 두 그룹 간에 유의미한 차이가 있는 것으로 간주되었습니다.
유전자 세트 강화 분석
유전자 집합 농축 분석을 위해 ToppGene Suite의 ToppFun을 사용했습니다(27) 상당히 농축된 유전자 온톨로지(GO)를 추론하기 위해(28) 용어, 경로 및 질병 용어. 이 접근법의 입력으로 후보 miRNA의 1,230개의 예상 표적 유전자를 사용했습니다. 경로 분석은 ToppGene 경로에서 KEGG, BioCarta, Reactome, GeneMAPP 및 MSigDB에 따라 예측된 표적 유전자의 유의한 경로를 찾기 위해 사용되었습니다. 기능 농축 용어의 중요성은 Bonferroni 조정을 기반으로 결정되었습니다. P-값.
정량적 역전사 PCR(qRT-PCR) 검증 및 복제
발견 단계에서 차별적으로 발현된 10개의 miRNA를 검증하기 위해 TaqMan MicroRNA Assay(miR-15b-5p, #000390; miR-26b-5p, #000407; miR-29b-3p, #000413; miR-125b-5p, #000449; miR-200c-3p, #002300)를 사용하여 qRT-PCR을 수행했습니다. 337; miR-5-002156p, #411; miR-5-001610p, #423; miR-5-002340p, #483; miR-5-002338p, #652; 및 miR-3-002352p, #7) 및 제조업체의 프로토콜에 따라 ViiA4366596 시스템(Life Technologies). 총 RNA의 2나노그램은 TaqMan MicroRNA 역전사 키트(#XNUMX, Life Technologies)를 사용하여 miRNA 특이적 프라이머를 사용하여 첫 번째 가닥 cDNA로 변환한 다음 TaqMan Probes로 실시간 PCR을 수행했습니다. 각 miRNA의 RQ는 XNUMX로 정의되었습니다.-ΔCt여기서 ΔCt는 내인성 miRNA(miR-374b-5p, #001319)에 대해 정규화된 문제의 샘플에 대한 임계값 주기의 차이입니다. 모든 PCR 반응은 2중으로 수행하였고, 이들의 Ct 값을 평균하였다. 어레이 기반 분석과 동일한 방식으로 각 miRNA의 logXNUMX fold-change ratio(ΔΔCt)를 계산했습니다. 비모수적 Mann-Whitney-Wilcoxon 테스트를 수행하여 임계값이 있는 두 그룹의 miRNA 발현 수준의 차이를 테스트했습니다. P-0.05의 값.
서양 얼룩 분석
각 혈청 샘플은 먼저 MARS-14 컬럼(1 × 2 mm, Agilent Technology, Santa Clara, CA, USA) 웨스턴 블롯 분석 전. MARS-1 컬럼에서 얻은 미결합 분획을 Amicon Ultracel-3 centrifugal filter(14 kDa cutoff)를 이용하여 농축한 후 bicinchoninic acid 방법을 이용하여 단백질 농도를 측정하였다. 동일한 양(4.6~50μg)의 대조군 및 IGD 혈청 샘플을 14~3% Mini-PROTEAN TGX 프리캐스트 겔(Bio-Rad, CA, USA)에서 분리하고 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막으로 옮겼습니다. 다음으로, 막을 실온에서 3분 동안 10% 무지방 분유를 함유하는 TBS-T(30mM NaCl, 4mM Tris-HCl, pH 20 및 190% Tween 25)에서 차단시켰다. 그런 다음 막을 DPYSL7.5(0.05:20, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA), GABRB5(30:2, Abcam, Cambridge, MA, USA) 및 CNR1(500:2, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA), DUSP1(1000:1, MybioSource, San Diego, CA, USA) 및 PI1(100:4, Mybio Source, San Diego, CA, USA) TBS-T에 1% 무지방 분유를 500°C에서 하룻밤 동안 첨가한 다음 소 항-마우스(15:1, Santa Cruz Biotechnology) 또는 염소 항-토끼(500:5, Cell Signaling, Beverly, MA, USA)를 실온에서 4시간 동안 양고추냉이 과산화효소에 접합한 적절한 1차 항체를 사용합니다. 신호 검출은 ECL 시약(GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)과 함께 화학발광을 사용하여 수행되었습니다. TotalLab 1,000D 분석 소프트웨어(Non-linear Dynamics, Newcastle upon Tyne, UK)를 사용하여 웨스턴 블롯 결과를 정량화했습니다. 그런 다음 다른 곳에서 설명한대로 각 샘플의 농도 측정 값을 나누어 농도 측정 비율 값을 계산했습니다 (29). 정규화를 위한 대조군으로, 46개의 IGD 및 대조군 샘플에서 풀링된 혈청 샘플을 모든 실험에 사용했습니다. 임계 값이있는 비모수 Mann-Whitney-Wilcoxon 테스트를 사용하여 통계적 유의성을 결정했습니다. P-0.05의 값.
결과
연구 대상의 특성
연구 대상자의 인구통계학적 및 임상적 특징은 표에 제시되어 있다. Table1.1. 한국인터넷중독 성향척도(K-스케일) 다른 곳에서 설명한 대로(20, 30), IGD 그룹은 대조군보다 K-Scale 중앙값 값이 유의하게 더 높았다(37 vs. 24, P = 3.81 × 10- 6) (테이블 (Table1) .1). IGD 그룹의 주간 인터넷 게임 시간 중앙값은 대조군보다 훨씬 길었습니다(18시간 대 5.25시간, P = 1.27 × 10- 6). 반면 K-WISC, BIS, BInS, BAS의 연령, 월가구소득, 교육기간, 블록설계, 어휘소검사 결과는 두 집단 간에 유의한 차이가 없었다.
IGD와 대조군 사이에서 차등적으로 발현된 miRNA
IGD 관련 miRNA를 발견하기 위해 1단계(발견 및 독립적 검증) 접근 방식을 채택했습니다. 연구 설계 및 전반적인 전략은 보충 자료의 그림 S51에 설명되어 있습니다. 발견 단계에서 우리는 25개의 miRNA를 포함하는 miRNA 어레이를 사용하여 26개 샘플(384개의 IGD 및 10개의 대조군)의 miRNA 발현 프로필을 분석했습니다. XNUMX miRNA의 발현 수준은 IGD와 대조군 사이에 유의미한 차이가 있는 것으로 나타났습니다(표 (Table2) .2). 이 10개의 miRNA의 상대적인 발현 수준은 그림에 나와 있습니다. Figure1.1. 그 중 423개(hsa-miR-5-483p 및 hsa-miR-5-15p)가 상향 조절되었고 5개(hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-337c-5p, hsa-miR-411c-5p, hsa-mi R-652-3p 및 hsa-miR-XNUMX-XNUMXp)는 IGD 그룹에서 하향 조절되었습니다.
표 2
차별적으로 발현된 마이크로RNA(miRNA) 및 접힘 변화.
| miRNA | 발견 | 검증 | 결합 | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| P-값 | 폴드 체인지 | P-값 | 폴드 체인지 | P-값 | 폴드 체인지 | |
| hsa-miR-15b-5p | 0.033 | 0.829 | 0.694 | 1.119 | 0.381 | 0.947 |
| hsa-miR-26b-5pa | 0.008 | 0.871 | 0.049 | 0.841 | 0.013 | 0.857 |
| hsa-miR-29b-3p | 0.005 | 0.400 | 0.560 | 1.187 | 0.089 | 0.647 |
| hsa-miR-125b-5p | 0.021 | 0.582 | 0.290 | 0.950 | 0.069 | 0.723 |
| hsa-miR-200c-3pa | 0.011 | 0.336 | 0.003 | 0.542 | 2.93 × 10- 5 | 0.415 |
| hsa-miR-337c-5p | 0.009 | 0.385 | 0.582 | 0.872 | 0.020 | 0.553 |
| hsa-miR-411-5p | 0.004 | 0.322 | 0.336 | 1.282 | 0.158 | 0.595 |
| hsa-miR-423-5p | 0.026 | 1.387 | 0.189 | 0.955 | 0.518 | 1.175 |
| hsa-miR-483-5p | 0.018 | 1.861 | 0.765 | 1.413 | 0.211 | 1.647 |
| hsa-miR-652-3pa | 0.019 | 0.715 | 0.049 | 0.877 | 0.011 | 0.782 |
amiRNA는 발견 및 검증 세트 모두에서 일관된 방식으로 크게 변경되었습니다..
후보 miRNA의 qRT-PCR 검증
10개의 후보 miRNA를 검증하기 위해 독립적인 검증 세트(20개의 IGD 및 16개의 컨트롤)로 qRT-PCR을 수행했습니다(보충 자료의 표 S1). 이러한 miRNA 중 200개(hsa-miR-3c-26p, hsa-miR-5b-652p 및 hsa-miR-3-XNUMXp)는 검증 세트의 IGD 그룹에서 상당히 하향 조절되었습니다(표 (Table2) .2). 337개의 다른 miRNA(hsa-miR-5c-125p, hsa-miR-423b 및 hsa-miR-5-15p)도 IGD 그룹에서 하향 조절되었지만 유의하지는 않았습니다. 나머지 5개의 miRNA(hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-411b-5p, hsa-miR-423-5p 및 hsa-miR-45-42p)는 검증 세트에서 반대로 표현되었습니다. 발견 및 검증 세트(총 XNUMX명의 IGD 피험자와 XNUMX개의 대조군)를 결합했을 때 검증된 XNUMX개의 miRNA는 지속적으로 유의미했습니다(표 (Table2) .2). 이 세 가지 miRNA의 CNS에서 자세한 정보, 염색체 위치, 성숙 서열 및 발현 수준은 보충 자료의 표 S2에서 확인할 수 있습니다.
IGD 위험에 대한 세 가지 miRNA의 동시 변경의 시너지 효과
0개의 miRNA의 결합 효과를 평가하기 위해 1개의 하위 그룹(2, 3, XNUMX 또는 XNUMX개의 miRNA 변경 포함)의 교차비(OR)를 관찰했습니다. miRNA 변경은 섹션 "에 설명된 대로 RQ 값으로 정의됩니다.재료 및 방법.” 3개의 miRNA 마커 모두 IGD 그룹에서 하향 조절되었기 때문에 RQ 값이 22 미만인 miRNA는 변경된 것으로 무시되었습니다. 세 가지 miRNA에 대한 각 연구 대상의 RQ 값에 대한 자세한 정보는 보충 자료의 표 S22에서 확인할 수 있습니다. 각 하위 그룹에 대해 대조군 수와 IGD 수의 비율로 확률을 계산한 다음 각 하위 그룹의 확률을 miRNA 변경 없이 하위 그룹의 확률로 나누어 각 OR을 계산했습니다. 95개의 miRNA 변형이 있는 개인은 miRNA 변형이 없는 개인보다 위험이 2.29배 더 높았습니다(OR 211.11, 0% CI 3–XNUMX). OR은 변경된 miRNA의 수가 XNUMX에서 XNUMX으로 증가함에 따라 증가하는 경향을 보였다(r2 = 0.996) (그림 (그림 22).
후보 miRNA의 표적 유전자의 GO 및 경로 분석
IGD 그룹에서 상당히 하향 조절된 세 가지 miRNA 마커의 기능에 대한 통찰력을 얻기 위해 miRWalk 2.0 데이터베이스를 사용하여 표적 유전자를 예측했습니다.31). miRWalk 데이터베이스(32-34) (보충 자료의 표 S4). ToppGene Suite에서 ToppFun을 사용한 유전자 집합 농축 분석은 miRNA의 표적 유전자가 "축삭 안내"와 같은 신경 발달 경로 및 "신경 발생"과 같은 GO 용어와 유의미하게 연관되어 있음을 보여주었습니다(보충 자료의 표 S5).
예측된 표적 유전자의 발현
140개의 miRNA의 다운스트림 표적 유전자 중 4개가 2개 이상의 miRNA에 대해 동시에 예측되었습니다(보충 자료의 표 SXNUMX). 다운스트림 표적 유전자의 단백질 발현 수준이 IGD와 대조군 간에 다른지 여부를 알아보기 위해 XNUMX개의 유전자를 선택했습니다(DUSP4 및 PI15), 이는 모든 3개의 miRNA 및 추가 3개의 유전자의 다운스트림 표적으로 예측됩니다(GABRB2, DPYSL2및 CN1) 2개의 miRNA에 대해 예측하고 실험에 사용할 수 있는 28개의 IGD 및 28개의 대조군의 혈장 샘플을 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행했습니다. 우리는 다른 곳에서 설명한 대로 밴드 강도와 면적을 측정하여 IGD와 대조군 사이의 XNUMX개 표적의 표현을 비교했습니다(29). 그 중 DPYSL2(28개의 IGD 및 28개의 대조군, P = 0.0037) 및 GABBR2(27개의 IGD 및 28개의 대조군, P = 0.0052)는 IGD 그룹에서 유의하게 더 높았습니다(그림 (그림 3) .3). 그러나 우리는 CNR1의 차등적 발현을 관찰할 수 없었다(P = 0.0853), DUSP4(P = 0.5443), PI15(P = 0.6346).
토론
miRNA가 신경 발달에 관여하는 것으로 보고되었다.35, 36), 정신 분열증과 같은 정신 질환에서 뇌 miRNA의 차등 발현이 관찰됩니다.37). 따라서 순환하는 miRNA 프로파일이 IGD에 유용한 바이오마커가 될 수 있다는 것은 타당합니다. 순환하는 miRNA는 다양한 신경정신병적 장애에 대한 바이오마커로 제안되었습니다.38-40); 그러나 IGD 개발의 분자 메커니즘은 임상적 및 사회적 중요성에도 불구하고 아직 많이 알려져 있지 않습니다. 특히 IGD 관련 miRNA에 대한 연구는 없었습니다. 이 연구의 목적은 두 가지였습니다. 첫째, 우리는 IGD와 관련된 플라즈마 miRNA를 발견하려고 시도했습니다. 둘째, 다운스트림 표적 유전자의 단백질 발현 및 GO를 탐색하여 miRNA 후보의 생물학적 의미를 평가했습니다. miRNA 발현 프로필의 게놈 전체 스크리닝과 후보의 다운스트림 검증을 통해 우리는 200개의 miRNA(hsa-miR-3c-26p, hsa-miR-5b-652p 및 hsa-miR-3-XNUMXp)의 발현이 대조군보다 IGD 환자에서 상당히 낮다는 것을 발견했습니다. 다른 XNUMX개의 miRNA 후보의 발현 패턴이 검증에서 복제되지는 않았지만, 이 연구에서 작은 샘플 크기로 인해 위음성이 될 수 있습니다. 우리가 아는 한, 이것은 혈액 miRNA 발현 프로필이 IGD에 유용한 바이오마커가 될 수 있다는 가능성에 대한 첫 번째 보고서입니다. 세 가지 miRNA 마커의 조합은 IGD 위험이 있는 사람들을 조기에 식별하기 위한 최소 침습적 도구 역할을 할 수 있습니다.
본 연구에서 확인된 miRNA는 다양한 신경정신질환에 관여하는 것으로 보고되었다. 혈액에서 hsa-miR-200c의 발현은 정신분열증과 같은 여러 정신 질환에서 하향 조절되는 것으로 보고되었습니다.41) 및 주요 우울 삽화(42). miR-200c는 전뇌에서보다 시냅스 분획에서 더 많이 발현되는 것으로 보고되었다.43) 및 또한 신경 세포 사멸과 관련이 있습니다(44). 이러한 이전 보고서를 기반으로 miR-200c는 신경 발달에 관여하며 발현이 교란되면 신경 정신 장애와 관련될 수 있습니다. 여러 연구에서 miR-652와 신경 정신 장애의 위험 사이의 연관성을 제안했습니다. 정신 분열증에 대한 혈액 바이오 마커를 식별하기 위해 우리의 접근 방식과 유사하게 Lai et al. 정신분열증 환자와 정상 대조군을 대상으로 TLDA 분석을 수행한 결과 hsa-miR-652를 포함한 XNUMX개의 miRNA가 정신분열증 환자에서 차등적으로 발현됨을 발견했습니다.45). 후속 연구에서 그들은 miRNA 발현 데이터를 사용하여 예측 모델을 설계하고 정상 대조군과 정신분열증을 성공적으로 구별했습니다.46). hsa-miR-652의 변화된 발현은 알코올 중독자에서도 관찰되었다.47). Hsa-miR-26b는 신경세포 분화 동안 활성화되는 것으로 밝혀졌다.48). Perkinset al. 정신분열증 환자의 전두엽 피질에서 hsa-miR-26b가 하향 조절된다고 보고했습니다.49).
이러한 miRNA의 교란된 발현과 IGD의 병태생리학 사이의 관계를 뒷받침하는 직접적인 증거는 없지만, 우리는 이러한 miRNA의 조절 장애가 우리가 예측한 다운스트림 유전자에 대한 다양한 이전 보고서를 기반으로 IGD의 병태생리학과 연관될 수 있다고 추론할 수 있습니다. 다음과 같은 세 가지 miRNA의 다운스트림 유전자 중 일부 GABRB2, CNR1, NRXN1및 DPYSL2 신경정신과적 장애와 관련이 있는 것으로 보고되고 있다. 감마-아미노부티르산(GABA)은 CNS의 주요 억제성 신경전달물질입니다. GABA 수용체의 조절 장애는 중독, 불안 및 우울증을 포함한 신경 정신 장애와 관련이 있습니다.50), 이는 IGD의 주요 기능이기도 합니다.8). GABA 수용체 유전자의 유전적 다형성은 알코올 중독 및 정신분열증과 관련이 있는 것으로 보고되었습니다.51, 52). DPYSL2(Dihydropyrimidinase-like 2)는 콜랩신 반응 매개체 단백질 계열의 구성원으로, 미세소관 조립, 시냅스 신호 전달 및 축삭 성장 조절에 역할을 합니다. 결과적으로, 이 분자는 정신 질환에 대한 바이오마커로 제안되었습니다.53, 54). 다형성 DPYSL2 유전자는 또한 알코올 사용 장애와 관련이 있는 것으로 보고되었습니다(55). 이전 보고서와 우리의 데이터는 하향 조절된 miRNA의 하류 표적인 GABRB2 및 DPYSL2의 과발현이 IGD를 포함한 신경 정신 장애의 병인에 영향을 미친다는 것을 시사합니다. 칸나비노이드 수용체 유형 1(CNR1)은 신경 전달 물질 방출을 조절하는 시냅스 전 이종 수용체이며 칸나비노이드 신호 전달 장애는 다양한 신경정신병적 장애와 관련이 있습니다.56). 유전적 다형성 CN1 유전자는 백인의 물질 의존성과 관련이 있는 것으로 알려져 있다.57). 쥐 모델에서 복부 해마 CNR1의 활성화는 정상적인 사회적 행동과 인지를 방해합니다.58). NRXN 계열의 유전적 변이는 중독을 비롯한 다양한 신경정신과 질환에 관여하는 것으로 알려져 있다.59).
세 가지 miRNA 후보의 생물학적 의미를 보다 직접적인 방식으로 조사하기 위해 다운스트림 표적 유전자의 단백질 발현을 조사했습니다. 혈장 샘플의 가용성이 제한되어 있기 때문에 140개의 공통 후보(2개 이상의 miRNA의 다운스트림으로 예측됨) 중 웨스턴 블롯으로 5개의 표적(GABRB2, DPYSL2, CNR1, DUSP4 및 PI15)을 검사하고 GABRB2 및 DPYSL2의 발현이 IGD 그룹에서 상당히 더 높았음을 확인했습니다. 이전 보고서와 우리의 데이터는 하향 조절된 miRNA의 하류 표적인 GABRB2 및 DPYSL2의 과발현이 IGD를 포함한 신경 정신 장애의 병인에 영향을 미칠 수 있음을 시사합니다. GO의 결과와 신경 발달 경로의 경로 분석은 miRNA 마커의 신경생물학적 의미를 뒷받침합니다. 또 다른 흥미로운 발견은 miRNA의 동시 변경의 시너지 효과였습니다. 3개의 miRNA 모두 하향 조절된 개체는 하향 조절되지 않은 개체보다 위험이 22배 더 높았으며, OR은 용량 의존적으로 증가했습니다. 제한된 샘플 크기로 인해 이 세 가지 변경에 대한 CI가 넓었지만 분명한 양의 상관관계(r2 = 0.996)은 세 가지 miRNA의 시너지 효과를 뒷받침합니다.
우리는 IGD 관련 miRNA 마커와 세 가지 miRNA 변형이 모두 있는 개인이 miRNA 변형이 없는 사람보다 위험이 22배 더 높다는 것을 발견했지만 이 연구에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 작은 샘플 크기는 다른 중요한 miRNA 마커를 놓칠 가능성을 높였습니다. 둘째, 우리의 데이터는 혈장 miRNA 프로필이 원인인지 결과인지를 명확히 하기에는 충분하지 않았기 때문에 임상 환경에서 이러한 비침습성 마커의 생물학적 역할을 확인할 수 없습니다. 추가 miRNA 프로파일링 및 뇌 조직 은행의 인간 뇌 조직을 사용한 다운스트림 유전자 분석은 보다 직접적인 답을 제공할 수 있습니다. 게임 장애 동물 모델을 이용한 뇌 조직 분석도 도움이 될 것입니다. 셋째, 혈장 샘플의 제한된 가용성으로 인해 우리는 XNUMX개의 다운스트림 후보 분자만 검사했습니다. 더 큰 샘플 세트로 더 많은 다운스트림 대상을 탐색하면 IGD의 분자 메커니즘을 더 잘 이해하는 데 도움이 됩니다.
요약하면, miRNA 발현 프로필의 게놈 전체 스크리닝과 독립적인 검증을 통해 우리는 200개의 IGD 관련 miRNA(hsa-miR-3c-26p, hsa-miR-5b-652p 및 hsa-miR-3-XNUMXp)를 발견했습니다. 많은 하위 유전자가 다양한 신경 정신 장애에 관여하는 것으로 보고되었으며 이러한 하위 유전자의 변경된 발현에 대한 실험적 검증은 이 연구에서 확인된 miRNA의 의미를 뒷받침합니다. 우리는 세 가지 miRNA 모두의 하향 조절을 가진 개인이 IGD의 위험이 높다는 것을 발견했습니다. 알려진 임상적 또는 환경적 위험 요인 및 진단 기준과 함께 우리의 발견은 IGD 위험이 높은 사람들을 돕기 위한 조기 개입을 촉진할 수 있습니다.
작성자 기여
ML과 HC는 이 문서에 동등하게 기여했습니다. ML, D-JK 및 Y-JC가 연구를 설계했습니다. SJ, S-MC, YP, DC 및 JL은 실험 및 데이터 생성을 수행했습니다. J-WC, S-HP, J-SC 및 D-JK는 혈액 샘플 및 임상 정보를 수집했습니다. ML, HC, S-HY 및 Y-JC가 데이터를 분석했습니다. ML, HC, S-HY 및 Y-JC가 원고를 설명했습니다. Y-JC가 프로젝트를 감독했습니다.
보충 자료
이 기사의 보충 자료는 온라인에서 찾을 수 있습니다 http://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpsyt.2018.00081/full#supplementary-material.
참고자료
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