Hypocretin (orexin)은 복부 tegmental 영역 (2014)에서 자사의 cotransmitter dynorphin의 antireward 효과를 약화하여 보상을 용이하게합니다.

John W. Muschamp,^a,1 조나단 A. 홀랜더,^b 제니퍼 L. 톰슨,^c 조지 보렌,^b 린다 C. 해싱어,^a 사라 온바니,^a 테오도르 M. 카메네카,^b 스테파니 L. 보그랜드,^c 폴 제이 케니,^b 및 William A. Carlezon, Jr.^a

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하이포크레틴(오렉신)과 다이노르핀은 감정과 동기를 조절하는 데 중요한 역할을 하는 신경 조절제입니다. 오렉신은 보상에 중요하고 약물 추구와 관련이 있는 반면, 다이노르핀은 부정적인 기분을 중재하고 우울한 상태와 관련이 있습니다. 이러한 상반되는 효과를 고려할 때, 두 펩타이드가 동일한 뉴런에서 발현되고 공동 방출된다는 보고는 반직관적입니다. 여기에서 우리는 orexin과 dynorphin이 동일한 시냅스 소포 내에서 동시 발현되고 이러한 공동 국소화가 보상, 약물 복용 및 충동적인 행동에 중대한 영향을 미친다는 것을 보여줍니다. 오렉신이 다이노르핀의 우울과 같은 반보상 효과를 차단한다는 사실은 우리가 뇌에서 오렉신의 기능적 역할을 보는 방식을 크게 변화시킵니다.

하이포크레틴(오렉신)과 다이노르핀은 동기가 부여된 행동에 반대 작용을 하는 신경펩티드입니다. 오렉신은 각성 및 보상 상태와 관련이 있는 반면, 다이노르핀은 우울한 상태와 관련이 있습니다. 우리는 반대 작용에도 불구하고 이 펩타이드가 시상 하부 내의 동일한 시냅스 소포에 포장되어 있음을 보여줍니다. 오렉신 기능의 붕괴는 측면 시상하부(LH) 자극의 보상 효과를 무디게 하고, 코카인 유발 충동을 제거하고, 코카인 자가 투여를 감소시킵니다. 다이노르핀 기능의 수반되는 중단은 이러한 행동 변화를 역전시킵니다. 우리는 또한 오렉신과 다이노르핀이 오렉신 함유 뉴런의 두드러진 표적인 복측피개영역(VTA) 도파민 뉴런의 흥분성에 반대 작용을 하고 VTA 내 오렉신 길항작용이 코카인 자가 투여 및 LH 자가 자극을 감소시켜 다이노르핀 길항작용에 의해 역전된다는 것을 보여줍니다. 우리의 연구 결과는 오렉신이 공동 방출된 다이노르핀의 보상 임계값 상승 효과를 차단할 수 있는 고유한 세포 과정을 식별하여 보상을 촉진하기 위해 허용적인 방식으로 작용합니다.

오렉신과 다이노르핀은 공동 전달 물질입니다.

우리는 형광 현미경을 사용하여 생쥐의 외측, 신경주위, 배측 시상하부의 동일한 뉴런 내에서 orexin과 dynorphin의 동시 발현을 확인했습니다.18()Fig. 1A). 여러 전달자를 표현하는 뉴런의 존재는 다른 뇌 회로에서 설명되었으며, 동시에 발현되는 신경 전달 물질의 방출이 다른 발사 속도로 발생하는 필터링 메커니즘의 신경 기반을 나타낼 수 있습니다.19). 그러나 EM을 사용하여 우리는 orexin과 dynorphin이 동일한 시냅스 소포 내에서 colocalized된다는 것을 발견했습니다. 공동 포장의 대부분의 사례는 면역 표지가 소낭 내에서 또는 그 근처에서 발견되는 수초가 없는 정맥류 축삭 돌기에서 관찰되었습니다. 신경 세포체 내에서 중요한 표지는 골지 복합체와 관련이 있는 반면 인접한 핵에서는 발견되지 않았다.Fig. 1 B 및 C). 수상 돌기는 또한 두 펩티드에 대한 소포 관련 표지를 포함하여 이러한 송신기의 잠재적 수지상 방출을 제안합니다. 소수의 미세 구조 프로파일은 비대칭 시냅스의 방출 영역 외부에 위치한 큰(~100nm) 소낭에 위치한 두 펩타이드에 대한 표지가 있는 축삭 말단을 포착했습니다.Fig. 1 B 및 C), 오렉신과 다이노르핀이 공동 전달 물질로 기능하고 정상 조건에서 세포 발화 주파수의 함수로서 차등적으로 방출되기보다는 함께 방출된다는 결론을 뒷받침합니다.

 

그림. 1.

오렉신과 다이노르핀은 시상하부 뉴런의 공동 전달 물질입니다. (A, 맨 왼쪽) 명시야 현미경 사진은 오렉신(적색) 및 다이노르핀(녹색) 면역 반응성에 대해 검사된 시상 하부 영역을 보여줍니다. (A, 맨 오른쪽) 병합된 XNUMX채널 이미지 ...

오렉신 봉쇄의 보상 역치 상승 효과는 다이노르핀 봉쇄에 의해 역전됩니다.

이 고유한 송신기 발현 패턴의 기능적 중요성을 탐구하기 위해 우리는 오렉신 및 다이노르핀 신호의 중단이 정상 및 비정상 동기를 반영하는 복잡한 행동에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 조사했습니다. C57BL/6 마우스에서 측면 시상하부(LH) 자극으로 강화된 두개내 자가 자극(ICSS)을 수행하도록 훈련되었습니다.20), OX 봉쇄₁가벼운 단계에서 N-(2-methyl-6-benzoxazolyl)-N"-1,5-naphthyridin-4-yl urea(SB334867)에 의한 Rs는 보상 임계값에서 복용량 의존적 증가를 일으켰습니다.Fig. 2A; 복용량에 대한 단방향 반복 측정 ANOVA: F_3,12 = 4.44, P < 0.02). ICSS 역치의 증가는 보상에 대한 민감도가 감소했음을 나타내는 우울증과 같은 징후인 자극의 보람 있는 영향에서 치료로 인한 감소를 반영합니다.20). 이 효과는 ICSS 반응률이 영향을 받지 않았기 때문에 진정 또는 기타 비특이적 행동 장애로 인한 것이 아닙니다.Fig. 2B; 복용량에 대한 단방향 반복 측정 ANOVA: F_3,24 = 0.33, P > 0.80).

 

그림. 2.

오렉신 봉쇄의 보상 임계값 상승 효과는 다이노르핀 봉쇄에 의해 역전됩니다. (A) OX에서 오렉신 신호 차단₁R by SB334867(0–30 mg/kg, ip)은 ICSS 테스트에서 보상 임계값을 높여 보상 감소를 나타냅니다. 이 효과 ...

SB334867에 의해 유발된 보상 임계값의 상승은 norBNI(nor-binaltorphimine) [약물에 대한 양방향 반복 측정 ANOVA(피험자 간 인자) × 용량 SB(피험자 인자 내) 상호 작용: F_3,24 = 3.98, P < 0.01], 이는 KOR에서 오래 지속되는 다이노르핀 작용 차단을 생성합니다(10). 이러한 데이터는 오렉신 신호 전달의 손실이 공동 방출된 다이노르핀의 잠재된 반보상 효과를 드러낸다는 것을 시사합니다. norBNI 단독 관리는 보상 임계값을 감소시키지 않았습니다. 이 효과는 norBNI 및 기타 원형 KOR 길항제의 독특한 약력학과 관련이 있을 수 있지만(10), 이는 또한 뇌 보상 회로의 활동을 조절하는 과정에 중복성이 있거나 오렉신 톤 단독(공동 방출된 다이노르핀에 의해 반대되지 않음)의 단계적 증가가 측면 시상 하부의 자극 부위에서 보상 신호를 전달하기에 불충분함을 나타낼 수 있습니다. 이러한 발견은 처음에는 어두운 단계 동안 ICSS 임계값에서 SB334867을 검사한 다른 사람들의 작업과 일치하지 않는 것처럼 보일 수 있습니다.21). 그러나, 오렉신 기능의 감소는 동물이 밝은 단계 또는 어두운 단계 동안 테스트되는지 여부에 따라 결과가 나타날 수 있다는 상당한 증거가 있습니다. 예를 들어 오렉신 KO 생쥐에서 음식과 물은 어두운 단계에서 테스트를 수행할 때 보상 효과를 유지하지만 밝은 단계에서는 그렇지 않습니다.22), 모든 행동 테스트를 수행한 시간입니다.

ICSS에 대한 전신 SB334867 및 norBNI 투여의 효과를 국소화하기 위해 별도의 마우스 집단에 LH 자극 전극 및 VTA 가이드 캐뉼라를 이식했습니다. SB334867을 VTA에 미세 주입하면 보상 임계값이 현저하게 증가하여 보상 민감도가 감소함을 나타냅니다. intra-VTA norBNI 단독으로는 ICSS 역치에 영향을 미치지 않았지만, 후속 SB334867 주입의 역치 상승 효과를 차단했습니다.Fig. 2C; 약물에 대한 일원 반복 측정 ANOVA: F_3,9 = 10.98, P < 0.01). 두개내 약물 주입은 전신 약물 주입에 비해 최대 반응률이 약간 감소하는 경향이 있었지만 이러한 효과는 통계적으로 유의하지 않았습니다.Fig. 2D; 약물에 대한 일원 반복 측정 ANOVA: F_3,9 = 1.03, P = 0.112).

Orexin 및 Dynorphin 전달에 의해 조절되는 충동성.

충동성은 보상을 추구하는 행동을 억제하는 데 결함이 있는 것이 특징이며 높은 수준의 충동성은 많은 정신 질환의 공통적인 특징입니다.23). 코카인을 포함한 약물 남용도 충동성을 증가시킬 수 있으며, 이는 중독을 발전시키는 것으로 추측됩니다.24). ICSS 테스트에서 LH 자극의 보상 효과에 대한 민감도를 조절하는 동시 방출 오렉신 및 다이노르핀의 핵심 역할을 고려하여, 우리는 이 두 신경펩티드 사이의 상호작용이 이 행동에서 기준선 충동성과 코카인 유발 결손에 영향을 미칠 수 있다는 가설을 세웠습니다. 충동성은 5-CSRTT(5-choice serial reaction time task)에서 조기 반응을 측정하여 설치류에서 정량화할 수 있습니다.25), 인간의 주의력을 연구하는 데 사용되는 연속 성능 테스트와 유사한 동물 모델. 이 테스트에서 조기 반응은 정상적인 조건에서 낮은 경향이 있으며 DA 전송을 높이는 약물에 의해 악화됩니다.26). 우리는 5-CSRTT를 사용하여 자발적 및 코카인 유발 충동 행동에 대한 orexin-dynorphin 시스템의 기여도를 조사했습니다. 단독 투여 시 SB334867은 이미 적은 수의 자발적인 조기 반응을 더욱 감소시켰다(Fig. 3A; F_3,21 = 4.89, P < 0.01). 이러한 감소는 응답 정확도에 대한 영향이 없을 때 발생했습니다(F_3,21 = 1.45, P = 0.25), 펠릿 검색 대기 시간(F_3,21 = 0.91, P = 0.44) 또는 완료된 자극 시행 횟수(F_3,21 = 1.46, P = 0.25), 경계심이나 운동 능력 저하로 인한 것이 아님을 나타냅니다. 그러나 norBNI의 투여는 조기 반응에 대한 SB334867의 효과를 역전시켰다(Fig. 3B; F_3,18 = 0.45, P = 0.71), 반대되지 않는 dynorphin 전송이 이러한 항충동 효과를 매개하는 데 중요하다는 것을 시사합니다. 단독으로 또는 SB334867과 함께 제공되는 norBNI는 응답 정확도 측정에 영향을 미치지 않습니다(F_3,18 = 0.66, P > 0.58), 대기 시간(F_3,18 = 3.09, P > 0.06) 또는 완료된 자극 시행 횟수(F_3,18 = 2.38, P > 0.10). SB334867을 사용한 전처리는 또한 코카인에 의해 유발된 조기 반응의 두 배 증가를 방지했습니다.Fig. 3C; F_6,24 = 5.84, P < 0.01). 이러한 데이터는 오렉신 신경 전달이 기본 조건과 코카인 자극 조건 모두에서 다이노르핀에 민감한 방식으로 충동적인 행동을 조절할 수 있다는 증거를 제공합니다.

 

그림. 3.

충동성 행동은 오렉신과 다이노르핀의 균형에 의해 조절됩니다. (A) SB334867은 운동 충동성의 5-CSRTT 쥐 모델에서 조기 반응을 약화시킵니다. 정확도 측정, 음식 펠릿을 회수하기 위한 대기 시간 및 생략된 시행 횟수가 측정되었습니다. ...

Dynorphin은 OX에서 감소된 코카인 자체 관리를 중재합니다.₁R-널 마우스.

중독에 대한 취약성은 충동적인 개인에서 현저하게 증가하며 코카인에 의한 충동성 증가는 중독의 출현에 기여하는 것으로 가정된다.23, 27). 게다가, orexin 전송과 dynorphin 전송은 독립적으로 코카인과 다른 남용 약물의 보상 효과를 조절하는 것과 연관되어 있습니다.28-32). 우리는 오렉신과 다이노르핀 전달 간의 상호작용이 약물 복용을 직접적으로 제어할 수 있다는 가설을 세웠습니다. 이 가능성을 탐색하기 위해 OX가 결핍된 유전자 변형 마우스에서 iv 코카인 자가 투여를 조사했습니다.₁루피(OX₁R^{- / -}). 이 유전형의 쥐는 광범위한 용량(주입당 0.1–1 mg/kg)에서 코카인 자체 투여가 상당히 낮았지만 동일한 강화 일정 하에서 음식 보상에 대해 변경되지 않은 반응을 보였습니다.33), 코카인 복용의 감소가 행동 수행의 적자에 이차적인 것이 아님을 시사합니다. 게다가 OX₁R^{- / -} 생쥐는 코카인 접근의 초기 약 세 세션 동안 정상적인 코카인 자가 투여 속도를 보였지만 그 후 코카인 복용이 급격히 감소했습니다.33). 우리는 주입당 0.3mg/kg의 용량에서 이 표현형을 확인했으며, 이는 OX를 통한 신호 전달을 나타냅니다.₁Rs는 코카인 자가 투여 행동을 확립하고 유지하는 데 중요한 역할을 합니다.Fig. 4; 양방향 반복 측정 ANOVA, 유전자형(대상 요인 간) × 약물 치료(대상 요인 내): F_1,12 = 12.91, P < 0.01]. norBNI로 전처리하면 SB334867을 투여한 쥐에서 정상적인 ICSS와 충동적인 행동을 회복한 것처럼 OX에서 코카인 자가 투여도 부분적으로 회복했습니다.₁R^{- / -} 한 신경전달물질 시스템의 기능에서 유전적 제거에 의해 생성된 행동 결함이 다른 신경전달물질 시스템의 봉쇄에 의해 구조되는 독특한 예를 제공하는 마우스. 이러한 결과는 OX에서₁R^{- / -} 생쥐의 경우, dynorphin의 반대되지 않는 작용은 코카인의 보람 있는 특성을 약화시켜 약물의 자가 투여를 감소시킵니다. 흥미롭게도 OX에서는₁R^{+ / +} (대조군) 마우스, norBNI는 예기치 않게 코카인 자가 투여를 감소시켰습니다. 이 효과에 대한 한 가지 가능한 설명은 소위 "직접" 선조체 흑색 중간 가시 뉴런과 같은 노노렉신 뉴런에 의해 방출되는 다이노르핀이 코카인 섭취에 반대 효과를 가지며 실제로 코카인의 보상 효과를 촉진할 수 있다는 것입니다. 코카인 보상에서 반대 역할을 하는 두 KOR 집단의 존재는 왜 norBNI가 OX에서 감지된 코카인 복용 행동의 결손을 부분적으로만 역전시켰는지 설명할 것입니다.₁R KO 생쥐. 대안적으로, KOR 길항작용은 코카인 금단의 혐오 또는 스트레스 효과를 감소시킵니다.34), 약물 섭취 패턴에 기여(17). 그럼에도 불구하고, 이 데이터는 온전한 오렉신 신호가 없을 때 다이노르핀의 우울 유사 효과가 우세하여 코카인의 보상 효과를 감소시키는 반면, 오렉신의 효과는 코카인의 보상 효과를 촉진하여 다이노르핀 신호가 없을 때 지속 시간을 연장한다는 것을 시사합니다.

 

그림. 4.

OX에서 코카인 자체 투여 감소₁R KO 생쥐는 KOR 봉쇄에 의해 복원됩니다. OX에서 오렉신 신호 전달 장애₁이 수용체의 유전적 결실에 의한 R은 코카인의 iv 자가 투여를 감소시킨다(주입당 0.3 mg/kg). 이 적자는 부분적으로 ...

Orexin과 Dynorphin은 VTA DA 뉴런의 흥분성에 균형 잡힌 반대 효과를 발휘할 수 있습니다.

시상하부의 orexin과 dynorphin 뉴런으로부터 입력을 받는 뇌 구조는 잠재적으로 두 펩타이드에 노출되어 신경 흥분성에 반대되는 영향을 받습니다.35, 36). 한 펩타이드의 효과가 다른 펩타이드보다 우세한 정도는 각 펩타이드의 상대적 풍부함, 세포외 공간에서의 수명, 다양한 표적 뉴런 집단에서의 수용체 발현, 시냅스후 세포에서 수용체와 세포내 신호 메커니즘 간의 상호작용을 포함하는 수많은 요인에 따라 달라질 수 있습니다. 충동성과 코카인 보상은 적어도 부분적으로는 VTA의 DA 뉴런에 의해 조절됩니다.26), 시상하부 오렉신 함유 세포(37). 또한, VTA에 오렉신을 주입하면 약물 탐색이 향상됩니다.6). VTA 뉴런의 활동에 대한 각 펩타이드의 상대적인 기여도를 평가하기 위해 단독으로 또는 함께 적용된 오렉신 및 다이노르핀에 노출된 C57BL/6 마우스 뇌 절편의 DA 세포로부터 전기생리학적 기록을 만들었습니다. 예상한 바와 같이, 따로 적용했을 때 오렉신은 균일하게 흥분한 반면, 다이노르핀은 억제 효과만 나타냈습니다.Fig. 5 A 및 B; F_2,50 = 18.95, P ≤ 0.01). 기록된 DA 뉴런 집단에서 대부분은 두 펩타이드의 포화 농도에 반응했지만 소수는 오렉신이나 다이노르핀에만 선택적으로 반응했습니다.Fig. 5B). 놀랍게도, 두 펩타이드가 이중 반응 뉴런에 적용되었을 때(n = 10) 발사 속도에 대한 순 효과는 없었습니다(Fig. 5A), 포화 농도에서 각 펩타이드의 반대 효과가 공동 방출시 서로 효과적으로 상쇄됨을 시사합니다. 10개의 뉴런 중 1.5개는 orexin의 존재에도 불구하고 dynorphin에 의한 우선적인 억제를 보인 반면, XNUMX개의 세포는 dynorphin의 존재에도 불구하고 orexin에 의해 우선적으로 흥분(>XNUMX배 변화)되었습니다.Fig. 5 A 및 C). 전반적으로 더 많은 세포가 다이노르핀보다 오렉신에 반응했지만, 두 펩타이드에 모두 반응한 세포는 오렉신과 다이노르핀을 함께 적용했을 때 발화 속도의 순 변화가 없었으며, 이는 각 펩타이드의 상반되는 영향이 연구된 VTA DA 뉴런 세트 내에서 균형을 이뤘음을 시사합니다.

 

그림. 5.

오렉신과 다이노르핀은 균형을 이루지만 VTA DA 뉴런에 반대되는 효과를 발휘합니다. (A, 왼쪽) 오렉신과 다이노르핀을 함께 적용하면 VTA DA 뉴런의 발화 속도에 순 변화가 없습니다(n = 10). 단독으로 적용했을 때, 다이노르핀은 억제성이었고 오렉신은 흥분성이었습니다. ...

orexin과 dynorphin 모두에 민감한 VTA DA 뉴런 내에서 잠재적인 orexin-dynorphin 상호작용을 더 자세히 밝히기 위해 우리는 대안적으로 SB334867로 처리하여 목욕 적용 dynorphin의 억제 효과를 증가시키려고 시도했습니다.무화과 S2A; F_5,25 = 2.13, P < 0.01) 또는 norBNI로 처리하여 목욕 적용 오렉신의 흥분 효과를 향상시키기 위해(무화과 S2B; F_3,27 = 5.48, P < 0.01). 두 실험 모두에서 OX₁R 및 KOR 봉쇄는 이러한 효과를 생성하지 못했으며, 이는 SB334867 및 norBNI가 비특이적 작업을 통해 효과를 발휘하지 않음을 시사합니다. 더 중요한 것은 이러한 데이터는 시험관 내에서 각 펩타이드의 색조가 SB334867 및 norBNI와 같은 소분자 길항제의 적용에 의해 영향을 받기에는 불충분하다는 것을 시사합니다. 이 발견은 큰 펩타이드 함유 소포의 세포외 유출이 일반적으로 슬라이스 준비물에는 일반적으로 존재하지 않는 높은 지속 발화 빈도에서만 발생한다는 이전 연구와 일치합니다.38).

norBNI가 OX에서 직접 "비표적" 행동을 통해 행동에 영향을 미치지 않았는지 확인하기 위해₁Rs, 우리는 다음으로 이 길항제가 OX에 미치는 영향을 조사했습니다.₁R 신호. 구체적으로, 인간 OX를 발현하는 배양된 CHO 세포에서 세포내 칼슘 과도 현상을 유도하기 위해 목욕 적용 오렉신 A, SB334867 또는 norBNI의 능력을 결정하기 위해 형광 측정 이미징 플레이트 판독기(FLIPR) 분석을 사용했습니다.₁루피 비록 오렉신 A가 세포내 칼슘(EC₅₀ = 0.01 μM) 및 SB334867은 용량 의존적으로 이 효과를 약화시켰습니다(EC₅₀ = 0.035 μM), norBNI는 세포내 칼슘의 기준선 또는 오렉신 A 유발 증가에 어떠한 영향도 주지 못했습니다. 이것은 VTA DA 신경 생리학에 대한 norBNI의 효과가 제안된 KOR 신호 메커니즘을 통해서만 이루어지며 약물이 OX에 직접적인 영향을 미치지 않음을 시사합니다.₁R (39()무화과 S3 A-C).

VTA의 Orexin-Dynorphin 상호 작용은 코카인 자체 관리를 규제합니다.

우리의 전기 생리학 연구는 orexin과 dynorphin 사이의 동적 상호 작용이 VTA DA 활동을 조절하고 VTA 뉴런이 동기 부여 된 행동에 대한 orexin-dynorphin 시스템의 효과에 대한 핵심 기질 역할을 할 가능성이 있음을 보여줍니다. 이 가설을 직접 테스트하기 위해 쥐의 iv 코카인 자가 투여에 대한 SB334867의 VTA 내 주입 효과를 조사했습니다. intra-VTA 비히클 주입과 비교하여 intra-VTA SB334867은 norBNI에 의해 차단되는 코카인 섭취를 현저하게 감소시켰습니다.Fig. 6; 일원 분산 분석: F_3,24 = 11.56, P < 0.01), 이 뇌 영역 내에서 반대되지 않는 다이노르핀 작용이 코카인 보상을 약화시킨다는 것을 시사합니다. 이러한 결과는 저노력 고정 비율 334867(FR1) 강화 계획에서 코카인 자체 투여에 대한 VTA 내 SB1의 부재를 입증한 결과와 차이가 있는 것으로 보입니다.40). 그러나 여러 보고서에 따르면 작업 요구가 증가함에 따라 SB334867이 약물 복용을 줄이는 데 더 효과적이라는 사실이 밝혀졌습니다(2, 33). 이 실험에서 쥐는 더 높은 노력의 FR5 일정을 수행했기 때문에 현재 발견은 이 문헌과 일치합니다. 이러한 데이터는 VTA DA 신경 생리학에 대한 오렉신과 다이노르핀의 상반되는 특성이 보상 중심 행동에 상당한 영향을 미칠 수 있다는 직접적인 증거를 제공합니다.

 

그림. 6.

VTA에서 오렉신-디노르핀 상호작용은 약물 복용을 중재합니다. 코카인 자체 투여는 intra-VTA SB334867(측면당 3μg)에 의해 감소되는 반면, 이 효과는 norBNI(10mg/kg, ip)로 전처리하면 역전됩니다.n = 9). ***P < ...

동물.

EM 실험에 사용된 성체 수컷 C57BL/6J 마우스(8주령; Jackson Laboratory)는 그룹 수용(케이지당 350-5마리); ICSS에 사용된 것들은 수술 후 단독으로 보관되었습니다. 성체 수컷(57g) Sprague-Dawley 쥐(Charles River Laboratories)를 6-CSRTT 및 코카인 자가 투여 실험에 사용했으며 19인 21조로 수용했습니다. 전기생리학 실험에 사용된 성체 수컷 C1BL/XNUMXJ 마우스(출생 후 XNUMX-XNUMX일)를 그룹 수용하였다(케이지당 XNUMX-XNUMX마리). OXXNUMX^{- / -} 생쥐와 그들의 OX1^{+ / +} 자가 투여 연구에 사용된 한배새끼(생후 6주)는 Jackson 연구소에서 구입하여 C57BL/6 마우스에 12세대 이상 역교배되었습니다. 이들 마우스는 그룹 수용하였다(케이지당 4마리). 모든 동물은 5시간 명/암 주기의 온도 제어 조건 하에 수용되었으며, 행동 ​​테스트는 명주기로 XNUMX-XNUMX시간 동안 발생했습니다. 음식과 물은 달리 명시되지 않는 한 자유롭게 사용할 수 있습니다. 절차는 미국 국립 보건원(National Institutes of Health)에 따라 수행되었습니다. 실험실 동물의 관리 및 사용 안내서 (50) McLean 병원, 브리티시 컬럼비아 대학교 및 스크립스 플로리다의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.

면역조직화학 및 현미경.

orexin A 또는 prodynorphin에 대한 형광 및 은으로 강화된 금 면역 표지는 이전에 보고된 절차에 따라 교대 마우스 뇌 절편에서 수행되었습니다.51) 표준 EM 프로토콜에 따라 처리됩니다. 면역 표지된 조직의 중첩되지 않는 영역을 임의로 선택하고 ImageJ 소프트웨어(National Institutes of Health)를 사용하여 입자 정량화를 위해 사진을 찍었습니다.SI 재료 및 방법, 면역조직화학 및 현미경).

전기 생리학.

패치 피펫(3–5 MΩ)을 143mM 포타슘 글루코네이트, 10mM Hepes, 0.2mM EGTA, 2mM MgATP, 0.3mM NaGTP(pH 7.2) 및 270–280mM mOsmol로 채웠습니다. pClamp 20 소프트웨어(Molecular Devices)를 사용하여 2kHz에서 데이터를 수집하고 10.0kHz에서 필터링했습니다. 전체 셀 구성을 획득한 후 셀을 -70mV에서 전압 고정하고 일련의 전압 단계(250ms, 60mV 단계에서 -130에서 -10mV까지)를 적용하여 과분극을 감지했습니다.I_h) 전류. I_h 전압 단계가 적용된 후 ~30ms와 248ms 사이의 전류 변화로 결정되었습니다. VTA DA 뉴런의 고유 활동은 전류 클램프 모드에서 측정되었습니다. 실험은 안정적인 기본 발사 속도가 달성되었을 때 시작되었습니다. 그런 다음 기판을 5분 동안 적용한 다음 인공 뇌척수액으로 세척했습니다. 각 3분 세그먼트의 마지막 5분은 데이터 분석에 사용되었습니다. Dynorphin A(1–17; 200nM) 및 orexin A(100nM)는 American Peptide에서 구입하여 증류수에 용해했습니다. 이러한 농도는 이전에 VTA 세포 활동에 포화 효과를 발휘하는 것으로 밝혀졌습니다.5, 52). Thiorphan(1μM)과 bestatin(10μM)은 Sigma-Aldrich에서 구입하여 증류수에 녹여 dynorphin A(SI 재료 및 방법, 전기생리학).

FLIPR 분석.

OX₁R 활성은 이전에 기술된 바와 같이 FLIPR 분석에 의해 세포내 칼슘 수준을 측정함으로써 평가되었다.53()SI 재료 및 방법, Fluorometric Imaging Plate Reader Assay).

ICSS.

LH에 정위적으로 지시된 케타민/자일라진(각각 80 및 10 mg/kg, ip; Sigma) 하에 단극 자극 전극 또는 캐뉼라(PlasticsOne)를 마우스에 이식했습니다(18) 및/또는 반대쪽 VTA [bregma에서: 전후방(AP), -3.2 mm; 내측(ML), -0.5mm; dorsoventral (DV), dura에서 -4.7 mm]. 7일의 회복 기간 후, 마우스는 이전에 설명한 대로 뇌 자극에 반응하도록 훈련되었습니다.18). 응답(임계값)을 지원하는 가장 낮은 주파수는 최소 제곱 최적선 분석을 사용하여 계산되었습니다. 마우스가 ICSS 임계값에 대한 안정성 기준(연속 10일 동안 ±5%)을 충족했을 때 약물 치료의 효과를 측정했습니다. SB334867(Scripps Florida) 또는 DMSO 비히클은 해밀턴 주사기(0.1mL/kg ip)를 사용하여 격일로 제공되었으며 임계값은 15분 테스트 세션에서 즉시 정량화되었습니다. ICSS 테스트 시작 10시간 전에 norBNI(10mg/kg ip; Sigma)를 식염수(48mL/kg)로 제공했습니다.

5-CSRTT.

쥐는 음식을 제한하고(자유 섭취 체중의 85%까지) 통풍이 잘되고 소음을 감소시키는 캐비닛(Med Associates) 내부에 컴퓨터로 제어되는 작동실에서 훈련되었으며 설명된 대로 5-CSRTT 절차가 수행되었습니다.25). SB334867(in DMSO, 0.1 mL/kg) 및/또는 코카인(in saline, 1 mL/kg; Sigma)은 다른 실험에서와 같이 테스트 10분 전에 ip 주입으로 제공되었으며 norBNI는 테스트 시작 최소 48시간 전에 제공되었습니다(SI 재료 및 방법, 5-선택 직렬 반응 시간 작업).

IV 코카인 자체 관리.

쥐와 생쥐를 이소플루란(1–3% vol/vol) 산소 증기 혼합물로 마취하고 확립된 절차에 따라 경정맥에 Silastic(VWR Scientific) 카테터를 삽입하여 외과적으로 준비했습니다.54). 래트에 카테터를 이식한 직후, 양측 스테인리스 스틸 가이드 캐뉼라(23 게이지, 길이 17mm)를 VTA에 이식했습니다(브레그마에서: AP, 5.3mm; ML, ±0.7mm; DV, 경질에서 -7.5mm). 안정적인 코카인 섭취가 달성된 후 매일 334867분 세션 동안 SB60 또는 norBNI로 테스트를 수행했습니다(연속 20일 동안 응답에서 <3% 변동; SI 재료 및 방법, IV 코카인 자체 관리).

통계.

데이터는 평균 ± SEM으로 표현됩니다. ICSS 실험의 경우 양방향 반복 측정 ANOVA를 사용하여 SB334867 처리 조건과 norBNI + SB334867 처리 조건 사이의 평균을 비교했습니다. SB334867 및 norBNI + SB334867 조건 내 평균을 비교하기 위해 Newman-Keuls 사후 테스트를 사용한 일원 반복 측정 ANOVA를 사용했습니다. 일원 반복 측정 ANOVA 및 Newman-Keuls 테스트도 모든 5CSRTT 실험에서 평균을 비교하는 데 사용되었습니다. 양방향 반복 측정 ANOVA는 OX를 사용한 코카인 자가 투여 실험에서 치료 그룹 간의 평균을 비교하는 데 사용되었습니다.₁R KO 생쥐. 일원 반복 측정 ANOVA 및 Newman-Keuls 테스트를 사용하여 VTA DA 뉴런에 의한 orexin 및 dynorphin에 대한 평균 반응을 비교했습니다. 단방향 반복 측정 ANOVA 및 Newman-Keuls 테스트는 SB334867 및 norBNI로 처리된 쥐의 코카인 섭취량을 비교하는 데에도 사용되었습니다. 다음과 같은 경우 차이가 중요한 것으로 간주되었습니다. P <0.05.

데이터 수집에 도움을 준 Dr. Garrett Fitzmaurice와 원고에 대한 유용한 의견과 Miranda S. Gallo 및 Melissa Chen에게 감사드립니다. 이 작업은 National Institutes of Health Grants F32-DA026250 및 K99-DA031767(JWM에), F32-DA024932 및 K99-DA031222(JAH에), R01-DA023915(to. PJK) 및 R01-MH063266(WAC에) 및 자연 과학 및 공학 연구 위원회 발견 보조금(SLB에)에 의해 지원되었습니다. ).

이해 상충 진술: WAC는 우울 장애 치료를 위한 카파-오피오이드 길항제의 사용과 관련된 특허(미국 특허 6,528,518; 양수인: McLean 병원)를 보유하고 있습니다. 다른 모든 저자는 경쟁하는 금전적 이익을 선언하지 않습니다.

이 기사는 PNAS 직접 제출입니다.

페이지의 해설 참조 5765.

이 기사에는 온라인에서 지원 정보가 들어 있습니다. www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1315542111/-/DCSupplemental.