मधुमेह। 2017; 60 (8): 1502-1511।
अनलाइन 2017 मई 20 प्रकाशित। doi: 10.1007/s00125-017-4305-4
PMCID: PMC5491592
1सार
मान / परिकल्पना
आहारको बोसोको भन्दा बढी मानिस मानव र रडारहरूमा मोटापछि नै हुन्छ। मानव र रडारों मा हालको अध्ययनहरु ले प्रदर्शन गरेको छ कि बोसो को लत एक मस्तिष्क को शराब, निकोटीन र ड्रगिंग संग मस्तिष्क इनाम सिस्टम को रोग को रूप मा एक सामान्य तंत्र को साझा गर्दछ। यसलाई हाइलाइट गरिएको छ कि एचएफडीले डोपामिन डीएक्सएनएमएक्सएक्स रिसेप्टर (डीएक्सएनएमएमएक्सआर) लाई स्ट्रिटममा सिग्नेलिंग गर्दछ जसले दिमाग इनाम प्रणालीको निर्णायक नियामकलाई हेरिन्छ। हामीले पहिले भने कि ब्राउन चावल-विशिष्ट बायोटेक्टिव घटक γ-ओरेज़ानोलले हाइफोथलमिक नियन्त्रणको माध्यमले HFD को प्राथमिकता पार्यो। यसैले हामीले यो संभावना पत्ता लगायौं कि γ-oryzanol चूहों मा दिमाग इनाम प्रणाली को कार्य को परिमार्जन गर्न हुनेछ।
तरिका
पुरुष C57BL / 6J चूहों एक HFD तपस्वी γ-oryzanol संग उपचार गरियो, र D2R सिग्नलिंग मा संलग्न अणुहरु को striatal स्तर मूल्यांकन गरियो। D2R प्रमोटरको डीएनए मेथाइलनमा γ-ओएनजानजानोलको प्रभाव र आहारको मोटोको लागि प्राथमिकताहरूमा पछिल्लो परिवर्तनहरू जाँच गरिएको थियो। यसको अतिरिक्त, 5-aza-2'-deoxycytidine को प्रभाव, डीएनए मिथाइलट्रान्सफेसिस (डीएनएमटीएस) को खाद्य प्राथमिकता मा, D2R सिग्नलिंग र स्ट्रिटम मा DNMTs को स्तर को जांच गरियो। DNMTs को गतिविधि मा γ-ओरानजानोल को रोकथाम प्रभावहरु vitro मा enzymatically मूल्यांकन गरियो।
परिणाम
चूहों देखि striatum एक HFD खिलाया, D2R को उत्पादन D2R को प्रमोटर क्षेत्र को डीएनए मेथिलेशन मा वृद्धि को माध्यम ले कम भएको थियो। Γ-orzzanol को मौखिक प्रशासन DNMTs अभिव्यक्ति र गतिविधि कम भयो, यसैले Striatum मा D2R को स्तर को पुनर्स्थापित। 5-aza-2'-deoxycytidine द्वारा DNMTs को औषधीय निषेध पनि आहार को बोसो को प्राथमिकता को बढावा दिए। यी निष्कर्षहरु संग, एंजाइमटिक इन विट्रो एस्सेले प्रदर्शन गरे कि γ-ऑयनजानोलले DNMTs को गतिविधि लाई रोक लगायो।
निष्कर्ष / व्याख्या
हामीले देखेका थियौं कि γ-ओरेज़ानोलले चिसोको स्ट्रिटममा D2R को प्रमोटर क्षेत्रको HFD-प्रेरित डीएनए हाइपरमिथाइलेशनलाई हस्तक्षेप गर्छ। हाम्रो प्रयोगात्मक उदाहरण γ-oryzanol हाइलाइट एन्टिबोनेस पदार्थ पदार्थको रूपमा उपन्यास एपिगनेटिक मोड्युलेटरको अलग-अलग सम्पत्तिको रूपमा हाइलाइट गर्दछ।
इलेक्ट्रनिक पूरक सामग्री
यस आलेखको अनलाइन संस्करण (Doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) सँग peer-reviewed तर अप्रयुक्त पूरक सामग्री, जुन अधिकृत प्रयोगकर्ताहरूका लागि उपलब्ध छ।
परिचय
मोटापे व्यक्तिहरूको शेयरहरूमाथि बढ्दै गएको छ, कम से कम आंशिक, सामान्य तंत्र को लत को शराब, निकोटीन र नशीली संग [1]। साथसाथै हाइपोथोमिलिक र हार्मोनको हार्मोनल नियमन, दिमाग इनाम प्रणाली, विशेष डोपामिन रिसेप्टर सिग्नलिंग, नशेको वा हेडोनिक फिडिंग व्यवहारसँग नजिक छ। [2]। बिराटनगरमा अघिल्लो अध्ययनले देखाएको छ कि एलियन्टिभस-मेटिनेटेड छोटो कपाल टिनबाट आरआईटीएटल डोपामिन डीएक्सएनएमएमएक्स रिसेप्टर (डीएक्सएनएमएमएक्सआर) को दस्तक आरएनए छिटो प्रेरित लत-इनाम इनाम घाटा र बाध्यता जस्ता खाना खोजी [3]। कम D2R घनत्वको कारण, पृष्ठीय स्ट्रिटम मोटाइ मानव र रडका स्थानहरूमा दुबारा नियन्त्रण समूहहरूको तुलनामा खाद्य इनामको लागी कम उत्तरदायी छ [3-5]। यस धारणा अनुसार, ट्याकIA ANKK1 जीन लोकेस (एन्कोडिङ DRD2 / एर्किरिन दोहोर्याउनुहोस् र 1 समावेश गर्ने क्यान्सस डोमेन), जसले घटेको D2R उत्पादन घटाउँछ, मानवमा मोटाइ फेनोटाइपसँग सम्बन्धित छ [6], जबकि बायोट्राट्रिक शल्य चिकित्सा पछि वजन घटाने को प्रभाव ऊतक को दबाइ D2R घनत्व संग जुडे हो [7]। यो डेटाले मोटापे को उपचार को लागि एक उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्य को रूप मा धैर्यपूर्वक D2R को महत्व को सुझाव दिछन। तथापि, केही ड्रगहरू जुन विकसित भएको थियो कि मस्तिष्क पुरस्कार इनाम प्रणालीमा काम गर्ने गम्भीर मनोचिकित्सा समस्याहरू समेत धेरै प्रतिकूल प्रभावहरू छन्, जसले गर्दा नै क्लिनिकहरूबाट उनीहरूको पछाडि हटाउने [8].
एपिगनेटिक परिमार्जन न केवल विकास र भेदभावको लागी महत्वपूर्ण हो, तर यसको कारणले तिनीहरू पर्यावरण परिवर्तनका परिणामहरूको रूपमा उत्पन्न हुन्छन्, जसमा आहार र जीवन शैली समेत [9]। डीएनए मेथाइलेशन जीन अभिव्यक्ति को स्थिरता को लागि एक प्रमुख एपिगनेटिक घटना हो [9]। चूहों मा, उच्च मांसपेशी आहार (एचएफडी) को मातृ को प्रदर्शन संतान मा केन्द्रीय इनाम प्रणाली को भित्र अन्तरराष्ट्रीय डीएनए मिथाइलेशन को मार्जिन गर्दछ, जसमा बच्चाहरु द्वारा एचएफडी को ओभरसेप्सनशन [10]। विशेष गरी, डीएनए मिथाइलट्रान्सफेसिस (डीएनएमटीएस) खिलाडिने व्यवहार र शारीरिक क्रियाकलापको नियमनमा महत्वपूर्ण भूमिका खेल्दछ [10, 11], सुझाव छ कि DNMTs मोटापे मधुमेह सिंड्रोम को उपचार को लागि चिकित्सीय लक्ष्य को वादा गर्न सक्छ। महत्त्वपूर्ण रूपमा, केहि प्राकृतिक खाद्य व्युत्पन्न पदार्थहरू, क्याफिक एसिड र epigallocatechin सहित, DNMT अवरोधकहरूको रूपमा काम गर्न जान्छन् [12, 13].
हामी हालैमा देखाइयो कि जैविक, भूरी चावल-विशिष्ट घटक γ-oryzanol, फ्युलिक एसिड एस्टर र धेरै फाइटोस्टरोलको मिश्रण, हाइपोथोमिकल endoplasmic पुनरावृत्ति (ईआर) तनाव मा कमी को माध्यम ले आहार को चारा को प्राथमिकता को attenuates [14]। चूहों र खरगोश मा, सामान्यतया प्रशासित γ-oryzanol आंत देखि तेजी देखि अवशोषित र मुख्य रूप देखि मस्तिष्क को वितरित [15, 16]। यी निष्कर्षहरू सँगै लैजानुपर्छ, केन्द्रीय तंत्रिका तवरमा अभिनय प्राकृतिक खाद्य व्युत्पन्न उत्पादनहरू मोटापेक्षमा सुरक्षित रूपमा खुवाउने व्यवहार सुरक्षित गर्न एक विकल्प हुन सक्छ। यस सन्दर्भमा, हामीले यो सम्मोचनको परीक्षण गर्यौं कि γ-oryzanol मा मस्तिष्क पुरस्कार इनाम प्रणालीमा डीएनए मिथाइलेशन स्थिति परिवर्तन हुनेछ, जसको परिणामस्वरूप चेसमा HFD को लागि प्राथमिकताको जगेडा।
तरिका
पशु
चार्ल्स रिभर लेबोरेटरीज जापान (कानगावा, जापान) बाट प्राप्त सात हप्ता पुरानो पुरुष C57BL / 6J चूहोंलाई एक 3 h / 4 h प्रकाश / २ h डिग्री सेल्सियस अन्तर्गत २- डिग्री सेल्सियसमा विशिष्ट रोगजनक-मुक्त अवस्थामा राखियो (प्रति केज c-–)। अँध्यारो चक्र एक हप्ता अनुकूलन पछि,--हप्ता पुरानो चूहों वजन-मिलान र प्रत्येक प्रयोग पार गर्न दुई वा तीन समूहमा विभाजित थियो। चूहोंलाई खाना र पानीमा नि: शुल्क पहुँचको अनुमति दिइयो। सबै पशु प्रयोगहरू Ryukyus विश्वविद्यालयको (Nos। 24 12२, 12 8१5352 र 5718 5943) पशु प्रयोग नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित भएको थियो।
Γ-oryzanol र 5-aza-2'-deoxycytidine को प्रशासन
HFD को लागि प्राथमिकता को मूल्यांकन गर्न को लागी, γ-oryzanol (Wako शुद्ध केमिकल इंडस्ट्रीज, ओसाका, जापान) को भोजन को परीक्षा परीक्षण को समयमा 8-हफ्ते चूहों मा ग्वार द्वारा प्रशासित गरियो जसलाई पहिला वर्णन गरिएको छ [14, 17]। अन्य प्रयोगहरुको लागि, एचएचडी (डीएक्सएनएमएमएक्सबी; रिसर्च आहार, न्यू ब्रन्सविक, NJ, संयुक्त राज्य अमरीका) सहित 12079% γ-oryzanol को रूपमा छर्रों को रूप मा निर्मित गरियो। आहारको घटकहरू इलेक्ट्रोनिक पूरक सामग्री (ईएमएस) तालिकामा देखाईएको छ 1। १२ हप्ताको भोजन पछि, स्ट्राइटम र हाइपोथैलेमसबाट टिश्यू स collected्कलन गरियो। Ice-oryzanol को दैनिक सेवन, माउसको औसत भोजन सेवनबाट अनुमान गरिएको, करीव 12२० /g / g शरीरको वजन थियो। Described-oryzanol को खुराकहरू पहिले वर्णन गरिए अनुसार निर्धारित गरिएको थियो [14]। 5-aza-2′-deoxycytidine (5-aza-dC; सिग्मा-Aldrich, सेन्ट लुइस, MO, संयुक्त राज्य अमेरिका) intraperitoneally इंजेक्शन (0.25 /g / g शरीरको वजन) हप्तामा तीन पटक १२ हप्ताका लागि [18].
आहारको मोटोको लागि प्राथमिकताको अनुमान
आहारको फ्याटका लागि प्राथमिकताहरू मूल्याङ्कन गर्न, खाना परीक्षणले चाउ र HFD (D12450B र D12451; रिसर्च आहारहरू) को रूपमा पहिले वर्णन गरेको छनौट [14]। आहारको घटक ESM तालिकामा देखाइयो 1। संक्षेपमा, चूहोंलाई चाउ र एचएफडीमा नि: शुल्क पहुँचको अनुमति दिइयो। चाउ र एचएफडी को सेवन साप्ताहिक मापन गरियो र आहार को बोसो को प्राथमिकता परिवर्तनको लागि विश्लेषण गरियो। HFD प्राथमिकता सूत्र अनुसार गणना गरिएको थियो: HFD प्राथमिकता = [(HFD सेवन / कुल खाद्य सेवन) × 100]।
डीएनए मेथिलेशन को लागि बिसेलफाइट अनुक्रमण
DNA एक DNeasy रगत र टिशू किट (QIAGEN, टोक्यो, जापान) को उपयोग गरेर शुद्ध गरियो। डीएनए समाधान भर्खरै तयार गरिएको m मोल / एल नाओएचसँग मिसिएको थियो, १ 3 मिनेटको लागि 37 15 डिग्री सेल्सियसमा कोरियो र .5.3..1.7 मोल / एल युरिया, १.4.9 मोल / एल सोडियम बिसुल्फाइट र 15 एमएमओएल / एल हाइड्रोक्विनोनमा थपियो। समाधान १at मिनेट को लागी 95 ° डिग्री सेल्सियस मा at ° डिग्री मा डिग्री र ub० डिग्री सेल्सियस मा उष्मायन को १ 30 चक्र को अधीनमा थियो [19]। बिसुलफाइट-उपचार गरिएको डीएनए मिनइल्युट पीसीआर शुद्धीकरण किट (क्यूएजेएन) प्रयोग गरेर शुद्ध र पीसीए द्वारा हाईफाई हाईस्टस्टर्ट यूरेसिल + तैयार मैिक्स पीसीआर किट (केपा बायोसिस्टम्स, मोबर्नर, एमए, संयुक्त राज्य अमेरिका) र D2R को प्रमोटर क्षेत्र को प्राइमर को प्रयोग गरेर प्रवर्द्धित गरियो। । प्राइमर अनुक्रमहरू निम्नानुसार थिए: अगाडि प्राइमर, एक्सएनएमक्सए-ग्टटागेट्टजीजीटीटीजीजीटीटीजीजीएटाएएए-एक्सएनक्स '; रिवर्स प्राइमर, 5'-ACCCTACCCTCTAAAACCACAACTAC-3 '। अर्को, एडाप्टर अनुक्रमहरू थप गरियो र Agencourt AMPure XP (बेकमान कलकर, ब्रे, CA, संयुक्त राज्य अमेरीका) को प्रयोग गरी सफा गरियो। त्यसपछि निर्माताहरूको प्रोटोकॉल अनुसार अनुक्रमको लागि नमूनाहरू तालियो र एक जी एस जूनियर (रुचे डिनोगोस्टिक, टोक्यो, जापान) मा लोड गरियो। मेथाइलेशन स्तर सबै साइटोसिन अवशिष्टहरूमा मेथाइलित साइटोसिनहरूको प्रतिशतको रूपमा व्यक्त गरिएको थियो।
DNMT गतिविधि परख
निर्माताको प्रोटोकॉल अनुसार DNMT एंजाइम गतिविधि गतिविधिले एक EpiQuik डीएनए मेथाइलट्रान्सफर एक्स्टेन्शन / इन्स्लेशन ग्यारेन्टी गतिविधि (एपिगेन्ट समूह, ब्रुकलिन, NY, संयुक्त राज्य अमरीका) र EPIgeneous मेथाइलट्रान्सफेस एस्बे किट (सीिसबियो जापान, चिबा, जापान) प्रयोग गरी प्रदर्शन गरिएको थियो।
डीएनए मेथाइलन मा प्रत्येक यौगिक को गतिविधि गतिविधि को आकलन गर्न को लागी S-डेनोसिल-एल-होमोसिस्टीन (SAH) प्रत्येक कम्पाउन्डको उपस्थितिमा मापन गरियो (स्क्रीनिंग एसेजको लागि २० μmol / l), Sad os मिनेट को लागी ad 10 डिग्री सेल्सियस मा -adenosyl methionine (SAM; 4 μmol / l) र DNMT सब्सट्रेट (n ng / μl)। माइकलिस – मेन्टेन कैनेटीक्सको मूल्या To्कन गर्न, DNMT37 (२० μmol / l) लाई zan-oryzanol, SAM (μ olmol / l) र ub ० डिग्री सेल्सियस मा d ° डिग्री सेल्सियस मा पाली DI-dC को संकेत गरीएको थियो। DNMT90a (१०० μmol / l) र DNMT1b (१०० olmol / l) γ-oryzanol, SAM (μ μmol / l) र min 20 डिग्री सेल्सियस मा १२० मिनेट को लागी Poly DG · dC को संकेत गरीएको इनक्युबेटेड थियो। Assays चतुर्भुज मा प्रदर्शन गरिएको थियो। झिकिएको प्रोटीन (०.5 मिलीग्राम / एमएल) SAM (μ μmol / l), पाली dI-dC (μ μg / ml), र बहु DG · dC (37 μg / ml) को साथ १२० मिनेटको लागि °० डिग्री सेल्सियस, र SAH गठन मापन गरिएको थियो।
एस्ट्रोजन-सम्बन्धित रिसेप्टर-γ गतिविधि परख
एस्ट्रोजेन सम्बन्धी रिसेप्टर-γ (ERRγ) मा or-oryzanol को सम्भावित विरोधी गतिविधि निर्माताको प्रोटोकल अनुसार मानव एस्ट्रोजेन सम्बन्धित रिसेप्टर गामा रिपोर्टर एसे प्रणाली (INDIGO बायोसाइन्स, स्टेट कलेज, पीए, संयुक्त राज्य अमेरिका) को प्रयोग गरेर मूल्यांकन गरिएको थियो। संक्षेपमा, गैर-मानव स्तनपायी रिपोर्टर कोषहरू सक्रिय ERRγ अभिव्यक्त गर्दै प्रत्येक कम्पाउन्डमा संकेत गरिएको सांद्रता २ h घण्टा ट्रिप्लिकेटमा उजागर गरियो।
पश्चिमी blotting
यो पहिले वर्णन गरिएको रूपमा प्रदर्शन गरिएको थियो [20] D2R (१: ,००, खरगोश), डोपामाइन ट्रान्सपोर्टर (DAT; १: ,००, खरगोश), टायरोसिन हाइड्रोक्लेसेज (TH; १: १०००, खरगोश) (AB1P, AB500P र AB1, Merck Millipore, Billerica, MA, संयुक्त राज्य अमेरिका), संकेत ट्रान्सड्यूसर र ट्रान्सक्रिप्शन αα (STAT500α; १: १०००, खरगोश) को सक्रियकर्ता, DNMT1 (१: १०००, खरगोश), DNMT1000a (१: १०००, खरगोश) (नम्बर 5084 1591,, 152०3२ र 3 1 1000 Cell; सेल सिग्नलिंग टेक्नोलोजी, टोक्यो, जापान), DNMT1b (१ μg / ml, खरगोश), ERRγ (१: १०००, खरायो) र β-एक्टिन (१: १०,०००, माउस) (ab1, ab1000 र ab3; Abcam, क्याम्ब्रिज, MA, USA)।
मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर
जीन अभिव्यक्तिलाई पहिलेको वर्णनको रूपमा जाँच गरिएको थियो [14]। एमआरएन स्तर को सामान्यकृत गरियो Rn18s (18S आरआरएनए)। प्राइमर सेट मात्रात्मक वास्तविक-समय पीसीआर विश्लेषणहरूको लागि प्रयोग गरिएको ESM तालिकामा संक्षेप गरिएको छ 2.
तथ्याङ्कगत मूल्याङ्कन
डाटा मतलब ± SEM को रूपमा व्यक्त गरियो। एक-तर्फी ANOVA र बारम्बार उपाय ANOVA बहु तुलना परीक्षणहरू पछि (Bonferroni-Dunn विधि) जहाँ प्रयोग भए। विद्यार्थीको t परीक्षण दुई समूहहरू बीचको मतभेदको विश्लेषण गर्न प्रयोग गरिएको थियो। भिन्नता मा उल्लेखनीय रूपमा उल्लेख गरिएको थियो p <००0.05।
परिणाम
5-aza-dC द्वारा DNMTs को औषधीय अवरोध चूहहरुमा आहार को चटाई को लागि प्राथमिकता
चूहों मा HFD खिलाए, D2R को प्रमोटर क्षेत्र मा डीएनए मेथाइलन को चूहों मा एक महत्वपूर्ण आहार को रूप मा एक चाउ आहार (चित्रा। (चित्र .1A) .1a)। अर्कोतर्फ, D2R को प्रमोटर क्षेत्रमा हाइपोथोमिलिक डीएनए मेथिलेशनले चाउचाउ आहारको अन्तर्गत स्ट्रिटममा स्पष्ट भन्दा बढी थियो (p <0.01) (छवि (चित्र .1A, 1ए, एफ) र एचएचडी द्वारा बदलिएको थिएन (चित्र। (चित्र .1F) .1f)। चूहों मा HFD खिलाया, Stiatum मा D2R को प्रमोटर क्षेत्र में संशोधित डीएनए मेथिलेशन सामान्य 5-Aza-DC, एक शक्तिशाली DNMT अवरोधक (छवि संग उपचार द्वारा सामान्यकृत गरिएको थियो। (चित्र .1A) .1a)। यसको विपरीत, हाइक्सथोममस मा D2R को प्रमोटर क्षेत्र मा डीएनए मेथाइलेशन 5-aza-dC (छवि द्वारा उपचार को रूप मा महत्वपूर्ण रूप देखि बदलन नहीं भएको थियो। (चित्र .1F) .1f) २० हप्ता पुरानो नर चूहोंले १२ हप्तासम्म एचएफडीलाई खुवायो भने स्ट्रिटममा, mRNA र D20R को प्रोटिनको स्तरमा उल्लेखनीय ह्रास आएको छ (चित्र) (चित्र .1b, 1b, k, l)। यसको विपरीत, डोपामिन D1 रिसेप्टर को स्तर (D1Rs, एन्कोड गरिएको द्वारा Drd1), जो एडेनेलीली चक्रवात र सीएएमपी मध्यवर्ती इंट्रासेलुलल सिग्नलिंग मा D2R को विपरीत ढंग देखि कार्य गर्दछ, अपरिवर्तित (चित्र। (चित्र .1c) .1c)। यसबाहेक, D2R सिग्नलसँग सम्बन्धित अन्य अणुहरूको स्तरमा कुनै परिवर्तन थिएन, जस्तै M र एनएएनटीमा र DAT मा mRNA र / वा प्रोटीन स्तर (छवि। (चित्र .1D, 1d, e, k, m)। अर्कोतर्फ, हाइपोथोमसमा कुनै स्पष्ट परिवर्तनहरू देखिएन, सहित D2R (चित्र। (चित्र .1-M) .1g-m)। खासगरी, हाइक्सथोमससमा D2R र TH को प्रोटीन स्तरहरू स्ट्रीटममा भन्दा कम (Fig। (चित्र .1L, 1l, m), सम्भवतः हिप्पोथाममस भन्दा तुलनामा दिमाग इनाम प्रणालीमा डोपामिन रिसेप्टर सिग्नलिंगको सापेक्ष महत्व को प्रतिबिंबित गर्दछ।
जाँच गर्न को लागी D2R को प्रमोटर क्षेत्र मा डीएनए मेथाइलन आहार को बोसो को प्राथमिकता को बदलन हुनेछ, 5-aza-dC-treated pice को फीडिंग व्यवहार को विश्लेषण गरियो। जस्तै अपेक्षित, 5-Aza-DC D2R को लागि एचआरडी-फेड चूहों को स्ट्रिटम मा एमआरएनए र प्रोटीन स्तरहरु लाई बढाया बढायो (चित्र। (चित्र .1b, 1b, k, l)। अर्कोतर्फ, स्तरमा कुनै असर पर्दैन Drd1, Th र Slc6a3 (DAT एन्कोडिङ) स्ट्रिटममा, वा स्तरमा Drd2, Drd1, Th र Slc6a3 हाइपोथोममस (चित्र। (चित्र .1-ई, 1c-e, g-m)। यदि वाहन-उपचार चूहों HFD लाई प्राथमिकता दिई, एचएचडी को प्राथमिकता को 5-Aza-DC-treated चूहों (वाहन-उपचार चूहों को मानहरु को लागि 88%) मा कमी आएको थियो (चित्र। (चित्र .1n) .1n)। नतीजा, 5-aza-dC संग उपचार शरीर को वजन मा लाभ कम (चित्र। (चित्र .11o)।
γ-oryzanol HFD-fed चूहों को striatum मा DNMTs को स्तर घट्छ
जस्तै हामीले पहिले रिपोर्ट गरे [14], γ-oryzanol को मौखिक प्रशासन ग्वार द्वारा पुरुष चूहों को महत्वपूर्ण रूप देखि एचएफडी (वाहन-उपचार चूहों को लागि मानों को 93%) को लागि प्राथमिकता को बढाया महत्वपूर्ण (चित्र। (चित्र .2A), 2a), को परिणामस्वरूप शरीर को वजन को लाभ को स्पष्ट उत्तेजना (चित्र। (चित्र .2b) .2ख)। यसैले हामीले स्ट्रिटममा D2R को epigenetic modulation मा γ-ओरेज़ानोलको सम्भावित प्रभाव पत्ता लगायौं।
स्तनपानमा, तीन प्रमुख DNMTs-DNMT1, 3A र 3b छन्। DNMT1 प्रकार्यहरू डीएनए मेथिलेशन कोयम राख्नका लागि, जबकि DNMT3a र 3b नोवो डीएनए मेथिलेशन को सुविधा मा भूमिका निभािन्छ [21]। Vivo मा DNMTs मा γ-ओरेज़ानोल को सम्भावित प्रभाव को अन्वेषण गर्न, हामीले HND-fed चूहों को दिमाग मा DNMTs को स्तर को मूल्यांकन गरे। यद्यपि एचएफडी प्रति डीएनएमटीको प्रोटीन स्तरमा स्ट्रिटमम वा हाइपोथोममसमा एमआरएनए र प्रोटीन स्तरहरूमा कुनै असर पर्दैन, γ-ओरेजानोलको साथ पूरकले स्ट्रिटमममा DNMTs को मात्रा कम भयो तर हाइपोथोममस (फरि। (चित्र .2-ई, 2c-e, g-i, k-n)। यी डेटाले यो संभावना बढाउँछ कि γ-oryzanol हुन सक्छ एक DriMTs को स्तर-विशिष्ट तरिका मा स्तर को विनियमित। त्यसै गरी, 5-Aza-DC ले DNMT3a को एमआरएनए स्तर र 3b लाई प्राथमिकताबद्ध ढंगले स्ट्रिटममा (ESM चित्र) मा कम गर्यो। 1a-d)।
अघिल्लो अध्ययनको आधारमा देखाएको छ कि DNMT1 को mRNA स्तर सकारात्मक रूपमा विनियमित भएको थियो, कम्तिमा आंशिक रूपमा, परमाणु रिसेप्टर ERRγ द्वारा [22], हामी ERRγ गतिविधि मा γ-ओरेज़ानोल को संभावित प्रभाव को जांच को। गैर मानव स्तनधारी कोशिकाहरुमा constitutively सक्रिय ERRγ, 4-hydroxy tamoxifen व्यक्त, ERRγ को एक शक्तिशाली आक्रामक एलोनिस्ट, स्पष्ट रूप देखि ERRγ गतिविधि कम। नोट, γ-ओरेज़ानोल आंशिक रूप देखि ERRγ गतिविधि (एक नै 40 अनियमित मूल्य को कमी मा कमी) (चित्र। (चित्र .3A) .3a)। महत्त्वपूर्ण रूपमा, ERRγ अत्यधिक स्ट्रिटमम मा व्यक्त गरिएको थियो तर यो हाइपोथोमस (फरि। (चित्र .3b-D) .3बी - डी)। स्ट्रिटममको अवस्थाको विपरीत, γ-ऑरेजानानोलले केवल एनएनटीटीएक्सएनएमएक्सको प्रोटीन स्तर बढेको हो भने केवल हाइपोथोमस (फरि। (चित्र .2k, 2k, l)। यी नतिजाहरु समझाई जान सक्छ, कम से कम आंशिक रूप देखि, हाम्रो भेटिन्छ कि STAT3α, DNMT1 स्तर को एक सकारात्मक नियामक [23], प्रचुर मात्रा में हाइपोथोममस में व्यक्त किया गया था लेकिन नहीं striatum में (चित्र। (चित्र .33ई-जी)।
त्यसो भए उनीहरुसँगको सम्बन्धको बारेमा जानकारी गराईएको छ। यसका बारेमा जानकारी गराउनु भएको छ। SAH मा कुनै पनि महत्त्वपूर्ण परिवर्तनहरू थिएनन् कि स्ट्रिटम वा HFD-fed र chow-fed चूहहरुको बीच हाइपोथोमलस (चित्र। (चित्र .2F, 2f, j)। सायद, γ-ओरेज़ानोलले स्ट्रिटमममा SAH गठनलाई निकै कम गर्यो (चित्र। (चित्र .2F) 2f) तर हाइपोथोममस मा (चित्र। (चित्र .2J), 2ज), सुझाव दिन्छ कि γ-oryzanol HriD-fed चूहों मा एक striatum विशेष तरिका मा DNMT गतिविधि को दबा सकते हो।
Vitro मा DNMTs को लागि γ-ओरेज़ानोल को रोकथाम गुणहरु मा एंजाइमिक विश्लेषण
हामी अर्कोले विग्रोमा DNMT गतिविधिमा γ-ओरेज़ानोलको प्रभावको मूल्यांकन गर्नुभयो। Γ-ओरेज़ानोल, फ्युलिक एसिड, 5-Aza-DC, हलोपेरिडोल (एक प्रतिनिधि D2R विरोधी), Quinpirole (एक D2R एग्रोनिस्ट प्रतिनिधि) र डीएनएमटीहरूको विरुद्ध SAHH को रोकथाम पोषणहरू मूल्यांकन गरियो। सकारात्मक नियन्त्रणको रूपमा, SAHले खुट्टा-निर्भर तरिकामा DNMT को गतिविधिलाई बलियो बनायो (चित्र। (चित्र .4-F) .4a-f)। जस्तै अपेक्षित, हेलोपेरिडोल र क्विनपिरलेले DNMTs (ESM चित्र) को गतिविधिमा कुनै प्रभाव देखाए। 2)। सायद, γ-ऑरेजानानोलले महत्वपूर्ण रूपमा DNMT1 (आईसी) को गतिविधिलाई अवरोध गर्यो50 = 3.2.२ μmol / l), a ए (आईसी)50 = २२..22.3 μmol / l) र bb (अधिकतम निषेध% 3%) (छवि। (चित्र .4d-f) .4d-f)। त्यसोभए, फ्युलिक एसिडको अवरोध गतिविधि, γ-ओरेजानोलको एक मेटाबोलाइट, γ-oryzanol (चित्र। (चित्र .44d-f)।
हामीले DNMTs मा γ-ओरेज़ानोलको अवधारणात्मक गुणहरूको खोजी गर्यौँ। SAH को गठन vitro मा DNMTs मा γ-ओएनजानानोल को रोकथाम गतिविधि को मूल्यांकन गर्न को लागी मापा थियो। DNMT मध्यस्थ डीएनए मेथाइलन को समयमा SAH गठन को बारे मा डेटा γ-oryzanol को उपस्थिति र अनुपस्थिति दुवै को लागि माइकलिस-Menten केनिनेट को एक संतृप्त पैटर्न को संकेत (चित्र। (चित्र .4-i) .4g-i)। DNMT1 मध्यस्थ डीएनए मेथाइलन मा, Eadie-Hofstee विश्लेषण ले प्रदर्शन गरे कि γ-oryzanol मा कुनै प्रभाव नहीं दिखायो V अधिकतम SAH गठनको (वाहन, 597 2 pm pmol / मिनेट; or-oryzanol २ μmol / l, 619१ pm pmol / min; or-oryzanol २० μmol / l, 20०608 pmol / min), जबकि γ-oryzanol ले स्पष्ट रूपमा वृद्धि गर्यो K m (वाहन, ०..0.47 μg / ml; or-oryzanol २ μmol / l, ०..2 μg / ml; or-oryzanol २० μmol / l, ०.0.67 μ μg / ml) (चित्र) (चित्र .4J) .4j)। यी परिणामहरूले यो सुझाव दिन्छ कि γ-oryzanol कम्तिमा कम्तीमा एक प्रतिस्पर्धात्मक तरिकामा DNMT1 लाई रोक गर्दछ। अर्कोतर्फ, DNMT3- र 3b-मध्यस्थ डीएनए मेथाइलनको लागि, γ-ओरेजानानोलले घट्यो V अधिकतम SAH को गठन (DNMT3a: वाहन, .85.3 2..63.1 pmol / मिनेट; or-oryzanol २ μmol / l, .20 42.5.१ pmol / मिनेट; or-oryzanol २० μmol / l, .3२..42.3 pmol / min; DNMT2b: वाहन, .28.0२..20 pmol / min; γ -oryzanol २ μmol / l; २.15.0.० pmol / min, γ-oryzanol २० μmol / l, १.XNUMX.० pmol / min) र, त्यस्तै, K m यस प्रतिक्रियाको लागि (DNMT3a: वाहन, ०.००0.0086μ μg / ml; γ-oryzanol २ μmol / l, ०.०2० μg / ml; or-oryzanol २० μmol / l, ०.०0.0080 μg / ml; DNMT20b: वाहन, ००१२२ μg / ml γ-; oryzanol २ μmol / l, ०.०० ०0.0058 μg / ml; γ-oryzanol २० μmol / l, ०.०3० μg / ml) (चित्र) (चित्र .4k, 4k, l)। यी नतिजाहरूले यो सुझाव दिन्छ कि γ-oryzanol कम से कम एक गैर-प्रतिस्पर्धी ढंगमा DNMT3a र 3b लाई रोकथाम गर्दछ।
γ-oryzanol HFD-fed चूहों को striatum मा D2R को वृद्धि को स्तर
हामी अर्को अग्निमा पुग्यौं कि γ-oryzanol DNMTs को अवरोध मार्फत दुर्व्यवहार D2R सामाग्री वृद्धि हुनेछ। HFD-fed चूहों मा, γ-ओरेज़ानोल को मौखिक प्रशासन D2Rs को प्रमोटर क्षेत्र मा striatal डीएनए मेथाइलन को कम (कम। (चित्र .5A), 5एक), जबकि यो हाइपोथोमसस मा यो गरे (चित्र। (चित्र .5F) .5f)। यी निष्कर्ष अनुसार, D2R को mRNA र प्रोटीन स्तरहरू पारस्परिक रूपमा वृद्धि भयो (चित्र। (चित्र .5b, 5b, g, k, l)। 5-aza-dc को साथ उपचार मा डेटा को समान (चित्र। (चित्र .1), 1), आरएनए र प्रोटीन स्तरहरु मा कुनै स्पष्ट प्रभाव थिएन Drd1, Th र Slc6a3 (DAT) स्ट्रिटममा, र स्तरहरूको कुनै प्रभाव छैन Drd1, Th र Slc6a3 हाइपोथोममस (चित्र। (चित्र .5-ई, 5c-e, h- k, m)।
अघिल्लो अध्ययनहरूले देखाइएको छ कि D2R र DNMT1 को स्तर कम से कम एनएएम-κB मार्फत ER ई तनाव र सूजन द्वारा नियमन गरिन्छ [17, 24, 25]। यसैले हामीले ईआर तनाव सम्बन्धी र सूजन सम्बन्धी जीनहरूको स्तरको जाँच गरेका छौं। पहिलेको प्रदर्शन [26], एचएफडीले TNF-α एन्कोडिङ जीनको अभिव्यक्ति बढ्यो (Tnfa), मोनोकाइट chemoattractant प्रोटीन - 1 (एमसीपी - 1) (Ccl2), सी / EBP homologous प्रोटीन (चोप), ईआर-स्थानीयकरण DnaJ 4 (ERdj4) (Dnajb9) र एक्स-बक्स बाइन्डिंग प्रोटीन 1 को spliced रूप (Xbp1s) हाइपोथोममस मा तर स्ट्रिटमम मा नहीं (चित्र। (चित्र .6) .6)। खासगरी, γ-ओरेज़ानोलसँग HFD को पूरक पूरै वृद्धि को अभिव्यक्ति कम भयो Ccl2, चोप, Dnajb9 र Xbp1s खासगरी हाइपोथोममसमा तर स्ट्रिटमममा छैन (चित्र। (चित्र .66).
छलफल
हालैको अध्ययनमा प्रमुख खोजहरु γ-oryzanol चूहों को striatum मा एक शक्तिशाली DNMT अवरोधक को रूप मा कार्य गर्दछ, यसैले, कम से कम आंशिक रूप देखि एचएफडी को लागि प्राथमिकता striatal D2R को माध्यम ले प्राथमिकता। HFD-fed चूहों बाट स्ट्रिटम मा, D2R को स्तर मा काफी कम भयो, जबकि D1R, TH र DAT को बदलन नहीं भयो (चित्र। (चित्र .1b-ई, 1b-e, k-m)। यो डेटा धारणा संग संगत छ कि घडी D2R को dysregulation भोजन इनाम को धारणा मा एक महत्वपूर्ण भूमिका निभािन्छ जब HFD मा, मोटापेक्ष पशुहरुमा HFD को हेडोडिक ओवरसोन्स्युशन गर्न को लागि अग्रणी [3]। हालको अध्ययनमा, एचएचडी-फेड चूहको उपचारले 5-Aza-DC को साथमा अत्याधिक मात्रामा घटेको D2R (चित्र। (चित्र .1b, 1b, k, l) सम्भवतः D2R को प्रोमोटर क्षेत्रमा डीएनए मिथाइल स्तरमा कमी (चित्र। (चित्र .1A), 1एक), र फलस्वरूप आहार को वसा को लागि वरीयता (चित्र। (चित्र .1n) .1n)। यो खोज मा HFD मा जब भोजन इनाम को धारणा मा striatal D2R को एक महत्वपूर्ण भूमिका को समर्थन गर्दछ।
हाम्रो विट्रो आइईमा प्रदर्शन गरिएको थियो कि DNMTs विरुद्ध γ-ओरेज़ानोलको रोकथाम गतिविधि यसको मेटाबोलाइट फेरिक एसिड (फ्याग। (चित्र .4d-f), 4डी-एफ), DNMTs मा यसको रोकथाम कार्य को लागि γ-ओरेज़ानोल को पूरा संरचना को महत्व को सुझाव दिछन। HFD-fed चूहों मा, हाम्रो अध्ययनहरु को सुझाव दि्छ, मौखिक प्रशासन पछि, γ-ओरानजानोल मस्तिष्क को एक पूर्ण संरचना को रूप मा पुग्छ र डीएनएमटी को स्तरहरु लाई प्राथमिकता मा striatum मा कम गर्दछ, जसको परिणामस्वरूप प्रमोटर क्षेत्र मा डीएनए मिथाइलेशन D2R स्ट्रिटममा। त्यसो भए, हाम्रो विट्रो अध्ययनले यो प्रदर्शन गरेको छ कि γ-oryzanol ERRγ को विरुद्ध एक आंशिक विरोधी को रूप मा कार्य गर्दछ, जो मुख्य रूप देखि DNMT1 उत्पादन को लागि एक सकारात्मक नियामक को रूप मा कार्य गर्दछ [22], र फलस्वरूप DNMT1 (चित्र। (चित्र .3A) .3a)। यसका लागि, ERRγ अत्यधिक striatum मा व्यक्त गरिएको थियो तर चूहों मा हाइपोथोमसस (फरि। (चित्र .3b) .3ख)। यो डेटा सुझाव छ कि γ-oryzanol को DNMT1 को mRNA स्तर कम गर्ने क्षमता छ, कम से कम, ERRγ को अवरोध मार्फत। स्ट्रिटमको विपरीत, γ-ओरेज़ानोलले एचएफडी-फेड चूहों (एचआईजीडी) बाट हाइक्सथोमससमा D2R को स्तरमा कुनै प्रभाव देखाएको छैन। (चित्र .5G, 5g, k, l)।
अर्कोतर्फ, हामीले देखेका थियौं कि γ-ओरेज़ानोल हाइपोथोमममा DNMT1 को मात्रा बढेको छ तर यो स्ट्रिटमम (चित्र। (चित्र .2k, 2k, l)। यो देखाइएको छ कि STAT3 ले DNMT1 को सामग्री घातक टी-लिम्फोमा कोशिकाहरूमा बढाउँछ। [23]। खासगरी, हामीले पहिले देखेका थियौं कि γ-ओरेज़ानोलले एचएफडी-फेड चूहों बाट हाइपोथोमसमा लेप्टिट-प्रेरित स्टAT3 फास्फोरिलेशन बढायो [14]। यो पनि ध्यान दिइन्छ कि STAT3α हाइपोथोममस मा पर्याप्त रूप देखि व्यक्त गरिएको थियो तर नहीं चूहों मा striatum (चित्र। (चित्र .3-G) .3ई-जी)। त्यसो भए पनि यो कुरामा हामी सबैलाई थाहा छ कि यो कुरा हो कि तपाईले तपाईलाई थाहा पाउनु हुन्छ? चित्र (चित्र .3b-g) .3बी-जी)। सामूहिक रूप देखि, त्यहाँ striatum र हाइपोथोमस चूहों को बीच ERRγ र STAT3IA को एक पारस्परिक पैटर्न को लागी प्रतीत हुन्छ। यसका लागि, यसका आधारमा यसका बारेमा जानकारी गराउनु पर्दछ। यसका लागि तपाईले तपाईलाई सहयोग पुर्याउनु भएको छ। यसको विपरीत, हाइपोथोममस मा, जहां STAT1α उत्पादन प्रमुख छ, γ-oryzanol को अधिमानतः DNMT3 को स्तर मा वृद्धि हुन सक्छ।
हालैको एक अध्ययनले प्रदर्शन गरेको छ कि एचएफडी द्वारा प्रेरित ईर्ष्या D2R सिग्नल को एहसास को रूप मा खाना पकाने को व्यवहार [3], मोटापे को उपचार को लागि दुर्व्यवहार DNMTs को निषेध को संभावित महत्व को सुझाव दिछन। अर्कोतर्फ, अघिल्लो अध्ययनले सम्भावना देखायो कि विशिष्ट हाइपोथोमिकल न्यूक्लेलीमा व्यक्त गरिएको मेलानोकोर्टिन रिसेप्टर 4 जीनको डीएनए मेथिलेशनको स्थिति agouti व्यावहारिक पीला चूहों मा मोटापे को ट्रांसजेनेशनल रूपहरु लाई परिमार्जन गर्न सक्छ [27]। यद्यपि थप अध्ययनहरू अंतर्निहित तनहुँहरू स्पष्ट गर्न warranted हुन्, यी अध्ययनहरूले HFD-प्रेरित मोटाईको pathophysiology मा ऊतक, जीन- र अनुक्रम विशिष्ट डीएनए मेथाइलन को महत्व बताउँछ।
हामीले भर्खरै रिपोर्ट गरेका थियौं कि एचएफडीले चिसोको अग्लो पनीरमा D2R को स्तर बढ्यो [17, 24]। यो सम्भव छ कि यस्तो वृद्धि मध्यस्थता छ, कम्तिमा आंशिक रुपमा, ईआर तनाव र सूजन द्वारा NF-κB द्वारा, किनकी D2R को प्रमोटर क्षेत्र मा धेरै एनएफ-κB-उत्तरदायी तत्वहरू छन् [17, 24]। यसबाहेक, भर्खरै अध्ययनले देखाएको छ कि TNF-α र IL-1β HFD-fed चूहों बाट एडिपोज ऊतक मा स्तर र DNMT1 को गतिविधि बढावा छ [25]। मुख्यतः, हालको अध्ययनले बताए कि HFD प्रेरित ईआर तनाव र सूजन प्राथमिकता को रूप मा हाइपोथोममस मा तर स्ट्रिटम मा नहीं (चित्र। (चित्र .6) .6)। हाम्रो प्रयोगात्मक प्रतिरूपमा ऊतक-क्षेत्र, र साइट-विशिष्ट डीएनए मेथाइलन र डेथेलिलेशनको गहिरो तंत्रले थप अनुसन्धानको लागि पर्खाइरहेको छ।
हाम्रो अघिल्लो रिपोर्टको साथमा देखियो कि γ-ऑरेजानोलले एचएचडीका लागि प्राथमिकता कोषमा ईआर तनाव को हाइपोथोमिकिक विनियमन मार्फत प्राथमिकता दिनेछ [14], γ-oryzanol पनि feeding व्यवहार को hedonic र चयापचय dysregulation दुवै ameliorating को एक अद्वितीय सम्पत्ति को प्रतिनिधित्व गर्दछ। किनकी केहि antiobesity ड्रग्स विकसित गरिएको छ महत्वपूर्ण प्रतिकूल प्रभाव को कारण जानिन्छ [8], मस्तिष्क पुरस्कार इनाम प्रणाली को तिर एक प्राकृतिक भोजन आधारित दृष्टिकोण को मोटापे मधुमेह सिंड्रोम को उपचार को लागि सुरक्षित तरिका देखि प्रत्याशित गरिन्छ [16]। यस क्रम मा, γ-oryzanol एक प्रतिभाशाली antiobesity उम्मेदवार एक एपिगनेटिक मोड्युलेटर को एक अलग सम्पत्ति संग।
Acknowledgements
हामी पाण्डुलिपिपको समीक्षाका लागि एस ओकामोटो (रुकुकुइस विश्वविद्यालय, जापान) को कृतज्ञ छौं। हामी सचिवालयीय सहायताका लागि एम। हिराता, एच। कानेसिरो, आई। अटतो र सी नोगुची (विश्वविद्यालयको रुकुवाईस, जापान) लाई धन्यवाद दिन्छौं।
संक्षिप्त
| 5-Aza-DC | 5-aza-2'-deoxycytidine |
| D1R | डोपामिन D1 रिसेप्टर |
| D2R | डोपामिन D2 रिसेप्टर |
| DAT | डोपामिन ट्रांसपोर्टर |
| DNMT | डीएनए मेथाइलट्रान्सफेस |
| ER | Endoplasmic पुनरावृत्ति |
| ERR | एस्ट्रोजन से संबंधित रिसेप्टर |
| HFD | उच्च फैटी आहार |
| SAH | S-एडेन्डोसिल-एल-होकोओस्टीन |
| सैम | S-एडनोस्सोल मेथियन |
| STAT3α | सिग्नल ट्रांसड्यूसर र ट्रान्सक्रिप्शन 3α को सक्रियता |
| TH | Tyrosine हाइड्रोक्साइलिस |
टिप्पणीहरू
डेटा उपलब्धता
डेटासेट उत्पन्न र / वा हालको अध्ययनको समयमा विश्लेषण उचित अनुरोधमा सम्बन्धित लेखकबाट उपलब्ध छ।
कोष
यो काम जापानको सोसायटी प्रमोशन विज्ञान (जेएसपीएस, केकेनेई ग्रान्ट नम्बर 15K19520 र 24591338), परिषदका लागि विज्ञान, टेक्नोलोजी र नवाचार (सीएसटीआई), क्रस-सेमनीय सामरिक अभिनव पदोन्नति कार्यक्रमको लागि अनुदान-इन-एड द्वारा सहयोग गरिएको थियो। (एसआईपी) 'अग्लो पीढ़ी कृषि, वानिकी र माछाहरु' बनाउनका लागी टेक्नोलोजीहरू, लोटटे फाउण्डेशन, एप्लाइड एंजाइमोलोजीका लागि जापान फाउण्डेसन, नयाँ एनर्जी र इण्डोनेशिया टेक्नोलोजी विकास विकास (एनईडीओ), लाइफ साइन्स नेटवर्कको गठनको लागि परियोजना (औषधि क्षेत्र) ) (ओकिन्वा प्रिफेक्चर, जापान) र ओकिन्वा प्रिफेक्चरको मेडिकल क्लस्टरिंग, प्रमोशन प्रोजेक्ट, जापानको ओकिन्सा प्रिफेक्चरको लागी उन्नत औषधि (ओकिन्सा प्रान्त, जापान) को लागी सहयोग प्रदान गर्दछ।
ब्याज को Duality
लेखकहरूले यो पाण्डुलिपिसँग सम्बद्ध चासोको कुनै पनि द्वन्द्व होइन भन्ने घोषणा गरे।
योगदान बयान
सीके र एचएमले अनुसन्धानलाई डिजाइन गरे। सीके र टीकेले प्रयोग गरे र डेटा विश्लेषण गरे। टीके, सीएस-ओ, सीटी, एमटी, एमएम र केएले डेटाको व्याख्या गर्न योगदान गर्यो। CK र HM ले पाण्डुलिपि लेख्नुभयो। सबै लेखकहरूले डेटा व्याख्या गर्न योगदान दिए। सबै लेखक पाण्डुलिपी पुन: संशोधन गर्न र यसको अन्तिम संस्करण अनुमोदनमा सामेल हुनुभयो। एचएम यस कामको ग्यारेन्टी हो, सबै डेटामा पूर्ण पहुँच थियो र डेटाको सत्यता र डेटा विश्लेषणको शुद्धता पूर्ण जिम्मेवारी लिन्छ।
फुटनोटहरू
इलेक्ट्रनिक पूरक सामग्री
यस आलेखको अनलाइन संस्करण (Doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) सँग peer-reviewed तर अप्रयुक्त पूरक सामग्री, जुन अधिकृत प्रयोगकर्ताहरूका लागि उपलब्ध छ।
सन्दर्भ
;