PMCID: පීඑම්සීඑන්එන්එක්ස්
එච්එම්එම්එස්එස්ඩී NIHMS174679
වියුක්ත
ජාන ප්රකාශනයෙහි කොකේන්-අනුපිලිවෙලට ලක් වූ වෙනස්කම් නිසා නයිට්රරල් හැඩරුව සහ හැසිරීම් වලදී කොකේන් ඇබ්බැහි වීම යටපත් විය හැකිය. හයිකොන් 3 ලයිසීන් 9 (H3K9) ඩයිමීටේෂන් සහ ලයිසීන් ඩයිම්ලෙට් ට්රාන්ස්ෆෙරාස් G9a සඳහා කොකේන්-ව්යාකාපිත හා ව්යාජ හැසිරීම් රටාව සඳහා අත්යාවශ්ය කාර්යභාරයක් අපි හඳුනා ගත්තා. නැවතත් කොකේන් පරිපාලනය න්යෂ්ටික අක්ත ඝෝෂනයේ H3K9 ඩයිමෙටයිලේෂන් ගෝලීය මට්ටම් පහත හෙලීය. ටීමෙම හයිඩෝනීය මෙතිල්කරණයෙහි ඔහුගේ අඩු වීම, මැදිහත් වීමෙන් මොළයේ කලාපයේ G9a මර්දනය මගින් මැදිහත් විය. එය කොකේන්-අනුපිලිවෙලන ප්රේරක සාධකය ΔFosB මගින් පාලනය කරන ලදි. කොන්දේසිගත mutagenesis සහ වෛරසයෙන් මැදිහත් වී ඇති ජාන හුවමාරුව භාවිතා කිරීම, G9a පහත හෙලීම මගින් කොකේන් දිගුකාලීන ක්රියාකාරීත්වයේ දී histone මෙතිල්කරණය සඳහා තීරක කාර්යභාරයක් ස්ථාපනය කිරීම මගින් එමගින් න්යෂ්ටියේ ඇක්බිබන් න්යුරෝනවල ඩෙන්ඩ්රික් ඇඩ්මිනේන් ඖෂධ නියුරෝන වැඩි දියුණු කිරීම සහ කොකේන් වැඩිදියුණු කිරීමේ වැඩි වීම වැඩි කර ඇත.
හැදින්වීම
නැවත නැවතත් කොකේන් හෙලිදරව් කිරීම මගින් මොළයේ ප්රකාශනය හා වෙනස් කරන ලද න්යෂ්ටික අණුකත්වයේ අඛණ්ඩ වෙනස්වීම් මගින් සංඝටිත වන අතර මොළයේ විපාක පරිපථයේ ප්රධාන අංගයකි (NAc)1-2). කොකායින්ගේ ඇබ්බැහිවීම ආශ්රිතව යටින් පවතින මෙම මොළයේ කලාපය තුළ චිරමැටින් නැවත සකස් කිරීම වැදගත් වේ. (3-9). NAc ප්රතිඵලයක් ලෙස කොකෝයින් නියාමනය කිරීම සඳහා කොකායින් නියාමනය කිරීම, අර්ධ වශයෙන් කොකෝයින්-induced modifications සිට chromatin එන්සයිම යන්ත්රෝපකරණ වලින්, histone ඇසිටිල්කරණය හා ෆොස්ෆොරයිලීකරණය (4, 7-9); කෙසේ වෙතත්, histone මෙතිල්කරණය පාලනය කිරීමේ එන්සයිම සඳහා වන කාර්යයන් තවමත් විමර්ශනය කර නොමැත.
මෑත කාලීන ජෙනමී-ප්රොපර් විශ්ලේෂණයක් භාවිතා කරන ක්ෂුද්ර හැඩයට සම්බන්ධ Chromatin Imunoprecination (ChIP-Chip) මගින් ප්රතික්රියාශීලී හයිස්ටන් H3 ලයිසීන් 9 (H3K9) සහ 27 (H3K27) මෙතිල්කරණය මගින් NAc නැවත නැවතත් කොකේන් ප්රතිකාර (6). එබැවින් H3K9 හෝ H3K27 මෙතිල්කරණය පාලනය කිරීම සඳහා ලිසීන් මෙතිල් ට්රාන්ස්ෆේරේසස් (KMTs) සහ ඩෙටිලේටේස් (KDMs)රූපය 1A). GFNXXA සහ GLP යන එන්සයිම දෙක පමණක් පමණක්, ජාන දෙකේ ප්රකාශනය සැලකිය යුතු ලෙස අඩු වී ඇති විට, නැවත නැවතත් කොකේන් පාලනයෙන් පසු පැය ගණනාවක් තිස්සේ තිරස්ඛීය නියාමනය නියාමනය කළහ.. G9a සහ GLP විශේෂයෙන් H3K9 (H3K9me2) ඩයිමෙටයිලේෂණය උත්ප්රේරනය කර ඇති බැවින් කොකේන් මගින් ඔවුන්ගේ නියාමනය අඩු වී ඇති අතර එම කාලසීමාව තුළ නිරීක්ෂණය කරන ලද Euchromatic H3K9me2 පහළ මට්ටමක පවතී (රූපය 1B). ඊට වෙනස්ව, හයිටොක්රොමැටික H3K27 මෙතිලීම ගෝලීය මට්ටම් නැවත නැවතත් කොකේන් නිරාවරණය වීමෙන් නොසැලී පැවතුණිසබැදි ද්රව්ය සඳහා උපකාරය S1 Fig). එහි උත්ප්රේරක ක්රියාකාරිත්වය ඉහළ මට්ටමක පවතී කෘතිම දී සහ ඉතින් (10), අපි NAc හි නැවත නැවතත් කොකේන් නිරාවරණය වීමෙන් පසුව G9a මර්දනයෙහි ක්රියාකාරී වැදගත්කම තවදුරටත් විමර්ශනය කිරීමට අපි යොමු කරමු. G9a ප්රෝටීන වල එහි mRNA මට්ටම් මෙන් ම නැවත නැවතත් කොකේන් පරිපාලනය කිරීමෙන් පසුව 24 පැය සැලකිය යුතු ලෙස අඩු විය.රූපය S2). G9a mRNA ප්රකාශනය NAc හි 35% කින් අඩු වුවද, ප්රතිශක්ති පරීක්ෂණ රසායනික විශ්ලේෂණය මගින් G15a ප්රෝටීන් මට්ටම් වල වඩා අඩුවෙන් 9% අඩු වීමක් පෙන්නුම් කරන ලද අතර, නැවත නැවතත් කොකේන් පරිපාලනය (H21K3me9)රූපය 1B). මෙම මොළයේ කලාපයේ G9a mRNA ප්රකාශනය ද නතර විය. 20% නැවත නැවතත් ස්වයංව පාලනය කිරීමේදී කොකේන් (රූපය S3).
එක්ස්රොමැටික H3K9me2 වල වෙනස්කම් ජානමය වශයෙන් වෙනස් කරන ලද ජානමය වෙනස් කිරීම් සමඟ සම්බන්ධ වී තිබේද යන්න හඳුනා ගැනීම සඳහා, අපි කොකායින් වෛරසය හෙවත් ඉතිහාසයේ පූර්ව කොකායින් හෙවත් ඉතිහාසයේ හෝ නොමැතිව සනාථ කරන ලද ජාන ප්රකාශ ප්රකාශන පැතිකඩයන් මගින් ඇතිවන කොකායින් ආසාදන මාත්රාව පරීක්ෂා කිරීම සඳහා ක්ෂුද්ර විචල්ය විශ්ලේෂණ යොදා ගනී ජාන ලැයිස්තු වගු S1-S3). නැවත නැවතත් කොකේන් ලබාගත් සතුන් කොහෙන්දැයි සැලකිලිමත් වූ සත්ත්වයන්ට සාපේක්ෂව කොකේන් අභියෝගයකින් පසු පැය එකහමාරකට වැඩි කාලයක් ජාන ප්රකාශනය නාටකාකාර ලෙස ඉහළ නංවයි.රූපය 1C). නැවත නැවතත් කොකේන් සිට ඉවත් කළ සතියේ සිට 1 සතියෙන් පසු කොකේන් අභියෝගයට ප්රතිචාර දැක්වීමෙන් මෙම ඉහළ ජාන ප්රකාශනය තවමත් සිදු වී ඇත. පූර්ව වාර්තා වලට අනුකූලව, කුඩා ජාන සංඛ්යාවක් (~ 10%) නැවත නැවතත් කොකේන් පරිපාලනයට පසු සංවේදී ප්රතිචාර දක්වයිරූපය 1C; බලන්න වගුව S1) (5). නැවත නැවතත් කොකේන් මගින් නිරීක්ෂණය කරන ලද වැඩිදියුණු කළ ජාන ප්රකාශනය, G9a හි භූමිකාව පිළිබඳ නිශ්චිතවම විමර්ශනය කිරීම සඳහා, මූසිකයන් GFP හෝ G9a හෝ ප්රකාශ කරන හර්පීස් සරලෙක්ස් වෛරස් (HSV) වල වාහකයන් අතරට NAc එන්නත් ලැබුණු අතර G9a අධි සංවේදනය ජාන ප්රකාශනය නැවත නැවතත් කරන ලද කොකේන්-ඉන්ජිනේරුවේ වැඩි දියුණු කිරීම අවහිර කිරීමට ප්රමාණවත් විය. 12 කාණ්ඩයේ අහඹු ලෙස තෝරාගත් ජානවලින් නැවත නැවතත් කොකේන් මගින් ප්රකාශයට පත් වූ ඉහළ මට්ටම්වල දැක්වෙන මට්ටම් වලින්, G9a සැලකිය යුතු ලෙස මෙම ජාන වලින් 50%වගුව S4).
G9a ප්රකාශනය නැවත නැවතත් කරන ලද කොකේන්-අනුයාත මර්දනය මැදිහත් වීමෙන් ඇතිවන ප්රචලිත සිද්ධි සංසිද්ධි සිද්ධාන්ත හඳුනා ගැනීම සඳහා, ක්ෂණික මුල් ජානයේ වැඩි ස්ථාවර රැහැන් නිෂ්පාදනයක් වන ΔFosB සඳහා හැකි ක්රියාකලාපයක් fosB. ΔFosB කොකේන් වලට නැවත නැවත නිරාවරණය වීමෙන් පසු NAc accumulation වේ, කොකේන් ප්රතිලාභය වැඩි කර ඇත (11). ΔFosB වලට අදාල ජානවලට සම්බන්ධව සම්ප්රේෂක ශල්යකර්මයක් හෝ මර්දනයෙකු ලෙස ක්රියා කළ හැකිය (3, 5, 6, 12). බිට්ස්සජන් NSE-tTA × tetOP-ΔFosB මූසිකය, ΔFosB ප්රකාශනය වැඩිහිටි සතුන්ගේ පෘෂ්ඨවංශික (NAc) සහ පෘෂ්ඨවංශික තීරයේ (Dorsal striatum)13) අපි NAc හි H3K9me2 සහ කොකේන් නියාමයේ කොකේන් නියාමනය මත ΔFosB ප්රකාශනයේ බලපෑම පරීක්ෂා කළෙමු. H3K9me2 මට්ටම් මට්ටම් අඩු කිරීම සඳහා ΔFosB අධි සංවේදීතාව ප්රමාණවත් විය (රූපය 1D) සහ G9a ප්රකාශනය (රූපය 1E), එමගින් නැවත නැවතත් කොකේන්වල බලපෑම් අනුකරණය කිරීම. මීට ප්රතිවිරුද්ධව, ΔFosB මෙම මොළයේ කලාපයෙහි GLP ප්රකාශය අඩු නොකළ අතර H39K1 සහ H2K3 සඳහා ප්රධානතම ත්රිකෝණිතකරණ එන්සයිම් සඳහා SUV9H3 සහ EZH27 සඳහා කිසිදු බලපෑමක් නොතිබුනි (රූපය S4). ස්වාභාවික ΔFosB අධි-අධි පීඩන පද්ධතියක් භාවිතයෙන් මෙම දත්ත තහවුරු කර ගැනීම සඳහා ඩිඅයිටයිප් වැඩිහිටි මීයන් GFP හෝ ΔFosB ප්රකාශයට පත් කරන ලද Adeno-associated virus (AAV) දෛනිකව ද්වි-එන්නත් කිරීම සිදු කරනු ලැබේ. ΔFosB හි වෛරස්-මැදිහත් වූ අධිරුක්තියක් මෙම මොළයේ කලාපයේ G9a ප්රකාශයේ මට්ටම් පහත හෙලීය (රූපය 1E).
G9a හි එවැනි ප්රකාශිත සහ විශේෂිත නියාමනයකින් අපට NAcc න්යුරෝන තුල විශේෂයෙන් G9a ප්රකාශය වෙනස් කිරීම කොකේන් වලට චර්යාත්මක ප්රතිචාරයන් පාලනය කරනවාදැයි විමසීමට අපට හේතු විය. වල් ටි මීයන් GFP හෝ G9a ප්රකාශ කරන HSV වල වාහකයන්ට NAc එන්නත් ලැබුණු අතර ඉන් අනතුරුව නිරපේක්ෂ කොකායින් වායුසමීකරණ ස්ථානයක මනාප ප්රකරණයක් භාවිතා කරන ලදී. NAc න්යුරෝන වල G9a හි වෛරස් අධික අවයවයන් චර්යාත්මක පරීක්ෂණයෙන් තහවුරු කරන ලදී (රූපය 2A). G9a overeexpression ජීඑස්පී මගින් අධික ලෙස ජීර්ණය කරන සතුන් සමග සසඳන විට කොකේන් සඳහා සැලකිය යුතු අඩුවීමක්රූපය 2B), සහ NAc හි H3K9me2 මට්ටම් වැඩි කරන ලදි (රූපය 2C). G9a හි (G9aH1093K) උත්ප්රේරක ලෙස මියගිය මුත්රා වල අධික විකිරනශීලීත්වය (14) කොකේන් මනාප වලට බලපෑවේ නැත (රූපය 2B) සහ මෙම මොළයේ කලාපයේ H3K9me2 මට්ටම් කෙරෙහි කිසිදු බලපෑමක් නොතිබිණ (රූපය 2C).
කොකේන්වල චර්යාත්මක බලපෑම් සම්බන්ධයෙන් G9a හි භූමිකාව තවදුරටත් අධ්යයනය කිරීම සඳහා, වැඩි විස්තර සඳහා NAc හි G9a ප්රකාශනයේ නැවත නැවතත් කොකේන්-අනුයාත මර්දනය අනුකරණය කිරීමට වැඩිහිටි G9aඑෆ් / එෆ් මූසිකයන් (14) ARE ආවරණ බීඑස්ඒ ආවරණ ආවරණ ලබා ගැනීම සඳහා NAc එන්නත් ලබා ඇත. NAc හි ඇති G9a හි AAV-Cre knockdown, ප්රතිශක්තිකරණය කරන ලද (immunohistochemically) (රූපය S5), වායු සමීකරණවලදී කොකේන්වල බලපෑම සැලකිය යුතු ලෙස වැඩි කරන අතර NAc හි H3K9me2 මට්ටම් (රූපය 2D, ඊ). G9a හා GLP, වාණිජමය වශයෙන් ලබා ගත හැකි ඖෂධීය සංඝටකයක් වන BIX01294 (15-16), එන්සයිම ආම්ලිකතාවය ද කොකේන් වලට චර්යාත්මක ප්රතිචාරයන් කෙරෙහිද බලපායි. සැබවින්ම, G9a සහ GLP හි ඖෂධීය ආබාධය කොකේන් සඳහා වැඩි කැමැත්තක් සහ NAc හි H3K9me2 හි අඩු වීමක් (රූපය 2F, ජී).
කොකේන් නැවත වරක් පරිපාලනය කරන ලද NAc මධ්යක නිහඬ න්යුරෝන මත ඩෙන්ඩ්රැටික් කඤ්චක ඝනත්වය වැඩි කරයි (17), මෙම න්යුරෝන මත උත්තේජක ග්ලූටැටැටර්ජික උපාගයන්හි ක්රියාකාරී වෙනස්කම් සමග සම්බන්ධ ක්රියාවලියක් (18-19) සහ ඖෂධයට හැසිරීම ප්රතිචාර දැක්වීම (17, 20). එබැවින් නැවත නැවතත් කොකේන් මගින් NAc හි ක්රියාකාරිත්වයේ G9a ක්රියාකාරිත්වය අවලස්සන බව උපකල්පනය කළ හැකිය. NAc නියුරෝන වල ඩෙන්ඩ්රික් නිපදවන කොඳු ඝනත්වය නියාමනය කිරීම සඳහා කොකේන් සතු හැකියාව මැදිහත් විය හැකිය. GCNUMXa ප්රතිදේහයක් සමඟ Chromatin Imunoprecination (ChIP) යොදා ගැනීමෙන්, අපි NAc හි ඇති අනුපූරක G9a ජාන ඉලක්ක කිහිපයක් හඳුනා ගෙන ඇති අතර, ඒවා එක් එක් කොකේන් ඩයිඩ්රැටික් ප්ලාස්ටික් බවට පූර්වයෙන් සම්බන්ධ වී ඇත (රූපය 3A) (20-26). අපි නැවත නැවතත් කොකේන් පරිපාලනය G9a බන්ධනය සැලකිය යුතු ලෙස අඩු වී ඇති අතර, මෙම ජාන ප්රවර්ධකයන් (H3K9me2) මට්ටම් (රූපය 3B). ඊට ප්රතිවිරුද්ධව, උග්ර කොකේන් පරිපාලනය වේගවත් ලෙස G9a විසින් එම ජාන ප්රවර්ධකයන් වෙත බඳවා ගනු ලැබීය. කොකේන් උග්ර මාත්රාවකින් පසු NAc 9 හි නිරීක්ෂණය කරන ලද G1a ප්රකාශනය සමඟ අනුකූල වීමරූපය S6). නිශ්චිත ජාන ප්රවර්ධකයන්ගේ G9a නිශ්චිත ජාන ප්රවර්ධකයන්ගේ ප්රකාශනයෙහි වෙනස්කම් සමග බැඳී ඇතත්, එවන් සිදුවීම්, NAc හි වෙනස් වූ ගෝලීය මට්ටම් G9a මගින් මැදිහත් වී ඇත්ද යන්න හෝ / හෝ G9a බඳවා ගැනීමේ වෙනස්කම් මගින් එදිරිව නැවත නැවතත් කොකේන් පාලනය
NAc හි ඇති ප්ලාස්ටික් ආශ්රිත ජාන වල G9 ආකෘතිය මත පදනම්ව නැවත නැවතත් කොකේන් ප්රතිකාර කිරීමෙන් අනතුරුව G9a ප්රකාශනය නඩත්තු කිරීම කොකේන්-ඉන්ජිනේරුමය ඩෙන්ඩ්රැරික් කොඳු ඇට සැකසීම් අවහිර කිරීමට ප්රමාණවත් විය. කොකේන් ප්රතිකාර ප්රොටෝකෝලය යොදා ගැනීමෙන් පසු NAc හි ඩෙන්ඩ්රික් කන්ජි ප්රේරනය ප්රවර්ධනය කිරීම සඳහා ආදර්ශණය කරන ලදී20), අපි HSV-GFP හෝ HSV-G9a සහිත එන්නත් කරන ලද සතුන් වල කොඳු ඝනත්වය පරීක්ෂා කළා. පූර්ව සොයාගැනීම් සමග එකඟත්වයට පැමිණි විට, අපි කොකායින් ප්රතිකාරයෙන් පසුව NAc හි ඩෙන්ඩ්රික් ඖෂධයේ නිපදවන ස්පිනී ඝනත්වය සැලකිය යුතු ලෙස ඉහළ ගොස් ඇති අතර, G9a overexpression මගින් සම්පූර්ණයෙන්ම අවහිර කරන ලද බලපෑමක් (රූපය 3C). G9a අධික රුධිර පීඩනය පමණක් කොකේන් නොමැති අවස්ථාවලදී NAc ඩැන්ඩ්රැටික් මාංශ පේශි ඝණත්වය අඩු කිරීමට ප්රමාණවත් නොවේ. මෙම දත්ත එක් කිරීම සඳහා G9aඑෆ් / එෆ් මීයන් HSV-Cre හි NAc එන්නත් ලබා ගන්නා ලද අතර, කොඛයින් නොමැතිව HSV-GFP ලබා ගන්නා සතුන් සමඟ සංසන්දනාත්මකව නිපදවන ලද අතර, G9a හි Knockdown ප්රකාශය NAc මධ්යකාලීන නිධන්හික න්යුරෝන මත ස්නායු ඝනත්වය සැලකිය යුතු ලෙස වැඩි විය (රූපය 3C).
G9a නැවත නැවතත් කොකේන් පසු නැවත නැවතත් කොකේන් නතර වීම GXNUMXa නිගමනය කිරීම ΔFosB මගින් මැදිහත් වී ඇති බව අපි ඊළඟට විමසා බැලූ අතර, මෙම සංක්රාන්ති සාධකය ද NAc dendritic කඤ්චේනාවන්හි නියාමයට සම්බන්ධදැයි යන්න විමසා බැලීය. ΔFosB මීට කලින් ඩෙඩ්රැටික් ප්ලාස්ටික් සඳහා හේතුවක් වී නොමැති නමුත් Cdk5 සහ NFκB උප ඒකක ඇතුළු එහි ඉලක්ක කිහිපයකටම එතරම් බලපෑමක් ඇති වී ඇත (20-23), සහ ΔFosB හි අඛණ්ඩ ප්රකාශනය NAc නියුරෝන වල පුනර්ජනනීය කොකේන් ප්රතිකාර කිරීමෙන් පසු වැඩිවන ඩෙන්ඩ්රික් නිපදවීමකි. (27). පළමුවෙන්ම, G9a සහ H3K9me2 ප්රකාශනය අඩු කරන ලද කොකේන් නොමැති අවස්ථාවක බිට්ස්ජන්ජියන් මීයන් තුළ ΔFosB ආශ්වාස කිරීම සොයාගන්නා ලදී (රූපය 1D, ඊ), GASNUMXa ආම්ලිකතාවට විවිධ ජානවලට සංයෝජන අඩු වී ඇති අතර, බොහෝමයක් ΔFBB හි සෘජු ඉලක්කයන් ලෙස පෙන්නුම් කර ඇත (රූපය 3D) (3, 6). ඊළඟට අපි NAc හි ΔFosB හි වෛරස් අධිරුධිර පීඩනය නිසා බාහිර තත්ව යටතේ ඩෙන්ඩ්රැටික් ස්පිනි ඝනත්වය සීඝ්රයෙන් ඉහළ ගොස් ඇති අතර, නැවත නැවතත් කොකේන් පාලනයෙන් පසුරූපය 3E). අනෙක් අතට, ΔJunD හි NAc හි අධික අවයව ප්රතිකි්රයාව ΔFosB අනුක්රමික ක්රියාකාරීත්වයේ ප්රතිරෝධී ක්රියාවලියක් වන අතර, නැවත නැවතත් කොකේන් තුළ ඩෙන්ඩ්රික් නිපැයුම් වර්ධනය කිරීම සඳහා NAc (රූපය 3C).
ΔFosB NAcB හි G9a ප්රකාශනය ΔFosB නියාමනය කරන බවත්, ΔFosB සහ G9a මගින් එම ඉලක්ක ජාන පාලනය කරන බවත් ΔFosB සහ G9a අතර අනෙකුත් අන්තර් ක්රියාකාරීත්වය පරීක්ෂා කිරීමට අපට මඟ පෑදීය. උග්ර කොකේන් පසු G9a මට්ටම් වැඩිවූ විට, G9a සමඟ බැඳීම fosB ජානය වැඩි වූ අතර නැවත නැවතත් කොකේන් මගින් G9a ප්රකාශනය යටපත් කරන විට, G9a බන්ධනය සඳහා fosB ජානය අඩු විය (රූපය 3A). නැවත නැවතත් කොකේන් පසු එවැනි ආසාදිත G9a බන්ධන සඳහා නිරීක්ෂණය නොකළේය c-fos, G9a බන්ධනය නැවත නැවතත් කොකේන් මගින් වැඩි කරනු ලැබේ (රූපය S7). මෙය මෙන් නොව, එය මෙන් නොව fosB, c-fos දිගුකාලීන මානසික අවපීඩනයෙන් හෙම්බත් වීම (induced,5). බිට්ස්ජන්ජියන් මීයන් තුළ ΔFosB අධි සංවේදීතාව සැලකිය යුතු ලෙස අඩු කිරීමට G9a බන්ධන ප්රමාණවත් විය. ෆොස්බබ් ජානය (රූපය 3D). තව ද, G9a අධි සංවේදීතාව නැවත නැවතත් කොකේන් පරිපාලනය කිරීමෙන් පසුව ΔFosB ප්රකාශය අඩු කිරීම සඳහා ප්රමාණවත් විය.වගුව S4). මෙම දත්ත G9a මගින් ස්වයංක්රීයවම කොකේන් පරිපාලනය විසින් ΔFosB ප්රේරණය සීමා කරයි. කෙසේ වෙතත්, ΔFosB නැවත නැවත ඖෂධය සමඟ සමපාත වන විට, එය G9a මර්දනය කිරීමෙන් හා එහිම තවදුරටත් උත්තේජනයක් උත්සන්න කරයි.
අවසාන වශයෙන්, NAc හි හිස්ටෝන් ලයිසීන් මෙතිල්කරණය, කොකේන් වලට ප්රතිචාර වශයෙන් න්යුරෝන ජාන ප්රකාශනය නියාමනය කිරීමේදී විවේචනාත්මකව සම්බන්ධ වී තිබේ. G9a හා H3K9me2 මර්දනය කිරීමෙන් පසු නැවතත් කොකේන් පරිපාලනය විසින් කොකේන් අභිරුචීන් අනුප්රාප්තිකය මගින්, අරුචිකිත්සක ප්ලාස්ටික් ආකෘති හැසිරවීම පාලනය කරන බොහෝ ජාන සංක්රමණික ක්රියාකාරිත්වය හරහා ප්රවර්ධනය කරයි. එවැනි යාන්ත්රණ මගින් පාලනය කරනු ලබන ජාන පිළිබඳව වඩා හොද අවබෝධයක් ලබාගැනීම මගින් මත්ද්රව්යවලට ඇබ්බැහිවීම පිළිබඳ සංකීර්ණ ජීව විද්යාත්මක පදනම පිළිබඳ දැනුම වැඩිදියුණු කරවන අතර ඇබ්බැහි වූ ආබාධ වැඩි දියුණු කිරීම සඳහා වඩාත් ඵලදායී ප්රතිකාර ක්රම දියුණු කර ගැනීමට හැකි වනු ඇත.
ද්රව්ය සහ ක්රම
සතුන් සහ ප්රතිකාර
වෙනත් ආකාරයකින් සඳහන් කර නොමැති නම්, මීයන් 12 පැයකින් සැහැල්ලු / තෙත චක්රයක් සහිත කොළයක සිට සිව් දිනකට හෝ පහක මස් (7 සිට 00 AM to 7: 00 PM) වලින් නිරන්තර උෂ්ණත්වයේ (23 ° C) ලිබිටුම් ජලය හා ආහාර සඳහා ප්රවේශය. සත්ව සාගර වෛද්ය මධ්යස්ථානයේ සහ සිනායිහි වෛද්ය විද්යාලයේ IACUC ආයතනය විසින් සියළුම සත්ත්ව ප්රොටොකෝලය අනුමත කරන ලදී.
කොකේන් අත්හදා බැලීම් සඳහා [IMUNOHISTOCHEMITRY, western blotting, ප්රමාණාත්මක PCR (qPCR), ක්ෂුද්ර විච්ඡේදක විශ්ලේෂණය සහ chromatin ප්රතිශක්තිකරණය (ChIP)], 8- 10-සතියේ පැරණි පිරිමි C57BL / 6J මීයන් භාවිතා කරන ලදී. දිනකට සෙලීන් (7 පතිකාරක සේලයින්, අයිපී), 'උග්ර' කොකේන් (6 ප්රතිකාර ප්ලාස්ටික් + එක් එක් ප්රතිකාර 20 mg / kg කොකේන්-HCl, ip) හෝ 'නැවත නැවත' කොකේන් (7 ප්රතිකාර 20 mg / kg) කොකේන්-HCl, ip). මීයන් 1 පැය හෝ 24 පැය අවසන් කිරීමෙන් පසු මිය ගිය අයගේ ජීවිත පූජා කළා. ක්ෂුද්ර ජීවීන්ගේ අධ්යයන සඳහා දිනපතා සෙලීන් (15 පතිකාරක සේලයින්, අයිපී), ඔක්ටේන් කොකායින් (14 ප්රතිකාර ප්ලාස්ටික් 1 ප්රතිකාර 20 mg / kg කොකේන්-HCl, ip), නැවත නැවතත් "උග්ර" කොකේන් ( 7 ප්රතිකාර ප්ලාස්ටික් 8 ප්රතිකාර 20 ප්රතිකාර / කොකේන්-HCl, ip) හෝ නැවත නැවත ඉවත් වීම + උග්ර කොකේන් (7 ප්රතිකාර 20 mg / kg කොකේන්-HCl + 7 ප්රතිකාර ප්ලාස්ටික් 1 අභියෝගාත්මක ප්රතිකාර 20 mg / kg කොකේන්-HCl, ip) සහ අවසන් ප්රතිකාරයෙන් පැය 1 පරිත්යාග කරන ලදී. චර්යාත්මක පරීක්ෂණවල දී මූසිකය පසු ශල්යකර්මයකට භාජනය කරන ලද අතර පහත විස්තර කර ඇති පරිදි 10 mg / kg කොකේන්-HCl, අයි.පී. HSV-GFP සහ HSV-G9a-GFP ආසාධනය කිරීමෙන් පසු පැටවුන්ගේ හයිඩ්රේටයේ නිපදවීම සහ ක්ෂුද්ර විචල්යය විශ්ලේෂණය කිරීම සඳහා මයිස් 'සෙලීන්' (5 ප්රතිකාරවල සේලයින්, අයිපී) හෝ 'නැවත නැවත කොකේන්' (5 ප්රතිකාර 20 mg / kg කොකේන්-HCl, ip ) 3 දවස් වලදී, මෙම එන්නත් කිරීමේ ප්රොටෝකෝලය හර්පීස් සරලෙක්ස් වෛරසය (HSV) transgene ප්රකාශනය (timing) තුළ න්යෂ්ටියේ ඇක්බුන්සන් (NAc) න්යුරෝන මත ස්පින ඝනත්වය වැඩි කිරීම සඳහා නිරූපණය කර ඇත.අතිරේක ප්රතිඵලය S1). අන්තිම ප්රතිකාරයෙන් පසුව ඩෙන්ඩ්රික් කන් විශ්ලේෂණය සඳහා යොදා ගන්නා මීයන් 4 පැය පූජා කරන ලදී.
GcNUMXa හි දේශීයව මකාදැමීම සඳහා NAc න්යුරෝන වලට සීමා කරන ලද ග්රන්ථය, වෙනත් තැනක සවිස්තරව විස්තර කර ඇති floxed G9a ඇලෙලෝට සඳහා ප්රතිශක්තික මීයන් භාවිතා කරන ලදී.S2). Cre-induced recombination XnumX 22 මඟින් පිටත රාමු අතර ඇති වන සංයෝජන මගින් විකෘත පිටපත් විකෘති කිරීමට හේතු වේ. අපි C25BL / 9J මූසිකයන් සම්පූර්ණයෙන්ම පෙරලා දැමූ G57a floxed මූසිකයන් භාවිතා කළා. මීයන් 6 සහ 2 යන වයස් කාණ්ඩයන් අතර GFP හෝ Cre-GFP ප්රකාශ කරන ලද ඇඩෙනෝ-ආශ්රිත වෛරස් (AAV) දෛශික (AAV) වාහකයන් (Steroidaxically Injected) ලෙස එන්නත් කර ඇත. Cre-mediated recombination කාර්යක්ෂමතාව තහවුරු කිරීම සඳහා ප්රතිශක්ති කාක්ෂික විශ්ලේෂණය භාවිතා කරන ලදී (බලන්න අතිරේක රූපය S5). අපි AAV භාවිතා කළේ 21 දිනකට පසු ශල්යකර්ම සඳහා එන්නත් කිරීමයි. G9a නිපදවන මීයන් තුළ ප්රතිශබ්බනය ස්ථාවර හා උපරිම මට්ටමින් වාර්තාගත වාර්තා (S3-S4). G9a සහ ΔJunD overexpression පරීක්ෂණ සමාන ලෙස ජීඑෆ්පී වෛරස් දෛශික භාවිතා කර, ඩයි ටයිට් G9a-GFP, උත්ප්රේරක ලෙස මිය ගිය G9aH1093K-GFP හෝ ΔJunD-GFP (බලන්න S2 G9a ඉදිකිරීම පිළිබඳ විස්තර සඳහා). අධි පීඩන උද්දීපනය කරන ලද මීයන්, 3 දවස් පසු ශල්යකර්ම සඳහා යොදා ගන්නා ලදී. HSV ප්රකාශනයේ සංක්රාන්ති ස්වභාවය සහ AAV ප්රකාශයේ සැලකිය යුතු ස්ථායී ස්වභාවය නිසා HSV වල වාහකයන් වේගවත් කෙටි කාලීන කාබන් ප්රකාශනයක් අවශ්ය වන අතර, AAV වාහකයන් දිගුකාලීන පරමාණුක ප්රකාශනයක් අවශ්ය කරන පර්යේෂණ සඳහා භාවිතා කරන ලදී. ආබාධිත හෝ ක්ෂය වන න්යුරෝන වල කිසිදු ආසාදනයකින් තොරව මොළයේ පෙදෙස තුළට එන්නත් කරන ලද න්යුරෝනීය සෛල වල පමණක් ආසාධනය කිරීම සඳහා, දිගුකාලීන අධ්යයනයන්හි දී ද වාහකයන් දෙකම පෙන්වා ඇත.
ඖෂධීය G9a / GLP සංඝටකය භාවිතා කරන චිකිත්සක අත්හදා බැලීම් සඳහා BIX01294 (25 ng / μl), මීයන් අනුකම්පිත කුඩා පොම්ප දෙකක් සහ ද්විපාර්ශවීය මාර්ගෝපදේශ කැනීම් සමග නාශකය නාසිකව පැවතීම. එක් එක් වාහනයක 12 හයිඩ්රොක්සොපීපීල් β-සයික්ලොඩෙක්ස්ට්රින් හෝ 0.25 දින සඳහා ඖෂධ එක් කිරීම (5 μl / පැ.සී.) ආරම්භ කිරීම සඳහා කුඩා පොම්ප ක්රියාත්මක කරන ලද 14 පැය සක්රීය කරන ලදී.
ΔFosB අධි-අධි පරීක්ෂන සඳහා [Western blotting, qPCR, සහ ChIP] සඳහා, පිරිමි බිට්ස්සජන් NSE-tTA × tetOP-ΔFosB මීයන් භාවිතා කරන ලදි (10 සතියේ පැරණි), එමඟින් ටෙට්රාසයික්ලයින් ව්යුත්පන්නය ඩොක්සිසක්ලින් (8 සෙක්ස් ඩොක්සික්සයික්ලයින්) නොලැබෙන අතර, ΔFosB හි ශක්තිමත් පටල සහිත සීමිත අර්ථනිරූපිත ප්රකාශනයක් පෙන්වන ලදීS5). මෙම මීයන් තුළ ΔFosB අධි සංවේදීතාව qPCR මගින් තහවුරු කරන ලදි. NSE-tTA × tetOP-ΔFosB මීයන්, වනජීවීන් 8-සතියේ පැරණි C57BL / 6J පිරිමි මීයන් GFP හෝ ΔFosB-GFP ප්රකාශ කර ඇති AAV වාෂ්ප සමග ස්ටෝෙටොක්සයික් ආකාරයෙන් එන්නත් කර ඇත. AAV වාහකයන් මෙම අවස්ථාවෙහිදී, 8 සතිපතා පසු ශල්යකර්මයේ දී උපරිම ΔFosB ප්රකාශනය සහතික කිරීම සඳහා, වෛරස් ආසාදිත හා බිට්සජන් Δ FosB අධි පීඩන ඇඟිලි අතර සන්සන්දනය කිරීම සඳහා ඉඩ සලසයි. වෛරස් අධි රුධිර පීඩනය සතිපතා පශ්චාත් ශල්යකර්මයේ දී ඵම්එච්ආර්එක් (xNUMX) මගින් තහවුරු කරන ලදී (8-මැනිය හැකි NAc පන්ච් එන්නත් අඩවියට විසුරුවා). AAV-GFP සහ AAV-ΔFosB-GFP යන රෝග නිධියන් සමඟ ලිංගාශ්රිතව බෝ නොවන අවයව ප්රතිකි්රයා කිරීමේදී සෙලීන් (15 ප්රතිකාර, සේලයින්, අයිපි) හෝ නැවත නැවත කොකේන් (14 ප්රතිකාර 14 mg / kg කොකේන්-HCl, ip) ශල්ය කර්මයකි. අවසන් ප්රතිකාරයෙන් පසු 30 දින, මොළය 6% paraformaldehyde සමඟ සවි කර ඇති අතර, එය vibratome මත වෙන් කරන ලද අතර ඩෙන්ඩ්රික් නිපදවීම නිපදවීම සඳහා භාවිතා කරනු ලැබේ.
බස්නාහිර විශ්කම්භය
14-gauge NAc පන්තීන් විසින් මල නොබැඳෙන වානේ මූසිකයන්ගේ මොළය භාවිතා කර 1 මිමි කෝරනා අංශ වලින් ලබාගෙන ඇති අතර ප්රෝටේසේ සහ පොස්පේටේස් ආම්ලිකතා අඩංගු 1 M HEPES ලයිසියේ බෆරයේ (1% SDS) හීලෑ වී ඇත. 10-30% SDS ජානවල මුළු ප්රෝටීන් වල 18 μg සාම්පල ඉලෙක්ට්රෝෆරූපනය කරන ලදී. ප්රෝටීනවල PVDF පටල වලට මාරු කරන ලද අතර H3K9me2 (එම්එන්එන්එක්ස්එක්ස්: 1), β-ටියුබුලින් (මූසිකය monoclonal, 500: 1), පූර්ණ-හයිටෝන් H60,000 (හාවා පොලිකෝලා, 3: 1) HFNXXXMLXMX5,000 (හාවා පොලික්ලිකන්, 1: 1000) හෝ ප්රති-ආක්ටික් ප්රතිදේහ (මවුස් මොනිකොන්ටා, 3: 27) එක රැයකදී (එච්එන්එම්එක්ස්) 3 ° C (සියළුම පටල 1% කිරි හෝ 500% Bovine serum albumin තුළ අවහිර කර ඇත). පසුව මී මැස්සෝ පෙරොක්සිඩේසා ලේබල් සහිත ද්විතියික ප්රතිදේහ සමඟ පොතු කරන ලදී (1: 60,000-1: 60,000 භාවිතා කරන ලද ප්රාථමික ප්රතිදේහය අනුව) සහ බෑන්ඩ්ස් සුපිරි ස්පඤ්ඤ බටහිර ඩුර උපස්ථරය භාවිතයෙන් පෙනීයයි. NIH Image J මෘදුකාංගය සහ H3K9me2 යන බෑන්ඩ්ස් ප්රමාණයන් ඔක්ටින් හෝ β-ටියුබුලින් හෝ සම්පූර්ණ හයිටෝන් H3 සඳහා සමාන බර පැටවීමට පාලනය කරන ලදී. නැවතත් කොකේන් ඇක්ටීන් මට්ටම් කෙරෙහි කිසිදු බලපෑමක් නොතිබුණි (රූපය S8) හෝ සම්පූර්ණ histone 3 (රූපය S1) NAc හි. තවද HSV-G9a-GFP සහ HSV-G9aH1093K-GFP ආසාධනය NAc හි β-ටියුබුලියේ සමස්ත මට්ටම් කෙරෙහි කිසිදු බලපෑමක් නැතරූපය S8).
හෘද රෝගය
මයිස් ක්ලෝරල් හයිඩ්රේට්ගේ මාරාන්තික මාත්රාවකින් යුක්ත වූ අතර 4% paraformaldehyde සමග පෙරටු කර ගත්තාම පෙර විස්තර කර ඇති පරිදි තනි හෝ ද්විත්ව ප්රතිශක්ති විද්යාව මගින් විශ්ලේෂණය කිරීමට පෙරS6). කෙටියෙන්, පසු නිශ්චිත මොළය 30% μm හි වෙන් කර තැබීමට පෙර 35% සුක්රෝස් තුළ රාත්රී කාමරයේ උෂ්ණත්වයට ලක් වූ අතර (ඩෙන්ඩ්රික් කඤ්චේල විශ්ලේෂණය සඳහා භාවිතා කරන මොළය 100 μm කොටස්වල 30% අංශයන් නොමැතිව 1% සුක්රෝස් නොමැතිව) වෙන් කරන ලදී. නිදහස්-පාවෙන NAc කොටස් 3X PBS සමඟ සෝදා, 0.1% සාමාන්ය බූරුවාගේ serum, 1% tritonX, 1X PBS) සහ පසුව GFP (කුකුල් පොලික්ලොලිල්, 8000: 9) සහ / හෝ anti-G1a (හාවා පොලිකෝලා , 500: 1) ප්රතිශක්තිකරණ ද්රාවණ තුළ ප්රතිදේහ. ඩෙන්ඩ්රැටික් කඤ්චුක සඳහා විශ්ලේෂණය කරන ලද අංශු 200 හි හාවා පොලික්ෙලෝනාල් ප්රති-GFP ප්රතිදේහ සමඟ පොසිලේ තබා ඇත. 3. එක් රැයකින් පුර්ව නික්ෂේපකයක් මඟින් NAc කොටස් 10 PBS සමඟ 1 විනාඩි සඳහා 2 විනාඩි සඳහා XINUMX මිනිත්තුව සඳහා 3 PBS වාරය සඳහා 1 PBS අවහිර කිරීමේ ද්රාවණ XXUMUMX සහ / හෝ Cy2 ෆ්ෙලොරසන්ට්-සම්බන්ධිත ද්විතියික ප්රතිදේහ සමඟ රඳවා තබා ගන්නා ලදී. කාමර උෂ්ණත්වයේ දී රාත්රී ප්රතිෙපෝෂිතය තුළ රූප සටහන් සඳහා ෙයොදා ගන්නා ලද අංශ ෙයොදා ගන්නා ලදී. 1 මිනිත්තුව සඳහා DAPI (1: 50,000) අඩංගු 10X PBS හි කොටස් ගැඹුරින් න්යෂ්ටික සම-පැල්ලම් කිරීම අත්කර ගනු ලැබීය. කොටස් නැවත වරක් සෝදා, එතනෝල් විජලනය හා ඩීඑෆ්එක්ස් සමග වැඩිවිය. සෑම අංශයක් ම ප්රතික්රියාකාරක අන්වීක්ෂයකින් භාවිතා කරන ලදී.
RNA හුදකලා සහ qPCR
ද්විපාර්ශ්වික 14-මිනුම් NAc පන්ච් ට්‍රයිසෝල් හි සමජාතීයකරණය කර නිෂ්පාදකයාගේ උපදෙස් අනුව සකස් කරන ලදී. ආර්එන්ඒ මයික්‍රෝ තීරු වලින් ආර්එන්ඒ පිරිසිදු කර ඇති අතර වර්ණාවලීක්ෂය මගින් ආර්එන්ඒ 260/280 සහ 260/230 සලාක> 1.8 බව තහවුරු කරන ලදී. ආර්එන්ඒ පසුව ජෛව රැඩ් අයිස්ක්‍රිප්ට් කට්ටලයක් භාවිතයෙන් ආපසු හරවා යවන ලදි. සීඩීඑන්ඒ ප්‍රමාණාත්මකව qPCR විසින් SYBR Green භාවිතා කර ඇත. ග්ලයිසෙරල්ඩිහයිඩ් -3-ෆොස්ෆේට් ඩයිහයිඩ්‍රොජිනස් (GAPDH) සාමාන්යකරණය කිරීමේ පාලනයක් ලෙස භාවිතා කරමින් කලින් විස්තර කර ඇති පරිදි සෑම ප්‍රතික්‍රියාවක්ම අනුපිටපත් හෝ ත්‍රිත්වයකින් ක්රියාත්මක කර විශ්ලේෂණය කරන ලදී.S7). බලන්න අතිරේක වගුව S5 mRNA උදාසීන අනුපිළිවෙල සඳහා.
DNA මයික්රෝතරන් විශ්ලේෂණය
කන්ඩායම් හතරක් (කණ්ඩායමට එක් එක් 3 ස්වායනික ජෛව ස්කෝටීය අනුපූරක) ක්ෂුද්රායිලයේ අධ්යයනය සඳහා 12 මයිෙකොයිඩ්රැම් වල එකතුව භාවිතා කරන ලදී. අවසාන කොකේන් එන්නත් කිරීමෙන් පසු 1 පැය, සතුන් ඉක්මනින් අතුගා දැමූ අතර මොළය ඉවත් කර අයිස් මත තැබූහ. NAc හි විඝටනය 15-කකුලේ ඉඳිකුරු කදම්බයක් භාවිතා කර RNA නිපදවන තෙක් වියළි අයිස් මත ශීත කළ හැක. ද්විපාර්ශවික පන්ච් සමූහයක් සඳහා එක් එක් සතුන් සඳහා ප්රතිශතයට සතුන් හතරක් එකතු කරන ලදි. RNA හුදකලා, ක්ෂුද්ර තරංග සැකසීම සහ දත්ත විශ්ලේෂණය කලින් විස්තර කරන ලදි (S8). කෙටියෙන් කිවහොත්, ඉහත විස්තර කර ඇති පරිදි ආර්එන්ඒ හුදකලා කර පිරිසිදු කර ඇති අතර එජිලන්ට්ගේ ජෛව විශ්ලේෂකය භාවිතයෙන් ගුණාත්මකභාවය පරීක්ෂා කරන ලදී. යූටී නිරිතදිග මයික්‍රෝආරේ හරය මඟින් සම්මත ක්රියා පටිපාටි භාවිතා කරමින් ඉලුමිනා මවුස් ඩබ්ලිව්ජී -6 v2.0 අරා වෙත ප්‍රතිලෝම පිටපත් කිරීම, විස්තාරණය කිරීම, ලේබල් කිරීම සහ දෙමුහුන්කරණය සිදු කරන ලදී. අමු දත්ත පසුබිම් අඩු කර ප්‍රමාණාත්මකව සාමාන්යකරණය කරන ලද්දේ බීඩ්ස්ටූඩියෝ මෘදුකාංගයෙනි. ජෙනීස්ප්‍රින්ග් මෘදුකාංගය භාවිතයෙන් සාමාන්යකරණය කරන ලද දත්ත විශ්ලේෂණය කරන ලද අතර 1.3 ගුණයකින් වෙනස් කළ හැකි කප්පාදුවක වැදගත්කම නිර්ණායක භාවිතා කරමින් ජෙනලිස්ට් ජනනය කරන ලද අතර p <0.05 හි දැඩි නොවන p අගය කපා හැරීමක් ද සිදු විය.
හේතු කිහිපයක් නිසා මෙම දත්තයන් කෙරෙහි දැඩි විශ්වාසයක් තබා ගන්නෙමු. පළමුවෙන්ම, සියළුම සත්ත්වයන් එකම කොන්දේසි යටතේ, එකී වේලාවටම ප්රතිකාර කළ, ප්රතිකාර හා මරාදැමිය. ඒ වගේම සියලුම RNA සහ අරාව සැකසීම එකම අවස්ථාවේ දී සිදු කරන ලදී. දෙවනුව, අප විසින් අරාබි අක්ෂර තුනක් සිදු කර ඇති අතර එක් එක් ප්රභේදයට අනුව විවිධ සතුන් එකට එකතු කර, එමගින් වෙනස් විචල්යතාවයන් වැඩි කිරීම හා සංඛ්යාත්මක බලය වැඩි කිරීම (S9). තෙවනුව, අපගේ අධ්යයනය සඳහා භාවිතා කරන ලද දත්ත විශ්ලේෂණ නිර්නායක නිර්දේශ කරනුයේ MicroArray Quality Control ව්යාපෘතිය මගින්, මෙම නිර්ණායකයන් ඉහළ මට්ටමේ අන්තර්-ප්රති නිෂ්පාදනයක් සහ අන්තර්-ප්ලාස්ටික් ප්රතිනිෂ්පාදනය ලබා දීම සඳහා වලංගු වන බැවිනි.S10-S11).
වෛරස් වාහකයන් ඉදිකිරීම
වෛරස් දෛශික ඇතුළත් කිරීම් ප්රමාණයන් නිසා, ඩයිටි ටයිප් G9a (G9a) හෝ උත්ප්රේරක ලෙස මිය ගිය G9a (G9aH1093K) සඳහා කේතීකරණ අනුපිළිවෙල නිසා මානව ක්ෂුද්රජීවී මුල් සෛලවල සයිලෙගෝලොවයර් වයිරස් (CMV) පාලනය යටතේ ආර්එස්පී ප්ලාස්මිඩ් (p1005 + HSV ප්ලාස්මිඩ්) ඇතුළත් කිරීම් ප්රමාණය ~ 9 kb, AAV-3.96 වාහකයන් සඳහා උපරිම ඇතුළත් කිරීම් ප්රමාණය ඉක්මවා ඇත). IE2 / 4 ප්රවර්ධකයා G5a ප්රකාශනය ධාවනය කරයි. ක්ෂීරපායී ජීර්ණය අනුගමනය කිරීමෙන් P9 + ජීඑස්එම්එක්ස්එක්ස් (pcDNA1005) ජීපීඑම්එක්ස් (ජීඑස්එන්එන්එන්එන්එන්එන්එක්ස්) ජීපීඑස් ජීපීසී ජීඑස්එම්එක්ස්එස් ජීපීඑස් ජීඑස්පීඑස් ජීඑස්එම්එස්එම් ජීඑස්එම්එස්එස් (සීඑම්අයි) නිපදවන ලදී. HSV-ΔJunD-GFP නිපදවීම සඳහා, EcoRI සීමාකරන ස්ථාන ΔJunD හි අනුක්රමික අනුක්රමය EcoRI අඩවියේ අඩංගු පොලි ඔලිසන් වල න්යෂ්ටිකෝටෝටයිඩ සහිත PCR මගින් උත්පාදනය කරන ලදී. PCR නිපැයුම p9 + දෛශිකයේ EcoRI වෙබ් අඩවියට ඇතුල් විය. NAc න්යුරෝන වල Cre recomcomase හි දේශීය ප්රකාශනය අත්පත් කර ගත් පරිදි AAV වාහකය භාවිතා කරමින් වෛරස්-මැදිහත්කාර ජාන සැපයුම මගින් ලබා ගන්නා ලදිS12). GFP හෝ Cre සඳහා GFP හි N-පර්යන්ත Fusion බවට ප්රතික්රියාකාරක AAV-2 දෛශිකයක් තුලට හුවමාරු ඩොනෝර් ඇග්රෝටර් අනුක්රමය හා බහුඅඩයිලයිටින් සංඥාව සහිත CMV ප්රෝටෝරයක් අඩංගු වේ. සියළු ෛදශික ඇතුළත් කිරීම් dideoxy-අනුකමණය මගින් තහවුරු කරන ලදි. වෛරස් වාහකයන් ත්රිත්ව-ද්රෝහී, අසරණ-නිදහස් ක්රමයක් භාවිතයෙන් නිෂ්පාදනය කරන ලදී (පෙර විස්තර කරන පරිදිS13). පියුරිං වෛරසය -80 ° C හි ගබඩා විය. HEK293 සෛල වලදී ආසාදිත තක්සේරුව මගින් වෛරස් ප්රමිතිය ඇගයීමට ලක් කරන ලදී. AAV-ΔFosB-GFP වෛරස් සමානයි. HSV-Cre සඳහා Cre expression (Cre expression) සහ න්යුරෝනමය විෂවීම වැළැක්වීම සඳහා IE4 / 5 ප්රවර්ධකයාට එරෙහිව IRES ප්රවර්ධකයෙක් විසින් මෙහෙයවනු ලැබීය. S14 වෛරස් ඉදිකිරීම් සඳහා). සෑම අවස්ථාවකදීම, වෛරස් අධික රුධිර පීඩනය තක්සේරු කරන ලදී කෘතිම දී සහ ඉතින් qPCR හරහා, සහ සැත්කම් පසු NAc-සීමා සහිත ප්රකාශනය පෙන්වීමට වෛරස් immunohistochemically තහවුරු.
ශල්ය කර්මයක්
කෙටමින් (100 mg / kg) / ක්සිලේසින් (10 mg / kg) නිර්වින්දනය, මීයන් කුඩා සත්ව ස්ට්රෝටැක්හි උපකරණයක් තුළ පිහිටුවා තිබූ අතර චිරාණි පෘෂ්ඨය නිරාවරණය විය. 0.5 μl / min හි 10 μ කෝණයකින් 1.6 ° කෝණය (AP + 1.5, ML + 4.4, DV-0.1) ද්වි වායුගෝලීය XYUMXX μl වෛරසය ආසාදනය කරන ලදී. ශල්යකර්මයෙන් පසුව 2 දිනකට ශල්යකර්මයෙන් පසුවන සතුන් සඳහා HSV එන්නත් ලබා ගැනීමට අවසර ලැබුණි. AAV වාහකයන්ගේ චර්යා පරීක්ෂාව සඳහා භාවිතා කරන ලද මීයන් 20 දවස් සඳහා ශල්යකර්මයට භාජනය කිරීමට පෙර ඉඩ ලබා ගැනීමට අවසර ලැබුණි. මෙම කාල වකවානුවේ වාහකයන් දෙකම සඳහා උපරිම වයිරස-මැදිහත් වූ transgene ප්රකාශනයන්ගේ කාල පරිච්ඡේදයන් සමග ගැලපේ. BIX01294 ආවරණ සඳහා එක් එක් කුඩා පොම්ප දෙක එක් එක් මූසිකයේ පිටුපස සෘජු ලෙස ස්ථානගත කර ඇත. NAc ට වඩා කුඩා කුඩියල් කුහර දෙකක් බාග්මා (AP + 1.5, ML + 1.0, DV-5.4) බහාලන මගින් කැනනයෙහි ස්ථානගත කිරීම් ලබා ගන්නා ලදී. මී මැස්සන්ට 4 සඳහා ශල්යකර්මයෙන් සුවය ලැබීමට පහත දැක්වෙන පරිදි කොකේන් වලට ස්ථානීය සාදන ක්රියා පටිපාටිය ආරම්භ කිරීමට පෙරාතුවම.
නිසි ස්ථානයේ අභිප්රාය
කලින් විස්තර කරන පරිදි ස්ථානයේ සැකසුම් ක්රියා පටිපාටිය සිදු කරන ලද්දේ පහත සඳහන් වෙනස්කම් සහිතව (S7). කෙටියෙන් කිවහොත්, HSV-G3a-GFP, HSV-G9aH9K-GFP හෝ HSV-GFP හි අභ්‍යන්තර-එන්ඒසී මුදල් සම්භාරයක් වියදම් කිරීමෙන් දින 1093 කට පසුව, මීයන් එකිනෙකට වෙනස් පරිසර තුනකින් සමන්විත වූ කන්ඩිෂනර් කුටිවලට දමා ඇත. කන්ඩිෂනර් කුටි දෙකෙන් එකක් සඳහා සැලකිය යුතු මනාපයක් පෙන්වන මීයන් අධ්‍යයනයෙන් බැහැර කර ඇත (<සියලු සතුන්ගෙන් 10%). තවමත් පවතින ඕනෑම කුටීර නැඹුරුවක් සඳහා සැකසීමට කන්ඩිෂනින් කණ්ඩායම් සමතුලිත කරන ලදී. පසු දින සතුන් සතුන්ට සේලයින් එන්නත් කර දහවල් එක් කුටියකට මිනිත්තු 30 ක් සීමා කර පසුව කොකේන් (10 mg / kg, ip) එන්නත් කර විනාඩි 30 ක් සවස් වරුවේ අනෙක් කුටියට දින 2 ක් (දෙකක් සේලයින් සහ කොකේන් යුගල දෙකක්). පරීක්ෂණය සිදු වූ දිනයේදී, මීයන් විනාඩි 20 ක් ප්රතිකාර නොමැතිව නැවත උපකරණ තුළට දමා ඔවුන් කැමති කුමන පැත්තදැයි ඇගයීමට ලක් කරන ලදී. Drug ෂධ ප්‍රතිකාරයේ effectiveness ලදායීතාවය සහතික කිරීම සඳහා කොකේන් යුගලනය කරන ලද කුටිවල කදම්බ බිඳීම් මගින් කොකේන් සඳහා ලොකොමෝටර් ප්රතිචාර තක්සේරු කරන ලදී. AAV සහ BIX01294 CPP අත්හදා බැලීම් සඳහා තරමක් වෙනස් කරන ලද ප්‍රොටෝකෝලයක් භාවිතා කරන ලදී. සතුන්ට නැවත සේලයින් හෝ කොකේන් (10 mg / kg, ip) එන්නත් කර විනාඩි 30 ක සැසි සඳහා නිශ්චිත කුටිවලට පමණක් සීමා කරන ලද නමුත් ඒ වෙනුවට දින 4 කට දිනකට එක් වරක් පමණක් කොන්දේසි පනවනු ලැබූ අතර 5 වන දින පරීක්ෂණයෙන් පසුව (සතුන්ට කොන්දේසි සහිත විය සවස් වරුවේ සහ කන්ඩිෂනර් ප්රතිකාර විකල්ප විය. සියලුම කණ්ඩායම් සඳහා, සේලයින් වලට ප්රතිචාර වශයෙන් මූලික දුම්රිය එන්ජින් තක්සේරු කරනු ලැබුවේ වෛරස් හෝ නිෂේධක ප්රතිකාර මගින් දුම්රිය එන්ජින් බලපෑමට ලක් නොවන බව සහතික කරමිනි.
ස්වයං පාලනයක්
මෙම අත්හදා බැලීම ආරම්භයේ දී 230-250 ග්රෑම් බර අනුව පිරිමි ළදරු Long-Evans මීයන් ලබා ගන්නා ලදී. 12 පැයට සැහැල්ලු / තද චක්රය (ආර්.එන්.ඒ. හි 9 හි දී ආලෝකය) ආවාටය. ලිබිටුම් ආහාර හා ජලය සඳහා ප්රවේශය. ඔවුන්ගේ නව පරිසරය තුළ පැටවුන්ට ඉඩ ලබා දෙන අතර, අත්හදා බැලීම ආරම්භ කිරීමට පෙර 1 සතියකට දිනපතා කළහ. සියලු ක්රියා පටිපාටි පවත්වනු ලැබුවේ රසායනික සතුන් රැකබලා ගැනීම හා භාවිතය සඳහා වූ ජාතික සෞඛ්ය ආයතනයෙහි අනුකූලව වන අතර එය සිනායි හි සත්ව සංරක්ෂණ හා භාවිත කමිටුව විසින් අනුමත කරන ලදි. ස්වයං පරිපාලන යන්ත්රෝපකරණ අධෝරක්ත කදම්භ මගින් දේශානුරූපී හැසිරීම් මැන බැලීම සඳහා සවි කර ඇත. ස්වයං පරිපාලනය කලින් විස්තර කර ඇති පරිදි (S15-S16) අයිසොෆ්ලෝරන් (2.4–2.7%) නිර්වින්දනය යටතේ දකුණු ජුගුලා නහරයට කැතීටර් සවි කර ඇත. කැතීටර් 0.1 U හෙපටින් සහ ඇම්පිසිලින් (10 mg / kg) අඩංගු සේලයින් ද්‍රාවණයක මිලි ලීටර් 50 ක් යොදනු ලැබීය. ශල්යකර්මයෙන් සුවය ලැබීමෙන් සතියකට පසු, ස්වයං පරිපාලන පුහුණුව ආරම්භ වූයේ ආලෝක / අඳුරු චක්‍රයේ අඳුරු අවධියේදී ය. ස්ථාවර අනුපාත -3 (FR0.75) ශක්තිමත් කිරීමේ කාලසටහනක් යටතේ සතුන්ට දිනපතා පැය 1 ක කොකේන් (1 mg / kg / infusion) වෙත ප්‍රවේශ වීමට අවසර දෙන ලද අතර එහිදී ක්රියාකාරී ලීවර මුද්‍රණ යන්ත්‍ර 1 ක් එක් drug ෂධයක් ලබා දී ඇත. මීයන් දින 6 කට පසු ඔවුන්ගේ කොකේන් ප්රමාණය ස්ථාවර කර ඇත (අඛණ්ඩව දින 15 ක් තුළ ප්රතිචාර අනුපාතයෙහි 3% විචලනය, අවම වශයෙන් 75% ක් ශක්තිමත් කළ ලීවරය මත ප්රතිචාර දක්වයි). අවසාන ස්වයං-පරිපාලන සැසිවාරයෙන් පැය 24 කට පසු, මීයන් ඉක්මනින් දිරාපත් වී, මොළය වේගයෙන් ඉවත් කර ආර්එන්ඒ හුදකලා කිරීම සහ qPCR සඳහා සකස් කරන ලදී.
Chromatin Imunoprecipitation (ChIP)
නැවුම් NAc පන්ච් formaldehyde cross-linked සහ කලින් විස්තර කරන පරිදි ChIP සඳහා සකස් කරන ලදිS17-S18) සුළු වෙනස්කම් සහිතව. කෙටියෙන්, 4 14-gauge NAc දඬු සඳහා එක් පැටවෙකු (එක් නියැදි එක් එක් එක් එක් සතුන්) එකතු කරන ලද 5% formaldehyde සමග සංසන්දනය කර 1 M glycine සමග සංකලනය කරන ලදී. එච්ජීඑම්එක්ස් එක්දින හීලෑකරණයට පෙරාතුව, බැක්ටීරියාවට එරෙහිව හාවා-හාවා / මූසිකය (වර්ෂාපතන ප්රතිශතය මත පදනම්ව) IgG චුම්බක පබළු (G2a) (හාවා පොලික්ෙලෝනා චිප් ශ්රේණියේ) හෝ H80K1me9 (මවුස් මොනොලෝනා චිප් ශ්රේණියේ) බ්ලොක් විසඳුමක නියත භ්රමනය යටතේ 3 ° C දී රාත්රී ප්රතිදේහ ටීසීය ශල්යකරණය සහ chromatin කැපීම පෙර විස්තර කරන ලදි (S17). පහත සඳහන් sonication, chromatin සමාන සාන්ද්රණය නව නල සඳහා මාරු කර ඇති අතර ~ 5% අවසන් නිෂ්පාදන "ආදාන" පාලනය ලෙස සුරැකිය. ප්රතික්රියා කරන ලද නියැදි / ප්රතිදේහ මිශණවල සම්පුර්ණ සේදීම සහ නැවත ප්රතිචක්රීකරණය කිරීමෙන් පසු එක් එක් chromatin නියැදියට එක් එක් chromatin නියැදියට ප්රතික්රියා / බීඩීස් මිශණ (~ 7.5 μg ප්රතිදේහ / නියැදිය) සමාන පරිමාව 16 ° C දී නියත භ්රමනය යටතේ ~ 4 පැය සඳහා එකතු කරන ලදී. ප්ලාස්ටික් කට්ටලයක් භාවිතා කරමින් DNA පවිත්ර වීමකට පෙර දිනකට එක් දිනකදී 65 ° C දී සාම්පල සායම් කිරීම හා නැවත හරවන ලදී. ඩීඑන්ඒ පවිත්රකරණයෙන් පසු, නියැදි qPCR වලට යටත් විය, කලින් විස්තර කරන ලද පරිදි ඒවායේ නියමිත ආදාන පාලනයන් වෙත සාමාන්යකරණය කරන ලදීS17). මුසික ෙපෝටෙලෝන ෙපොලිස් ආකාරෙය් IgG පතිෙද්හයක් භාවිතා කරමින් සාමාන්ය මූසික IgG Imunoprecipitations ද සංඥා විස්තාරණය කිරීම සඳහා සුදුසු ෙපෝෂණය සඳහා පාලනය කිරීමට ද සිදු කරන ලදී. ඇඩිනීන් පොස්පොරිබොසොසොල් ට්රාන්ස්ෆෙරාසා (APRT) කොකේන් සහ ΔFosB අධිරුධිර පීඩන පරීක්ෂණ සඳහා ඍණාත්මකව පාලනය කරන ලදී. බලන්න අතිරේක වගුව S5 ප්රවර්ධන කථිකාකාර අනුපිළිවෙල සඳහා.
ඩෙන්ඩ්රික් කන් විශ්ලේෂණය
නිව්නෝනියා (morphology) නියාමයට අනුව G9a වල භූමිකාව අධ්යයනය කිරීම සඳහා, අපි පහත දැක්වෙන වෙනස්කම් සමග විස්තර කර ඇති ක්රමවේදයන් භාවිතා කළෙමු (S1). HSV-GFP එන්නත් කිරීමෙන් පසු HSV-G9a-GFP, HSV-ΔJunD-GFP එන්නත් කිරීමෙන් දින තුනකට පසු (ඩිග්ටයිප් C57Bl / 6J මීයන් තුළ සියලු වෛරස යොදා ගනී) හෝ HSV-Cre-GFP (G9aඑෆ් / එෆ් මීයන්) වෛරස් ප්රකාශනය උපරිම වූ විට මූසිකය ක්ෂය වූ විට මොළය ක්රිප්-ආරක්ෂිත වූ අතර පසුකාලීනව vibratome මත 100 μm හිදී වෙන් කරන ලදි. ඉහත විස්තර කර ඇති GFP වලට ප්රතිදේහයක් භාවිතා කිරීමෙන් අනතුරුව කොටස් ප්රතිශක්තිකරණ (Imunohistochemistry බලන්න) බලන්න. G9a overexpression හා hippy numbers මත ඇති වන බලපෑම ඇගයීම සඳහා ΔJunD overexpression හි බලපෑම ගණනය කිරීම සඳහා, GFP-ප්රකාශනය වන NAc මාධ්යයෙන් අවම වශයෙන් 1 μm හි අවම 2-299 μm හි නියුෙරෝට ආසන්න වශයෙන් කඤ්චුක සංඛ්යාව මැනිය හැක. නිසරු න්යුරෝන (MSNs). එම්.කේ.එස්.සී. වල අනෙකුත් නියුරෝන වර්ගීකරණවල අණුක වෙනස්කම් දක්නට ලැබෙන බැවින්, HSV මූලික වශයෙන් මෙම මොළයේ කලාපයේ DARPP-32 ආසාදන වන බව පෙන්නුම් කරයි.S19), අපි මෙම අධ්යයනයන් තුල MSN ලෙස සුවිශේෂී ලෙස තක්සේරු කර ඇති බව අපට විශ්වාසයි. එක් සත්වයක් සඳහා 6-8 වර්ගයේ 3-4 න්යෂ්ටීන් (7 කණ්ඩායම්) 8-100 නියුරෝන පරීක්ෂාවට ලක් කළ අතර ඉන් පසු සංඛ්යාත්මක විශ්ලේෂණය සඳහා එක් එක් සත්වයා සඳහා සාමාන්ය අගයක් ලබා ගන්නා ලදී. NAc නිපදවන ඝනත්වය මත ΔFosB අධි-අධි පීඩනය පරීක්ෂා කිරීම සඳහා නිර්මාණය කර ඇති පරීක්ෂණ, ඉහත විස්තර කර ඇති පරිදි, AAV දෛශිකයන් දිගු කාලයක් සඳහා GFP හෝ ΔFosB-GFP ප්රකාශ කිරීම සඳහා භාවිතා කරන ලදී. සියලුම HSV රූපයන් 63X තෙල්-ගිල්වීමේ අරමුණු සහිත චුම්බක අන්වීක්ෂයක් යොදා ගෙන ඇත (AAV රූප 1X තෙල්-ගිල්වීමේ අරමුණින් අල්ලා ගන්නා ලදී). 1024 හි අත්තනෝමතික ඒකකය සහ 1024 × 10 රාමු ප්රමාණයෙන් සාදා ඇති පිංතූර රූපයෙන් ලබා ගන්නා ලදි. ඩෙන්ඩ්රිටික් දිග මැනීම NIH Image J මෘදුකාංගය මගින් මනිනු ලැබූ අතර, පර්යේෂන ස්කෑන් කිරීමකට පෙරාතුව ස්ලයිඩ් කේතයන් සංකේතාත්මකව පරික්ෂා කරන ලදි. ඩෙන්ඩ්රි XNUMX μm සඳහා කඤ්චක සාමාන්ය අගය ගණනය කරන ලදී.
සංඛ්යාන විශ්ලේෂණය
ෙකොන්ෙද්සි සහිත ස්ථාන මනාප සහ ඩෙන්ඩ්රික් කඤ්චක විශ්ෙල්ෂණය සඳහා වැදගත්කම නිර්ණය කිරීම සඳහා එක් හා ෙදකක ANOVAs සිදු කරන ලදී. සිසුන්ගේ ටෙස්ට් පරීක්ෂාව සඳහා qPCR, බටහිර බ්ලොග්කරණය, ඩෙඩ්ට්රික් සැත්කම් විශ්ලේෂණය, G9a හි HSV-Cre වලට HSV-GFP සංසන්දනය කරමින්එෆ් / එෆ් මීයන්, මයික්‍රෝආරේ විශ්ලේෂණයන් (ඉහත බලන්න) සහ ක්‍රෝමටින් ප්‍රතිශක්තීකරණ අත්හදා බැලීම්. DrugFosB අධික ලෙස පීඩනය යෙදීමෙන් පසු drug ෂධ ප්රතිකාර හා වෛරසයේ සැලකිය යුතු ප්රධාන බලපෑම් සනාථ කිරීමත් සමඟ ඩෙන්ට්‍රිටික් කොඳු ඇට පෙළේ dens නත්වය පිළිබඳ ද්වි-මාර්ග ANOVA විශ්ලේෂණයකින් පසුව සැලසුම් කළ සිසුන්ගේ ටී පරීක්ෂණ භාවිතා කරන ලදී. සංඛ්‍යා පුරාවෘත්තවල ඇතුළත් කර ඇති සියලුම අගයන් මධ්‍යන්‍ය ± SEM (* p ≤ 0.05; ** p <0.001) නියෝජනය කරයි. සඳහා සවිස්තරාත්මක සංඛ්යානමය විශ්ලේෂණයන් අත්තික්කා. 1-3 ප්රධාන පෙළේ පාඨයන්හි දක්වා ඇත: විස්තරාත්මක රූප සටහන් සංඛ්යාලේඛන ඇතුළත් කිරීම.
පාද සටහන්
අත්පිටපතට ඇතුළත් නොවන ද්රව්යයක් බව මම සහතික කරමි කොකේන්-ඉන්ඩස්ටි්රයාවේ ප්ලාස්ටික් හි Histone Methyltransferase G9a අත්යවශ්ය කාර්යභාරය කලින් ප්රකාශයට පත් කර ඇති හෝ අන්තර්ජාලය ඇතුලත්ව වෙනත් ස්ථානයක සැලකිල්ලට ගැනේ.
සතුන්ගේ භාවිතය සම්බන්ධව සියලු කටයුතු ආයතන හා IACUC මාර්ගෝපදේශ අනුව ටෙක්සාස් සවුත් වෙස්ටර්න් වෛද්ය මධ්යස්ථානය සහ වෛද්ය සිනායි විද්යාලයේ වෛද්ය විද්යා පීඨයේ දී පවත්වන ලදී.
ආශ්රිත සහ සටහන්
;