ෆොස්ෆරයිලේෂන් (2006) මගින් ඩෙල්ටා ෆොස්බී ස්ථායිතාව නියාමනය කිරීම

ජේ නුරෝෂි. 2006 May 10;26(19):5131-42.

මූලාශ්රය

මනෝචිකිත්සක දෙපාර්තමේන්තුව, මූලික ස්නායු විද්‍යා මධ්‍යස්ථානය, ටෙක්සාස් විශ්ව විද්‍යාලයේ නිරිතදිග වෛද්‍ය මධ්‍යස්ථානය, ඩලස්, ටෙක්සාස් 75390-9070, ඇමරිකා එක්සත් ජනපදය.

වියුක්ත

පිටපත් කිරීමේ සාධකය ඩෙල්ටා ෆොස්බී (FosB2 හෝ FosB [කෙටි ස්වරූපය] ලෙසද හැඳින්වේ) යනු අපයෝජනය, ආතතිය සහ විද්‍යුත් විච්ඡේදනය වැනි drugs ෂධ ඇතුළු මනෝචිකිත්සක උත්තේජක වර්ග කිහිපයකට නිදන්ගතව නිරාවරණය වීමෙන් මොළය තුළ ඇති කරන දිගු කාලීන ප්ලාස්ටික් බව පිළිබඳ වැදගත් මැදිහත්කරුවෙකි. . ඩෙල්ටා ෆොස්බී හි විශේෂ ලක්‍ෂණයක් නම්, වරක් ප්‍රේරණය කළ විට, එය තවදුරටත් උත්තේජනය නොමැති විට සාපේක්ෂව දිගු කාලයක් මොළයේ පවතී. කෙසේ වෙතත්, මෙම ස්ථාවර ස්ථායිතාවයට යටින් පවතින යාන්ත්‍රණ තවමත් හඳුනාගෙන නොමැත. සෛල සංස්කෘතියේ දළ වශයෙන් 10 h හි අර්ධ ආයු කාලයක් සහිත ඩෙල්ටා ෆොස්බී සාපේක්ෂව ස්ථාවර පිටපත් කිරීමේ සාධකයක් බව මෙහිදී අපි පෙන්නුම් කරමු. තවද, ඩෙල්ටා ෆොස්බී යනු මොළයේ ඇති පොස්පොප්‍රෝටීන් වන අතර ඩෙල්ටා ෆොස්බී හි ඉහළ සංරක්‍ෂිත සෙරීන් අපද්‍රව්‍යයක (සර්එක්ස්නූඑම්එක්ස්) පොස්පරීකරණය මගින් ප්‍රෝටිසෝමල් හායනයෙන් එය ආරක්ෂා කරයි. මෙම පොස්පරීකරණය කේසීන් කයිනාස් 27 මගින් මැදිහත් වී ඇති බවට සාක්ෂි කිහිපයක් අපි සපයන්නෙමු. මෙම සොයාගැනීම් ඩෙල්ටා ෆොස්බී පොස්පරීකරණය කර ඇති බවට පළමු සාක්ෂිය වන අතර එය පෙන්නුම් කරන්නේ පොස්පරීකරණය එහි ස්ථායිතාවයට දායක වන බවයි. එය මොළයේ දිගුකාලීන අනුවර්තනයන්ට මැදිහත් වීමේ හැකියාවෙහි හරය වේ.

හැදින්වීම

පිටපත් කිරීමේ සාධකය FFosB, FosB2 හෝ FosB [කෙටි ස්වරූපය] ලෙසද නම් කර ඇති අතර එය ක්ෂණික මුල් ජානයේ සී පර්යන්ත-කප්පාදු කරන ලද භේද ප්‍රභේදයකි. ෆොස්බබ් (Dobrazanski et al., 1991; නාකබෙප්පු සහ නතන්ස්, 1991; යෙන් සහ වෙනත්., 1991). පූර්ණ-දිග FosB මෙන්ම, osFosB සතුව ඩීඑන්ඒ බන්ධනය වන මූලික වසමක් සහ ලුසීන් සිපර් එකක් ඇත. එමඟින් ජුන් ප්‍රෝටීන සමඟ දෙගුණ වන අතර සක්‍රියකාරක ප්‍රෝටීන්- 1 (AP-1) පිටපත් කිරීමේ සාධක සංකීර්ණ සෑදෙන අතර එය බොහෝ ජානවල ප්‍රකාශනය නියාමනය කරයි (මෝගන් සහ කුරන්, 1995; රයිල්ස්කි සහ කැක්ස්මරෙක්, 2004). ෆොස්බී හි සී පර්යන්තයේ දක්නට ලැබෙන අක්‍රීය සක්‍රිය කිරීමේ වසමේ කොටසක් නොතිබුණද, os ෆොස්බී සංස්කෘතික සෛලවල සහ මොළයේ ප්‍රබල පිටපත් කිරීමේ සක්‍රියකාරකයක් සහ මර්දකයක් ලෙස ක්‍රියා කරයි (Dobrazanski et al., 1991; නාකබෙප්පු සහ නතන්ස්, 1991; චෙන් සහ අල්., 1997; මැක්ලන්ග් සහ නෙස්ලේටර්, 2003; කුමාර් සහ අල්., 2005).

Δමානසික ආතතිය, ඇතැම් තුවාල, ප්‍රති-සයිකෝටික හා විෂ නාශක drugs ෂධ, අපයෝජන drugs ෂධ සහ ස්වාභාවික විපාක ඇතුළු විවිධාකාර මනෝ ක්‍රියාකාරී උත්තේජකවලට නිරාවරණය වීමෙන් පසු නිදන්ගත, නමුත් උග්‍ර නොවන, කලාපයේ විශේෂිත ආකාරයකින් මොළයට FosB පොළඹවනු ලැබේ. (Hope et al., 1994b; Hiroi සහ Greybiel, 1996; මොරටල්ල සහ අල්., 1996; Bing et al., 1997; මැන්ඩෙල්සි සහ අල්., 1997; කෙල්ස් සහ ඇල්., 1999; Werme et al., 2002; ඇන්ඩර්සන් සහ වෙනත් අය, 2003; කොල්බි et al., 2003; පියමන් සහ ඇල්., 2003; පර්රුටි සහ අල්., 2004; Zachariou et al., 2006). ΔFosB හි ප්‍රේරණය මොළයට මෙම උත්තේජක කිහිපයක ක්‍රියාකාරී බලපෑම් සමඟ කෙලින්ම සම්බන්ධ වී ඇත. අමතර උත්තේජනයක් නොමැති අවස්ථාවක පවා osFosB හි නොනැසී පැවතීම, උග්‍ර උත්තේජකවලට ප්‍රතිචාර වශයෙන් වේගයෙන් ප්‍රේරණය වන, පැය කිහිපයක් ඇතුළත බාසල් මට්ටම් කරා දිරාපත් වන අතර, නිදන්ගත උත්තේජනයෙන් පසු අවපීඩනය පෙන්නුම් කරන අනෙකුත් සියලුම ෆොස් පවුලේ පිටපත් කිරීමේ සාධක වලින් එය වෙන්කර හඳුනා ගනී.Hope et al., 1992; Daunais et al., 1993; පර්සිකෝ සහ වෙනත්., 1993; Hiroi සහ Greybiel, 1996; පර්රුටි සහ අල්., 2004). මෙය නිදන්ගත උත්තේජක මගින් ඇති වන නියුරෝන අනුවර්තනයන්ට යටින් පවතින ජාන ප්‍රකාශනයේ දීර්-කාලීන වෙනස්කම් වලට මැදිහත් වීමට ΔFosB ආකර්ශනීය අපේක්ෂකයෙකු බවට පත් කරයි.

ΔFosB හි දීර් presence කාලයක් පැවතීම එහි mRNA තවදුරටත් ප්‍රේරණය නොකිරීම නිසා (චෙන් සහ අල්., 1995), අපි අනුමාන කළෙමු, සහජයෙන්ම අස්ථායී වන පූර්ණ-දිග FosB සහ අනෙකුත් සියලුම ෆොස් පවුලේ ප්‍රෝටීන මෙන් නොව, osFosB අසාමාන්‍ය ලෙස ස්ථාවර පිටපත් කිරීමේ සාධකය විය හැකිය (Hope et al., 1994b; චෙන් සහ අල්., 1997; නෙස්ලේටර් සහ අල්., 2001; මැක්ලන්ග් සහ ඇල්., 2004). එපමණක් නොව, උග්‍ර හා එදිරිව නිදන්ගත උත්තේජනය කරන ලද මොළයේ පටක වල ප්‍රතිශක්තීකරණ විශ්ලේෂණයෙන් යෝජනා කළේ osFosB පැහැදිලිවම වෙනස් වන බවයි M_r (අණුක ස්කන්ධය) උග්‍ර තත්වයේ ∼33 kDa සිට නිදන්ගත ප්‍රතිකාර අතරතුර ∼35-37 kDa දක්වා (Hope et al., 1994a; චෙන් සහ අල්., 1995). මෙම විවිධ සමස්ථානික සඳහා සංකේතවත් කළ හැකි අතිරේක එම්ආර්එන්ඒ පවතින බවට කිසිදු සාක්ෂියක් නොමැති හෙයින්, අපි තවදුරටත් අනුමාන කළේ os ෆොස්බී පශ්චාත් පරිවර්තනීය ලෙස වෙනස් කර ඇති අතර සමහර විට මෙය අසාමාන්‍ය ස්ථාවරත්වයට දායක වන බවයි. කෙසේ වෙතත්, අද වන විට, පිරිවැටුම පිළිබඳ ජෛව රසායනික විශ්ලේෂණයක් හෝ ΔFosB හි පශ්චාත් පරිවර්තන වෙනස් කිරීම් වාර්තා වී නොමැත. වර්තමාන අධ්‍යයනයේ පරමාර්ථය වූයේ osFosB යනු පොස්පොප්‍රෝටීන් ද යන්න සහ එහි ස්ථායිතාවයට පොස්පරීකරණය දායක වේද යන්න තීරණය කිරීමයි.

පෙර කොටස ඊළඟ කොටස

ද්රව්ය සහ ක්රම

ක්ෂීරපායී සෛල රේඛා සහ ඩීඑන්ඒ සාදයි.

පීසීඑක්ස්එන්එම්එක්ස් සෛල (ක්ලෝන්ටෙක්, මවුන්ටන්වීව්, සීඒ) ඉහළ ග්ලූකෝස් ඩීඑම්ඊඑම් තුළ එල්-ග්ලූටමමින් (එල්-ග්ලන්) අඩංගු වන අතර 12% භ්‍රෑණ බෝවින් සේරම් (එෆ්බීඑස්), එක්ස්එන්එම්එම්එක්ස් අශ්ව සේරම් (ඉන්විට්‍රජන්, කාල්ස්බෑඩ්, සීඒ) , 5 U / ml පෙනිසිලින්, සහ 10 μg / ml ස්ට්‍රෙප්ටොමයිසින් (දෙකම සිග්මා-ඇල්ඩ්‍රික්, ශාන්ත ලුවී, MO වෙතින්). හෙලා සෛල (ඇමරිකානු වර්ගයේ සංස්කෘතික එකතුව, මනස්සාස්, වීඒ) L-Gln අඩංගු ඉහළ ග්ලූකෝස් ඩීඑම්ඊඑම් වලින් සංස්කෘත කරන ලද අතර 100% FBS, පෙනිසිලින් සහ ස්ට්‍රෙප්ටොමයිසින් සමඟ අතිරේකව සපයන ලදී. සෛල රේඛා දෙකම 100 ° C දී තෙතමනය සහිත 10% CO දී පවත්වා ගෙන යනු ලැබේ₂ වායුගෝලය.

ඩීඑන්ඒ සමඟ අස්ථිර මාරුවීම් සඳහා, පීසීඑක්ස්එන්එම්එක්ස් හෝ හෙලා සෛල ළිං තහඩු හයකට (පීසීඑක්ස්එන්එම්එක්ස් සෛල සඳහා කොලජන් I ආලේප කර ඇත) බීජ රෝපණය කරන ලද අතර ඊළඟ දවසේ 12-12% සංගෘහිතයට ළඟා වන අතර පසුව Lipofectamine 90 (Invitrogen) භාවිතයෙන් සම්ප්‍රේෂණය විය. සමහර අත්හදා බැලීම් වලදී (බලන්න අත්තික්කා. 1 ⇓⇓⇓⇓⇓-7), OsFosB නැවත සංයෝජිත හර්පීස් සිම්ප්ලෙක්ස් වෛරසය (HSV) ආසාදනය වීමෙන් PC12 සෛල තුළ අස්ථිර ලෙස ප්‍රකාශ විය.

OsFosB සහ FosB cDNAs අපගේම pTetop- ඉදිකිරීම් වලින් ලබා ගන්නා ලදි (චෙන් සහ අල්., 1997), සහ pcDNA3.1 දෛශිකයට (ඉන්විට්‍රජන්) උප-ක්ලෝන කර ඇත. මෙම pcDNA3.1-osFosB / FosB ඉදිකිරීම් ක්ෂීරපායී සෛලවල ප්‍රකාශනය සඳහා සහ අඩවි යොමු කරන ලද විකෘතිතා සඳහා අච්චුවක් ලෙස භාවිතා කරන ලදී. කලින් විස්තර කළ පරිදි ප්‍රතිසංයෝජක HSV-osFosB සකස් කරන ලදී (Neve et al., 1997), සහ සකස් කිරීමේදී ∼1 × 10 හි මාතෘකාවක් තිබුණි⁸ pfu / ml.

ස්පන්දන-හඹා යාමේ අත්හදා බැලීම්.

ආසාදනය / මාරුවීමෙන් පසු ආසන්න වශයෙන් 24 h, ළිං තහඩු හයක සෛල (PC12 හෝ HeLa) PBS හි 2 මිලි සමඟ දෙතුන් වතාවක් සේදීම සහ 37 ° C දී 1 h සඳහා 2 මිලි සඳහා Cys / Met-free DMEM (Invitrogen) මෙට් සහ සයිස් හි අන්තර් සෛලීය තටාක ක්ෂය කිරීම සඳහා 5% ඩයලයිස් කරන ලද FBS (හයික්ලෝන්, ලෝගන්, යූටී) සමඟ අතිරේකව. මෙම “සාගින්න” කාලපරිච්ඡේදය අවසානයේදී, drugs ෂධ (සෛල වලට ප්‍රතිකාර කළ යුතු නම්) එකතු කරන ලද අතර, සෛල 12-25 withCi සමඟ (ස්පන්දනය) ලේබල් කරන ලදි. ³⁵එස් ප්‍රෝටීන් ලේබල් මිශ්‍රණය (පර්කින් එල්මර්, වෙල්ලස්ලි, එම්ඒ) අළුතින් සංස්ලේෂණය කරන ලද සියලුම ප්‍රෝටීන ලේබල් කිරීම සඳහා 1 at C දී ∼37 h සඳහා. රේඩියෝ ලේබලය PBS හි 2 මිලි සමඟ දෙවරක් හෝ තුන් වරක් සේදීමෙන් ඉවත් කරන ලදී ³⁵එස්-ලේබල් කරන ලද ප්‍රෝටීන අනුගමනය කරන ලද්දේ (හඹා යාම) මාධ්‍යය “සීතල” (විකිරණශීලී නොවන) මාධ්‍යයෙන් 5% FBS සමඟ අතිරේකව හා විවිධ කාලවලදී සෛල අස්වැන්නෙනි. හඹා යාම පුරාම සෛල ප්‍රතිකාර පවත්වා ගෙන යනු ලැබීය. මෙම අත්හදා බැලීම්වල සියලුම සංඛ්‍යා මගින් විවිධ ප්‍රෝටීන වල පිරිවැටුම් අනුපාත සංසන්දනය කිරීම ප්‍රශස්ත කිරීම සඳහා සමාන ආරම්භක ප්‍රමාණයක් පෙන්වයි.

සතුන් සහ නිදන්ගත විද්‍යුත් විච්ඡේදක අල්ලා ගැනීමේ ප්‍රතිකාරය.

වැඩිහිටි ස්ප්‍රැග් ඩව්ලි පිරිමි මීයන්ට (200-300 g; චාල්ස් රිවර් රසායනාගාර, කිංස්ටන්, RI) දිනකට එක් වරක් 7-9 d සඳහා විද්‍යුත් විච්ඡේදක අල්ලා ගැනීම් (ECS) මගින් ප්‍රතිකාර කරන ලදී. කලින් විස්තර කර ඇති පරිදි ECS සිදු කරන ලදී (Hope et al., 1994a) භාවිතා කරමින් උගෝ බැසිල් (කොමේරියෝ වීඒ, ඉතාලිය) පහත සඳහන් සැකසුම් සහිත ඊසීඑස් ඒකකය: සංඛ්‍යාතය, එක්ස්එන්එම්එක්ස් ස්පන්දන / ය; ස්පන්දනය සමඟ, 100 ms; කම්පන කාලය, 0.5 s; සහ වත්මන්, 1.0 mA. කිසිදු විදුලි ධාරාවක් නොමැතිව කන්-ක්ලිප් ඉලෙක්ට්රෝඩ යෙදීමෙන් වංචා පාලක සතුන්ට සමාන්තරව සලකනු ලැබීය.

³² පී පරිවෘත්තීය ලේබල් කිරීම.

මොළයේ පෙති ලේබල් කිරීම සඳහා, මීයන් දිරාපත් වූ අතර, මොළය ඉක්මනින් විසුරුවා හරින ලද අතර, 300 frontm ඉදිරිපස බාහික පෙති ඩීඑස්කේ මයික්‍රොස්ලයිසර් (ටෙඩ් පෙලා, රෙඩින්, සීඒ) සමඟ සකස් කරන ලදී. පෙති ප්ලාස්ටික් නල තුළ පොස්පේට් ient න කෘතිම සීඑස්එෆ් (ඒසීඑස්එෆ්) මිලි ලීටර් වලින් පුරවා ඇති අතර ඕ සමඟ නිරන්තර මෘදු බුබුලු යටතේ 2 at C හි පවත්වා ගෙන යනු ලැබේ.₂/ CO₂ මිශ්රණය (හෙමිංස් et al., 1989). පෙති (නලයකට පෙති දෙකක්) ඔකාඩායික් අම්ලය (1.3 ng / ml) තිබීම හෝ නොතිබීම තුළ 8-10 h සඳහා 100 mCi සමඟ ලේබල් කරන ලදී. මෙම පුර්ව ලියාපදිංචි තක්සේරු කිරීම අවසානයේ පෙති සීතල ACSF සමඟ අවම වශයෙන් තුන් වතාවක් සේදී ඇති අතර පසුව 250 coldl හි සීතල විකිරණශීලී ප්‍රතිශක්තිකරණ තක්සේරුකරණ (RIPA) බෆරයේ [PBS, pH 7.4, 150 mm NaCl, 1% (v / v ) Igepal, 0.5% (w / v) සෝඩියම් ඩයොක්සිකොලේට්, 0.1% (w / v) SDS, 1 mm EDTA] SDS සමඟ 0.6% දක්වා භාවිතා කිරීමට පෙර අතිරේකව, ක්ෂීරපායී සෛල සඳහා ප්‍රෝටියේස් නිෂේධක කොක්ටේල් (5 μl / ml; සිග්මා-ඇල්ඩ්රිච්), පොස්පේටේස් නිෂේධක කොක්ටේල් I සහ II (1: 100; සිග්මා-ඇල්ඩ්රිච් හි භාවිතා වේ), 1 mm PMSF සහ 2% ග්ලිසරෝල්. 15 මිනිත්තුව සඳහා සමජාතීය තම්බා 15,000 at හි කේන්ද්‍රාපසාරීකරණයෙන් ඉවත් කරන ලදී. g 15 මිනිත්තුව සඳහා. එහි ප්‍රති ing ලයක් ලෙස සුපර්නාටන්වල ඇති ප්‍රෝටීන් සාන්ද්‍රණය BCA ප්‍රෝටීන් තක්සේරුව (පියර්ස්, හොල්ම්ඩෙල්, එන්.ජේ) භාවිතා කර තක්සේරු කරන ලදී.

සඳහා ³²සංස්කෘතික සෛලවල ලේබල් කිරීම, ආසාදනයෙන් / මාරු කිරීමෙන් පසු ∼24 h, සෛල පොස්පේට් රහිත මාධ්‍යයෙන් දෙතුන් වතාවක් සෝදා මෙම මාධ්‍යයෙන් ∼1 h සඳහා පුර්ව ලියාපදිංචි කර ඇත. මෙම සාගින්නෙන් පසු, 0.2-0.3 mCi ³²පී.එච්₃PO₄ (පර්කින් එල්මර්) එක් එක් ළිඳට එකතු කරන ලද අතර, 4-12 h සඳහා සෛල ලේබල් කරන ලද්දේ අත්හදා බැලීමේ වර්ගය අනුව ය (අත්තික්කා බලන්න. පිරිවිතර සඳහා 1-7). පසුව සෛල පීබීඑස් සමඟ තුන් වරක් සෝදා 15 මිනිත්තුව සඳහා අයිස් මත ලයිසස් කරන ලද අතර අතිරේක RIPA බෆරයේ 50 withl සමඟ. සීරීම් මගින් ලයිසෙට් එකතු කරන ලද අතර ඩීඑන්ඒ කැපීම සඳහා 10 ga ඉඳිකටුවක් හරහා 25 වාරයක් සම්මත කරන ලදී, 10 මිනිත්තුව සඳහා තම්බා, 15,000-CN හි 15-30 මිනිත්තුව සඳහා 4 rpm දී කේන්ද්‍රාපසාරී විය. ඉවත් කරන ලද ලයිසෙට් (සුපර්නැටන්ට්ස්) නව නළයකට මාරු කරන ලද අතර BCA ප්‍රෝටීන් තක්සේරුවක් (පියර්ස්) සිදු කරන ලදී. මෙම අත්හදා බැලීම්වල සියලුම සංඛ්‍යා පෙන්නුම් කරන්නේ ඒවායේ සාපේක්ෂ පොස්පරීකරණය මට්ටම් සංසන්දනය කිරීම ප්‍රශස්ත කිරීම සඳහා සම්පූර්ණ වල්-වර්ගය (WT) සහ S27A osFosB ප්‍රෝටීන සමාන ප්‍රමාණයකි.

රසායනික ද්‍රව්‍ය හා සෛලීය සංස්කෘතික ප්‍රතිකාර.

ඔකාඩායික් අම්ලය (OA; සිග්මා-ඇල්ඩ්රිච්) එතනෝල් වල විසුරුවා හරින ලද අතර 100 ng / ml අවසාන සාන්ද්‍රණයක දී භාවිතා කරන ලදී. 5,6-Dichloro-1-d-d-ribofuranosyl-benzimidazole (DRB; Biomol, Plymouth Meeting, PA) ඩිමෙටයිල් සල්ෆොක්සයිඩ් (DMSO; Sigma-Aldrich) තුළ විසුරුවා හරින ලද අතර 50 ofm හි අවසාන සාන්ද්‍රණයක දී සෛල සංස්කෘතිය සඳහා භාවිතා කරන ලදී. ස්පර්මයින් (සිග්මා-ඇල්ඩ්රිච්) ජලයේ දියකර අවසන් 200 ofm සාන්ද්‍රණයක දී භාවිතා කරන ලදී. කැල්ෆොස්ටින්-සී (බයෝමෝල්) ඩීඑම්එස්ඕ හි විසුරුවා හරින ලද අතර එය 0.2 atm හි භාවිතා කරන ලද අතර ෆෝර්බෝල් එක්ස්එන්එම්එක්ස්-මිරිස්ටේට් එක්ස්එන්එම්එක්ස්-ඇසිටේට් (පීඑම්ඒ; ප්‍රොමේගා, මැඩිසන්, ඩබ්ලිව්අයි) ඩීඑම්එස්ඕ හි විසුරුවා හරින ලද අතර එක්ස්එන්එම්එක්ස් atm හි භාවිතා කරන ලදී. myristoylated-autocamtide-12 හා සම්බන්ධ නිශේධනීය පෙප්ටයිඩ (m-AIP; Biomol) ජලයේ දියකර 13 සහ 0.1 ofm අවසාන සාන්ද්‍රණයක දී භාවිතා කරන ලදී. පුළුල් වර්ණාවලී ප්‍රෝටීන් කයිනාස් නිෂේධක H-2 සහ H-1 (Biomol) ජලයේ දියකර පිළිවෙලින් 10 සහ 7 ofm සාන්ද්‍රණයක දී භාවිතා කරන ලදී. MG8 (කැල්බියෝචෙම්, සැන් ඩියාගෝ, සීඒ) සහ ඉපොක්සොමිසින් (පෙප්ටයිඩස් ඉන්ටර්නැෂනල්, ලුයිස්විල්, කේවයි) යන දෙකම ඩීඑම්එස්ඕ හි විසුරුවා හරින ලද අතර පිළිවෙලින් 150 සහ 200 ofm සාන්ද්‍රණයක දී භාවිතා කරන ලදී. සියළුම අත්හදා බැලීම් වලදී, ඩීඑම්එස්ඕ (වාහනය) සෛල වලට එකතු කරන ලද්දේ ප්‍රතිකාර හරහා නියත ඩීඑම්එස්ඕ ප්‍රමාණයක් පවත්වා ගැනීමටය. සඳහා ³²පී ලේබල් කිරීමේ අත්හදා බැලීම්, the ෂධ ලේබලයට පෙර වහාම එකතු කරන ලද අතර ඉතිරි ලේබල් කිරීමේ කාලය සඳහා තබා ඇත. ස්පන්දන-හඹා යාමේ අත්හදා බැලීම් සඳහා, Cys / Met “සාගින්නෙන් පෙළෙන” අවස්ථාවේ දී drugs ෂධ එකතු කරන ලද අතර, ලේබල් කිරීමේ කාල පරිච්ඡේදය තුළ තබා ඇති අතර පසුව ඒවා හඹා යාමේ මාධ්‍යයට එකතු කරන ලදී. මෙම පෙප්ටයිඩවල ඉක්මන් පිරිවැටුමට වන්දි ගෙවීම සඳහා හඹා යාම පුරා සෑම 3-4 h ට ප්‍රෝටිසෝම් නිෂේධක වැඩි කරන ලදී.

OsFosB immunoprecipitation, immunoblotting සහ autoradiography.

ප්‍රතිශක්ති ප්‍රතිරෝධක සඳහා, ප්‍රතිශක්ති ප්‍රතිරෝධක (IP) සමඟ ඉදිරියට යාමට පෙර SDS සාන්ද්‍රණය 1% දක්වා පහත හෙලීම සඳහා ලයිසෙට් 5: 0.1 සරල RIPA සමඟ තනුක කර ඇත. නිශ්චිත බන්ධනය සීමා කිරීම සඳහා, අවම වශයෙන් 4 h සඳහා ප්‍රතිශක්තිකරණ නොවන IgG සහ ප්‍රෝටීන් G-Sepharose (සිග්මා-ඇල්ඩ්‍රික්) සමඟ ප්‍රතිශක්තිකරණයෙන් ලයිසෙට් මුලින්ම ඉවත් කරන ලදී. Δ ෆොස්බී එළු පොලිකාලෝනීය ප්‍රතිදේහයක් භාවිතයෙන් ඉවත් කරන ලද ලයිසෙට් වලින් ප්‍රතිශක්තිකරණයට ලක් කරන ලද අතර එය 48 μg හි 0.5-1 Ig හි ෆොස්බී සහ os ෆොස්බී (එස්සී-එක්ස්එන්එම්එක්ස්; සැන්ටා ක ru ස් ජෛව තාක්ෂණය, සැන්ටා ක ru ස්, සීඒ) යන දෙඅංශයේම අභ්‍යන්තර ප්‍රභවයක් හඳුනා ගනී. (මුළු ප්‍රෝටීන වලින් 10-50) g) මුළු පරිමාව 300 මිලි. අවම වශයෙන් 0.5 h සඳහා රොටරයක් මත 4 at C දී IP මෘදු ලෙස මිශ්‍ර කරන ලද අතර පසුව X-NUMX proteinl ප්‍රෝටීන් G-Sepharose එකතු කරන ලද අතර අවම වශයෙන් තවත් 8 h සඳහා IP මිශ්‍ර කරනු ලැබේ. 15 at හි භ්‍රමණය වීමෙන් අයිපී පෙති ගසා ඇත g 3-C දී 5-4 මිනිත්තුව සඳහා, සීතල සරල RIPA හි 0.5 මිලි සමඟ තුන් වතාවක් සහ 0.1% Tween 20 අඩංගු සීතල PBS සමඟ දෙවරක් සේදීම. පසුව අයිපී නැවත සීතල පීබීඑස් මිලි ලීටර් වලින් මාරු කර, මාරු කර, නව නළයකට තල්ලු කරන ලද අතර, ප්‍රතිශක්තිකරණ ප්‍රෝටීන ඉවත් කරන ලද්දේ එක්ස්එන්එම්එක්ස් හි එක්ස්එන්එම්එම්එක්ස් එක්ස්එල්එන්එම්එක්ස් එකතු කිරීමෙන් ලයිම්ලි ප්‍රෝටීන් නියැදි බෆරය අඩු කිරීමෙනි. මෙම අයිපී ප්‍රොටෝකෝලය හේතුවෙන් ලයිසෙට් හි ඇති සියලුම ΔFosB හි නිශ්චිත හා effective ලදායී වර්ෂාපතනයක් ඇති විය. 0.5% Tris-HCl නිර්ණායක ජෙල් (ජෛව-රැඩ්, හර්කියුලිස්, සීඒ) මත සම්පූර්ණ අයිපී පැටවීමෙන් ප්‍රතිශක්ති ප්‍රතිරෝධක ප්‍රෝටීන SDS-PAGE වලට යටත් කරන ලද අතර පසුව පීවීඩීඑෆ් හෝ නයිට්‍රොසෙලුලෝස් වෙත මාරු කරනු ලැබේ. මාරු කිරීමෙන් පසුව, පටලය වාතය වියලනු ලැබූ අතර ³²පී- සහ ³⁵එස්-රේඩියෝ ලේබල් කරන ලද ප්‍රෝටීන් බෑන්ඩ්ස් කොඩැක් (රොචෙස්ටර්, එන්වයි) ඔටෝරාඩියෝග්‍රැෆික් ෆිල්ම් භාවිතා කරමින් ඔටෝරාඩියෝග්‍රැෆි මගින් මෙන්ම පොස්පරස් කිරීම මගින් කුණාටුවක් (අමර්ෂම් ජෛව විද්‍යාව, පිස්කට්වේ, එන්.ජේ) ෆොස්ෆර්ඉමේජර් භාවිතා කරන ලදී. සම්පුර්ණ (පොස්පරීකරණය නොකරන ලද සහ පොස්පරීකරණය කළ) cell සෛල ලයිසෙට් හෝ මොළයේ සමජාතීයතාවයේ ඇති ෆොස්බී හඳුනාගනු ලැබුවේ ප්‍රතිශක්ති ප්‍රතිරෝධක ප්‍රෝටීන ප්‍රතිශක්තීකරණ අවහිර කිරීමෙනි (හඳුනා ගැනීමට භාවිතා කරන එකම පටලය භාවිතා කරමින්) ³²P- ලේබල් කරන ලද ප්‍රෝටීන්), හෝ SDS-PAGE වලට යටත්ව ලයිසෙට් / සමජාතීය ප්‍රෝටීන සමාන ප්‍රමාණයක් PVDF හෝ නයිට්‍රොසෙලුලෝස් වෙත මාරු කරනු ලැබේ. මෙම පටලය මුලින්ම අවහිර කරනු ලැබුවේ පීබීඑස් හි 1% (w / v) නොබැඳි වියළි කිරි (ජෛව-රැඩ්) සමඟ 0.1% (v / v) සමඟ 20 h සඳහා 1 h සඳහා 25 h (සිග්මා) සමඟය. මෙම පටලය එක රැයකින් 4 at C දී ප්‍රතිශක්තිකරන අවහිර කරනු ලැබුවේ අපගේම හාවාගේ FosB විරෝධී පොලිකාලෝනීය ප්‍රතිදේහය සමඟ ඇමයිනෝ අම්ල වලට එරෙහිව ජනනය කරන ලද 1-16 FosB / osFosB (1: 10,000 හි භාවිතා වේ). ප්‍රාථමික පුර්ව ලියාපදිංචි තක්සේරු කිරීමෙන් පසුව, අවහිර කිරීමේ බෆරය සමඟ 5 මිනිත්තුව සඳහා පටල හතර වතාවක් සෝදා, පසුව 25 ° C දී ∼1 h සඳහා එළු ප්‍රති-හාවා IgG සමඟ අශ්වාරෝහක පෙරොක්සයිඩ් සමඟ සංයෝජනය වී ඇත (1: 5000 හි බෆරය අවහිර කිරීමේදී, දෛශිකයෙන් රසායනාගාර, බර්ලිංගම්, සීඒ). 10 මිනිත්තුව සඳහා අවහිර කිරීමේ බෆරය සමඟ පටල තුන් වරක් සහ පීබීඑස් සමඟ එක් වරක් 5 මිනිත්තුව සඳහා සෝදා ඇත. වැඩි දියුණු කරන ලද රසායන ද්‍රව්‍ය (පියර්ස්) සහ / හෝ ඊසීඑල්-ප්ලස් ප්‍රතික්‍රියාකාරක (අමර්ෂම් ජෛව විද්‍යාව) සහ ස්ටෝම් ෆොස්ෆර්ඉමේජර් භාවිතා කරමින් ප්‍රතිදීප්ත බව හඳුනා ගැනීමෙන් කොඩැක් එම්ආර් චිත්‍රපටයේ මුළු Δ ෆොස්බී ප්‍රෝටීන් පටි දර්ශනය විය.

කෘමීන්ගේ සෛල වලින් osFosB නැවත සංයෝජනය කිරීම.

Ter ෆොස්බී එස්එෆ්එක්ස්එන්එම්එක්ස් කෘමි සෛල තුළ එන් ටර්මිනස් හෙක්සා-ඔහුගේ-ටැග් කළ ප්‍රෝටීන් (එන්-හිස් (එක්ස්එන්එම්එම්එක්ස්) os ෆොස්බී) ලෙස බැක්-ටු-බැක් බැකුලෝ වයිරස් ප්‍රකාශන පද්ධතිය (ඉන්විට්‍රජන්) භාවිතා කරමින් නිෂ්පාදකයාගේ උපදෙස් අනුගමනය කළේය. කෙටියෙන් කිවහොත්, එන්ජී-ටර්මිනල් ටැගය වන එම්.ජී.එච්.එච්.එච්.එච්.ඒ.ජී.ට පෙර ΔFosB cDNA (අපද්‍රව්‍ය 9-6) pFASTBacTM2 දෛශිකයේ උප-ක්ලෝන කරන ලද අතර එය නැවත සංයෝජිත බැකුලෝ වයිරස් උත්පාදනය සඳහා භාවිතා කරන ලදී. Sf237 සෛල නැවත සංයෝජිත වෛරසයෙන් ආසාදනය වී ඇති අතර N-His (1) osFosB සෛල ලයිසෙට් වලින් පවිත්‍ර කරනු ලැබුවේ නිකල් තීරුවක් (Qiagen, Valencia, CA) භාවිතා කරමින් ඇනෝනික් හුවමාරුව (ඇමර්ෂම්) ජෛව විද්‍යාව), සහ ජෙල්-පෙරහන් තීරුවක් භාවිතා කරමින් ප්‍රමාණය බැහැර කිරීම (අමර්ෂම් ජෛව විද්‍යාව).

එන්නත් වේ පොස්පරීකරණය අධ්‍යයනය.

එන්නත් වේ 30 μm උපස්ථරයක් (N-His (10) osFosB හෝ ධනාත්මක පාලන උපස්ථරයක්), 6 μm ATP, සහ 250 μCi / μl [γ- අඩංගු 1 volumel පරිමාවක කාල පා course මාලාව සහ ස්ටොයිකියෝමිතික විශ්ලේෂණය සඳහා පොස්පරීකරණය ප්‍රතික්‍රියා සිදු කරන ලදී.³²P] ATP, කයිනාස් නිෂ්පාදකයා විසින් සපයනු ලබන බෆරය සහ පහත දැක්වෙන කයිනස් වලින් එකක්: CK2 (20 ng /; l; Upstate, Charlottesville, VA), CaMKII (10 ng /; l; Upstate), PKC (1.6 ng /; l; Calbiochem) හෝ p70S6K (2.5 mU /; l; Upstate). නියමිත වේලාවට ප්‍රතික්‍රියා ද්‍රාවණයෙන් 5 all ඇල්කොහොට් ඉවත් කිරීම සහ 4 හි සමාන පරිමාවක් එකතු කිරීම මගින් කාල පා course මාලා ප්‍රතික්‍රියා සිදු කරන ලදී. ආනුභවිකව නිර්වචනය කරන ලද රේඛීය ස්ථායී තත්වයන් යටතේ CK2 ප්‍රතික්‍රියාව සඳහා මයිකල්-මෙන්ටන් චාලක පරාමිතීන් තීරණය කරන ලදී. මෙම ප්‍රතික්‍රියා 15 minl සඳහා 10 μl පරිමාවකින් 2 ng / μl එන්සයිම, 250 ATm ATP, 1 μCi / μl [γ- අඩංගු වේ.³²P] ATP, සහ N-His (6) XFOSB සාන්ද්‍රණය 2.5-30 fromm සිට පරාසයක පවතී. සියලුම ප්‍රතික්‍රියා 30 at C දී ජල ස්නානයක දී සිදු කරන ලදී. SDS-PAGE සහ Bio-Safe Coomassie (Bio-Rad) සමඟ ජෙල් පැල්ලම් කිරීමෙන් පසුව, ජෙල් වියළන ලද අතර, ³²පී-පොස්පේට් සංස්ථාගත කිරීම තක්සේරු කරන ලද්දේ පොස්පරීකරණය විශ්ලේෂණය කිරීමෙනි (පහත බලන්න, දත්ත ප්‍රමාණකරණය, ගණනය කිරීම් සහ සංඛ්‍යාලේඛන).

ද්විමාන ෆොස්ෆොපෙප්ටයිඩ් සිතියම සහ ෆොස්ෆොඇමිනෝ අම්ල විශ්ලේෂණය.

මෙම විශ්ලේෂණයන් දෙකම විස්තර කර ඇති පරිදි සිදු කරන ලදී ප්ලොග් සහ ඩන් (2000). කෙටියෙන් කිවහොත් වියළි ජෙල් කොටස් අඩංගු වේ ³²පී-ලේබල් කරන ලද osFosB (එක්කෝ සිට කෘතිම දී ප්‍රතික්‍රියා හෝ පරිවෘත්තීය ලෙස ලේබල් කරන ලද සෛලවල ප්‍රතිශක්ති ප්‍රතිරෝධක වලින්), බැහැර කරන ලද, නැවත විජලනය කළ, සේදූ සහ ට්‍රිප්ටික් ජීර්ණයට භාජනය විය. ට්‍රිප්ටික් ජීර්ණ නිෂ්පාදන අඩංගු සුපර්නැටන්ට් ලයොෆිලීකරණය කරන ලද අතර ලයොෆිලේට් කිහිප වතාවක් සෝදා නැවත 10 electl ඉලෙක්ට්‍රෝෆොරසිස් බෆරයේ pH 1.9 හි නැවත ලබා දෙන ලදී. නියැදිය (3 μl) සෙලියුලෝස් තුනී ස්ථර වර්ණදේහ (ටීඑල්සී) තහඩුවක (ඇනල්ටෙක්, නෙවාක්, ඩීඊ) හඳුනාගෙන ඇති අතර එක් මානයකින් ඉලෙක්ට්‍රෝෆොරසිස් මගින් ද අනෙක් මානය ටීඑල්සී නඟින්නෙන් ද වෙන් කර ඇත. එහි ප්‍රති ing ලයක් ලෙස පොස්පොපෙප්ටයිඩ සිතියම් දෘශ්‍යකරණය හා පොස්පරීකරණය මගින් දර්ශනය විය. ෆොස්ෆොඇමිනෝ අම්ල විශ්ලේෂණය සඳහා, ඉලෙක්ට්‍රෝෆොරසිස් බෆරයේ නැවත යථා තත්ත්වයට පත් කරන ලද ට්‍රිප්ටික් ඩයිජෙස්ට් 2 Xl, එච්එල්එල් ජල විච්ඡේදනය මගින් 105 at C දී 25 මිනිත්තුව සඳහා 3 m සඳහා XNUMX m සඳහා එන්.₂ වායුගෝලය. ජලයේ හය ගුණයකින් තනුක කිරීමෙන් ප්‍රතික්‍රියාව නතර වූ අතර මිශ්‍රණය ලයොෆිලීකරණය විය. ලයොෆිලේට් ඉලෙක්ට්‍රෝෆොරසිස් බෆරයේ 5 μl, pH 1.9 හි නැවත යථා තත්ත්වයට පත් කරන ලද අතර සෙලියුලෝස් TLC තහඩුවක පොස්ෆෝ-සේර්, -Thr සහ -Tyr ප්‍රමිතීන් සමඟ දක්නට ලැබුණි. ඉලෙක්ට්‍රෝෆොරසිස් බෆරය, පීඑච් එක්ස්එන්එම්එක්ස් භාවිතා කරමින් ටීඑල්සී තහඩුවේ දිගින් අඩකට වඩා වැඩි ප්‍රමාණයක් සිදු කරන ලද අතර පසුව තහඩුව පීඑච් එක්ස්එන්එම්එක්ස් බෆරයට මාරු කරන ලද අතර, ඉලෙක්ට්‍රෝෆොරසිස් සම්පූර්ණ කිරීම සඳහා සිදු කරන ලදී. ටීඑල්සී තහඩුව ඇසිටෝන් හි 1.9% (v / v) නින්හයිඩ්‍රින් ද්‍රාවණයකින් ඉසීමෙන් පොස්ෆොඇමිනෝ අම්ල ප්‍රමිතීන් දෘශ්‍යමාන විය. ³²පී ලේබල් කරන ලද ඇමයිනෝ අම්ල සාම්පල ඔටෝරාඩියෝග්‍රැෆි සහ පොස්පරීකරණය මගින් දෘශ්‍යමාන කරන ලදී.

siRNA- ප්‍රේරිත CK2α තට්ටු කිරීම.

CK2 (වර්‍ගාත්මකව) තට්ටු කිරීම සඳහා අපි RNA මැදිහත්වීමේ ක්‍රමයක් භාවිතා කළෙමු (ඩී මයිරා සහ වෙනත් අය, 2005). PC12 සෛල කොලජන් I- ආලේපිත ළිං තහඩු හයක් මත ∼70-80% සංග්‍රාමයට ළඟා වූ අතර, ඒවා 20 nm (අවසාන සාන්ද්‍රණය) සමඟ අස්ථිරව සම්ප්‍රේෂණය කරන විට, සීආර්එන්ඒ හෝ සීආර්එන්ඒ සමඟ උත්ප්‍රේරකයේ එම්ආර්එන්ඒ දෙසට යොමු වේ. R මාරු කිරීමේ නියෝජිත සයිලන්ට්ෆෙක්ටින් (බයෝ-රැඩ්) හි 2 usingl භාවිතා කරමින් නිෂ්පාදකයාගේ උපදෙස් අනුගමනය කරමින් මීයන් CK5 හි අනු ඒකකය. දළ වශයෙන් 24 h පසු, ඉහත සඳහන් කළ පරිදි සෛල osFosB ප්ලාස්මිඩ් සමඟ අස්ථිරව සම්ප්‍රේෂණය විය. ආසන්න වශයෙන් 24 h පසුව (siRNA මාරුවීමෙන් පසු ∼48 h), සෛල දෙකටම යටත් විය ³²ඉහත විස්තර කර ඇති පරිදි පී පරිවෘත්තීය ලේබල් කිරීම හෝ ස්පන්දන-චේස් විශ්ලේෂණය. '2'P-AAAUCCCUG ACAUCAUAUUUU5' (Dharmacon, Lafayette, CO) 3'P-CAAACUAUAAUCGUACAUCUU5 '3'P-UCAAUCAU-GACAUUAUGCGUU5' 3'P-UAGUCAUAUAAAUCUUCCGUU5: පහත සඳහන් CK3α siRNAs හතර සමාන ප්රතිඵල සමඟ භාවිතා කරන ලදී. Control ණාත්මක පාලනයක් ලෙස අපි භාවිතා කළෙමු නිහ ile negative ණ පාලනය #3 siRNA වෙතින් ඇම්බියන් (ඔස්ටින්, TX). CK2 තට්ටු කිරීමේ ප්‍රමාණය නිරීක්ෂණය කරන ලද්දේ CK2 විරෝධී පොලිකාලෝනීය ප්‍රතිදේහයක් (නාමාවලිය # 06-873 Upstate වෙතින්) එක රැයකින් 1: 1000 තනුක කිරීමෙනි. N- ටුබුලින් පැටවීමේ පාලකයක් ලෙස භාවිතා කරන ලද අතර එක් රාත්‍රියක 05: 661 තනුක කිරීමේදී ඒකවර්ණ ප්‍රතිදේහයක් (නාමාවලිය # 1-20,000 සිට උඩු මහලේ සිට) අනාවරණය විය.

අඩවි-යොමු කරන ලද විකෘතිතා.

සර්ක්ස්එන්එම්එක්ස් ඇල හෝ ඇස්ප් වෙත විකෘති කිරීම ක්ෂණික වෙනස් කිරීමේ වෙබ් අඩවියකින් මෙහෙයවන ලද විකෘතිතා කට්ටලයක් (ස්ට්‍රැටජීන්, ලා ජොල්ලා, සීඒ) භාවිතා කරමින් නිෂ්පාදකයාගේ උපදෙස් අනුගමනය කරන ලදී. ΔFosB ප්‍රෝටීන මූසිකයේ Ser27 විකෘති හඳුන්වා දීම සඳහා පහත දැක්වෙන විකෘතිතා ප්‍රයිමර් භාවිතා කරන ලදී. Ser27 සිට Ala දක්වා: (ප්‍රතිලෝම ප්‍රයිමර්) 27′GCCGAAGGAGTCCACCGAAGCCAGGTACTGAGACTCGGCGGAGGG3. Ser27 සිට Asp (ඉදිරි ප්‍රාථමික) 5′CCCTCCGCCGAGTCTCAGTACCTGGATTCGGTGGACTCCTTCGGC3. විකෘති වූ භෂ්ම තද අකුරින් ඇති අතර සර්ක්ස්නූම්ස් කෝඩෝනය ඇල අකුරු කර ඇත.

ජෛව තොරතුරු.

ProFosB සඳහා විභව ෆොස්ෆරයිලේෂන් අඩවි සහ කයිනස් සෙවූයේ මූසික ප්‍රෝටීන් අනුක්‍රමය ප්‍රෝසයිට් ඇතුළු විශේෂිත දත්ත සමුදායන් වෙත ඉදිරිපත් කිරීමෙනි.http://www.expasy.org/prosite/), PredictProtein (Rost et al., 2004), සහ NetPhosK (බ්ලොම් සහ වෙනත්., 2004).

දත්ත ප්‍රමාණකරණය, ගණනය කිරීම් සහ සංඛ්‍යාලේඛන.

පීවීඩීඑෆ් හෝ නයිට්‍රොසෙලුලෝස් පටලයේ ඇති ප්‍රෝටීන් ප්‍රමාණය ප්‍රමාණාත්මක කරන ලද්දේ ස්ටෝම් ෆොස්ෆර්ඉමේජර් සහ ඒ සමඟ ඇති ඉමේජ් ක්වාන්ට් මෘදුකාංගය (අමර්ෂම් ජෛව විද්‍යාව / අණුක ගතිකය) භාවිතා කර ය. සෛල සංස්කෘතිය හා මොළයේ පෙති පොස්පරීකරණය අධ්‍යයනය කිරීමේදී, ලබා ගත් අගයන් ³²P- ලේබල් කරන ලද ප්‍රෝටීන මුළු osFosB සඳහා ලබාගත් අගයන් මගින් බෙදනු ලැබූ අතර එය අනුපාතයක් ලෙස ප්‍රකාශ විය. තුළ කෘතිම දී ෆොස්ෆරයිලේෂන් අධ්‍යයන, ප්‍රමාණය ³²විස්තර කර ඇති පරිදි oseFosB (stoichiometry) හි මවුලයකට ΔFosB ලෙස ලේබල් කරන ලදී (සහින් සහ වෙනත් අය, 2004). සියළුම මිනුම් භාවිතා කරන ලද උපකරණයේ රේඛීය පරාසය තුළ ගනු ලැබීය. චාලක පරාමිතීන් ගණනය කරනු ලැබුවේ මයිකල්-මෙන්ටන් ආකෘතිය භාවිතා කරමිනි V = V_{මැක්ස්}[S] / ([S]+K_M) සහ V_{මැක්ස්} = k₂[E_මුළු]. අර්ධ ආයු කාලය (t_1/2ΔFosB සහ FosB හි ස්පන්දන-හඹා යාමේ බිම් වලින් තක්සේරු කරන ලදි (දත්ත ලක්ෂ්‍යයන්ට වඩාත් ගැලපෙන රේඛීය නොවන ප්‍රතිගාමීත්වය භාවිතා කරමින්) සහ ඉතිරි ප්‍රෝටීන ප්‍රමාණය මුල් පිටපතෙහි 50% වන කාලයට අනුරූප වේ. සියලු සංඛ්‍යාලේඛනවල, පෙන්වා ඇති ප්‍රති results ල අවම වශයෙන් ස්වාධීන අත්හදා බැලීම් දෙකක් හෝ තුනක් නියෝජනය කරයි. සියලුම ප්‍රස්ථාරවල, පෙන්වා ඇති දත්ත සාමාන්‍ය ± SEMs (3 are) වේ n ≤16). වෙනස්කම් වල සංඛ්‍යානමය වැදගත්කම තක්සේරු නොකළ යුගලයක් භාවිතා කරමින් තක්සේරු කරන ලදී t පරීක්ෂණය, බහු සැසඳීම් සඳහා නිවැරදි කරන ලද අතර තරු ලකුණු වලින් දැක්වේ p N 0.05.

පෙර කොටස ඊළඟ කොටස

ප්රතිපල

OsFosB යනු අසාමාන්‍ය ලෙස ස්ථාවර පිටපත් කිරීමේ සාධකයකි

OssFosB යනු සාපේක්ෂව ස්ථාවර පිටපත් කිරීමේ සාධකයක් බව අප කලින් අනුමාන කළද (නෙස්ලේටර් සහ අල්., 2001), ප්‍රෝටීන වල පිරිවැටුම් පැතිකඩ පිළිබඳ analysis ජු විශ්ලේෂණයක් මේ දක්වා සිදු කර නොමැත. මෙම ප්‍රශ්නයට විසඳුම් සෙවීම සඳහා අපි නියුරෝන වැනි සෛල රේඛාවක් ලෙස පුළුල් ලෙස භාවිතා කර ඇති PC12 සෛල භාවිතා කරමින් ස්පන්දන-හඹා යාමේ අත්හදා බැලීම් සිදු කළ අතර, osFosB නැවත සංයෝජිත හර්පීස් සිම්ප්ලෙක්ස් වෛරසය (HSV-osFosB) ආසාදනය හරහා අස්ථිර ලෙස ප්‍රකාශ කරන ලදී. අලුතින් සංස්ලේෂණය කරන ලද ප්‍රෝටීන පරිවෘත්තීය ලෙස ලේබල් කරන ලදී ³⁵S-Met / Cys, සහ පිරිහීමේ රටාව ³⁵එස් ලේබල් කරන ලද osFosB (³⁵S-osFosB) විකිරණශීලී ලේබල් කරන ලද ඇමයිනෝ අම්ල ඉවත් කිරීමෙන් පසු විවිධ කාලවලදී ලබාගත් සෛල ලයිසෙට් වලින් ප්‍රතිශක්තිකරණයෙන් එය නිරීක්ෂණය කරන ලදී. SDS-PAGE සහ ඔටෝරාඩියෝග්‍රැෆි මගින් ප්‍රතිශක්ති ප්‍රතිරෝධක විශ්ලේෂණය කිරීමෙන් හෙළි වූයේ PC12 සෛලවල osFosB හි අර්ධ ආයු කාලය ∼10 h (රූපය. 1). මෙම සොයාගැනීම්වලින් පෙනී යන්නේ cellFosB හි අර්ධ ආයු කාලය බොහෝ ප්‍රේරණය කළ හැකි පිටපත් කිරීමේ සාධකවලට වඩා ඉහළ මට්ටමක පවතින බවයි (සාකච්ඡාව බලන්න), පූර්ණ-කාලීන FosB ද ඇතුළුව, සෛල සංස්කෘතියේ අර්ධ ආයු කාලය ∼90 min (Dobrazanski et al., 1991; කාලේ සහ වෙනත් අය. 2004). ඊට අමතරව, osFosB හි පරිහානිය පළමු මට්ටමේ on ාතීය ක්ෂය වක්‍රයකට නොගැලපෙන බව සඳහන් කිරීම වටී, නමුත් එය මන්දගාමී හායනයකින් ආරම්භ වන ද්විභාෂා වේ. මෙයින් ඇඟවෙන්නේ ΔFosB විශේෂ එකකට වඩා සහ / හෝ එකකට වඩා පිරිහීමේ මාර්ගයක පැවැත්මයි.

විශාල අනුවාදය බලන්න:

PowerPoint Slide ලෙස බාගන්න

රූපය 1.

OsFosB යනු අසාමාන්‍ය ලෙස ස්ථාවර පිටපත් කිරීමේ සාධකයකි. OsFosB හි අර්ධ ආයු කාලය සෛල සංස්කෘතියේ ∼10 h වේ. ΔFosB PC12 සෛල තුළ HSV-osFosB ආසාදනය වීමෙන් හෝ osFosB අඩංගු ප්ලාස්මිඩ් සමඟ අස්ථිර මාරුවීමක් මගින් ප්‍රකාශ කරන ලද අතර, ද්‍රව්‍ය හා ක්‍රමවල විස්තර කර ඇති පරිදි සෛල ස්පන්දන-හඹා යාමේ පරීක්ෂණවලට භාජනය විය. OsFosB අධික ලෙස මුද්‍රණය කිරීම සඳහා භාවිතා කළ ක්‍රමය නොසලකා සමාන ප්‍රති results ල ලබා ගන්නා ලදි. රූපයේ දැක්වෙන්නේ ΔFosB පරිහානියේ කාල පා course මාලාව (සහ නියෝජිත ස්වයංක්‍රීය විකිරණ). සැලසුම් කරන ලද දත්ත යනු අවම වශයෙන් ස්වාධීන අත්හදා බැලීම් පහකින් ලබාගත් අවම වශයෙන් 15 තනි දත්ත ලක්ෂ්‍යවල සාමාන්‍ය ± SEM ය. සංසන්දනය කිරීම සඳහා, පූර්ණ-කාලීන FosB හි වාර්තා වූ අර්ධ ආයු කාලය දක්වා ඇත.

Os ෆොස්බී යනු මොළයේ ඇති පොස්පොප්‍රෝටීන් ය

ΔFosB හි පශ්චාත් පරිවර්තන වෙනස් කිරීම එහි පැහැදිලි ස්ථාවරත්වයට දායක විය හැකි යැයි අපි උපකල්පනය කර ඇත්තෙමු. පිටපත් කිරීමේ සාධකවල ස්ථායිතාව ඇතුළු බොහෝ ආකාරවලින් පොස්පරීකරණය වෙනස් කර ඇති බව පෙන්වා දී ඇති හෙයින් (සමාලෝචනය සඳහා, බලන්න ඩෙස්ටෙරෝ සහ වෙනත් අය, 2000; විට්මාර්ෂ් සහ ඩේවිස්, 2000), ΔFosB යනු පොස්පොප්‍රෝටීන් ද යන්න අපි සොයා බැලුවෙමු. මේ සඳහා, osFosB ප්‍රකාශනය නිදන්ගත ඊසීඑස් භාවිතා කරමින් මීයන්ගේ මොළය තුළ ප්‍රේරණය කරන ලදි, මෙය ඉහළ ඉදිරිපස බාහිකයේ ඉහළ මට්ටමේ ΔFosB ඇති කිරීමට දන්නා ප්‍රතිකාරයකි (Hope et al., 1994a). අවසාන ECS ප්‍රතිකාරයෙන් දිනකට පසු, osFosB මට්ටම ඉහළ මට්ටමක පවතින විට, තුනී ඉදිරිපස බාහික පෙති සකස් කර පරිවෘත්තීය ලෙස ලේබල් කරන ලදී ³²පී-ඕතොපොස්පේට්. සමාන්තර පෙති කට්ටලයක් රේඩියෝ ලේබල් කර නොතිබූ අතර, මුළු totalFosB මට්ටම් හඳුනා ගැනීමට මේවා භාවිතා කරන ලදී. නිශ්චිත ප්‍රති-ෆොස්බී / os ෆොස්බී ප්‍රතිදේහයක් සමඟ ප්‍රතිශක්ති ප්‍රතිරෝධක කිරීමෙන් පසුව සහ එස්ඩීඑස්-පේජ් විසින් ප්‍රතිශක්තිකරණ ප්‍රෝටීන වෙන් කිරීමෙන් පොස්පරීකරණය කරන ලද ³²පී-ලේබල් කරන ලද os ෆොස්බී ස්වයංක්‍රීය රූපසටහන මගින් අනාවරණය කර ගත් අතර මුළු os ෆොස්බී ප්‍රතිශක්තිකරන අවහිරතාවයෙන් අනාවරණය විය. මෙම විශ්ලේෂණයෙන් හෙළි වූයේ osFosB මොළයේ පොස්පරීකරණය කර ඇති බවයි ³²නිදන්ගතව ප්‍රතිකාර කරන ලද මොළයේ සාම්පලවල ∼35 kDa හි පී-ලේබල් කරන ලද පටිය, නමුත් ව්‍යාජ ප්‍රතිකාර ක්‍රම මගින් හඳුනාගත නොහැකිය.රූපය. 2A). නිදන්ගත උත්තේජනයක් නොමැති විට ΔFosB හි බාසල් මට්ටම ඉතා අඩු බැවින් මෙය අනුරූප වේ. ප්‍රතිශක්තිකරණ ප්‍රතික්‍රියාවේ නිශ්චිතතාව විදහා දක්වන්නේ ප්‍රතිශක්තිකරණ නොවන IgG වර්ෂාපතනයේ සං signal ා නොමැතිකමෙනි.

විශාල අනුවාදය බලන්න:

PowerPoint Slide ලෙස බාගන්න

රූපය 2.

Os ෆොස්බී යනු මොළයේ ඇති පොස්පොප්‍රෝටීන් ය. A, OsFosB මොළයේ පොස්පරීකරණය කර ඇත. ද්‍රව්‍ය හා ක්‍රම වල විස්තර කර ඇති පරිදි නිදන්ගත ඊසීඑස් ප්‍රතිකාර මගින් අන්තරාසර්ග osFosB මීයන්ගේ මොළයට ප්‍රේරණය විය. ඉදිරිපස බාහික පෙති පරිවෘත්තීය ලෙස ලේබල් කරන ලදී ³²පී.එච්₃PO₄ පැය කිහිපයක්. පෙති සමජාතීයකරණය කිරීමෙන් පසුව, osFosB ප්‍රතිශක්තීකරනය නොකළ අතර පොස්පරීකරණය කළ ΔFosB (³²P-osFosB) ස්වයංක්‍රීය රූප සටහන (ඉහළ පුවරුව) මගින් අනාවරණය විය. ප්‍රතිශක්තිකරණ අවහිරතා (පහළ පුවරුව) මගින් ප්‍රත්‍යාවර්තක නොවන ප්‍රතිශක්ති ප්‍රතිරෝධකවල ඇති ΔFosB අනාවරණය විය. Negative ණාත්මක පාලනයක් ලෙස, ව්‍යාජ ප්‍රතිකාර කළ සතෙකුගේ ප්‍රතිශක්ති ප්‍රතිරෝධක සහ ප්‍රතිශක්තිකරණ නොවන IgG පෙන්වා ඇත. B, මූසිකය සඳහා අනුරූප අනාවැකි ලකුණු සහිත අපේක්ෂක පොස්පරීකරණය අඩවි සහ කයිනස් osFosB ප්‍රෝටීන් අනුක්‍රමය ජෛව තොරතුරු විශ්ලේෂණය මඟින් ලබා ගන්නා ලදී. ඉහළ පුරෝකථන ලකුණු ඇති අපේක්ෂක අඩවි ප්‍රෝටීන් අනුක්‍රමය තුළ ඉස්මතු කර වගුවේ ලැයිස්තුගත කර ඇත. ප්‍රෝටීන අනුපිළිවෙලෙහි ඩීඑන්ඒ බන්ධන (මූලික) වසම සහ ලුසීන් සිපර් තද අකුරින් පවතී. C, D, SerFosB ෆොස්ෆරයිලේෂණය Ser / Thr ෆොස්ෆේටේස් නිෂේධක OA මගින් වැඩි කරයි. C, ³²ස්වයංක්‍රීය විකිරණවේදය මගින් (Ctr) හෝ 100 ng / ml OA (ප්‍රස්ථාරය සහ ඉහළ පුවරුව) නොමැති විට ලේබල් කරන ලද ඉදිරිපස කොටසේ පෙති වලින් ප්‍රතිශක්ති ප්‍රතිරෝධකවල P-osFosB මට්ටම් අනාවරණය විය. පහළ පුවරුවේ දැක්වෙන්නේ ප්‍රතිශක්තිකරන අවහිර කිරීම් මගින් ලේබල් නොකළ පෙති වලින් ප්‍රතිශක්තීකරණ ප්‍රතිරෝධක වලින් අනාවරණය වී ඇති බවයි. D, PC12 සෛල HSV-osFosB හෝ HSV-LacZ (දෛශිකය) ආසාදනය වී ඇති අතර පරිවෘත්තීය ලෙස ලේබල් කර ඇත ³²පී.එච්₃PO₄ 100 ng / ml OA නොමැති විට (Ctr) හෝ තිබීම. ³²ස්වයංක්‍රීය විකිරණවේදය (ප්‍රස්තාරය, ඉහළ පුවරුව) මගින් ප්‍රතිශක්ති ප්‍රතිරෝධක වල P-osFosB මට්ටම් අනාවරණය විය. පහළ පුවරුවේ ප්‍රතිශක්තීකරණ අවහිරතා මගින් සෛල ලයිසෙට් වලින් අනාවරණය කරගත් මුළු ΔFosB පෙන්වයි.

ΔFosB ෆොස්ෆරයිලේෂණයට සම්බන්ධ වන කයිනාස් (ය) සහ අඩවි (ය) පැහැදිලි කිරීමේ පළමු පියවර ලෙස, අපි එහි ඇමයිනෝ අම්ල අනුක්‍රමය ජෛව තොරතුරු විශ්ලේෂණයන් කිහිපයකට යටත් කළෙමු. මෙයින් හෙළි වූයේ, ΔFosB ටයර් ෆොස්ෆරයිලේෂන් අපේක්ෂක අඩවි නොමැති වුවද, එහි CaMKII අඩවි තුනක්, CK2 අඩවි තුනක් සහ ඉතා ඉහළ පොස්පරීකරණය පුරෝකථන ලකුණු සහිත PKC අඩවි දෙකක් ඇතුළුව Ser / Thr kinase සම්මුති අඩවි කිහිපයක් අඩංගු වන බවයි.රූපය. 2B). ජෛව තොරතුරු තාක්ෂණයෙන් පුරෝකථනය කර ඇති පරිදි, osFosB යනු Ser හෝ Thr අපද්‍රව්‍ය මත පමණක් පොස්පරීකරණය කර ඇත්නම්, එහි පොස්පරීකරණය සැලකිය යුතු ලෙස වෙනස් කළ යුත්තේ Ser / Thr පොස්පේටේස් වල ක්‍රියාකාරිත්වයෙනි. මෙම උපකල්පනය පරීක්ෂා කිරීම සඳහා, අපි ඉදිරිපස බාහික පෙති සමඟ ලේබල් කළෙමු ³²සෙර් / ත්‍රි ප්‍රෝටීන් පොස්පේටේස් නිෂේධනයක් වන OA ඉදිරිපිට හෝ නොමැති විට P-orthophosphate. හි පෙන්වා ඇති පරිදි රූපය 2C, OA විශාල (∼2.5 ගුණයකින්) වැඩි වීමට හේතු විය ³²P-osFosB. එය සමස්ත osFosB මට්ටම්වල සුළු වැඩිවීමක් ද ඇති කළ අතර, එය OA හි පිළිකා කාරක බලපෑම් සම්බන්ධ කරන පෙර වාර්තා වලට අනුකූල වන අතර ෆොස් ප්‍රෝටීන ඇතුළු ක්ෂණික මුල් ජාන කිහිපයක් ඇති කිරීමට ඇති හැකියාව සමඟ එය සම්බන්ධ වේ (මිලර් et al., 1998; චෝව් සහ අල්., 2004). ශුද්ධ ප්‍රති result ලය පොස්පරීකරණය කළ osFosB මට්ටම්වල සැලකිය යුතු සමස්ත වැඩි වීමකි (∼60%).

පර්යේෂණාත්මක හැසිරවීමට වඩා සුදුසු PC12 සෛල තුළ osFosB මොළයේ දක්නට ලැබෙන ආකාරයටම පොස්පරීකරණය කිරීමේ රටාවක් පෙන්වූයේ දැයි අපි සොයා බැලුවෙමු. HSV-osFosB ආසාදනය හරහා අපි PC12 සෛල තුළ osFosB ප්‍රකාශ කළ අතර සෛල සමඟ පරිවෘත්තීය ලෙස ලේබල් කළෙමු ³²OA තිබීම හෝ නොමැතිවීම තුළ P-orthophosphate. HSV-osFosB- ආසාදිත සෛල වලින් ප්‍රෝටීන වල සාර්ථක ප්‍රකාශනය සහ ප්‍රතිශක්තීකරණ ප්‍රතිශක්තිකරණය ප්‍රතිශක්තීකරණයේ දෙකම තිබීම පෙන්නුම් කරයි (රූපය. 2D, පහළ පුවරුව) සහ ∼35 kDa කලාපයක ස්වයංක්‍රීය රූප සටහන (ඉහළ පුවරුව), දෛශික ආසාදිත සෛලවල නොමැත. මොළයේ නිරීක්ෂණය කළ පරිදි, OA මගින් සමස්ත osFosB මට්ටම්වල සුළු වැඩිවීමක් සිදු වූ නමුත් ඊට වඩා වැඩි (ආසන්න වශයෙන් දෙගුණයක්) වැඩි වීමක් සිදුවිය ³²P-osFosB, එහි ප්‍රති ing ලයක් ලෙස ΔFosB පොස්පරීකරණයෙහි සැලකිය යුතු (∼50%) ශුද්ධ වැඩි වීමක් සිදුවිය. තවද, ජෛව තොරතුරු අනාවැකි වලට අනුකූලව, ටයර් පොස්පේටේස් නිෂේධනයක් සමඟ PC12 සෛලවලට ප්‍රතිකාර කිරීමෙන් සැලකිය යුතු වෙනසක් සිදු නොවීය. ³²P-osFosB මට්ටම් (දත්ත පෙන්වා නැත). මෙම සොයාගැනීම්වලින් හෙළි වූයේ osFosB මොළයේ සහ PC12 සෛලවල ඇති Ser සහ / හෝ Thr අපද්‍රව්‍ය මත පොස්පරීකරණය කර ඇති අතර දෙවැන්න cellFosB හි පොස්පරීකරණය හා පිරිහීමේ පැතිකඩ තවදුරටත් අධ්‍යයනය කිරීම සඳහා හොඳ සෛලීය සංස්කෘතික පද්ධතියක් බව තහවුරු කර ඇති බවයි.

CK2 නමුත් PKC හෝ CaMKII ෆොස්ෆරයිලට් notFosB නොවේ කෘතිම දී

ඉහත විස්තර කර ඇති පරිදි, osFosB ඇමයිනෝ අම්ල අනුක්‍රමය විශ්ලේෂණය කිරීමෙන් CK2, PKC, සහ CaMKII ෆොස්ෆරයිලේෂන් අඩවි සඳහා ඉහළ පුරෝකථන ලකුණු අනාවරණය විය. ΔFosB පොස්පරීකරණය කළ හැකි මෙම කයිනස් වලින් කවරේද යන්න තීරණය කිරීම සඳහා, අපි මාලාවක් පවත්වන ලදී කෘතිම දී පිරිසිදු කරන ලද කයිනස් සහ පිරිසිදු කරන ලද ප්‍රතිසංයෝජක ΔFosB භාවිතා කරමින් පොස්පරීකරණය කිරීමේ ප්‍රතික්‍රියා. හි පෙන්වා ඇති පරිදි රූපය 3A, අපේක්ෂක kinases තුනෙන්, සැලකිය යුතු ආකාරයකින් CK2 පොස්පරීකරණය කළ latedFosB පමණි. මීට අමතරව, තවත් කයිනස් කිහිපයක් පරීක්ෂාවට ලක් කරන ලදී (උදා: GSK3 සහ p70S6K) නමුත් සැලකිය යුතු ලෙස පොස්පරීකරණය කිරීමට අසමත් විය osFosB (දත්ත පෙන්වා නැත). කාල පා course මාලා විශ්ලේෂණය අනුව CK2 ප්‍රතික්‍රියාවේ අතිරේක ගුනාංගීකරනයෙන් හෙළි වූයේ kinFosB () මවුලයකට ∼0.5 මෝල් පොස්පේට් ඒකාබද්ධ කිරීම මෙම කයිනස් මගින් උත්ප්‍රේරණය කළ හැකි බවයි.රූපය. 3B). CK2 හට osFosB පොස්පරීකරණය කළ හැකි බව කෘතිම දී සැලකිය යුතු ස්ටොයිකියෝමිතිකයකට (∼50%) භෞතික විද්‍යාත්මකව අදාළ ප්‍රතික්‍රියාවක් යෝජනා කරයි. පිරිසිදු කරන ලද osFosB ප්‍රමාණය වැඩි වෙමින් තිබියදී CK2 පුර්ව ලියාපදිංචි කිරීමෙන් අපි මෙම ප්‍රතික්‍රියාවේ චාලක විද්‍යාව අධ්‍යයනය කළ අතර, CK2 ෆොස්ෆරයිලට් osFosB සමඟ a V_{උපරිම} 5.8 pmol · min^-1 · .G^-1 එන්සයිමයේ, a K_M 18.4 ofm, සහ a k_බළලා 0.2 / s හි (රූපය. 3C). මෙම චාලක පරාමිතීන් සඳහා ලබාගත් අගයන් මෙම ප්‍රතික්‍රියාවේ භෞතික විද්‍යාත්මක අදාළතාවයට තවදුරටත් සහාය වේ. උදාහරණයක් ලෙස K_M DKPP2 සඳහා CK32 හි, එහි වඩාත්ම ප්‍රසිද්ධ උපස්ථරයක් වන 3.4 μm වන අතර, k_බළලා ∼0.3 / s (ජිරෝල්ට් සහ වෙනත් අය, 1989); එම K_M ATP සඳහා ∼10 - 40 fromm සිට (කොචෙට් සහ වෙනත්., 1983; සිල්වා-නෙටෝ සහ වෙනත් අය, 2002), සහ කේසීන් සඳහා ∼10-50 μm සිට (මෙග්ජියෝ සහ වෙනත්., 1977; පියරින් සහ වෙනත් අය, 1987). මෙම දත්ත සියල්ලම පෙන්නුම් කරන්නේ KFosB යනු CK2 සඳහා හොඳ උපස්ථරයක් බවයි කෘතිම දී.

විශාල අනුවාදය බලන්න:

PowerPoint Slide ලෙස බාගන්න

රූපය 3.

CK2 නමුත් PKC හෝ CaMKII ෆොස්ෆරයිලට් notFosB නොවේ කෘතිම දී. ඔටෝරාඩියෝග්‍රැෆි (ඉහළ පුවරුව) පොස්පරීකරණය කළ නිෂ්පාදිතය පෙන්වන අතර, කූමාසි-පැල්ලම් සහිත ජෙල් (පහළ පුවරුව) ප්‍රතික්‍රියාවේ මුළු ΔFosB පවතින බව පෙන්වයි. A, පිරිසිදු කරන ලද ප්‍රතිසංයෝජක osFosB වලට යටත් විය කෘතිම දී විවිධ අපේක්ෂක කයිනස් මගින් පොස්පරීකරණය කිරීම (ඒවායින් තුනක් පෙන්වා ඇත). B, කාල පා course මාලාව සහ ස්ටොයිකොමිතික විශ්ලේෂණයන් පෙන්වා දෙන්නේ CK2 හට osFosB පොස්පරීකරණය කළ හැකි බවයි කෘතිම දී ∼50% ක ස්ටොයිකියෝමිතිකයක් සමඟ. C, CK2 ප්‍රතික්‍රියාවේ චාලක විශ්ලේෂණයෙන් හෙළි වූයේ osFosB යනු හොඳ විශ්වාසයක් බවයි කෘතිම දී උපස්ථරය. ප්‍රතික්‍රියාවේ රේඛීයකරණය ද්විත්ව පරස්පර කුමන්ත්‍රණයක (පහළ) පෙන්වා ඇත, නමුත් චාලක පරාමිතීන් ව්‍යුත්පන්න කර ඇත්තේ මයිකල්-මෙන්ටන් වක්‍රය (ඉහළ) ය.

CK2 අඛණ්ඩ සෛල තුළ osFosB හි පොස්පරීකරණය හා ස්ථායිතාව වෙනස් කරයි

ΔFosB හි CK2- මැදිහත් වූ පොස්පරීකරණයෙහි භෞතික විද්‍යාත්මක අදාළත්වය තක්සේරු කිරීම සඳහා, අපි භාවිතා කරමින් සංසන්දනාත්මක පොස්පොපෙප්ටයිඩ සිතියම් ගත කළෙමු. කෘතිම දී phosphorylated සහ PC12- සෛල-පොස්පරීකරණය කළ osFosB. SDS-PAGE සහ ජෙල් ඉවත් කිරීමෙන් පසුව ³²P-osFosB (සිට කෘතිම දී ප්‍රතික්‍රියා හෝ ප්‍රතිශක්ති ප්‍රතිරෝධකයෙන් ³²පී-ලේබල් කරන ලද සෛල), ප්‍රෝටීන් ට්‍රිප්සින් සමඟ ජීර්ණය කරන ලද අතර එහි ප්‍රති ing ලයක් ලෙස පොස්පොපෙප්ටයිඩ ද්විමාන වෙන් කිරීමකට භාජනය විය. මෙම විශ්ලේෂණයෙන් හෙළි වූයේ සීඑක්එක්ස්එන්එම්එක්ස් ප්‍රතික්‍රියාවෙන් ලැබෙන ප්‍රධාන පොස්පොපෙප්ටයිඩය පීසීඑක්ස්එන්එම්එක්ස් සෛල තුළ ඇති ෆොස්ෆොස් පොස්පරීකරණය කරන ලද ප්‍රධාන ෆොස්ෆොපෙප්ටයිඩ දෙකෙන් එකක් සමඟ සංයුක්ත වී ඇති බවයි (රූපය. 4A), PKC හෝ CaMKII (දත්ත පෙන්වා නැත) ප්‍රතික්‍රියාවේ ප්‍රති ing ලයක් ලෙස ඇති පොස්පොපෙප්ටයිඩයන් නොපෙන්වයි. PC12 සෛල වලින් සිතියමේ දෙවන osFosB ෆොස්ෆොපෙප්ටයිඩයක් තිබුනි, නමුත් ඒ හා සමාන ෆොස්ෆොපෙප්ටයිඩයක් ජනනය කිරීමට අප විසින් පරීක්‍ෂා කරන ලද කිසිදු කයිනස්වල නොහැකියාව නිසා කෘතිම දී, මෙම දෙවන ෆොස්ෆොපෙප්ටයිඩයේ අනෙක් ෆොස්ෆොපෙප්ටයිඩයට වඩා වෙනස් ෆොස්ෆරයිලේෂන් අඩවියක් තිබේද යන්න හෝ එකම ෆොස්ෆරයිලේෂන් අඩවිය අඩංගු විශේෂිත ට්‍රිප්ටික් පෙප්ටයිඩයක් නියෝජනය කරන්නේද යන්න අපි දැනට නොදනිමු.

විශාල අනුවාදය බලන්න:

PowerPoint Slide ලෙස බාගන්න

රූපය 4.

CK2 අඛණ්ඩ සෛල තුළ osFosB හි පොස්පරීකරණය හා ස්ථායිතාව වෙනස් කරයි. A, CK2 නමුත් PKC සෛල තුළ පොස්පරීකරණය ΔFosB ලෙස නොපෙනේ. CK2 හෝ PKC විසින් ΔFosB පොස්පරීකරණය කරන ලද ද්විමාන පොස්පොපෙප්ටයිඩ සිතියම් කෘතිම දී හෝ නොවෙනස්ව PC12 සෛල මගින්. ඊතල මගින් පෙන්වන්නේ CK2- ෆොස්ෆරයිලෙටඩ් පෙප්ටයිඩයේ සංයෝජනය වන නමුත් PC12 සෛල වලින් ලබාගත් ΔFosB ෆොස්ෆොපෙප්ටයිඩ වලින් එකක් සහිත PKC- පොස්පරීකරණය කළ එකක් නොවේ. B, PC බලවත් CK12 සක්‍රියකාරක ශුක්‍රාණු (SP) සමඟ සෛලවලට ප්‍රතිකාර කිරීමෙන් PC2 සෛලවල ෆොස්බී පොස්පරීකරණය වැඩි වන අතර CK2 inhibitor DRB සමඟ ප්‍රතිකාර කිරීමෙන් අඩු වේ. ඊට වෙනස්ව, පීසීඑක්ස්එන්එම්එක්ස් සෛලවල ඇති ෆොස්බී පොස්පරීකරණය පීකේසී සක්‍රියකාරකයක් (පීඑම්ඒ) හෝ පීකේසී විශේෂිත නිෂේධක කැල්ෆොස්ටින්-සී (කැල්ෆ්) සමඟ ප්‍රතිකාර කිරීමෙන් බලපෑමට ලක් නොවීය. නියෝජිත ස්වයංක්‍රීය රූප සටහනක් (ඉහළ පුවරුව) සහ ප්‍රතිශක්තීකරණ (පහළ පුවරුව) පෙන්වා ඇත. සී-එෆ්, ΔFosB ස්ථායිතාව මත CK2 ක්‍රියාකාරිත්වයේ බලපෑම. සංඛ්‍යාලේඛන osFosB පරිහානියේ කාල පා course මාලාව (සහ නියෝජිත ස්වයංක්‍රීය රූප සටහන) පෙන්වයි. XFosB අස්ථිර ලෙස ප්‍රකාශ කරන PC12 සෛල CK2 inhibitor DRB නොමැති විට හෝ නොතිබීම තුළ සිදු කරන ලද ස්පන්දන-හඹා යාමේ අත්හදා බැලීම් වලට භාජනය විය.C), CK2 සක්‍රියකාරක ශුක්‍රාණු (D), හෝ පුළුල් වර්ණාවලීක කයිනාස් නිෂේධකය H-8 (E), එය DRB හි නිශ්චිත බලපෑම් පාලනය කිරීම සඳහා භාවිතා කරන ලදී. F, KFosB ස්ථායිතාව මත CK2 හි උත්ප්‍රේරක අනු ඒකකය තට්ටු කිරීමේ බලපෑම. පීසීඑක්ස්එන්එම්එක්ස් සෛල සීආර්එක්ස්එන්එම්එක්ස් සහ එක්ස්එන්එම්එම්එක්ස් මීයන් ඉලක්ක කර නොගත් සීආර්එන්ඒ (සීටීආර්) හෝ සිරා සමඟ සම්ප්‍රේෂණය කරන ලදී. පසුව Δ ෆොස්බී ප්ලාස්මිඩ් සමඟ සම්ප්‍රේෂණය කරන ලදී. ඉහළ පුවරුවේ CK12 සහ ΔFosB ප්‍රෝටීන් මට්ටම් කෙරෙහි CK2 siRNA වල බලපෑම පෙන්වන සම්පූර්ණ සෛල ලයිසෙට් වල ප්‍රතිශක්තීකරණ බ්ලොට් නිරූපණය කෙරේ. - ටියුබුලින් සඳහා අනුරූප ප්‍රතිශක්තිකරණයක් පැටවීමේ පාලනයක් ලෙස දැක්වේ.

CK2 හි භෞතික විද්‍යාත්මක අදාළතාවය ΔFosB kinase ලෙස තවදුරටත් විසඳීම සඳහා, අපි KFosB- ප්‍රකාශිත PC12 සෛලවලට CK2 ක්‍රියාකාරකම් මොඩියුලේට් කරන drugs ෂධ දෙකක් සමඟ ප්‍රතිකාර කළෙමු. හි පෙන්වා ඇති පරිදි රූපය 4B, PC12 සෛල වලට පාරගම්ය වන CK2 inhibitor DRB සමඟ ප්‍රතිකාර කිරීමෙන් osFosB පොස්පරීකරණය අඩු විය.මෙග්ජියෝ සහ වෙනත්., 1990; Szyszka et al., 1995), සහ ප්‍රබල CK2 සක්‍රියකයක් ලෙස හැඳින්වෙන පොලිමීන් ශුක්‍රාණු සමඟ ප්‍රතිකාර කිරීමෙන් වැඩි වේ (කොචෙට් සහ චම්බාස්, 1983; මෙග්ජියෝ සහ වෙනත්., 1983). ඊට වෙනස්ව, පීසීසීඑන්එම්එක්ස් සෛලවලට පීකේසී නිෂේධක කැල්ෆොස්ටින්-සී සමඟ ප්‍රතිකාර කිරීම (කොබයාෂි සහ අල්., 1989; ටමාකි සහ වෙනත් අය, 1990) හෝ PKC සක්‍රියකාරක PMA (ෂ්මිට් සහ හෙකර්, 1975; බෙහ් et al., 1989) ΔFosB පොස්පරීකරණයෙහි සැලකිය යුතු වෙනසක් සිදු නොවීය. පීඑම්ඒ සම්බන්ධයෙන් ගත් කල, සුළු (හා සැලකිය යුතු නොවේ) වැඩි වීම ³²මෙම drug ෂධය නිසා ඇති වන osFosB මට්ටම්වල වැඩි වීමක් නිසා P-osFosB ගණනය කළ හැකිය; ඇත්ත වශයෙන්ම, ෆෝර්බෝල් එස්ටරයන් ෆොස්බී (ෆොස්බී) ඇතුළු ෆොස් පවුලේ ප්‍රෝටීන කිහිපයක ප්‍රකාශනය ඇති කරන බව වාර්තා වේ.Yoza et al., 1992; සුහ් et al., 2004). තවද, විශේෂිත සෛල-පාරගම්ය CaMKII inhibitor m-AIP සමඟ සෛලවලට ප්‍රතිකාර කිරීම (ඉෂිඩා සහ ෆුජිසාවා, 1995; ස්ටීවන්ස් සහ වෙනත් අය, 1999) ΔFosB ෆොස්ෆරයිලේෂන් අඩුවීමට ද හේතු නොවීය (දත්ත පෙන්වා නැත). මෙම ප්‍රති results ල අපගේ අනුකූල වේ කෘතිම දී සොයාගැනීම් සහ ඇඟවුම් කරන්නේ අස්ථිර සෛල තුළ osFosB CK2 විසින් පොස්පරීකරණය කර ඇති නමුත් PKC හෝ CaMKII නොවේ. CK2 නිෂේධනය ΔFosB පොස්පරීකරණය සම්පූර්ණයෙන්ම වළක්වන්නේ නැති බව පෙන්නුම් කරන්නේ ප්‍රෝටීන වල අතිරේක පොස්පරීකරණය අඩවි පවතින බවයි.

NextFosB හි පිරිවැටුමට සහ එහි ස්ථායිතාවයට CK2 කාර්යභාරයක් ඉටු කරන්නේ දැයි අපි ඊළඟට විමසා බැලුවෙමු. මේ සඳහා, අපි පොක්ස්ෆරයිලේෂන් අධ්‍යයනයේදී භාවිතා කරන ලද CK12 නිෂේධකය හෝ CK2 සක්‍රියකාරකය සමඟ ප්‍රතිකාර කළ FosB- ප්‍රකාශිත PC2 සෛල භාවිතා කරමින් ස්පන්දන-හඹා යාමේ පරීක්ෂණ සිදු කළෙමු. හි පෙන්වා ඇති පරිදි රූපය 4C, CK2 inhibitor DRB සමඟ සෛලවලට ප්‍රතිකාර කිරීම ΔFosB හි පිරිවැටුම් අනුපාතය කෙරෙහි සැලකිය යුතු බලපෑමක් ඇති කළ අතර, එහි පරිහානියේ වක්‍රයේ හැඩය වෙනස් වීම, ද්විභාෂාවේ සිට වක්‍රය දක්වා on ාතීය ක්ෂය වීමකට වඩා සමීප බව පෙන්නුම් කරයි. අනෙක් අතට, CK2 සක්‍රිය ශුක්‍රාණු තිබීම ΔFosB හි පිරිහීමේ අනුපාතයෙහි සැලකිය යුතු අඩුවීමක් ඇති කළ අතර එය හඹා යාමේ පළමු පැය තුළ ප්‍රෝටීන් සමුච්චය වීමට හේතු විය (රූපය. 4D).

බොහෝ කයිනාස් සක්‍රියකාරක සහ නිෂේධකයන් මෙන්, ශුක්‍රාණු සහ ඩී.ආර්.බී. සී.කේ.එස්.එන්.එම්.එම්.එස්. ඇත්ත වශයෙන්ම, ඩීආර්බී විසින් සම්ප්‍රේෂණ සාධකය IIH (TFIIH) - ඇසෝසියේටඩ් කයිනාස් (යන්කුලොව් සහ වෙනත් අය, 1995), එහි ප්‍රති results ලය වන්නේ ආර්එන්ඒ පොලිමරේස් II- මැදිහත් වූ පිටපත් කිරීම නිෂේධනය කිරීමයි. මෙම බලපෑම osFosB හි ස්ථායිතාවයට සිතිය හැකි බැවින්, අපි පුළුල් වර්ණාවලීක කයිනාස් නිෂේධක H-8 (හිඩාකා සහ කොබයාෂි, 1992) FFosB පිරිවැටුම මත සාන්ද්‍රණයක (200 μm) TFIIH ආශ්‍රිත කයිනස් නිෂේධනය කිරීමට දන්නා නමුත් CK2 නොවේ (යන්කුලොව් සහ වෙනත් අය, 1995). හි පෙන්වා ඇති පරිදි රූපය 4E, H-8 සමඟ ප්රතිකාර කිරීම ΔFosB හි පිරිවැටුම් අනුපාතයට බල නොපායි. තවත් පුළුල් වර්ණාවලීක කයිනාස් නිෂේධනයක් වන H-7 සමඟ සමාන ප්‍රති results ල ලබාගෙන ඇති අතර එය සාන්ද්‍රණයක දී TFIIH ආශ්‍රිත කයිනස් නිෂේධනය කරන නමුත් CK2 නොවේ (දත්ත පෙන්වා නැත). ඩී.ආර්.බී. නිසා ඇති වන ෆොස්බී ස්ථායිතාව අඩුවීම බොහෝ දුරට CK2 නිෂේධනයට හේතු විය හැකි බවට අර්ථ නිරූපණයට මෙම දත්ත තවදුරටත් සහාය වේ.

OsFosB පිරිවැටුමේ CK2 හි කාර්යභාරය තවදුරටත් තහවුරු කිරීම සඳහා, අපි සිරා හරහා CK2 තට්ටු කිරීමෙන් ඇති වන ප්‍රතිවිපාක පිළිබඳව සොයා බැලුවෙමු. අපි මෙම අත්හදා බැලීම් සිදු කළේ පළමුවෙන්ම පාලනය කළ (පාලනය කළ නොහැකි) siRNA හෝ මීයන් CK12 (CK2α) සහ 2 h හි උත්ප්‍රේරක අනු ඒකකයේ mRNA ඉලක්ක කරගත් siRNA හෝ සිරස් සමඟ සම්ප්‍රේෂණය කළ PC24 සෛල භාවිතා කර පසුව ΔFosB සමඟ සම්ප්‍රේෂණය කරන ලදි. හි පෙන්වා ඇති පරිදි රූපය 4F, ΔFosB මට්ටම්වලට (ඉහළ පුවරුවට) බලපාන්නේ නැතිව CK2α siRNA සමඟ මාරුවීම කාර්යක්ෂමව හා විශේෂයෙන් CK2α ප්‍රෝටීන් මට්ටම් බිඳ දැමීය. ස්පන්දන-හඹා යාමේ විශ්ලේෂණයෙන් හෙළි වූයේ සීකේඑක්ස්එන්එම්එක්ස් බිඳ දැමීම නිසා ΔFosB පිරිවැටුම් අනුපාතය සැලකිය යුතු ලෙස ඉහළ ගොස් ඇති බවයි. CK2 ක්‍රියාකාරකම් වලක්වාලීම (DRB ප්‍රතිකාරයෙන් හෝ siRNA හරහා වේවා) ΔFosB හි පිරිවැටුම වැඩි කරන අතර ද්විභාෂා වක්‍රයේ මන්දගාමී අනුපාත සං component ටකය අතුරුදහන් වීමට හේතු වන අතර, CK2 සක්‍රිය කිරීම වක්‍රයේ මන්දගාමී අවධිය වැඩි කරන අතර, ශක්තිමත් සහාය සපයයි KFosB ස්ථායිතාව නියාමනය කිරීමේදී CK2 කාර්යභාරයක් ඉටු කරයි යන අදහස.

Ser2 හි CK27 phosphorylates ΔFosB

CK2 විසින් osFosB පොස්පරීකරණය කරන ලද වෙබ් අඩවිය (ය) හඳුනා ගැනීම ආරම්භ කිරීම සඳහා, අපි CK2 විසින් ප්‍රතිසංයෝජක FosB පොස්පරීකරණය කළ පොස්ෆෝ-ඇමයිනෝ අම්ල විශ්ලේෂණයක් සිදු කළෙමු. කෘතිම දී සහ PC12 සෛල තුළ osFosB පොස්පරීකරණය කර ඇත. මෙම අත්හදා බැලීම්වලින් හෙළි වූයේ, අවස්ථා දෙකේදීම අනාවරණය වූ එකම ෆොස්ෆෝ-ඇමයිනෝ අම්ලය ෆොස්ෆෝ-සේර් (රූපය. 5A). මෙම සොයාගැනීම, CK2 සඳහා ලබාගත් ස්ටොයිකියෝමිතිකය සමඟ කෘතිම දී ෆොස්ෆරයිලේෂන් ප්‍රතික්‍රියාව (∼50%) (රූපය. 3B) සහ CK2 ෆොස්ෆොපෙප්ටයිඩ සිතියමේ එක් වැදගත් ස්ථානයක් පමණක් තිබීම (රූපය. 4A), යෝජනා කරන්නේ ΔFosB හි CK2 ෆොස්ෆරයිලේෂන් බොහෝ විට තනි සෙරීන් අපද්‍රව්‍යයකට සීමා වී ඇති බවයි. මෙම නිගමනය පොස්පරීකරණය සම්මුති අඩවි විශ්ලේෂණයට අනුකූල වේ (රූපය. 2B), එය පුරෝකථනය කළේ CK27 සඳහා එක් අපේක්ෂක සෙරීන් එකක්, එනම් Ser2 ය. වර්ගීකරණ විශ්ලේෂණයෙන් හෙළි වූයේ ෆෝස් පවුලේ සාමාජිකයන් අතර පරිණාමය තුළින් සර්ක්ස්නූම්ස් ඉතා ඉහළින් සංරක්ෂණය කර ඇති බවයි (රූපය. 5B), එය වැදගත් භෞතික විද්‍යාත්මක කාර්යයක් දරනු ඇතැයි යෝජනා කරයි.

විශාල අනුවාදය බලන්න:

PowerPoint Slide ලෙස බාගන්න

රූපය 5.

Ser2 හි CK27 Phosphorylates ΔFosB. A, CK2-phosphorylated හි පොස්පෝඇමිනෝ අම්ල විශ්ලේෂණය (කෘතිම දී) සහ PC12 සෛල-පොස්පරීකරණය කරන ලද osFosB මෙම අවස්ථා දෙකෙහිම පොස්පරීකරණය කරන ලද ප්‍රධාන අපද්‍රව්‍ය සෙරීන් බව පෙන්නුම් කරයි. B, FosB / osFosB ඇමයිනෝ අම්ල අනුක්‍රමය පිළිබඳ හරස් විශේෂ විශ්ලේෂණයෙන් හෙළි වූයේ ෆොස් පවුලේ සාමාජිකයන් අතර මිනිසුන්ගේ සිට සීබ්‍රාෆිෂ් (අඳුරු ඉස්මතු කිරීම) දක්වා සර්ක්ස්එන්එම්එක්ස් ඉහළ සංරක්ෂණයක් ඇති බවයි. කෙසේ වෙතත්, CK27 සම්මුති අඩවියට අවශ්‍ය + 3 ස්ථානයේ ඇති ආම්ලික අපද්‍රව්‍ය සංරක්ෂණය නොකෙරේ (සැහැල්ලු ඉස්මතු කිරීම). C, හෙලා සෛල වල් ආකාරයේ ΔFosB (WT) හෝ osFosB සමඟ අක්‍රීයව සම්ප්‍රේෂණය කරන ලද්දේ සර්ක්ස්එන්එම්එක්ස් ඇල (S27A) සමඟ ආදේශ කිරීම සඳහා ලක්ෂ්‍ය විකෘතියක් ඇතිවය. සෛල පරිවෘත්තීය ලෙස ලේබල් කරන ලදී ³²පී.එච්₃PO₄ CK2 සක්‍රිය කිරීම සඳහා වාහනය හෝ ශුක්‍රාණු (SP) සමඟ ප්‍රතිකාර කරනු ලැබේ. ලබාගත් osFosB immunoprecipitates හි නියෝජිත ස්වයංක්‍රීය රූප සටහනක් (ඉහළ පුවරුව) සහ ප්‍රතිශක්තීකරණ (පහළ පුවරුව) පෙන්වා ඇත. ව්‍යාජ සම්ප්‍රේෂණය කළ සෛලවල (දෛශිකයේ) ප්‍රතිශක්තීකරණ ප්‍රතිරෝධය දැක්වේ.

Ser27 osFosB හි පොස්පරීකරණය කර ඇත්දැයි තීරණය කිරීම සඳහා, අපි මෙම අපද්‍රව්‍ය ඇල වෙත විකෘති කළ අතර ප්‍රෝටීන වල පොස්පරීකරණය තත්වයේ ප්‍රතිවිපාක විශ්ලේෂණය කළෙමු. මේ සඳහා, WT හෝ S27A විකෘති ΔFosB අස්ථිර ලෙස ප්‍රකාශ කිරීම සඳහා අපි හෙලා සෛල (ඉහළ කාර්යක්ෂමතාවයකින් සම්ප්‍රේෂණය කළ හැකිය) භාවිතා කළෙමු. බද්ධ කිරීමෙන් පසු දළ වශයෙන් 24 h, සෛල පරිවෘත්තීය ලෙස ලේබල් කරන ලදී ³²පී-ඕතොපොස්පේට් සහ සම්පූර්ණ සෛල ලයිසෙට් සකස් කරන ලදී. ප්‍රතිශක්තීකරණ හා SDS-PAGE අනුගමනය කරමින්, ³²P-osFosB ස්වයංක්‍රීය විකිරණවේදය මගින් සහ මුළු ΔFosB ප්‍රතිශක්තීකරණ මගින් අනාවරණය විය. හි පෙන්වා ඇති පරිදි රූපය 5C (පහළ පුවරුව), දෛශික සම්ප්‍රේෂණය කළ සෛල තුළ osFosB අනාවරණය නොවූ අතර, WT හෝ S27A විකෘති withFosB සමඟ සම්ප්‍රේෂණය වූ සෛල සාර්ථකව ප්‍රෝටීන ප්‍රකාශ කළේය. S27A විකෘතිය සැලකිය යුතු (∼30%) අඩුවීමක් ඇති බව අපට පෙනී ගියේය ³²P-osFosB මට්ටම් (රූපය. 5C, ඉහළ පුවරුව සහ ප්‍රස්තාරය), සජීවී සෛල තුළ, ΔFosB Ser27 මත පොස්පරීකරණය කර ඇති බව පෙන්නුම් කරයි. සෛල තුළ Ser27 ඇත්ත වශයෙන්ම CK2 විසින් පොස්පරීකරණය කර ඇත්දැයි තහවුරු කර ගැනීමේ උත්සාහයක් ලෙස, WT සහ S2A osFosB හි පොස්පරීකරණය මොඩියුලේට් කිරීමට CK27 සක්‍රිය ශුක්‍රාණුවට ඇති හැකියාව අපි සංසන්දනය කළෙමු. අපි මීට පෙර PC12 සෛල තුළ නිරීක්ෂණය කළ පරිදි (රූපය. 4B), හෙලා සෛල වලට ශුක්‍රාණු සමඟ ප්‍රතිකාර කිරීමෙන් ඩබ්ලිව්ටී ප්‍රෝටීන වල පොස්පරීකරණය සැලකිය යුතු ලෙස වැඩි විය. S27A විකෘතිය මගින් මෙම බලපෑම සැලකිය යුතු ලෙස අඩු වී ඇත (රූපය. 5C) ΔFosB හි Ser27 යනු CK2 සඳහා භෞතික විද්‍යාත්මක උපස්ථරයක් යන අර්ථ නිරූපණයට සහය දක්වයි.

Ser27 හි පොස්පරීකරණය ΔFosB හි ස්ථායිතාව නියාමනය කරයි

CK2 සක්‍රිය වූ විට CK2 නිෂේධනය කර වැඩි දියුණු කළ විට osFosB හි ස්ථායිතාව අඩු වන බව තහවුරු කිරීමෙන් පසු (රූපය. 4), සහ Ser2 හි CK27 ෆොස්ෆරයිලෙට්ස් osFosB (රූපය. 5), මෙම වෙබ් අඩවියේ පොස්පරීකරණය වැළැක්වීම මගින් ප්‍රෝටීන් අස්ථාවර කළ යුතු යැයි අපි පුරෝකථනය කළෙමු. WT හෝ S27A විකෘති ΔFosB මගින් අස්ථිර ලෙස ප්‍රකාශ කරන හෙලා සෛල සමඟ සිදු කරන ලද ස්පන්දන-හඹා යාමේ පරීක්ෂණ මගින් අනාවැකි පළ කළ පරිදි, S27A විකෘතියේ ප්‍රති resulted ලයක් ලෙස ΔFosB හි පරිහානියේ වේගය සැලකිය යුතු ලෙස වැඩි වූ අතර ප්‍රෝටීන වල අර්ධ ආයු කාලය සමගාමීව අඩු විය. (රූපය. 6A). මෙම නියාමන යාන්ත්‍රණය වඩාත් නියුරෝන වැනි PC12 සෛල රේඛාවේ ද සිදුවන්නේ දැයි අපි පසුව සොයා බැලුවෙමු. මෙම අත්හදා බැලීම්වලින් හෙළි වූයේ, අපි හෙලා සෛල තුළ නිරීක්ෂණය කළ පරිදි, S27A ලක්ෂ්‍ය විකෘතිය PC12 සෛලවල ΔFosB හි අර්ධ ආයු කාලය නාටකාකාර ලෙස අඩුවීමට හේතු වන බවයි (∼11 සිට ∼4 h දක්වා) (රූපය. 6B). මෙම අස්ථායීකරනය CK2 නිෂේධනය හෝ තට්ටු කිරීම නිසා ඇති වූ තත්වයට සමාන වේ (රූපය. 4) Ser2 හි CK27- මැදිහත් වූ පොස්පරීකරණය ΔFosB හි ස්ථායිතාව නියාමනය කරයි යන අදහස සඳහා තවදුරටත් සහාය සපයයි. ΔFosB ප්‍රෝටීන් පිරිවැටුම මත Ser27 ෆොස්ෆරයිලේෂන් නියාමන කාර්යභාරය සඳහා අමතර සාක්ෂි ෆොස්ෆොමිමිටික් Ser27 to Asp mutation (S27D) භාවිතා කර ලබා ගන්නා ලදී. S27D විකෘතිය ෆොස්ෆොමිමිටික් ලෙස සලකනු ලැබේ, මන්ද එය විශාල negative ණ ආරෝපිත (කාබොක්සයිල්) කාණ්ඩයක් ඇමයිනෝ අම්ලය 27 හි තැන්පත් කරන අතර එමඟින් අර්ධ වශයෙන් සර්ක්ස්නූඑම්එක්ස් හි පොස්පරීකරණය අනුකරණය කරයි. හි පෙන්වා ඇති පරිදි රූපය 6C, S27D විකෘතිය S27A විකෘතියේ ප්‍රතිවිරුද්ධ බලපෑමට හේතු වූ අතර එහි ප්‍රති W ලයක් ලෙස WT ප්‍රෝටීන වලට වඩා සැලකිය යුතු ලෙස ස්ථායී ප්‍රෝටීනයක් ඇති විය. CK2 සක්‍රිය කිරීමෙන් පසු ලබාගත් බලපෑමට සමානව (රූපය. 4D), S27D විකෘතියේ ප්‍රති ulted ලයක් ලෙස සමුච්චය වී ඇති අතර හඹා යාමේ පළමු පැය තුළ osFosB මට්ටම ඉහළ ගියේය.

විශාල අනුවාදය බලන්න:

PowerPoint Slide ලෙස බාගන්න

රූපය 6.

Ser27 හි පොස්පරීකරණය ΔFosB හි ස්ථායිතාව නියාමනය කරයි. A, C, ΔFosB හි පිරිවැටුම් අනුපාතය මත Ser27 ෆොස්ෆරයිලේෂණයේ බලපෑම පෙන්වන ස්පන්දන-ලුහුබැඳීමේ විශ්ලේෂණය. වල්-වර්ගය ΔFosB (WT) හි පිරිහීමේ පැතිකඩ සහ ඇස්තමේන්තුගත අර්ධ ආයු කාලය, Ser27 සිට Ala විකෘති (S27A) සහ ෆොස්ෆොමිමිටික් Ser27 සිට Asp විකෘති (S27D) දක්වා ඇත. එකම සොයාගැනීම් හෙලා සෛල වලින් ලබා ගන්නා ලදි (A) සහ PC12 සෛල (B, C).

Ser27 ෆොස්ෆරයිලේෂන් ΔFosB එහි ප්‍රෝටිසෝමල් පිරිහීම වැළැක්වීම මගින් ස්ථාවර කරයි

Ser27 හි පොස්පරීකරණය ΔFosB ස්ථාවර කරන යාන්ත්‍රණය පැහැදිලි කිරීම ආරම්භ කිරීම සඳහා, අපි ප්‍රෝටිසෝම් නිෂේධක MG132 (Palombella et al., 1994; Tsubuki et al., 1996) සහ ඉෙපොක්සොමිසින් (හනාඩා සහ වෙනත්., 1992; කිම් සහ අල්., 1999) WT සහ S27A විකෘති ΔFosB හි පිරිහීමේ අනුපාතය වෙනස් කිරීමට. ස්පන්දන-හඹා යාමේ අත්හදා බැලීම් සිදු කරන ලද්දේ ඩබ්ලිව්සී හෝ එස්එක්ස්එන්එම්එක්ස් A ෆොස්බී ප්‍රකාශ කරන ප්‍රති සංයෝජක එච්එස්වී ආසාදිත පීසීඑක්ස්එන්එම්එක්ස් සෛල භාවිතයෙන් වන අතර ඩීඑම්එස්ඕ හෝ ප්‍රෝටිසෝම් නිෂේධක දෙකෙන් එකක් සමඟ ප්‍රතිකාර කරනු ලැබේ. මෙම අත්හදා බැලීම්වලින් හෙළි වූයේ ඩබ්ලිව්ටී ප්‍රෝටීන වල පිරිහීමේ වේගය ප්‍රෝටිසෝම් නිෂේධක දෙකෙන් එකක් හෝ පැවතීමට සාපේක්ෂව සංවේදී නොවන බවයි (රූපය. 7A), S27A විකෘති මෙම drugs ෂධ වලට සංවේදී වේ (රූපය. 7B). WT ප්‍රෝටීන මෙන් නොව S27A විකෘතිය ප්‍රෝටිසෝම පිරිහීමේ ඉලක්කයක් බව මෙයින් ඇඟවෙයි. ඇත්ත වශයෙන්ම, MG132 හෝ එපොක්සොමිසින් සමඟ සෛල වලට ප්‍රතිකාර කිරීම ΔFosB හි පරිහානියේ අනුපාතය මත S27A විකෘතියේ බලපෑම සම්පූර්ණයෙන්ම ආපසු හැරවිය. S27A විකෘති වල අර්ධ ආයු කාලය ∼4 සිට ∼9 h දක්වා MG132 සහ to ඉපොක්සොමිසින් සඳහා 12 h (රූපය. 7B). මෙම සොයාගැනීම්වලින් පෙනී යන්නේ Ser27 හි osFosB හි පොස්පරීකරණය ප්‍රෝටීන ප්‍රෝටෝසෝම පිරිහීමෙන් ආරක්ෂා කරන අතර එම නිසා එහි අසාමාන්‍ය ස්ථායිතාව සඳහා අත්‍යවශ්‍ය බවයි.

විශාල අනුවාදය බලන්න:

PowerPoint Slide ලෙස බාගන්න

රූපය 7.

Ser27 හි පොස්පරීකරණය ΔFosB හි ප්‍රෝටිසෝම පිරිහීම වැළැක්වීම මගින් ස්ථාවර කරයි. A, B, HSV- ආසාදිත PC12 සෛල සමඟ ස්පන්දන-හඹා යාමේ විශ්ලේෂණය පිරිහීමේ පැතිකඩ පෙන්වන අතර වල් ආකාරයේ ΔFosB (A) හෝ S27A osFosB (B) ප්‍රෝටිසෝම් නිෂේධක දෙකක් [MG132 සහ epoxomicin (Epoxo)] නොමැති විට හෝ නොතිබීම. වල් ආකාරයේ ΔFosB හි පිරිවැටුමට කිසිදු drug ෂධයක් සැලකිය යුතු බලපෑමක් නොකරන බව සලකන්න. නමුත් ප්‍රෝටිසෝම් නිෂේධනයක් සහිත සෛල වලට ප්‍රතිකාර කිරීමෙන් S27A osFosB ස්ථායී විය. C, දිගු කාලීන මොළයේ ප්ලාස්ටික් බව සඳහා මැදිහත් වීමට ΔFosB ට ඇති හැකියාව තුළ සර්ක්ස්නූම්ස් ෆොස්ෆරයිලේෂනයේ භූමිකාව සඳහා ආදර්ශයකි. ප්‍රේරණය වූ පසු, S27 හි CK2- මැදිහත් වූ පොස්පරීකරණය මගින් ΔFosB හි කොටසක් මොළයේ ස්ථාවර වේ. මෙහි ප්‍රති results ලය වන්නේ එහි සමුච්චය වීමයි. එහි ප්‍රති results ලයක් ලෙස ජාන ප්‍රකාශනයේ දිගුකාලීන වෙනස්කම් සිදු වේ. ජාන ප්‍රකාශනයේ මෙම ස්ථායී වෙනස්කම් ස්ථාවර චර්යාත්මක අනුවර්තනයන්ට දායක වේ. අනෙක් අතට, සෙර් / ත්‍රි පොස්පේටස් පීපීඑක්ස්එන්එම්එක්ස් සහ / හෝ පීපීඑක්ස්එන්එම්එක්ස්ඒ විසින් එස්එක්ස්එන්එම්එක්ස් හි ඩෙෆොස්ෆරයිලේෂණය කිරීමෙන් ප්‍රෝටීන අස්ථාවර වන අතර එය ප්‍රෝටිසෝමල් යන්ත්‍ර මගින් සැකසෙනු ඇත.

පෙර කොටස ඊළඟ කොටස

සාකච්ඡා

වර්තමාන අධ්‍යයනයේ දී, අපි පෙන්වන්නේ cellFosB සෛල සංස්කෘතියේ ∼10 h හි අර්ධ ආයු කාලයක් ඇති අතර එමඟින් පූර්ණ-දිග FosB හා අනෙකුත් බොහෝ ප්‍රේරක පිටපත් කිරීමේ සාධක සමඟ සසඳන විට එය ස්ථායී වන අතර සෛල සංස්කෘතියේ අර්ධ ආයු කාලය කෙටි විය හැකිය මිනිත්තු කිහිපයක් ලෙස සහ කලාතුරකින් 3 h ඉක්මවයි (හැන් සහ අයිසන්මන්, 1984; Dobrazanski et al., 1991; රොබට්ස් සහ වයිට්ලව්, 1999; ෆෙරාරා et al., 2003; හිරාටා et al., 2004). ඊට අමතරව, osFosB මොළයේ පොස්පරීකරණය කර ඇති බවත් එහි පොස්පරීකරණය PP1 / PP2A inhibitor okadaic අම්ලයට සංවේදී බවත් අපට පෙනී යයි. අපගේ සෛල සංස්කෘතික අධ්‍යයනවලින් පෙන්නුම් කරන්නේ ΔFosB හි ස්ථායිතාව CK2 විසින් සංස්කරණය කර ඇති අතර ඉහළ CK2 ක්‍රියාකාරකම් ප්‍රෝටීන් ස්ථාවර කරන බවයි. අවසාන වශයෙන්, අපගේ සොයාගැනීම්වලින් පෙනී යන්නේ ඉහළ සංරක්‍ෂිත N ටර්මිනස් සෙරීන් (S2) මත CK27 ෆොස්ෆරයිලෙට්ස් osFosB සහ S27 හි පොස්පරීකරණය මගින් ප්‍රෝටෝසෝම පිරිහීමෙන් fromFosB ආරක්ෂා කරන බවයි. එබැවින් අපි යෝජනා කරන්නේ ආකෘතියක් SKNNX විසින් S27 හි ΔFosB පොස්පරීකරණය කිරීම ΔFosB හි පිරිවැටුමේ තීරණාත්මක නියාමන යාන්ත්‍රණයකි.රූපය. 7C). PhospFosB හි එවැනි පොස්පරීකරණය-මැදිහත් ස්ථායීකරණය ක්‍රියාකාරී ලෙස වැදගත් වේ, මන්දයත් විශේෂයෙන් මොළයේ කලාපවල osFosB මට්ටම ඉහළ යාම බොහෝ ස්නායු ජාන සෘජුවම නියාමනය කරන බව පෙන්වා දී ඇත. ඉතින් සහ ස්නායු මනෝචිකිත්සක ආබාධ කිහිපයක සත්ව ආකෘතිවල ප්‍රබල චර්යාත්මක බලපෑම් ඇති කිරීම (හැඳින්වීම බලන්න).

පොස්පරීකරණය යනු CREB (cAMP ප්‍රතිචාර මූලද්‍රව්‍ය බන්ධන ප්‍රෝටීන්) වැනි ඇතැම් පිටපත් කිරීමේ සාධකවල පිටපත් කිරීමේ ක්‍රියාකාරකම් නියාමනය කිරීමේ වේගවත් හා ආපසු හැරවිය හැකි ක්‍රමයක් වුවද (බොහ්මන්, 1990), පිටපත් කිරීමේ සාධක පිරිහීම පාලනය කිරීම ඊටත් වඩා බලවත් (අඩු පහසුවෙන් ආපසු හැරවිය හැකි) නියාමනයක් සපයයි (ඩෙස්ටෙරෝ සහ වෙනත් අය, 2000). ඒවායේ පිරිහීමේ මට්ටමින් ක්‍රියාකාරී ක්‍රියාකාරකම් නියාමනය කරනු ලබන පිටපත් කිරීමේ සාධක අතර NFκB (ඩෙස්ටෙරෝ සහ වෙනත් අය, 2000), සී-මයික් (Sears et al., 1999), සහ සී-ෆොස් (ෆෙරාරා et al., 2003), වෙනත් අය අතර. බොහෝ අවස්ථාවන්හිදී, සී-ෆොස් සඳහා පෙන්වා ඇති පරිදි, පොස්පරීකරණය යනු පිටපත් කිරීමේ සාධකයක ස්ථායිතාවයේ ප්‍රධාන නියාමකයෙකි (ඔකාසාකි සහ සාගාටා, 1995; Tsurumi et al., 1995), ෆොස් ආශ්‍රිත ප්‍රතිදේහජනක- 1 (Fra-1) (වියාල් සහ මාෂල්, 2003), Fra-2 (Manabe et al., 2001), සී-ජුන් (Fuchs et al., 1996), JunB (Fuchs et al., 1997), ATF2 (Fuchs et al., 2000), සහ p53 (බුෂ්මන් සහ වෙනත් අය, 2001). මේ අනුව අපගේ අධ්‍යයනයන් එහි පිටපත් කිරීමේ සාධක ලැයිස්තුවට osFosB එකතු කරන අතර එහි ක්‍රියාකාරීත්වය එහි පොස්පරීකරණය මත රඳා පවතින ස්ථායිතාව මගින් නියාමනය කරනු ලැබේ.

සී.ලිච්ෆීල්ඩ්, 2003; Unger et al., 2004), සෛලීය ආතති ප්‍රතිචාර (Yanagawa et al., 1997; කැටෝ et al., 2003), සහ ඩීඑන්ඒ අළුත්වැඩියා කිරීම සහ ක්‍රෝමටින් ප්‍රතිනිර්මාණය කිරීම (බාර්ස් සහ වෙනත්., 2003; Krohn et al., 2003). CK2 හි ස්ථිතික උපස්ථර වලින් තුනෙන් එකකට වඩා වැඩි ප්‍රමාණයක් ජාන ප්‍රකාශනය නියාමනය කිරීමට සම්බන්ධ ප්‍රෝටීන වේ (මෙග්ජියෝ සහ පින්නා, 2003). ඇත්ත වශයෙන්ම, CK2 ප්‍රමුඛ න්‍යෂ්ටික කයිනස් එකක් බව පෙන්වා දී ඇත (Krek et al., 1992) (සමාලෝචනය සඳහා, බලන්න යූ et al., 2001) සහ පිටපත් කිරීමේ සාධක කිහිපයක bZIP වසම් සමඟ අන්තර් ක්‍රියා කිරීමට (යමගුචි et al., 1998). CK2- මැදිහත් වූ පොස්පරීකරණය IkB () ඇතුළු බොහෝ ප්‍රෝටීන වල පිරිහීම (වැඩි දියුණු කිරීම හෝ අඩු කිරීම) වෙනස් කරන බව පෙන්වා දී ඇත.ෂ්වාස් සහ වෙනත් අය, 1996), පීටීඑන් (ටොරස් සහ පුලිඩෝ, 2001), කාච කොනෙක්සින් (යින් සහ අල්., 2000), ක්‍රෝමටින් ආශ්‍රිත ප්‍රෝටීන් HMG1 (විස්නියෙව්ස්කි සහ වෙනත් අය, 1999), සහ HMGB වැනි පිටපත් කිරීමේ සාධක කිහිපයක් (Stemmer et al., 2002), Myf-5 (ශීත et තුව සහ වෙනත්., 1997), සහ සී-මයික් (චන්නවජාල සහ සෙල්ඩින්, 2002). CK2 මොළයේ බහුලයි (ඇල්කසාර් සහ වෙනත්, 1988; ජිරෝල්ට් සහ වෙනත් අය, 1990), සහ එහි ක්‍රියාකාරිත්වය ස්නායුක පැවැත්ම ඇතුළුව මොළයේ ක්‍රියාකාරිත්වයේ බොහෝ අංශවලට සම්බන්ධ කර ඇත (බොහින්ග් සහ වෙනත් අය, 2003), අවකලනය (Nuthall et al., 2004), අයන නාලිකා ශ්‍රිතය (ජෝන්ස් සහ යකෙල්, 2003; Bildl et al., 2004), සහ දිගුකාලීන විභවතාව සහ නියුරෝන ප්ලාස්ටික් බව (Diaz-Nido et al., 1992; ලිබර්මන් සහ මෝඩි, 1999; රේකාර්ඩ් සහ වෙනත් අය, 2003).

ස්නායුක ක්‍රියාකාරිත්වය නියාමනය කිරීමේදී CK2 හි කාර්යභාරය පිළිබඳ මෙම වර්ධනය වන සාක්ෂි තිබියදීත්, එහි ක්‍රියාකාරිත්වය පාලනය කරන්නේ කුමක් ද යන්න ගැන දන්නේ අල්ප වශයෙනි. CK2 ව්‍යුහාත්මකව ක්‍රියාකාරී යැයි සැලකේ, නිශ්චිත උපස්ථර වලට පොස්පරීකරණය කිරීමේ හැකියාව නියාමනය කිරීම එහි අන්තර් සෛලීය ප්‍රාදේශීයකරණයේ වෙනස්වීම් මත රඳා පවතී (උදා: සයිටොසෝල් එදිරිව න්යෂ්ටිය) (අහමඩ් සහ තව්ෆික්, 1994; යූ et al., 1999). නිදන්ගත උත්තේජනයෙන් පසු මොළයේ osFosB සමුච්චය කිරීම සඳහා අවශ්‍ය සං sign ා මොනවාද යන්න පිළිබඳව මෙම තොරතුරු වැදගත් ප්‍රශ්නයක් මතු කරයි (රූපය. 7C). එක් අවශ්‍යතාවයක් වන්නේ නැවත නැවත සක්‍රීය කිරීමයි fosB osFosB mRNA හි ජානය සහ ප්‍රේරණය (චෙන් සහ අල්., 1995). අපගේ දත්ත වලට අනුව CFosB හි CK2 ෆොස්ෆරයිලේෂණය එහි ස්ථායිතාව සඳහා ඉතා වැදගත් වන අතර, ජාන ප්‍රකාශනය මත osFosB හි දිගුකාලීන බලපෑම් සඳහා දෙවන සං signal ාවක් අවශ්‍ය විය හැකි බව යෝජනා කරයි, එනම් CK2 විසින් ප්‍රෝටීන වල පොස්පරීකරණය උත්තේජනය කරන සං signal ාවක්. කිසියම් නොදන්නා යාන්ත්‍රණයක් මගින් CK2 සක්‍රිය කිරීම හෝ එය න්‍යෂ්ටියට මාරුවීම මෙයට ඇතුළත් විය හැකිය. විකල්පයක් ලෙස, ΔFosB හි CK2 ෆොස්ෆරයිලේෂන් ව්‍යුහාත්මක විය හැකිය, එනම් එක් එක් උත්තේජකවලට ප්‍රතිචාරයක් ලෙස osFosB ප්‍රෝටීන් පරිවර්තනය කර ඇති බැවින්, එයින් කොටසක් පොස්පරීකරණය වී ස්ථායී වන අතර එමඟින් නැවත නැවත උත්තේජනය කිරීමෙන් බලපෑමට ලක් වූ නියුරෝන වල ඉහළ මට්ටම්වලට එකතු වේ.

අපගේ සොයාගැනීම්වලින් පෙනී යන්නේ KFosB පොස්පරීකරණය සඳහා වගකිව යුතු එකම කයිනාස් සහ වෙබ් අඩවිය CK2 සහ S27 නොවන බවයි, මන්ද CK2 නිෂේධනයට හෝ S27A විකෘතියට ΔFosB පොස්පරීකරණය සම්පූර්ණයෙන්ම වැළැක්වීමට නොහැකි වූ බැවිනි. ඒ හා සමානවම, S27A විකෘතියේ ප්‍රති results ලය වන්නේ 30% ෆොස්ෆෝ- osFosB අඩු වීමකි. S27 යනු ප්‍රෝටීන වල ප්‍රධාන පොස්පරීකරණය කරන ස්ථානයක් බව තර්ක කරයි. කෙසේවෙතත්, අපි osFosB හි වෙනත් පුටින්ටිව් කයිනස් සහ පොස්පරීකරණය අඩවි විමර්ශනය කරන්නෙමු. අවසානයේදී, මොළයේ ΔFosB හි S27 සහ වෙනත් ඕනෑම පොස්පරීකරණය අඩවි වල පොස්පරීකරණය විශ්ලේෂණය කිරීම ද වැදගත් වනු ඇත. ඉතින් විවිධ වර්ගයේ නිදන්ගත උත්තේජනයන්ගෙන් පසුව, නිදසුනක් ලෙස, ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂමිතික හෝ පොස්පොස්පෙෆික් ප්‍රතිදේහ භාවිතා කිරීම.

ඉහත සඳහන් කළ පරිදි, osFosB හි S27 පරිණාමය පුරා සහ අනෙකුත් ෆොස් පවුලේ ප්‍රෝටීන අතර ඉතා ඉහළින් සංරක්ෂණය කර ඇත. කෙසේ වෙතත්, CK2 සඳහා සම්මුති අඩවිය නොවේ: පෙන්වා ඇති පරිදි රූපය 5B, CK2 ෆොස්ෆරයිලේෂන්හි ප්‍රධාන නිර්ණායකයක් වන + 3 හි ආම්ලික අපද්‍රව්‍යයක් ඇත්තේ සී-ෆොස් හෝ ෆ්‍රා-එක්ස්එන්එම්එක්ස් නොව FosB / osFosB (සහ සීබ්‍රාෆිෂ් සීනොලොග්) පමණි.මරීන් සහ අල්., 1986; මෙග්ජියෝ සහ වෙනත්., 1994). මේ අනුව, S2 හි CK27 ෆොස්ෆරයිලේෂන් හිඟකම අනෙකුත් ෆොස් පවුලේ ප්‍රෝටීන ΔFosB තරම් ස්ථායී නොවීමට හේතුව පැහැදිලි කරයි. කෙසේ වෙතත්, ΔFosB හා සමාන CK2 සම්මුති අඩවියක් ඇති පූර්ණ-දිග FosB ඒ හා සමානව ස්ථාවර නොවන්නේ මන්දැයි මෙයින් පැහැදිලි නොවේ. මෙම සංරක්‍ෂිත අපද්‍රව්‍ය මත CK2 විසින් පූර්ණ-දිග FosB පොස්පරීකරණය කර ඇත්දැයි අපි නොදනිමු. FosB හි එකම වාර්තා (ස්කිනර් සහ වෙනත් අය, 1997) සහ සී-ෆොස් (ඔකාසාකි සහ සාගාටා, 1995; චෙන් සහ අල්., 1996phospFosB හි නොමැති මෙම ප්‍රෝටීන වල සී-පර්යන්ත කලාපයේ අඩවි පොස්පරීකරණය මගින් විස්තර කෙරේ. CK2 විසින් පූර්ණ-දිග FosB සහ අනෙකුත් ෆොස් පවුලේ ප්‍රෝටීන වල විභව පොස්පරීකරණය සඳහා සෘජු පරීක්ෂණයක් අවශ්‍ය වේ. කෙසේ වෙතත්, ඒවා පොස්පරීකරණය කළද, අනෙක් ෆොස් පවුලේ ප්‍රෝටීන සී සී පර්යන්තයේ වේගවත් පිරිහීම සඳහා ප්‍රෝටීන ඉලක්ක කරන මෝස්තර අඩංගු බව දන්නා කරුණකි (Papavassiliou et al., 1992; Jariel-Encontre et al., 1997; Acquaviva et al., 2002). නිදසුනක් ලෙස, සියලුම ෆොස් පවුලේ ප්‍රෝටීන වල සී පර්යන්තයේ ∼21 අපද්‍රව්‍ය විශාල ප්‍රමාණයක් පවතින නමුත් ΔFosB හි නොමැති විට එය සී-ෆොස් සඳහා අස්ථාවර කිරීමේ වසමක් ලෙස ක්‍රියා කරයි (Acquaviva et al., 2001). මෙම අනුක්‍රමය ඒ හා සමානව පූර්ණ-දිග FosB අස්ථාවර කරන බව අපට පෙනී ගියේය (Carle et al., 2004), domainFosB හි මෙම වසම නොමැතිකම එහි ස්ථායීතාවයට සම්පූර්ණයෙන්ම හේතු නොවේ. ඒ වෙනුවට, මෙම සී ටර්මිනස් වසම හා සර්ක්ස්නූම්ස් ෆොස්ෆරයිලේෂන් නොමැතිවීම සංයෝජනය FosB සහ FosB අතර ස්ථායිතාවයේ දළ වශයෙන් පස් ගුණයක වෙනසක් සඳහා පූර්ණ වශයෙන් හේතු වන බව පෙනේ.

ෆොස් පවුලේ ප්‍රෝටීන වල පිරිහීම සංකීර්ණ වන අතර එය සම්පූර්ණයෙන් වටහාගෙන නැතත්, ප්‍රෝටිසෝමල් පිරිහීම ඊට සම්බන්ධ ප්‍රධාන මාර්ගය බව පෙනේ (සැල්වට් සහ වෙනත් අය, 1999; Acquaviva et al., 2002; ෆෙරාරා et al., 2003). මෙහි ඉදිරිපත් කර ඇති දත්ත, ප්‍රෝටිසෝමල් නිෂේධකයන් ΔFosB පරිහානියේ වේගය සැලකිය යුතු ලෙස වෙනස් නොකරන අතර, අනෙකුත් ෆොස් පවුලේ ප්‍රෝටීන මෙන් නොව osFosB 26S ප්‍රෝටිසෝම් මගහරින අතර එය ස්ථායීකරණයේ ප්‍රධාන කාර්යභාරයක් ඉටු කරයි. එබැවින් ප්‍රධාන සාධක දෙකක සංයෝජනයට osFosB හි වැඩි දියුණු කළ ස්ථායිතාව ආරෝපණය කළ හැකි යෝජනා ක්‍රමයක් අපි යෝජනා කරමු: (1) සී-පර්යන්ත අස්ථාවර කිරීමේ වසමක් නොමැති වීම සහ (2) CK27 විසින් S2 හි පොස්පරීකරණය.

සාරාංශයක් ලෙස, වර්තමාන අධ්‍යයනය ක්ෂණික මුල් ජානයේ නිෂ්පාදනයක් වන osFosB ඇයි යන්න පිළිබඳව යාන්ත්‍රික අවබෝධයක් ලබා දෙයි fosB, අනෙක් සියලුම ෆොස් පවුලේ සාමාජිකයන් මෙන් නොව, සාපේක්ෂව දිගු කල් පවතින ප්‍රෝටීනයකි. අනෙකුත් ෆොස් පවුලේ ප්‍රෝටීන වේගවත් නමුත් අස්ථිර උත්තේජක-පිටපත් කිරීමේ සම්බන්ධතාවයට මැදිහත් වේ යැයි සිතුවද (මෝගන් සහ කුරන්, 1995), osFosB හි සාපේක්ෂ ස්ථායිතාව මගින් නිදන්ගත උත්තේජනය මගින් ඇතිවන දිගුකාලීන පිටපත් කිරීමේ වෙනස්කම් වලට මැදිහත් වීමේ හැකියාව ලබා දෙයි. ΔFosB මොළයේ තිරසාර අණුක ස්විචයක් ලෙස ක්‍රියා කරන අතර උග්‍ර ප්‍රතිචාර ක්‍රමයෙන් නිදන්ගත අනුවර්තනයන් බවට පරිවර්තනය කරයි. XFosB හි ස්ථායිතාව සඳහා කේන්ද්‍රීය යාන්ත්‍රණයක් ලෙස Ser27 ෆොස්ෆරයිලේෂන් හදුනා ගැනීම osFosB හි ක්‍රියාකාරිත්වය නියාමනය කිරීමේ මාධ්‍යයන් සංවර්ධනය කිරීම සඳහා නව මංපෙත් විවර කරයි.

පෙර කොටස ඊළඟ කොටස

පාද සටහන්

නොවැම්බර් 21 ලැබුණු දිනය, 2005.
සංශෝධනය පෙබරවාරි 21, 2006.
අප්රේල් 2, 2006 භාර ගන්නා ලදි.

මෙම කාර්යයට භින්නෝන්මාදය සහ අවපාතය පිළිබඳ පර්යේෂණ සඳහා වූ ජාතික සන්ධානයක්, පී.ජී.යූ. වෙත ජාතික මත්ද්‍රව්‍ය නිවාරණය පිළිබඳ ජාතික ආයතනයක් (NIDA) ජාතික පර්යේෂණ සේවා සම්මානය සහ ජාතික මානසික සෞඛ්‍ය ආයතනයෙන් සහ NIDA වෙතින් ඊ.ජේ.එන්. ආචාර්ය ජේම්ස් බිබ්ට උදව් කිරීම ගැන ස්තූතියි කෘතිම දී පොස්පරීකරණය තක්සේරු කිරීම, පරිවෘත්තීය ලේබල් කිරීම සඳහා භාවිතා කරන මොළයේ පෙති සැකසීම සඳහා ආචාර්ය මින්ග්-හූ හැන් සහ නැවත එකතු කරන ලද එච්එස්වී ඇසුරුම්කරණය සඳහා වෛද්‍ය රේචල් නෙව්ගේ උදව් සඳහා.
ජී. රුඩෙන්කෝගේ වර්තමාන ලිපිනය: ජීවිත විද්‍යා ආයතනය සහ c ෂධ විද්‍යා දෙපාර්තමේන්තුව, මිචිගන් විශ්ව විද්‍යාලය, 210 වොෂ්ටෙනෝ මාවත # 3163 ඒ, Ar න් ආබර්, එම්අයි 48109-2216.
ලිපි හුවමාරුව එරික් ජේ. නෙස්ලර්, 5323 හැරී හයින්ස් බොලිවාර්ඩ්, ඩලස්, TX 75390-9070 වෙත යොමු කළ යුතුය. විද්යුත් තැපෑල: [විද්‍යුත් ආරක්‍ෂිත]

පෙර කොටස

ආශ්රිත

ඇක්වාවිවා සී, බ්‍රොක්ලි එෆ්, ෆෙරාරා පී, බොසිස් ජී, සැල්වට් සී, ජැරියෙල්-එන්කොන්ට්‍රේ අයි, පීචැසික් එම් (2001) ජී (0) සිට එස්-අදියර සංක්‍රාන්තිය අතරතුර සී-ෆොස් ප්‍රෝටෝ-ඔන්කොප්‍රෝටීන් හි වේගවත් ප්‍රෝටිසෝම පිරිහීම පාලනය කිරීමට සම්බන්ධ සී-ටර්මිනල් ට්‍රයිපෙප්ටයිඩ මෝටරයක් හඳුනා ගැනීම. oncogene 20:7563-7572.

වියුක්ත

හැදින්වීම

ද්රව්ය සහ ක්රම

ක්ෂීරපායී සෛල රේඛා සහ ඩීඑන්ඒ සාදයි.

ස්පන්දන-හඹා යාමේ අත්හදා බැලීම්.

සතුන් සහ නිදන්ගත විද්‍යුත් විච්ඡේදක අල්ලා ගැනීමේ ප්‍රතිකාරය.

32 පී පරිවෘත්තීය ලේබල් කිරීම.

රසායනික ද්‍රව්‍ය හා සෛලීය සංස්කෘතික ප්‍රතිකාර.

OsFosB immunoprecipitation, immunoblotting සහ autoradiography.

කෘමීන්ගේ සෛල වලින් osFosB නැවත සංයෝජනය කිරීම.

එන්නත් වේ පොස්පරීකරණය අධ්‍යයනය.

ද්විමාන ෆොස්ෆොපෙප්ටයිඩ් සිතියම සහ ෆොස්ෆොඇමිනෝ අම්ල විශ්ලේෂණය.

siRNA- ප්‍රේරිත CK2α තට්ටු කිරීම.

අඩවි-යොමු කරන ලද විකෘතිතා.

ජෛව තොරතුරු.

දත්ත ප්‍රමාණකරණය, ගණනය කිරීම් සහ සංඛ්‍යාලේඛන.

ප්රතිපල

OsFosB යනු අසාමාන්‍ය ලෙස ස්ථාවර පිටපත් කිරීමේ සාධකයකි

Os ෆොස්බී යනු මොළයේ ඇති පොස්පොප්‍රෝටීන් ය

CK2 නමුත් PKC හෝ CaMKII ෆොස්ෆරයිලට් notFosB නොවේ කෘතිම දී

CK2 අඛණ්ඩ සෛල තුළ osFosB හි පොස්පරීකරණය හා ස්ථායිතාව වෙනස් කරයි

Ser2 හි CK27 phosphorylates ΔFosB

Ser27 හි පොස්පරීකරණය ΔFosB හි ස්ථායිතාව නියාමනය කරයි

Ser27 ෆොස්ෆරයිලේෂන් ΔFosB එහි ප්‍රෝටිසෝමල් පිරිහීම වැළැක්වීම මගින් ස්ථාවර කරයි

සාකච්ඡා

පාද සටහන්

ආශ්රිත

මෙම ලිපිය උපුටා දක්වයි

ඉක්මන් සබඳතා

³² පී පරිවෘත්තීය ලේබල් කිරීම.