Keçirilən nöronal inhibisyon həssaslaşdırmada dolayı və birbaşa yolların qarşılıqlı rollarını göstərir (2011)

mücərrəd

Narkomaniyanın həddən artıq mənfi nəticələrinə baxmayaraq, psixostimulyator istifadəsi və sui-istifadə halları üstünlük təşkil edir. Dərmanların müntəzəm istifadəsinə və nəticədə məcburi, vərdişli davranışa və inhibitor idarəetmənin itirilməsinə qədər irəliləməsi diskret neyrosirkulyasiyada bir sıra molekulyar uyğunlaşmaları əhatə edir.^1,2,3. Striatum bağımlılığı vasitəçilik edən əsas prosesləri meydana gətirmək düşündüyü bir çox davranış və neyrobioloji uyğunlaşma üçün əsas bir yer olaraq təyin olundu.^1,2,3. Striatumdakı neyronların əksəriyyəti (~ 95%) GABAergic orta spiny proyeksiya neyronlarıdır (MSNs). tşapka neyropeptid ifadələrində fərqlənir və iki əsas efferent yol meydana gətirir⁴.

• Striatopallidal MSNlər enkefalin (ENK) ehtiva edir və dolayı yol təşkil edir
• halbuki striatoniqral MSN-lərdə dynorfin (DYN) və P maddəsi var və birbaşa yol təşkil edir..

Bir çox konseptual modellər, bu MSN-lərin populyasiyalarının həm mexaniki, həm də funksional olaraq bir-birinə qarşı olduğunu fərz edirlər^5,6. Bununla birlikdə, davranışın idarə edilməsində onların diferensial rolunu dəstəkləyəcək qədər az empirik dəlil mövcuddur, çünki bu hüceyrə populyasiyaları fiziki cəhətdən bir-birinə qarışmış və seçmə manipulyasiyasını texniki cəhətdən əlçatmaz edir.

Bu striatal hüceyrə populyasiyasının təkrarlanan sui-istifadə hallarına məruz qaldıqdan sonra baş verən davranışların inkişafındakı rolunu araşdırmaq üçün iki yeni strategiyanı birləşdirdik: ENR və ya DYN gen təbliğatçılarını striatopallidal və ya striatonigral neyronlara qarşı transgene ifadəsini hədəfləyən viral vektorlar. müvafiq olaraq və mühəndis GPCR (G.)_{i / o}Müslüman insan muscarinik M₄ DREADD; Dizayner dərmanı tərəfindən aktivləşdirilmiş dizayner reseptoru; hM₄D)⁷ başqa bir farmakoloji olaraq təsirsiz bir ligand, clozapineN-oksid^8,9 (CNO; Şəkil 1a, h). Mədəni neyronlarda ifadə edildikdən sonra CNO rəhbərliyi G-ni stimullaşdırır_{i / o}-cox hM₄D reseptorları beləliklə daxili rektifikasiya edən kalium 3 (Kir3) kanallarını aktivləşdirir və nəticədə membran hiperpolarizasiyası və keçici neyron susdurulmasına səbəb olur⁹.

  

Şəkil 1

Striatal hüceyrə siqnalının müvəqqəti və hədəf alınması. (a, h) P. Amplikon xəritələriENK-hM₄D/pENK-GFP (a) və sDYN-hM₄D/pDYN-GFP (h) vektorları hədəfləmək. (b, i) Konfokal mikroskopiya göstərdi ki, sENK-hM₄D reseptorları seçilmiş şəkildə striatopallidal şəklində ifadə edildi ...

Viral vektorların hüceyrə fenotipinin spesifikliyini yoxlamaq üçün, virusların dorsal striatum infuziyasından sonra ikili etiketli immunofluoresans mikroskopiyasından istifadə etdik (Əlavə Şəkil 1) hemagglutinin etiketli hM olduğunu ifadə edənlər₄D reseptorları ya ENK promouterinin nəzarəti altındadırENK-hM₄D) və ya DYN təbliğatçısı (səhDYN-hM₄D). Tapdıq ki, sENK-hM₄D İfadə əsasən ENK tərkibli MSN-lərdə idi (90% hemagglutinin hüceyrələri ENN +, 85 94'dan; 6% hemagglutinin hüceyrələri PN, 4 hüceyrələrdən 70 maddə idi; Şəkil 1b) halbuki səhDYN-hM₄D İfadə əsasən maddə P tərkibli MSN-lərdə idi (95% hemagglutinin hüceyrələri maddə P +, 109 hüceyrələrdən 115 çıxdı; 5% hemagglutinin hüceyrələri ENK +, 5 hüceyrələrdən 97 idi; Şəkil 1i). Bənzər nəticələr yaşıl flüoresan zülalını ifadə edən təbliğatçı spesifik virusların infuziyasından sonra əldə edildi (sENK-GFP və pDYN-GFP; ƏlavəFigs. 2a və 3a).

Striatopallidal MSN-lərin ilk növbədə globus pallidus xarici (GPe) və striatonigral MSN-lərin əsas əsas nigra pars reticulata (SNpr) layihəsini həyata keçirdiyini nəzərə alsaq, bu beyin bölgələrinə retrograd tracer Fluoro-Gold inyeksiyasından istifadə edərək bu ikili etiketli flüoresan immunohistokimiya tətbiq etdik. təsdiqləyin sENK və pDYN viruslar yoluxucu infeksiyaya yol açdı. Müşahidə etdik ki, sENK-GFP GPe daxil olan infrusiyalardan sonra striatal Fluoro-Gold ifadəsi ilə birlikdə lokallaşdırılmış hüceyrələr, lakin SNpr deyil (Əlavə Şəkil 2b) halbuki səhDYN-GFP SNpr-də infuziyalardan sonra striatal Fluoro-Gold ifadəsi ilə birlikdə lokallaşdırılmış hüceyrələr, lakin GPe deyil (Əlavə Şəkil 3b). Viral vektorların ifadəsi, viral infeksiya bölgəsindəki ENK + və ya maddə P + neyronlarının sayını dəyişmədi, bu təbliğatçılardan viral vasitəçi gen ötürülməsi üçün istifadənin endogen neyropeptid səviyyəsinə mane olmadığını irəli sürdü. Bütün bu nəticələr səhENK və pDYN viral vektorlar, müvafiq olaraq ayrılmış striatal hüceyrə populyasiyalarında genləri ifadə edirlər.

HM olsa da₄Digər nöronal tiplərin fəaliyyətini modulyasiya etmək üçün D reseptoruna əsaslanan üsullar nümayiş etdirilib⁹, onların striatal neyronlara təsir qabiliyyəti araşdırılmamışdır. Buna görə striatal orta spiny neyronları hM ilə yoluxdurduq₄Herpes simplex virusunun (HSV) təbliğatçısı nəzarəti altında olan D reseptorları, iki gün sonra dorsal striatumun koronal dilimlərini hazırladı və hM-nin necə olduğunu araşdırdı.₄D ifadə edən orta spiny striatal neyronlar CNO-ya cavab verir. CNO-nun (10 μM) yerli tətbiqi membran potensialının hiperpolarizasiyasına səbəb olduğunu (~ 7 mV), təməl membran potensialının −80 mV-ə uyğunlaşdırıldığını müşahidə etdik; Şəkil 1c) və CNO tətbiqindən sonra neyronların giriş müqavimətini azaltdı (Şəkil 1d, e), kalium keçiriciliyinin (yəni Kir3 vasitəçi cərəyan) CNO tərəfindən hM-də aktivləşdirilməsini təklif edir₄D reseptoru ifadə edən neyron. Bundan əlavə, CNO-nun perfuziyası hM-də ortaya çıxan fəaliyyət potensialının sayını əhəmiyyətli dərəcədə azaltdı₄D-ifadə neyron, lakin nəzarət hüceyrələrində deyil, bununla da virusa yoluxmuş neyronların funksional çıxışını maneə törədir hM ifadə₄D reseptorları yalnız giriş müqavimətini dəyişdirmədi (P = 0.84) və ya fəaliyyət potensial atəşi (P = 0.64). (Şəkil 1f, g). Birlikdə götürülərək bu məlumatlar hippokampal neyronlara bənzədiyini göstərir⁹, hM₄D / CNO əsaslı metod siçovul striatal neyronların həyəcanlılığını təsirli dərəcədə azalda bilər.

Konsepsiyanın əlavə sübutu olaraq hM-nin olub olmadığını sınaqdan keçirdik₄D reseptorları, sinir fəaliyyətinin davranışla əlaqəli stimul tərəfindən əvvəlcədən ortaya çıxdığı bir yaxşı qurulmuş bir dövrə içərisində neyrotransmaya mane olur. Buna görə, ventral tegramal bölgəyə (VTA) neyronları hM ilə yoluxdurduq₄D reseptorları dopamin neyronlarını güclü şəkildə ifadə edən bir HSV təbliğatçısının nəzarəti altında¹⁰, və qida mükafatının gözlənilməz təhvil verilməsindən sonra böyüyən nüvədəki dopamin ifrazatındakı dəyişiklikləri ölçmək üçün sürətli tarama tsiklik voltametriya istifadə edildi¹¹. CNO İdarəsi, nəqliyyat vasitəsi ilə müqayisədə nüvədəki böyüdülmüş qranuladan yaranan dopamin azadlığını əhəmiyyətli dərəcədə artırdı (Əlavə Şəkil 4). Nəhayət, striatumdakı xüsusi neyron hüceyrə tiplərinin aktivliyinin azaldığını yoxladıq vivo ilə amfetamin Fos ifadəsini stimullaşdırmaq qabiliyyətini dəyişdirə bilər. Amfetamin kimi psixostimulyatorlar c- nin güclü aktivatorlarıdırfos striatumda¹² və c- artacaqfos eksperimental şəraitimizdə həm striatoniqral, həm də striatopallidal neyronlarda¹³. Neyron fəaliyyətinin markeri olaraq istifadə edilməsinə əlavə olaraq, c- nin psixostimulyator induksiyasıfos psixomotor həssaslıq ilə əlaqəli sinir uyğunlaşmalarının başlanğıcında və saxlanmasında mühüm rol oynadığı düşünülür^1,14. CN-nin vasitəçiliyi ilə p-nin aktivləşdirildiyini gördükENK-hM₄D reseptorlar, striatumdakı amfetamin təsirli c-Fos hüceyrələrinin ümumi sayını əhəmiyyətli dərəcədə azaldıb (Şəkil 1k və Əlavə Şəkil 5a). Bu azalma həm hemagglutinin-müsbət nöronlarda (yəni hM ifadə edənlərdə) meydana gəldi₄D reseptorları) və hemagglutinin mənfi neyronları (yəni hM ifadə etməyənlər)₄D reseptorları; Şəkil 1l), hM arasında bir nöronal çarpaz danışıq effekti təklif edir₄D ifadəli neyron və infeksiyasız neyron. HM olduqda amfetaminlə hərəkətə gətirilən c-Fos hüceyrələrinin ümumi sayında və hemagglutinin-müsbət c-Fos hüceyrələrinin sayında da ciddi azalmalar müşahidə edildi.₄D reseptorları birbaşa yol neyronlarında aktiv oldu (Şəkil 1n, o və Əlavə Şəkil 5b). Əhəmiyyətli olanı, bu təsirlər, sadəcə, hər hansı birinin ifadəsindən bəri bir roman reseptorunun viral ifadəsi ilə meydana gəlmirENK-hM₄D və ya səhDYN-hM₄D CNO müalicəsi olmadıqda reseptorların, amfetaminlə hərəkətə gətirilən Fos hüceyrələrinin sayına təsir göstərmədi (Əlavə əncir. 6 və 7). Beləliklə, bu tapıntılar, CN-nin vasitəçiliyi ilə hM-nin aktivləşdirildiyini göstərir₄D reseptorları nörotransmitterin salınmasını azaltmaqla və hüceyrədaxili siqnalları azaltmaqla neyron fəaliyyətinin azalmasına da səbəb ola bilər.

Asılılıq gətirən dərmanlara təkrar məruz qalmaq davranış həssaslığının mütərəqqi və davamlı artmasına səbəb ola bilər. Vacibdir ki, həssaslıq insan narkomaniyasının inkişafında tətbiq olunan eyni sinir dövranlarından bəzilərini əhatə edir³. Burada yeni alətlərimizdən istifadə edərək striatal neyron fəaliyyətinin dövrə spesifik nəmlənməsinin amfetamin həssaslığının inkişafına təsirini araşdırırıq. Doğrudan və dolayı yol neyronlarının striatoniqral neyronların həssaslaşmanı təşviq etdiyi və striatopallidal neyronların həssaslığı və davranış aktivləşdirmə və inhibisyonda konseptual olaraq təklif etdikləri rollarına uyğunduqları bir-birlərinə zidd rol oynadığını fərz etdik.^5,6. Müvafiq olaraq, biokimyəvi olaraq azalmış striatopallidal neyronların neyron həyəcanlılığının, həssaslığın bir həddini artıran bir amfetamin təyin edən rejimin həssaslaşmasına səbəb olacağını və striatoniqral neyronların neyron həyəcanlılığının azalmasının normal sağlam həssaslığı təmin edən bir protokolda həssaslığın qarşısını alacağını yoxladıq.

İlk araşdırma üçün, GFP nəzarətindəki lokomotor həssaslığın həddindən artıq səviyyəsinə səbəb olan bir müalicə rejimindən istifadə etdik (dörd dərman ifrazı). Tutulma dövründən sonra həssaslığın davamlı olub olmadığını müəyyən etmək üçün neyronal fəaliyyətin CNO tərəfindən əlaqəli paslanmasının olmaması halında orta bir çətinlik amfetamin dozası (2 mq / kq) tətbiq edildi. P-nin CNO vasitəçiliyi ilə aktivləşdirilməsiENK-hM₄D Amfetamin müalicəsi zamanı reseptorlar amfetaminə olan kəskin lokomotor cavabını dəyişdirmədi (Şəkil 2a). Bununla birlikdə, CNO vasitəçiliyi ilə dolayı yol neyronlarında neyron fəaliyyətinin pozulması GFP nəzarətlərinə nisbətən daha möhkəm həssaslığın inkişafına kömək etdi (Şəkil 2b). Bu həssaslığın artırılması, bir həftə sonra CNO müalicəsi olmadıqda aparılmış amfetamin çağırışında davam etdirildi (Şəkil 2c, d). Bu təsirlər, striatopallidal neyronların hM tərəfindən bir CNO-ya bağlı azalmasına aid edilə bilər₄D reseptorları hM çünki₄CNO müalicəsi olmadan D reseptoru ifadəsi amfetamin bu mülayim dozaj rejiminə lokomotor həssaslığı vermir (Əlavə Şəkil 6).

  

Şəkil 2

Striatopallidal və ya striatonigral nöronların həyəcan keçiriciliyini müvəqqəti olaraq azaltmaq amfetamin həssaslığına əks təsir göstərmişdir. (a, e) P-nin CNO tərəfindən aktivləşdirilməsindən sonra amfetaminə kəskin lokomotor reaksiyalarENK-hM₄D (a) və sDYN-hM₄D (e) reseptorları. ...

Striatoniqral neyronların dərmana qarşı reaksiyasını əks bir şəkildə tənzimləyə biləcəyini təyin etmək üçün, GFP nəzarətində möhkəm həssaslaşma meydana gətirən amfetamin dərman müalicəsi rejimi zamanı dorsomedial neyronların biokimyəvi olaraq azalma təsirini sınaqdan keçirdik. ) habelə reseptor vasitəçiliyi ilə neyron fəaliyyətinin pozulması olmadıqda amfetamin az bir doz dozasında (0.5 mq / kq). Dolayı yolların nəmlənməsində olduğu kimi, amfetamin müalicəsi zamanı CNO vasitəçiliyi ilə birbaşa yol neyronlarının həyəcanlılığının azalması amfetaminə qarşı kəskin lokomotor reaksiyasını dəyişdirmədi (Şəkil 2e). Həssaslığın inkişafı, p-nin CNO tərəfindən aktivləşdirilməsindən sonra GFP nəzarətinə bənzər görünsə dəDYN-hM₄D müalicə mərhələsində reseptorlar (Şəkil 2f), həssaslaşma p-də davam etmədiDYN-hM₄D qrup lakin yenə də GFP nəzarətində möhkəm saxlanıldı (Şəkil 2g, h). Bu təsirlər, hM tərəfindən striatonigral nöronların fəaliyyətinin CNO-ya bağlı azalmasına da aid edilə bilər₄D reseptorları hM çünki₄CNO müalicəsi olmadıqda D reseptoru ifadəsi lokomotor həssaslığın inkişafını maneə törətmədi, çünki həssaslaşma müalicə mərhələsində və dərman problemi üzərində müşahidə edildi (Əlavə Şəkil 7). Bu məlumatlar striatonigral neyronların təkrar narkotik istifadəsinin nəticəsi olan uzunmüddətli davranış uyğunlaşmalarının tənzimlənməsi üçün xüsusilə vacib ola biləcəyini göstərir.

Nəticədə, bu məlumatlar dərman təcrübəsindən asılı davranış plastisiyasının tənzimlənməsində striatopallidal və striatonigral neyronların tənqidi və əksinə rollarının ilk dəlilini təqdim edir.. Bundan əlavə, neyron inhibisyonunun amfetaminə qarşı kəskin lokomotor reaksiyasına təsirinin olmaması, dərmanlara kəskin reaksiyalarını tənzimləyən mexanizmlərin təkrar narkotik məruz qalması ilə baş verən davamlı uyğunlaşmaları tənzimləyən mexanizmlərdən fərqli olduğuna dair daha bir sübut verir. Nəhayət, fenotipik spesifik viral vektorları hüceyrə funksiyasını daim pozmadan neyronal fəaliyyətini dəyişdirə bilən dizayner reseptorları ilə cütləşdirmək, asılılığın molekulyar əsaslarını dekonstruksiya etmək üçün yeni və güclü bir yanaşma təmin edir.

Əlavə material

Minnətdarlıq

Dəyişikliklər

References