Рецептори на допамин D2 в зависимост от пристрастяващата дисфункция и компулсивно хранене при затлъстели плъхове (2010)

Коментар: Това проучване демонстрира, че когато на животното е предоставен неограничен достъп, силен естествен подсилващ (много стимулираща храна) може да причини спад в D2 рецепторите. Този спад се наблюдава при почти всички плъхове и настъпва доста бързо. Когато „високо вкусната“ храна беше премахната, плъховете отказаха да ядат нормална чау. Плъховете продължават да изпиват (когато могат), въпреки че съчетават електрически удари с „много вкусната“ консумация на храна.

• Пълно проучване

Nat Neurosci. 2010 май; 13S: 635-641. Публикувано онлайн 2010 март 28. Дой:  10.1038 / nn.2519

абстрактен

Ние открихме, че развитието на затлъстяването е съчетано с появата на прогресивно влошаващ се дефицит в отговор на нервните награди. Сходни промени в хомеостазата на наградата, предизвикана от кокаин или хероин, се считат за решаващи за задействане на прехода от случайно към компулсивно вземане на наркотици. Съответно, открихме компулсивно поведение при хранене при затлъстели, но не постни плъхове, измерени като вкусна консумация на храна, която беше устойчива на разрушаване от аверсивен условен стимул. Стриаталните рецептори на допамин D2 (D2Rs) са понижени при плъхове със затлъстяване, както се съобщава при хора, пристрастени към наркотици. Освен това, медиираните от лентивирус нокауда на стриаталните D2Rs бързо ускориха развитието на пристрастяване като награда дефицити и началото на компулсивно като храна търси при плъхове с разширен достъп до вкусна храна с високо съдържание на мазнини. Тези данни показват, че свръхпотреблението на вкусна храна предизвиква пристрастяване към невроадаптивни реакции в схемите за награждаване на мозъка и стимулира развитието на компулсивно хранене. Поради това общите хедонични механизми могат да бъдат в основата на затлъстяването и наркоманията.

Въведение

Храненето се влияе от удоволствието и възнаграждението, а получаването на хранителна награда може силно да мотивира консумацията1, 2. Въпреки това хедоничните механизми, допринасящи за затлъстяването, остават слабо разбрани. При хиперфагични хора с вроден дефицит на лептин активността в дорзалния и вентралния стриатум, които са основните компоненти на веригите за възнаграждение на мозъка, се увеличава значително в отговор на изображенията на храна3, а заместителната терапия с лептин отслабва както стриаталната активност, така и самоотчитането на „харесването“ на храна . Това предполага, че стриатумът е важен в хедонистичните аспекти на хранителното поведение. Наскоро беше показано, че активирането на стриатума в отговор на изключително вкусна храна е притъпено при индивиди със затлъстяване в сравнение с постно управление3. Освен това хипофункцията на гръбния стриатум и дългосрочното наддаване на тегло са най-изразени при лица с алел TaqIA на локуса на гена DRD4 – ANKK2, което води до намалена експресия на D1R в стриата и е доказано, че предразполага индивидите към разстройства на зависимостта от веществата2, 4 Тези и подобни наблюдения доведоха до предложението, че дефицитите в обработването на награди могат да бъдат важен рисков фактор за развитието на затлъстяване и че хората със затлъстяване могат компулсивно да консумират вкусна храна, за да компенсират хипочувствителността на възнаграждението5. По-специално, не е ясно дали дефицитите в обработката на възнагражденията са съставни и предхождат затлъстяването, или дали прекомерната консумация на вкусна храна може да доведе до дисфункция на възнагражденията и по този начин да допринесе за затлъстяването, предизвикано от диетата.

Определяща характеристика на индивиди с наднормено тегло и затлъстяване е, че те продължават да преяждат въпреки добре познатите отрицателни здравни и социални последици. В действителност, много хора с наднормено тегло изразяват желание да ограничат консумацията на храна, но все пак се борят да контролират приема си и многократно консумират отвъд техните енергийни изисквания7, 8. Развитието на поведението на хранене, което е нечувствително към отрицателен резултат, е аналогично на натрапчивото поведение при приемане на наркотици, наблюдавано при наркозависимите хора, което също е непроницаемо за отрицателни последствия. Тук изследвахме ефектите от разширения достъп до вкусна диета с високо съдържание на мазнини върху чувствителността на системите за възнаграждение на мозъка при плъхове. Изследвахме и връзката между диеторегулираната хедонична дисрегулация и появата на компулсивно търсене на храна. И накрая, изследвахме ролята на стриталните D9Rs в тези реакции на поведение, подобни на зависимостта.

Пристрастени към наградата дефицити при плъхове със затлъстяване

За да тестваме ефектите от ограничения или разширен достъп до вкусна диета с високо съдържание на мазнини, подготвихме мъжки плъхове Wistar (300-350 g) с биполярен стимулиращ електрод в страничния хипоталамус и ги тренирахме за 10-14 дни в дискретно проучване процедура на възнаграждение за мозъчна стимулация (BSR) с текущ праг, докато се установят стабилни прагове за възнаграждение4. В процедурата на BSR плъховете реагират енергично, за да получат възнаграждаваща електрическа самостимулация чрез постоянния стимулиращ електрод, с минималната интензивност на стимулация, която поддържа поведение на самостимулация, наречена праг на възнаграждение10. Тъй като праговете за възнаграждение остават стабилни и непроменени за продължително време при базови условия, тази процедура осигурява чувствителна мярка за отзивчивостта на системите за възнаграждение на мозъка. След установяване на стабилни BSR прагове (дефинирани като <10% вариация в праговете през три последователни сесии), разпределихме плъхове в три групи, които не показаха разлики в средните телесни тегла или прагове за награда между групите. На трите групи беше даден диференциален достъп до диета в стил „кафетерия“, състояща се от вкусна, енергийно гъста храна, лесно достъпна за консумация от човека (вж. Онлайн методи). Плъховете са имали 0 h (плъхове само с чау; n = 9), 1 h (плъхове с ограничен достъп; n = 11) или 18–23 h (плъхове с удължен достъп; n = 11) достъп до диетата на ден за 40 последователни дни. Известно е, че диетите в кафетериите водят до затлъстяване, предизвикано от диета при плъхове11. Всички плъхове също са имали свободен достъп до стандартна лабораторна чау, с прагове за възнаграждение, наддаване на тегло и прием на калории през цялото време.

Теглото се увеличава значително при плъхове с разширен достъп до диети в кафетерия в сравнение с групите само с храна или с ограничен достъп (фиг. 1a). Теглото също има тенденция да се увеличава при плъхове с ограничен достъп в сравнение с плъхове само с храна, но този ефект не достига статистическа значимост. Развитието на затлъстяването при плъхове с удължен достъп е тясно свързано с влошаващия се дефицит в функцията за награждаване на мозъка, което се отразява в прогресивно повишените прагове на BSR (фиг. 1b). Тъй като между трите групи не са наблюдавани разлики в латентността на отговора за BSR (допълнителна фигура 1), дефицитите в поведението не могат да обяснят това наблюдение. Подобни дефицити в мозъчната функция за възнаграждение са докладвани при плъхове с удължен, но не ограничен достъп до интравенозен кокаин или хероин самоуправляващи се12, 13, 14. По този начин, удълженият достъп до вкусна храна с високо съдържание на мазнини може да предизвика дефицити, свързани с пристрастяването, като функция за възнаграждение на мозъка, считана за важен източник на мотивация, която може да предизвика преяждане и да допринесе за развитието на затлъстяване1, 6.

Фигура 1: Повишаване на теглото и дисфункция на възнаграждение при плъхове с разширен достъп до диети в кафетерията.

(а) Средно (± sem) наддаване на тегло при плъхове само с чау, ограничен достъп и с удължен достъп (взаимодействие достъпа × ден: F39,702 7.9 = 0.0001, P <0.05; * P <78,1092 в сравнение с групата само с чау post hoc тест). (b) Средна (± sem) процентна промяна спрямо базовите прагове за възнаграждение (достъп × време взаимодействие: F1.7 = 0.0005, P <0.05; * P <XNUMX в сравнение с група само за чау, пост хок тест).

Когато изследвахме поведението на хранене в детайли (Фиг. 2), открихме, че общият дневен калориен прием е сходен между плъхове само с храна и ограничен достъп (Фиг. 2a, d). Обратно, общият прием на калории при плъхове с разширен достъп е почти два пъти по-голям от този при плъхове с ограничен достъп и само за храна (фиг. 2a, d). Въпреки че плъховете с ограничен достъп и самото хранене поддържат приблизително еднакъв дневен калориен прием (Фиг. 2a, d), плъховете с ограничен достъп получават само ~ 33% от дневните си калории от храна (Фиг. 2b, d), което показва, че те развиват подобно на склонност към хранене поведение и консумират ~ 66% от дневния им калориен прием по време на сесията им за достъп до 1 в кафене diet15 (фиг. 2d). Плъховете с удължен достъп получават само малка фракция (~ 5%) от техния общ калориен прием от чау (фиг. 2b); те консумират храната почти изцяло (фиг. 2d). Промяната в диетичните предпочитания в групите с ограничен и разширен достъп също се отразява в значително увеличение на приема на мазнини в сравнение с плъхове само с храна (фиг. 2c и допълнителна фигура 2). В съответствие с предишните доклади 16, има тенденция за консумация на храната в кафенето, за да се намали с времето при плъховете с удължен достъп. Това може да отразява развитието на толерантност към вкусовите качества на хранителните продукти, предоставени като част от диетичното кафене с течение на времето. Независимо от това, предпочитанията към диетата на кафетерията спрямо стандартната храна остават постоянно високи в тези плъхове (допълнителна фигура 3). Тези данни показват, че разширен, но не и ограничен достъп до вкусна храна с високо съдържание на мазнини, предизвиква пристрастяване като награден дефицит, преяждане и загуба на хомеостатичен енергиен баланс. За разлика от това, ограничен достъп до вкусна храна води до склонност към потребление, но не нарушава хомеостатичния енергиен баланс или функцията за възнаграждение на мозъка. Възможно е обаче, че ограниченият достъп до диетата в кафетерията за повече от 40 последователни дни ще предизвика значително увеличаване на теглото и нарушаване на функцията за награждаване на мозъка.

Фигура 2: Модели на консумация при плъхове с разширен достъп до кафетерийна диета.

а) Среден (± sem) дневен калориен прием при плъхове само с чау, ограничен достъп и удължен достъп (достъп: F1,324 = 100.6, P <0.0001; време: F18,324 = 7.8, P <0.0001; достъп × времево взаимодействие: F18,324 = 4.6, P <0.0001; * P <0.05 в сравнение с група само за чау, post hoc тест). (б) Среден дневен калориен прием (± sem) от чау (достъп: F2,504 = 349.1, P <0.0001; време: F18,504 = 5.9, P <0.0001; достъп × време взаимодействие: F36,504 = 3.52, P <0.0001; * P <0.05 в сравнение с група само за чау, post hoc тест). (в) Среден дневен калориен прием (± sem) от мазнини (достъп: F2,486 = 118.7, P <0.0001; време: F18,486 = 8.8, P <0.0001; достъп × време взаимодействие: F36,486 = 6.2, P <0.0001; * P <0.05 в сравнение с група само за чау, post hoc тест). (г) Сравнение на средния (± sem) общ калориен прием и консумираните калории изключително от чау през целия 40-дневен период на достъп (достъп: F2,54 = 25.0, P <0.0001; калориен източник: F2,54 = 1235.2, P <0.0001; достъп × взаимодействие с източници на калории: F2,54 = 485.7, P <0.0001; *** P <0.001 в сравнение с общите калории в групата само с чау, ### P <0.001 в сравнение с общите калории в същата група плъхове, post hoc тест).

След 40 дни на плъховете вече не е бил разрешен достъп до вкусната диета, но продължават да имат достъп ad libitum до стандартна лабораторна чау. Ежедневно оценявахме праговете за възнаграждение и консумацията на чау през този принудителен период на „въздържание“. Повишаването на праговете за възнаграждение се запазва най-малко 2 седмици при плъховете с удължен достъп, когато те вече нямат достъп до вкусната диета (фиг. 3а). Това контрастира с относително преходните (~ 48 часа) дефицити във функцията за възнаграждение, отчетени при плъхове, подложени на абстиненция от самоприложен кокаин13. По време на този абстиненционен период също се наблюдава значително намаляване на приема на калории (фиг. 3б) и постепенно намаляване на телесното тегло (фиг. 3в) при плъхове с удължен достъп и в по-малка степен при плъхове с ограничен достъп. предишни доклади11, 15. След 14 d въздържание плъховете бяха убити и разположенията на електродите бяха определени чрез оцветяване с крезил виолет (фиг. 3d).

Фигура 3: Постоянна награда дисфункция и хипофагия по време на абстиненция при плъхове с удължен достъп до кафетерия диета.

(a) Средна процентна промяна спрямо изходните прагове за награда (± sem) по време на въздържание от вкусна диета с високо съдържание на мазнини (достъп: F2,112 = 3.7, P <0.05; време: F4,112 = 2.3, P> 0.05; * P <0.05 в сравнение с група само за чау, пост хок тест). (б) Среден калориен прием (± sem) в последния ден от достъпа до диета с високо съдържание на мазнини (изходно ниво) и по време на 14-те дни на въздържание, когато е била налична само стандартна чау (достъп: F2,168 = 41.7, P <0.0001 ; време: F6,168 = 65.6, P <0.0001; достъп × време взаимодействие: F12,168 = 38.3, P <0.0001; * P <0.05 в сравнение с група само за чау, post hoc тест). (в) Промяна в средното телесно тегло (± sem) в сравнение с телесното тегло в последния ден от достъпа до диета с високо съдържание на мазнини (изходно ниво) и по време на 14-те дни на въздържание, когато е налице само стандартна чау (достъп: F1,126 = 37.2, P <0.0001; време: F7,126 = 3.1, P <0.01; достъп × време взаимодействие: F7,126 = 40.9, P <0.0001; * P <0.05 в сравнение с група само за чау, пост хок тест). (г) Хистологична реконструкция на местоположението на BSR стимулиращи електроди в страничния хипоталамус само на чау (триъгълници), ограничен достъп (квадрати) и удължен достъп (кръгове) плъхове.

Striatal D2Rs при плъхове със затлъстяване: роля в дефицита на възнаграждение

След това тествахме хипотезата, че свръхконсумацията на вкусна диета в кафенето може да намали плътността на стриата D2R, допринасяйки за развитието на хипочувствителност, подобна на пристрастяване. На нова кохорта плъхове само с чау, с ограничен достъп и с продължителен достъп беше разрешен достъп до диетата на кафенето, докато не настъпи статистически значимо увеличение на телесното тегло при плъховете с удължен достъп в сравнение с групата само с чау (P <0.05 ; Фиг. 4а). Стриаталната експресия на силно гликозилираната (~ 70 kDa) свързана с мембраната форма на D2R е била по-ниска при плъхове с удължен достъп, отколкото при плъхове с ограничен достъп или само чау (Фиг. 4b; вж. Онлайн методи). Когато разделихме плъховете във всяка група за достъп на две подгрупи въз основа на средно разделение на телесното тегло (леко или тежко), открихме ясна обратна връзка между телесното тегло и стриаталната експресия на D2R (Фиг. 4а, в). Не открихме статистически значимо намаляване на експресията на негликозилираните незрели (~ 39 kDa) и междинно гликозилирани цитоплазматични (~ 51 kDa) форми на D2R (допълнителна фигура 4) 17, което показва, че стриаталната експресия на D2R при плъхове с удължен достъп вероятно е регулирани чрез пост-транскрипционни механизми.

Фигура 4: Нарастването на теглото е обратнопропорционално свързано с нивата на стритална D2R.

(а) Плъховете само за чау, ограничен достъп и разширен достъп бяха разделени на две групи за всяко условие за достъп въз основа на средното разделение на телесното тегло: леко (L) или тежко (H). (b) Целият стриатен комплекс е събран от всички плъхове и нивата на D2R във всяка група, измерени чрез Western blot. Асоциираната с мембраната D2R лента се разделя при 70 kDa и контролът за зареждане с протеин е показан по-долу (β-актин, 43 kDa). Имуноблоти с пълна дължина са показани на допълнителна фигура 12. (c) Относителните количества D2R в стриатума на плъхове само с чау, ограничен и продължителен достъп са количествено определени чрез денситометрия (F2,6 = 5.2, P <0.05, основна ефект на достъпа; * P <0.05 и ** P <0.01 в сравнение с групата само за чау-L).

След това, за да проверим функционалната значимост на индуцираните от диетата редукции на функцията на стриатален D2R към мозъчно възнаграждение, ние проектирахме и валидирахме лентивирусен вектор, за да доставим къса шпонка интерферираща РНК (shRNA), за да съборим D2R (Lenti-D2Rsh; фиг. 5 и допълнителна фигура 5). Праговете на възнаграждение започват да се увеличават при плъхове, третирани с Lenti-D2Rsh почти веднага след като им е разрешен разширен достъп до диети на кафетерия, докато праговете за възнаграждение остават непроменени в плъхове с удължен достъп, третирани с празен лентивирусен вектор (Lenti-control) през сравнително краткия период на достъп до храненето в кафенето (14 d; Фиг. 6a). Латентността на реакцията е непроменена в двете групи плъхове, което показва, че този ефект не е вторичен по отношение на дефицитите при изпълнението на задачите (допълнителна фигура 6). Праговете за възнаграждение също са непроменени при плъхове, третирани с Lenti-D2Rsh или Lenti-контрол, които имат достъп до храна само през същия период (фиг. 6b).

Праговете остават постоянно повишени по време на допълнително 15d на въздържание, когато всички плъхове имат достъп само до стандартна храна (допълнителна фигура 7). Затова нокаутирането на стриаталния D2R увеличава уязвимостта към хипофункция на възнаграждение, предизвикана от диета, но не променя основната активност на системите за възнаграждение на мозъка.

Фигура 5: Лентивирус-медиирана нокдаун на стриаталната експресия на D2R.

(а) Графично представяне на стриаталните области, в които Lenti-D2Rsh е свръхекспресиран. Зелените кръгове в лявото стритално полукълбо представляват местата, в които са насочени вирусните инфузии. Зеленото оцветяване в дясното ивичесто полукълбо е представително имунохимично оцветяване за зелен флуоресцентен протеин (GFP) от мозъка на плъх Lenti-D2Rsh. (b) Представителен имуноблот за намалената експресия на D2R в стриатума на плъхове Lenti-D2Rsh. Имуноблоти с пълна дължина са показани на допълнителна фигура 13. (c) Относителни количества D2R в стриатума на Lenti-control и Lenti-D2Rsh плъхове, количествено определени от денситометрия (* P <0.05 в сравнение с Lenti-контролната група, post hoc тест ). (d) Инфекция на глиални клетки в стриатума от вектора Lenti-D2Rsh не е открита. Зеленото оцветяване е GFP от вируса; червеният е астроцитният маркер глиен фибриларен киселинен протеин (GFAP); клетъчните ядра са подчертани чрез DAPI оцветяване в синьо. Белите стрелки показват локализирана област на глиоза, открита само на мястото на инжектиране на вируса в стриатума, а не в околните тъкани, в които вирусът се е разпространил. Дори в тази област нито един от астроцитите не е GFP-положителен. Жълтите стрелки в увеличеното изображение подчертават типичните GFP-отрицателни астроцити, които са били открити. (д) Високи нива на невронална инфекция в стриатума от вектора Lenti-D2Rsh. Зеленото оцветяване е GFP от вируса; червеното е невроналният ядрен маркер NeuN; клетъчните ядра са подчертани чрез DAPI оцветяване в синьо. Жълтите стрелки в увеличеното изображение подчертават GFP-положителни и NeuN-положителни неврони в стриатума. (е) Изображение с по-голямо увеличение на вирусно инфектиран (GFP-позитивен) неврон в стриатума на плъхове Lenti-D2Rsh, което показва типичните морфологични характеристики на средните бодливи неврони.

Фигура 6: Нокаутиране на стриатална D2R увеличава уязвимостта за възнаграждаване на дисфункцията при плъхове с удължен достъп до кафетерийна диета.

(а) Средна (± sem) процентна промяна от изходните прагове за възнаграждение при плъхове Lenti-control и Lenti-D2Rsh, които са разширили достъпа до диетата на кафенето в продължение на 14 последователни дни (вирус: F1,156 = 5.9, P <0.05; време: F13,156 = 2.2, P <0.05; взаимодействие с вируса × време: F13,156 = 2.2, P <0.05; #P <0.05, ефект на взаимодействие). (b) Средна (± sem) процентна промяна от базовите прагове за възнаграждение при плъхове Lenti-control и Lenti-D2Rsh, които са имали достъп само за чау. (в) Среден (± sem) калориен прием на плъхове по време на 14 d само чау или разширен достъп (достъп: F2,28 = 135.6, *** P <0.0001). (г) Средно (± sem) наддаване на тегло по време на 14 d само за чау или разширен достъп (достъп: F2,28 = 96.4, P <0.0001; *** P <0.001, основен ефект от достъпа).

Ние открихме, че приема на калории (Фиг. 6c) и нарастване на теглото (Фиг. 6d) са подобни в Lenti-D2Rsh и съответните Lenti-контролни групи при условия само на храна или разширен достъп (Допълнителни Фигури 8 и 9). По този начин нокдаунът на стритарна D2R променя нито предпочитанията към диетата на кафетерията, нито общия прием на калории, когато вкусовата храна е свободно достъпна за консумация.

Компулсивно хранене при затлъстели плъхове: роля за стритална D2R

След това тествахме хипотезата, че компулсивно хранене може да се появи при плъхове с разширен достъп до диетата в кафенето и че дефицитите в сигналите на D2R на стриата могат да допринесат за този ефект. На нова кохорта плъхове само с чау, с ограничен достъп и с продължителен достъп беше разрешен достъп до диетата на кафенето за> 40 дни, докато при разширените плъхове настъпи статистически значимо увеличение на теглото (P <0.05 в сравнение с плъхове само с чау; данни не показан). След това и на трите групи плъхове беше разрешен достъп само до 30 минути на ден до диетата на кафенето в продължение на 5-7 дни в оперантна камера, докато се постигне стабилен прием (дефиниран като <10% вариация в дневния прием). След това половината плъхове във всяко условие за достъп бяха изложени на светлина (обусловен стимул), съчетана с доставяне на удари на крака (наказана група), докато останалите плъхове във всяка група бяха изложени на светлината-реплика при липса на удар на крака (ненаказана група ). В тестовия ден ние изследвахме ефектите само от излагането на светлината на реплика върху вкусната консумация на храна (фиг. 7; вж. Онлайн методи). Установихме, че средният калориен прием по време на 30-минутните сесии на изходно ниво е по-висок при плъховете само с чау и ограничен достъп, отколкото при плъховете с удължен достъп (Фиг. 7а, б). Това предполага, че плъховете само с чау и ограничен достъп се припиват към вкусната храна по време на периодичните 30-минутни сесии за достъп, отразени във факта, че тези плъхове консумират ~ 40-50% от дневния си калориен прием, обикновено ~ 100 kCal, по време на тези сесии (фиг. 7а, б). За разлика от това, плъховете с удължен достъп изглеждат устойчиви на развиването на това поведение, наподобяващо преяждане, може би защото тяхната история на почти неограничен достъп до вкусна храна за> 40 последователни дни установява модели на хранене, които са относително негъвкави за промяна. В тестовия ден не наблюдавахме статистически значими ефекти от възпроизвеждането на светлината-реплика върху консумацията на храна при ненаказаните плъхове от групите само за чау, ограничен или удължен достъп, в сравнение с приема през базовия период (Фиг. 7а). Следователно само светлината-реплика няма мотивационна забележителност. При наказани плъхове, сдвоената ударна светлина значително намалява вкусния прием на храна при плъховете само с чау и ограничен достъп. Светлината-реплика обаче не е оказала ефект върху вкусния прием на храна при плъховете с удължен достъп, показвайки, че тяхната консумация е нечувствителна към отвратителни екологични сигнали, предсказващи несгоди. Изходният енергиен прием при плъхове с удължен достъп е бил по-нисък от този в останалите групи. Тъй като обаче приемът на чау през подобни периоди от време е далеч по-нисък (фиг. 7г), е малко вероятно това да представлява „ефект на пода“, който обърква нашите констатации. Заедно нашите данни подкрепят идеята, че компулсивно подобно поведение при хранене може да се появи при плъхове с удължен достъп по начин, аналогичен на компулсивното приемане на кокаин, наблюдавано при плъхове с история на разширен достъп до лекарството18.

Фигура 7: Принудителна реакция за вкусна храна.

а) Средна (± sem) вкусна диета при ненаказани плъхове по време на 30-минутните базови сесии и в тестовия ден, когато плъховете са били изложени на неутрално обусловен стимул, който преди това не е бил сдвоен с вреден шок на крака (достъп: F2,20 = 5.2, P <0.05; #P <0.05 в сравнение с плъхове само с чау). (б) Средна (± sem) вкусна диета при наказани плъхове по време на 30-минутните базови сесии и в тестовия ден, когато плъховете са били изложени на условен стимул, който преди това е бил съчетан с вреден шок на крака (достъп: F2,21 = 3.9 , P <0.05; реплика: F1,21 = 8.6, P <0.01; достъп × реплика взаимодействие: F2,21 = 4.7, P <0.05; * P <0.05 в сравнение с приема по време на изходната сесия, #P <0.05 в сравнение с плъхове само с чау). (в) Средна (± sem) вкусна диета по време на 30-минутни базови сесии и в тестовия ден при плъхове Lenti-control и Lenti-D2Rsh, които преди това са имали само чау или разширен достъп до диета в кафенето (реплика: F1,26, 29.7 = 0.0001, P <0.05; * P <0.01, ** P <30 в сравнение с приема по време на базовите сесии, post hoc тест). (d) Средно (± sem) консумация на чау по време на 2-минутни базови сесии и на тестовия ден при плъхове Lenti-control и Lenti-D1,26Rsh, които преди това са имали само чау или разширен достъп до диета в кафенето (реплика: F44.9 = 0.0001, P <0.05; * P <0.01, ** P <XNUMX в сравнение с приема по време на базовите сесии, post hoc тест).

И накрая, ние изследвахме ефектите от сдвоения с наказания условен стимул върху приема на храна при плъховете Lenti-control и Lenti-D2Rsh, които преди това имаха достъп само до чау или разширен достъп до диетата в кафенето (плъхове от фиг. 6). Установихме, че приемливият прием на храна по време на 30-минутните сесии на изходното ниво е сходно висок (~ 40 kCal) и във всичките четири групи (фиг. 7в). В допълнение, общата дневна консумация на чау (в домашната клетка) е сходна между четирите групи плъхове по време на кондициониращите сесии и в тестовия ден (допълнителна фигура 10). Следователно 14-те дни на предишния достъп до диетата в кафенето не са били достатъчни, за да блокират поведението, наподобяващо преяждане, по начин, подобен на този, наблюдаван при плъхове, които са имали> 40 дни удължен достъп до диетата в кафенето (фиг. 7а, б). Аверсивният светлинен стимул нарушава вкусния прием на храна при плъхове Lenti-control и Lenti-D2Rsh, които преди това са имали достъп само за чау (Фиг. 7в). По същия начин, отвратителният условен стимул нарушава вкусния прием на храна при плъховете за контрол на Lenti, които преди това са имали 14 d удължен достъп до диетата в кафенето. За разлика от това, отвратителният условен стимул не е оказал влияние върху вкусната консумация на храна при плъховете Lenti-D2Rsh, които преди това са имали 14 d удължен достъп до диетата в кафенето (фиг. 7в). Праговете на BSR остават значително повишени при тези плъхове, когато са записани 48 часа след тестовата сесия, докато праговете остават стабилни и непроменени в останалите три групи плъхове

(Допълнителна фигура 11). За да се провери, че устойчивостта към условното стимулиране, предизвикано от потискане на вкусовия прием на храна в плъхове с разширен достъп на Lenti-D2Rsh, не е вторично след увреждания в класическите процеси на кондициониране, ние тествахме ефектите на аварийния условен стимул върху консумацията на по-малко вкусна стандартна храна всичките четири групи плъхове. За разлика от консумирането на вкусна храна, ние открихме, че всичките четири групи плъхове са консумирали малко храна (~ 2 kCal) по време на 30 min базисните сесии (фиг. 7d) и че приемът на храна е бил разрушен във всичките четири групи от подобна величина при излагане на аверсивен условен стимул (фиг. 7d). Тези данни показват, че нокауда на стриаталните D2Rs значително ускорява появата на компулсивно-подобно хранене на вкусна храна, но само при плъхове с история на разширен достъп. Освен това, тъй като компулсивното хранене е било открито само при плъхове Lenti-D2Rsh, които имат повишени прагове на BSR, хипофункцията за възнаграждение, предизвикана от диетата, може да бъде необходима предшестваща поява на натрапчиво търсене на храна.

Дискусия

Лесният достъп до вкусна храна с високо съдържание на мазнини се счита за важен рисков фактор за околната среда за затлъстяването19. Открихме, че удълженият достъп до изключително вкусна диета в стил кафетерия води до преяждане и увеличаване на теглото, съчетано с постепенно повишаване на праговете на BSR при плъхове. Този ефект върху праговете на BSR може да бъде обяснен с постепенно намаляване на реакцията на схемите за награждаване на мозъка, интерпретация, съответстваща на факта, че ограничаването на храната и загубата на тегло могат да се увеличат, докато острото прехранване може временно да намали NUMX, отговаряйки за BSR при плъхове. Тази находка представлява продължение на работата, показваща, че острото подхранване на плъхове чрез интрагастрално хранене tube20, и стомашно раздуване или интравенозна инфузия на глюкагон, които имитират постпрандиални сатитиХНУМХ, 21, 21, намалява отговора за възнаграждаване на латералния хипоталамичен BSR stimulation22. Предишната работа също така показа, че многократно насилствено хранене на плъхове чрез интрагастрални тръби, докато теглото им се увеличи с ~ 23 g, също така намалява степента на реакция за BSR, ефект, който продължава докато телесното тегло се нормализира24. Както при тези находки при плъхове, реагирането при котки за латерален хипоталамичен BSR беше инхибирано от предишното хранене до satiation25, показвайки, че взаимодействията между функцията за награждаване на мозъка и метаболитното състояние са запазени и по този начин е вероятно да се появят и при хората. Лесният достъп и последващото преяждане на диети в стила на кафетерия при хората се считат за важен екологичен принос за сегашната епидемия на затлъстяването в западните общества 200. Нашите данни показват, че възнаграждаващата хипофункция възниква при плъхове, които обилно преяждат вкусна диетична храна, подобна на тази, консумирана от хората, и че този ефект става все по-тежък, тъй като те получават по-голяма тежест. Трябва да се отбележи, че всички плъхове с повишени прагове на повишаване ≥23% са имали BSR електроди, разположени в рамките на ~ 26 μm от дупката на корневата кухина. Чувствителността на свързаните с възнаграждение неврони в тази област се увеличава чрез ограничаване на храната по начин, който е чувствителен към мастния хормон лептин, и този мозъчен участък се счита за важен субстрат за хранителни награди. Следователно мозъчните кръгове, които регулират хранителните хедоники, се инхибират от пост-вегетативни сигнали, които предсказват ситост, в съответствие с последните изследвания на човешкия образ, които показват, че стомашното раздразнение NUMX и пептидът от постпрандиалния фактор YY19-20 (PYY) 500 модулират активността на районите на мозъка участие в обработката на възнаграждения. В допълнение, системите за възнаграждение също се възпрепятстват от прекомерното наддаване на тегло. Последните доклади показват, че циркулиращият лептин, ключов регулатор на енергийния баланс, може да проникне в мозъчните тъкани и да инхибира активността на схемите за възнаграждение 27, 28, 3, 36.

Дефицитът на възнаграждение при плъхове с наднормено тегло може да отразява контрадаптивното намаляване на изходната чувствителност на веригите за възнаграждение на мозъка, за да се противопостави на свръхстимулацията им от вкусна храна. Подобна хипофункция, предизвикана от диета, може да допринесе за развитието на затлъстяване, като увеличи мотивацията за консумиране на „обезогенни“ диети с висока награда, за да се избегне или облекчи това състояние на отрицателна награда6, 32. Това може да обясни хипофагията, която наблюдавахме при удължен достъп плъхове и в по-малка степен при плъхове с ограничен достъп, когато вкусната храна беше изтеглена и имаше само по-малко вкусната чау. Такъв сценарий е в съответствие и с данните от изследвания на човешкия мозъчен образ, при които притъпеното активиране на стриатума в отговор на силно вкусна храна, особено при лица с генетични полиморфизми, за които се смята, че намаляват експресията на D2R в стриата, е свързано с дългосрочно наддаване на тегло4. Не е ясно дали подобна хипочувствителност при възнаграждение при затлъстели индивиди се проявява преди развитието на затлъстяване и е свързана единствено с генетични фактори („синдром на дефицит на възнаграждение“) или дали преяждането може да причини смущения в обработката на наградите. Нашите данни показват, че разширеният достъп до вкусна високоенергийна храна и последващите преяждащи тъпи възнаграждават чувствителността и следователно могат да представляват важен хедоничен механизъм, който насърчава развитието на затлъстяване. Подобна дисфункция на възнаграждението, която се съобщава тук при затлъстели плъхове, се открива и при плъхове с анамнеза за удължен достъп до интравенозно кокаин или самоуправление на хероин, но не и при тези с анамнеза с ограничен достъп12, 13, 14. Освен това преходът от случайно до натрапчиво търсене на наркотици се предлага в резултат на опит за облекчаване на постоянното състояние на намалено възнаграждение, предизвикано от тази индуцирана от наркотици дисфункция на възнагражденията12, 32, 33. По този начин, нашите данни показват, че затлъстяването и наркоманията могат да споделят основните хедонични механизми.

Понижаването на експресията на стриатален D2R е забележителен невроадаптивен отговор на свръхпотреблението на вкусна храна. Наистина, намаляването на плътността на стриаталната D2R се наблюдава при индивиди с наднормено тегло4, 34 и гризачи35, 36. Обратно, индивиди с анорексия нервоза имат повишена стриатална D2R37, а загубата на тегло при затлъстели индивиди след бариатрична (стомашна байпас) хирургия е свързана с повишена плътност на стригавите D2R28. Генният полиморфизъм, наречен TaqIA A1 алел, води до намаляване на плътността на стриталния D2R и индивиди, които носят този алел, са свръхпредставени в наднормените популации4. TaqIA алел също повишава уязвимостта към алкохола, опиоидния и психомоторния стимулант. Следователно, намаляването на плътността на стриаталната D38R, което се проявява или чрез конститутивни генетични фактори, или като последица от преяждане, може да допринесе за невробиологичните механизми на затлъстяване. Ние открихме, че стриталните нива на изоформата 2 kDa D70R, за които се смята, че отразяват D2R, свързана с мембраната, са обратно пропорционални на телесното тегло при плъхове от групите само с храна, с ограничен достъп и с разширен достъп (Фиг. 2). Нарушението на стриаталната експресия на D4R, най-силно изразено в дорсолатералната лента (Фиг. 2), води до увеличаване на праговете на BSR почти веднага след излагане на храната в кафенето. По този начин намаляването на стрикалната експресия на D5R ускорява бързо появата на възнаграждаваща хипофункция при плъхове с разширен достъп до силно вкусна храна, което е в съответствие с данните от човешкия мозък, които показват, че дефицитите в стриталната плътност на D2R допринасят за възнаграждаване на хипофункция при затлъстели индивиди2.

Три характеристики на плъховете Lenti-D2Rsh също са забележителни. Първо, въпреки, че нокдаунът на стриталния D2R, комбиниран с разширен достъп до вкусна диета, е довел до повишаване на праговете на BSR, няма разлика в приема на калории или увеличаване на теглото при тези плъхове в сравнение с контролните плъхове. Това може да отразява факта, че плъховете са имали 14 d само за достъп до храненето в кафенето; по-дългите периоди на достъп може да са довели до по-голямо наддаване на тегло с течение на времето, подобно на по-високата податливост към повишаване на теглото, наблюдавана при хора с дефицит в стриталния D2R сигнал NXX. Въпреки това, предимството на ограничаване на достъпа до диетата на кафенето само до 4 d е, че нокдаун плъховете с разширен достъп са единствената група, която показва повишени прагове на BSR, и това ни позволява да оценим потенциалната роля на възнаграждаващата хипофункция в развитието на компулсивно хранене (виж по-долу). Второ, праговете на BSR останаха стабилни и непроменени в нокдаун плъховете, които имаха достъп само до храна. Това показва, че намалената експресия на стритална D14R сама по себе си не е достатъчна, за да индуцира хипотензивност на възнаграждението; вместо това тя изглежда взаимодейства с прекомерното потребление на вкусна храна, за да ускори появата на това състояние на намалена чувствителност на възнаграждение. Други адаптивни реакции в схемите за възнаграждение на мозъка могат следователно да предизвикат хипочувствителност на възнаграждението при плъхове с разширен достъп до диети в кафетерията. С оглед на това, ние отбелязваме, че агонистът D2R бромокриптин намалява циркулиращите нива на лептин2, а лептинът потиска храненето поне отчасти, като инхибира стриталните региони, които контролират хедоничните реакции към храна39, 3, 30. Следователно, възможно е понижаването на стриталния D31R в отговор на увеличаване на телесното тегло увеличава сигнализирането на лептин и по този начин увеличава инхибиторните ефекти на този адипокин върху системите за възнаграждение на мозъка. Накрая отбелязваме, че ние насочихме нашите лентивирусни вектори към дорзолатералната лента. Това се дължи главно по технически причини, тъй като страничното поставяне на канюли за доставяне на вируса в стриатума ни позволява също така да поберем намиращия се в хипоталамуса стимулиращ електрод за определяне на BSR праг. По този начин е възможно прицелването на D2Rs за нокдаун в други области на стриатума, особено на дорсомедиалните и вентралните области (core and shellus), може да има повишени прагове на BSR дори при липса на вкусна диета.

Дорсолатералният стриатум е силно замесен в обучението за навик тип стимул-реакция, което се отразява в развитието на консуматорско поведение, което е нечувствително към девалвация чрез предварително хранене до насищане или чрез сдвояване с вредни стимули40. Като се насочим предимно към дорзолатералния стриатум, може да сме съборили популации от D2R, които регулират уязвимостта на плъховете към развитието на принудително хранене. В съответствие с ролята на стриаталните D2Rs в компулсивно поведение, алелът TaqIA на човешкия локус DRD2 – ANKK1 на гена - което води до ниска стриатална D2R плътност5, притъпява стриаталното активиране в отговор на вкусна храна4 и повишава уязвимостта към затлъстяването4 - също е свързан с дефицити в обучението за избягване на действия с негативни последици41. Загубата на инхибиторен контрол върху поведението, което може да има отрицателен резултат, е характерна черта както на затлъстяването, така и на пристрастяването към наркотици, при което консумативното поведение продължава въпреки негативните социални, здравни или финансови последици. Поведението на кокаин при плъхове с анамнеза за голям прием на наркотици може да стане негъвкав и устойчив на разрушаване от неприятен условен стимул, който предсказва отрицателен резултат (шок на крака) 18. По същия начин мишките, които преди са имали достъп до вкусна диета с високо съдържание на мазнини, ще прекарват повече време в отвратителна среда (ярко осветена), за да получат вкусна храна, отколкото мишките, които нямат опит с диетата42. Открихме, че вкусната консумация на храна при плъхове с разширен достъп до диетата в кафенето е по същия начин нечувствителна към неприятен условен стимул. В съответствие с ролята на стриаталните D2R в този ефект, компулсивно хапване е установено при стриталните D2R нокдаун плъхове, които преди това са имали 14 d удължен достъп до диетата на кафенето, но не и в контролните групи. От гледна точка на невроциркулацията, разширеният достъп до вкусна храна може да предизвика пластичност в кортикостриаталните пътища, като по този начин направи животните по-уязвими от развитието на подобно натрапчиво поведение, с дефицити в стриаталния D2R сигнал, засилващ този процес. Всъщност намалената стритална D2R плътност при затлъстели индивиди е свързана с намален метаболизъм в префронталната и орбитофронталната кортикални области43, които упражняват инхибиторен контрол върху поведението44.

По-специално, компулсивно-подобна консумация на вкусна храна беше открита само при нокдаун плъхове, които преди това са имали разширен достъп до диети в кафетерия, а не при контролни плъхове, които са имали разширен достъп до диети за кафетериите за същия период от време, нито при плъхове, които са имали достъпът само до chow. Основната разлика между нокдаун плъховете с предварително разширен достъп и до другите групи е тяхното постоянно повишени прагове на BSR. Това може да отразява общи невробиологични източници на хипофункция на възнаграждението и появата на принудително подобно хранене, които са временни съвпадащи, но независими явления. Алтернативно, хипофункцията за възнаграждение, предизвикана от диета, може да послужи като субстрат за отрицателно подсилване, което улеснява развитието на компулсивно-подобно хранене 14, 32, 33. Каквито и да са основните механизми, нашите находки показват, че приличната на пристрастяване реакция за вкусна храна може да се появи при плъхове със затлъстяване и да покаже, че дефицитите в стриталното D2R сигнализиране увеличават уязвимостта към развитието на това поведение.

В обобщение, ние открихме, че свръхстимулацията на мозъчните системи за възнаграждение чрез прекомерна консумация на вкусна, енергийно плътна храна предизвиква дълбоко състояние на възнаграждение за хипотензивност и развитие на принудително хранене. Тези дезадаптивни поведенчески реакции при затлъстели плъхове вероятно се дължат на дефицити, предизвикани от диета при стриарична сигнализация D2R. Свръхпотреблението на лекарства за злоупотреба подобно намалява плътността на стриталния D2R, индуцира дълбоко състояние на хипофункция на възнаграждение и предизвиква появата на принудително поведение на приемане на наркотици. Нашите констатации следователно подкрепят предишната работа4, 19, 42, 45, 46, 47, като показват, че затлъстяването и наркоманията могат да възникнат от подобни невроадаптивни реакции в схемите за награждаване на мозъка.

Методи

Плъхове.

Мъжки плъхове Wistar с тегло 300-350 g в началото на експериментите бяха получени от Charles River. При пристигането, плъховете се настаняват индивидуално при постоянна температура в 12-h цикъл светлина-тъмнина (светва при 2200 h). Плъховете се разрешават ad libitum достъп до стандартна лабораторна храна и вода по време на експеримента. Всички процедури са одобрени от Комитета за грижа и използване на животните в институцията на Scripps Florida, и плъховете са лекувани в съответствие с насоките, изложени от Националните институти по здравеопазване относно принципите на грижата за животни.

Хирургични процедури.

Плъховете, приготвени с BSR стимулиращи електроди, първоначално се анестезират чрез инхалиране на 1-3% изофлуран в кислород и се поставят в стереотаксична рамка (Kopf). Биполярните BSR електроди (11 mm дълги) бяха имплантирани в задния латерален хипоталамус (предно-горната, -0.5 mm от брегмата; средно-странично, ± 1.7 mm от средната линия; dorsoventral, 8.3 mm от dura; резците бяха регулирани до 5 mm над вътрешната линия ) 47. Плъхове, получаващи вирусни инжекции, също се приготвят с двустранни направляващи канюли (габарит 23, дължина 14 mm), разположени над стриатума (преднозолово, 2.8 mm от брегмата; средно-странично, ± 3.1 mm от средната линия; dorsoventral, -2.4 mm от dura) 48 и пълни със стилуси 14-mm. Четири винта от череп от неръждаема стомана и зъболекарски акрил държат електрода и канюлите на място. Хирургичната рана се лекува с локален антибиотик веднъж на всеки 12 h за 5 d след операцията. На плъховете беше позволено 7-10d да се възстанови от операцията и след това бяха обучени в BSR праговата процедура.

BSR процедура.

Плъховете се обучават да реагират за BSR стимулация в съответствие с дискретен метод на токов праг, подобен на този, описан другаде 10, 14. Накратко, сегашните нива на BSR варират в редуващи се низходящи и възходящи серии в стъпки 5-μA. Във всяка тестова сесия бяха представени четири променливи низходящи / възходящи серии. Прагът за всяка серия е дефиниран като средата между две последователни интензитета на тока, за които плъховете са отговорили най-малко в три от петте изпитвания, и две последователни интензитета на тока, за които плъховете не са отговорили в три или повече от петте изпитвания. Общият праг на сесията беше определен като средната стойност на праговете за четирите отделни серии. Всяка тестова сесия беше с продължителност приблизително 30 мин. Стабилните прагове на BSR бяха определени като ≤10% вариация в праговете за 5 последователни дни, обикновено установени след 10 – 14 d на обучението. Латентността на отговора за всяка тестова сесия е определена като средната латентност на отговора на всички изпитвания, по време на които е настъпил положителен отговор.

Пакетиране и доставка на вируси.

Доставя се РНК с къса фиби и се изразява конститутивно с помощта на векторната система pRNAT-U6.2 / Lenti (GenScript). Вирусните частици се приготвят съгласно протокола на производителя. Накратко, клетките HEK 293FT бяха трансфектирани с вектор, съдържащ вмъкване на shRNA (5′-GGATCCCGCGCAGCAGTCGAGCTTTCTTCAAGAGAGAAAGCTCGACTGCTGCGCTTTTTTCCAACTCTCAGAG-3 ′) или празен вектор, плюс ViraPower среда за опаковане на смес (Invitro) 72 (hv) (24). След това супернатантът се събира и концентрира чрез ултрацентрифугиране (76,755 g, ротор Beckman Coulter SW 32 TI, 90 минути, 4 ° C) и титърът на вируса се определя чрез активирано от флуоресценция сортиране на клетки в съответствие с инструкциите на производителя. Вирусът се разделя на аликвотни части и се съхранява в защитени от светлина кутии при -80 ° C до употреба.

Плъхове със стабилни прагове на BSR получават двустранни вирусни инжекции на три места в стриатума на всяко мозъчно полукълбо (2 μl на инжекция, 1 μl min-1, 1 min между инжекциите, общо шест инжекции на плъх). На плъховете е било разрешено възстановяване поне от 2-3 d след интрастритални инжекции преди възстановяването на BSR праговата оценка. Ежедневната оценка на прага на BSR продължава за 33 d след инжектиране на вируса, за да се гарантира, че е постигнато максимално стритално съкращение на D2R, преди да се даде възможност на плъховете да получат достъп до диети от кафенето. Няма разлики в BSR праговете между плъховете Lenti-контрол и Lenti-D2Rsh по време на тези 33 d (данните не са показани).

Имунологично.

Плъховете бяха убити приблизително 1 часа след редовния им достъп до диети на кафетерия, а мозъците бързо бяха отстранени. Мозъчни участъци с дебелина от ~ 1 – 2 mm бяха приготвени с помощта на коронална мозъчна матрица (1-mm интервал на срязване; пластмаса One) върху леден блок и бяха взети тъканни перфорации на дорзалния стриатум (bregma: ~ 2.2 до -0.26 mm). Щанцовите тъкани се събират бързо, замразяват се и се съхраняват при -80 ° C до употреба. Отделните проби бяха размразени върху лед и бяха събрани равни количества стритална тъкан на базата на зависимо от теглото средно разделение на групите за достъп (плъхове 7 – 10 на басейн). Тъканта се ресуспендира в 500 μl ледено студен RIPA буфер (Thermo Scientific), съдържащ натриев ортованадат, инхибитори на фосфатазен коктейл 1 и 2 (Sigma-Aldrich), левпептин и пепстатин преди хомогенизиране. Тъканните лизати се варят за 10 min в буфер за проба и се зареждат в 4% -20% или 10% Tris-глицин SDS гелове (Invitrogen). Протеинът се прехвърля върху нитроцелулозни мембрани, блокирани за 1 h при ~ 23-25 ° C (5% сухо обезмаслено мляко и 0.2% Tween-20 в PBS, рН 7.4) и се инкубират в първично антитяло през нощта при 4 ° C. Следващите първични антитела се разреждат в блок разтвор: D2R миши моноклонални (Santa Cruz, 1: 100) или Р-актин миши моноклонални (Santa Cruz, 1: 200). Хемилуминесцентният ECL реагент се добавя след инкубиране с конюгирани с хрян пероксидаза вторични антитела (Amersham, 1: 2,000). Зрело свързаната с мембраната форма на D2DR (70 kDa) 17, 49 се нормализира до контрола на зареждане с протеин (Р-актин; 43 kDa) и се определя количествено чрез денситометрия с използване на NIH Image J софтуер.

Имунохимичен анализ.

Плъховете бяха анестезирани и транскардиално перфузирани с 4% параформалдехид в PBS (рН 7.6). Мозъците се отстраняват, поставят се фиксирани за една нощ и се съхраняват в захароза (30% разтвор в PBS, рН 7.4) за най-малко 72 h. Замразени тъканни срезове (30 μm дебелина) се събират от микротом и се блокират (3% BSA, 5% нормален козен серум и 0.3% Triton X-100 в PBS) за 1 h при ~ 23-25 ° С. Следните първични антитела се добавят към блоковия разтвор и се инкубират в продължение на една нощ при 4 ° С: пилешки поликлонал към GFP (Abcam, 1: 1,000); заешко моноклонално до GFAP (Millipore, 1: 1,000); миши моноклонални до NeuN (Millipore, 1: 1,000). Срезовете се инкубират с флуоресцентно-конюгирани вторични антитела при ~ 23-25 ° C: анти-пиле-488-nm багрило (Jackson ImmunoResearch, 1: 1,000), анти-заешко-594-nm багрило (Invitrogen, 1: 1,000) ) и анти-мише-594-nm багрило (Invitrogen, 1: 1000). Секциите бяха монтирани с Vectashield монтажна среда, съдържаща DAPI (Vector Labs) и покрити с покритие. Изображенията са направени с помощта на флуоресцентен микроскоп Olympus BX61 (обектив × 2) или конфокален микроскоп Olympus (цели 10 и × 100).

Процедура на хранене.

Плъховете се настаняват поотделно върху хартиени подложки (алфа-подложки; Shepherd Specialty Papers), за да се предотврати замърсяването на хранителните продукти с разхлабени материали за легла. Диетата в кафетерия се състоеше от бекон, колбас, чийзкейк, паундова торта, глазура и шоколад, които бяха индивидуално претеглени преди да бъдат предоставени на плъховете. Хранителните хранителни продукти в кафетерията бяха доставени в малки метални съдове. Всички хранителни продукти, включително стандартна лабораторна храна, се претеглят отново след завършване на храненето. Калоричният прием от различните макронутриенти се изчислява, като се използва хранителната информация, предоставена от производителя.

Потискане на хранителното поведение, предизвикано от Cue.

Процедурите за хранене се провеждат в шумозаглушени оперантни камери, идентични по размери с тези, използвани в експериментите с BSR. Плъховете бяха поставени в оперантна камера и имаха достъп до диетата на кафенето или чау в продължение на 30 минути. Хранителните продукти се доставяха в малки метални съдове. Всички хранителни продукти се претеглят преди и след хранене, което се извършва по време на нормалния период на хранене на плъховете. Консумацията на чау е оценена чрез консумация на пелети от чау от 45 mg, идентични по състав на чау, осигурени в домашните клетки на плъховете. След това на плъховете беше разрешен достъп от 30 минути на ден до диетата в кафенето, докато се постигне стабилен прием (дефиниран като <10% вариация в дневния прием), изискващ 5-7 дни. След стабилизиране на вкусния прием на храна през този изходен период, плъховете във всяко състояние на достъп бяха разпределени в две групи: наказани (тези, които получават шок от крака) и ненаказани (без да получават шок от крака). След това плъховете бяха подложени на четири кондициониращи сесии през последователни дни в същата оперантна камера, в която преди това са имали достъп до вкусната храна. По време на 30-минутните сесии за кондициониране, светлината-сигнал (условният стимул) се активира за 10 минути, изключва се за 10 минути и след това се включва отново за 10 минути. Наказаните плъхове са получили шок от крака само по време на представяне на светлината (0.5 mA за 1.0 s; 10 стимулации с интервали от ~ 1-минута). Безнаказаните плъхове бяха представени със светлината-реплика по същия начин, но без доставяне на крак шок. В тестовия ден, в деня след финалната кондиционна сесия, плъховете в наказаните групи получават периодичен шок на крака (общо пет стимулации), сдвоени с активиране на светлината на сигнала за 5 минути. Безнаказаните плъхове отново бяха изложени на светлината-реплика при липса на шок от крака. След периода на наказанието от 5 минути, на всички плъхове беше разрешен достъп до вкусната храна за 30-минутна сесия с периодично активиран кондициониран стимул (10 минути включена светлина, 10 минути изключена светлина, 10 минути включена светлина).

Статистически анализи.

Изходните прагове за възнаграждение бяха определени като средна прагова стойност за 5 d преди достъп до диети за кафене за всеки субект. Праговете за възнаграждение бяха изразени като процентно изменение от базовата прагова стойност. Данните за процента на базовите прагови стойности за възнаграждение, увеличаването на теглото, консумацията на калории и консумацията на калории от мазнини бяха анализирани чрез двуфакторен анализ на повторяемост на мерките, с достъп (само за храна, ограничен достъп или разширен достъп), източник на калории ( стандартна диета от храна или кафетерия), вирус (Lenti-control или Lenti-D2Rsh) и реплика (двойка или несвързана с наказание) като фактори между участниците и време като фактор вътре в субекта. Когато е уместно, основните ефекти в анализите на дисперсията бяха допълнително анализирани от тестовете Bonferroni post hoc. Всички статистически анализи бяха извършени с помощта на GraphPad Prism софтуер.

Източници

Източници

Кореспонденция с:

· Пол Дж. Кени ([имейл защитен])