Multnombraj studoj kun la markilo de neŭra aktiveco Fos indikas, ke kokaino aktivigas nur malgrandan proporcion de neŭtriaj striaj neŭronoj. Ĝis nun, efikaj metodoj ne estis haveblaj taksi neŭroadaptojn induktitajn specife ene de ĉi tiuj aktivigitaj neŭronoj. Ni uzis fluoreskajn aktivigitajn ĉelojn (FACS) por purigi striatajn neŭronojn aktivigitajn dum kokona-induktita lokomocio en naiva kaj kokain-sentivigita cfos-lacZ transgenaj ratoj. Aktivigitaj neŭronoj estis markitaj kun antikorpo kontraŭ β-galactosidase, la proteina produkto de la geno lacZ. ĈOcaine induktis unikan genan espriman profilon selektive en la malgranda proporcio de aktivigitaj neŭronoj, kiuj ne estis observitaj en la neaktiva plimulto de neŭronoj. Ĉi tiuj genoj inkluzivis ŝanĝitajn nivelojn de la tujaj fruaj genoj arko, fosBKaj nr4a3, same kiel genoj implikitaj en p38 MAPK-signalado kaj ĉel-speca specifaĵo. Ni proponas, ke ĉi tiu FACS-metodo uzeblas por studi molekulajn neŭroadaptojn en specifaj neŭronoj kodantaj la kondutajn efikojn de misuzitaj drogoj kaj aliaj lernitaj kondutoj.

bestoj

ino cfos-lacZ transgenaj ratoj (Kasof et al., 1995; Koya et al., 2009) kaj inaj Sprague-Dawley-ratoj (Charles River, Raleigh, NC, Usono) estis loĝigitaj individue en normaj plastaj kaĝoj en temperaturo kaj humideco-kontrolita ĉambro. Ili estis konservitaj sur 12: 12 h inversa lumo: malhela ciklo (lumoj ŝaltitaj ĉe 20.00 h), kaj permesis senpagan aliron al manĝo kaj akvo. Ili estis alklimigitaj al ĉi tiuj loĝaj kondiĉoj dum minimume 7-tagoj antaŭ drogaj traktadoj. Eksperimentaj proceduroj estis aprobitaj de la NIDA-Besto-Prizorgo kaj Uzo-Komitato.

Traktadoj de drogoj

Por akutaj kokainaj eksperimentoj, ratoj estis injektitaj kun kokaino (30 mg / kg, ip; n = 8) aŭ salo (1 ml / kg; n = 6) kaj metis en rondan Plexiglass-ĉambron (38 cm-diametro). Ratoj estis oferitaj 90 minutojn post injektoj por akiri cerban histon. Ĉi tiu traktado estis ripetita tri fojojn en apartaj tagoj por akiri tri biologiajn replikojn por analizo de mikroarray. Aldone, tri sendependaj biologiaj replikoj estis simile produktitaj por kvanta PCR (qPCR). Por qPCR-analizoj de arko, pdyn, adora2a, nur ĉi tiuj tri sendependaj biologiaj replikoj estis uzataj. Por qPCR-analizoj de fosB, nr4a3, kcnc1, kaj mapo2k6, Ni ankaŭ uzis restantan RNA de ĉiu el la mikroarray-specimenoj.

Por ripetitaj kokainaj eksperimentoj, inaj ratoj estis sentivigitaj per kvar injektoj de kokaino (15 mg / kg ip) administritaj unufoje ĉiun duan tagon. En injektotagoj, ĉiu rato estis metita en XMUMX × 43 cm kvadratan Plexiglas-lokomotora agadkamero (Med Associates, St Albans, VT, Usono) por kutimi 43-minutojn. Ratoj estis injektitaj kun kokaino kaj lokomotora agado estis registrita kiel distanco vojaĝita dum 30-minutoj. Post la kvara ripetita kokain injekto, ratoj restis en sia hejma kaĝo dum 60-7 tagoj. En testo tago, ratoj estis kutimigitaj por 8-min en la lokomotoraj ĉambroj kaj tiam injektitaj kun kokaino (30 mg / kg ip) aŭ salina veturilo. Ratoj dekapitis kaj cerboj estis ĉerpitaj naŭdek minutojn post injektoj. La tuta sentiviga traktado estis ripetita tri fojojn dum apartaj semajnoj por akiri tri biologiajn replikojn de ĉiu grupo por qPCR-analizo.

Ĉela dissociacio

Striatala histo estis disocia por akiri unusolan ĉelon. Ratoj dekapitis kaj ties striato ĉerpis ene de du minutoj. Ĉiu striato estis pikita per razaj klingoj sur glacia malvarma vitra plato kaj metita en 1 ml da Hibernato A (Kato # HALF; Brain Bits, Springfield, IL). Striataoj estis enzimataj digestiĝitaj en 1 ml da Accutase per striatum (Cat # SCR005; Chemicon, Billerica, MA) kun fin-super-fina miksado por 30 min ĉe 4 ° C. Ŝtofo estis centrifugita dum du minutoj ĉe 425 × g kaj resopandita en 300 µl da glacia malvarma Hibernato A. Ĉiuj postaj centrifugaj paŝoj estis faritaj je 4 ° C.

Digestita striatula histo estis me mechananike disigita per trito. Kvar striatoj estis kombinitaj en unu Eppendorf-tubon kaj trituratajn dek fojojn per granda diametro Pasteur-pipeto (~ 1.3mm). Tuboj estis nelonge metitaj sur glacion por aranĝi grandajn histojn; 600 µl da nuba suspendo enhavanta disociatajn ĉelojn estis translokigitaj al 15 ml Falcon-tubo sur glacio. 600μL da freŝa Hibernato A estis aldonita al la originala Eppendorf-tubo kaj tiam trituradaj paŝoj ripetiĝis kiel supre kun pipoj de mezaj kaj malgrandaj diametroj (~ 0.8mm kaj ~ 0.4mm). Ĉiu nuba suspendo enhavanta disajn ĉelojn estis kunigita kun la antaŭa pendado.

Restantaj ĉelaj rampoj en la amasigita ĉela suspendo estis forigitaj per filtrado per antaŭ-malsekigitaj 100 μm kaj 40 μm-ĉelaj kribriloj (Falcon-marko, BD Biosciences, San Jose, CA). Malgrandaj ĉelaj forĵetaĵoj en la suspendo estis reduktitaj centrifugante la filtraton por 3 min ĉe 430 × g tra tri-paŝa denseca gradiento de Percoll (Cat # P1644; Sigma, Sankta Luiso, MO). La nuba supra tavolo (proksimume 2 ml) enhavanta forĵetaĵojn forĵetis. La ĉeloj en la ceteraj tavoloj estis ĉesigitaj de la restanta Percoll-solvo kaj centrifugitaj dum kvin minutoj ĉe 550xg. La buleto estis resendita en 1 ml da Hibernato A.

Immunolabeling kaj FACS

Disigitaj ĉeloj estis fiksitaj kaj permeabligitaj aldonante egalan volumenon de etanolo por fina koncentriĝo de 50% etanolo kaj konservitaj sur glacio dum 15-minutoj per foja miksado. Ĉeloj estis centrifugitaj dum du minutoj ĉe 425xg kaj resuspendigitaj en RNase-senpagaj fosfat-bufritaj saloj (PBS). Ĉeloj estis inkubataj per biotinilata primara antikorpo kontraŭ NeuN (diluvo 1: 1000, Cat # MAB377B, Chemicon) kaj primara antikorpo kontraŭ β-galactosidasa ((β-gal; 1: diluado 10000, Cat # 4600-1409, Biogenesis, Biogenesis) , Unuiĝinta Reĝlando). Ĉeloj estis rotaciitaj end-over-end en primara antikorpo dum 30-minutoj ĉe 4 ° C kaj centrifugitaj dum tri minutoj ĉe 425xg. La ĉeloj estis lavitaj kun 800 μl de PBS kaj resubpenditaj en 700 μl de PBS. Ĉeloj estis inkubitaj. kun fluoreska markita streptavidino (Streptavidin-phycoerythrin, 1: 1000 diluvo, Cat # SA1004-1, Invitrogen, Carlsbad, CA) kaj malĉefa antikorpo (Alexa Fluor 488-markita kontraŭ-kapra IgG, 1: 1000-diluado, CatN # AX, diluado CatN # X) 11055, Invitrogen) kaj turnita ekstrema-super-fino por 15 min-ĉeloj estis lavitaj kun 800 µl de PBS, centrifugitaj dum tri minutoj ĉe 425 × g, kaj resuspenditaj en 1 ml da PBS.

Immunolabeled-ĉeloj estis skanitaj kaj ordigitaj ĉe la Johns Hopkins Bayview Campus-fluo-citometria kerna instalaĵo. FACS Aria (BD, Franklin Lakes, NJ) estis uzata por ĉela ordigo. Kontrolaj specimenoj estis analizitaj unue por determini optimumajn kriteriojn por ordigi testajn specimenojn. Specife, fiksaj ĉeloj sen traktado de antikorpoj estis uzataj por agordi la luman disĵetan pordegon. Fiksaj ĉeloj traktitaj kun fluoreska malĉefa antikorpo, sed neniu primara antikorpo, tiam estis uzataj por agordi sojlojn por endogena fluoreska histo kaj nespecifaj ligado per streptavidino aŭ malĉefa antikorpo. Tuj poste, kontrolaj specimenoj markitaj kun primara kaj malĉefa antikorpo por ĉiu proteino (NeuN aŭ β-gal) estis uzataj por kompensi fluoreskan interkovron en najbaraj kanaloj. Fine, testaj specimenoj etikeditaj per ambaŭ fluoreskaj markiloj estis analizitaj kaj ordigitaj. Ordigitaj ĉeloj estis kolektitaj en malalt-ligajn tubojn (Kato # 022431081, Eppendorf, Westbury, NY) kun 100 μl de PBS en ĉiu tubo.

RNA eltiro

Post ordigo, specimenoj enhavantaj ĉu βgal-pozitivajn aŭ βgal-negativajn ĉelojn el raŭkaj injektitaj kokainoj aŭ ĉiuj NeuN-pozitivaj ĉeloj el salaj injektitaj ratoj estis centrifugitaj dum 8 min ĉe 2650 × g ĉe 18 ° C. NeuN-negativaj ĉeloj de salaj injektitaj ratoj centrifugis dum 8 min ĉe 6000 ×g je 18 ° C. Por mikroarraj eksperimentoj, RNA estis ĉerpita kun Trizol Reagent (Kato # 15596-026, Invitrogen) laŭ la instrukcioj de fabrikanto. Kvalito kaj kvanto de RNA estis taksitaj uzante la Bioanalyzer Picochip (Kato # 5067-1513, Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Por qPCR-eksperimentoj, RNA estis ĉerpita kun kit RNEasy Micro (Kato # 74004; Qiagen, Valencio, CA) laŭ la instrukcioj de fabrikanto kun DNase-traktado. Kvanto kaj pureco de RNA estis taksita uzante Nanodrop-spektrofotometron (Thermo Scientific, Wilmington, DE).

Microarray-eksperimentoj

Microarrays estis uzata por analizi RNA de NeuN-pozitivaj kaj NeuN-negativaj ĉeloj de salaj injektitaj ratoj, kaj βgal-pozitivaj kaj βgal-negativaj neŭronoj de kokainaj injektitaj ratoj. Kiel priskribite supre en la sekcio pri drogoj, mikroartikoj enhavis tri biologiajn replikojn por ĉiu el la kvar specimenoj. Kvin µl da totala RNA de ĉiu specimeno estis etikeditaj uzante la Illumina TotalPrep RNA-Amplifikado-Kit (Kato # IL1791; Ambion, Austin, TX) en du-paŝa procezo de cDNA-sintezo sekvita de en vitro RNA-transskribo kun biotino-16-UTP. 0.75 μg de biotin-markita cRNA estis hibridigitaj dum 16-horoj al Illumina Sentrix Rat Ref12_v1 BeadChips (Cat # BD-27-303; Illumina, San Diego, CA). Biotinylated cRNA hibridigita al la blato estis detektita kun Cy3-markita streptavidino kaj kvantigita uzante la ilaron BeadStation 500GX Genetic Analysis Systems-skanilon. Ĉiuj etikedado kaj analizo estis farita ĉe la Johns Hopkins Bayview Medicina Kampuso Lowe Family Genomics Core.

PCR-kvanta reala tempo

Realtempa kvanta PCR estis uzita por validigi FACS kaj mikrorajn rezultojn. RNA estis inversa transskribita en cDNA uzante la kit RETROscript (Kato # AM1710, Ambion) kun primara oligo (dT). Ĉiu 25 μl PCR-reago inkluzivis 12.5 μl de Taqman Gene Expression Master Mix (Kato #4369514; Aplikataj Biosistemoj, Foster City, CA), 1.1 μl ĉiu el 20 μM antaŭen kaj inversajn printilojn, 0.25 μl de 100 μM FAM-etiketita sondilo, 5 µl da akvo, kaj 5 μl de 1 ng / µl cDNA. Kombinaĵoj de sondilo kaj sondilo [tablo 1] estis dizajnitaj uzante la Ensemblo-Projekton de Roche Universal Probe Library por esti intron-ampleksanta. PCR-reagoj estis monitoritaj uzante la Opticon Light Cycler (Biorad, Hercules, MD). La programo komenciĝis per 20-plato legas ĉe 50 ° C por fotoblikado, sekvita per 5 min ĉe 95 ° C, kaj poste 40-cikloj de 20 sek ĉe 94 ° C, 1 min ĉe 60 ° C, kaj plato legita.

 

tablo 1

Primiloj kaj sondoj uzataj por qPCR

Normaj kurbaj reagoj unue estis prizorgitaj por ĉiu geno por determini ampleksan efikecon [tablo 1]. Esprimo niveloj por ĉiu amplifita geno estis kalkulitaj uzante efikecon ^ ΔC_q kie ΔC_q = C_q(eksperimenta geno) - C_q(referenca geno) por ĉiu biologia repliko. Gorasp2 estis elektita kiel referenca geno ĉar ĝi ne estis malsame esprimita inter neŭronoj kaj gliaj en mikroarray-analizoj. Ĝi estis plu validita kiel referenca geno pro egala qPCR-amplifado tra ĉiuj specimenoj dum la ŝarĝo de la sama kvanto de ŝablono. Teknika provo triobligas C_q valoroj estis averaĝitaj antaŭ kalkuli ΔC_q por ĉiu geno en specimeno. Por ĉiu mRNA mezurita en qPCR, genaj esprimaj valoroj estis averaĝitaj tra biologiaj replikoj. Poste por reflekti fald-ŝanĝajn valorojn, ni dividis ĉi tiun mezumon per la mezaj genaj esprimaj valoroj de NeuN-pozitivaj ĉeloj el salaj injektitaj ratoj. Ĉi tiuj valoroj estas indikitaj kiel rimedoj kaj normaj eraroj en la grafikaĵoj kaj tabloj.

Immunohistoĥemio

Cerba histo estis akirita de sovaĝaj tipaj inoj Spraque-Dawley-ratoj sekvante la samajn akrajn kaj ripetajn kokainajn traktadojn priskribitajn supre por la mikroarray kaj qPCR-eksperimentoj. Tamen 90 minutojn post testo tagaj injektoj, ratoj estis profunde anestezitaj kun isoflurano kaj perfuzitaj kun 100 ml de PBS sekvitaj de 400 ml de 4% paraformaldehido (PFA). Cerboj estis post-fiksitaj en PFA dum 2-horoj kaj transdonitaj al 30% sukrosa solvo ĉe 4 ° C dum 2-3-tagoj. Cerboj estis frostigitaj sur pulvorigita seka glacio kaj konservitaj je −80 ° C ĝis disiĝo. Koronaj sekcioj estis tranĉitaj 40 μm dikaj inter Bregma 2.5 kaj −0.5 (Paxinos kaj Watson, 1998).

Sekcioj estis imunelaborataj por Fos kaj Arko. Mallonge, sekcioj estis lavitaj tri fojojn en Tris-bufrita salo (TBS) kaj permeabligitaj por 30 min en TBS kun 0.2% Triton X-100. Sekcioj estis lavitaj denove en TBS kaj inkubitaj en primaraj antikorpoj diluitaj en PBS kun 0.3% Triton X-100 dum 24-horoj sur shaker ĉe 4 ° C. Ni uzis kuniklon poliklonal kontraŭ antikorpo c-Fos (diluvo 1: 500, Cat # sc-52, Bioteknologio de Santa Cruz, Santa Cruz, CA) kaj muson antikorpan Arkon monoklonan (diluvo 1: 100, Cat # sc-17839, Santa Cruz Biotechnology). Sekcioj estis lavitaj tri fojojn en TBS kaj inkubitaj en malĉefaj antikorpoj diluitaj en PBS dum 1.5-horoj sur shaker ĉe ĉambra temperaturo. Ni uzis kontraŭ-kuniklan antikorpon Alexa Fluor 488-markitan azenon (1: 200-diluo, Kato # A21206, Invitrogen) kaj kontraŭfusa antikva antikorpoj de 568-1-markita kapsula Alexa Fluor (200: XNUMX-diluo, Kato # A11004, Invitrogen). Sekcioj estis lavitaj en TBS, muntitaj sur krom-alumajn tegitajn lumbildojn, kaj kovritaj per VectaShield malmola fiksita muntilo.

Fluoreskaj bildoj de Fos kaj Arc-imunoreaktiveco en kaŭdato-putamen kaj NAc (proksimume 2.0 mm antaŭaj al Bregma) estis kaptitaj per CCD-fotilo (Coolsnap Fotometrics, Roper Scientific Inc., Trenton, NJ) ligita al Zeiss Axioskop 2-mikroskopo. Bildoj por kalkuli etikeditajn ĉelojn estis prenitaj ĉe 200x-pligrandiĝo; bildoj por determini Fos kaj Arc-kolokalizon estis prenitaj ĉe 400x-pligrandiĝo. Labelitaj ĉeloj el kvar hemisferoj po rato estis aŭtomate kalkulataj per IPLab-programaro por Makintoŝo, versio 3.9.4 r5 (Scanalytics, Inc., Fairfax, VA). Kalkuloj el ĉiuj kvar hemisferoj averaĝis akiri ununuran valoron por ĉiu rato.

Datumoj analitiko

Datumoj pri lokomotora sentiveco estis analizitaj per unudirekta ANOVA kun ripetaj mezuroj por la ĉefa efiko de tempo dum 4-injektaj tagoj. Statistika signifo estis fiksita je p <0.05. Microarray-datumoj estis analizitaj uzante DIANE 6.0, kalkul-bazitan microarray-analizan programon bazitan sur SAS JMP 7.0, kiel antaŭe priskribite (Garg et al., 2009). Fluoreskaj intensaj datumoj de mikroradioj estis submetitaj al filtrado per detekto p-valoroj kaj Z normaligo. Specimenkvalito estis analizita per scatterplotoj, ĉefa komponentanalizo kaj gena specimeno Z-punkt-bazita hierarkia agregacio por ekskludi eblajn valorojn. ANOVA-testoj tiam estis uzitaj por elimini genojn kun pli grandaj variancoj ene de ĉiu kompargrupo. Genoj estis identigitaj kiel diference esprimitaj se p <0.01, absoluta Z-ratio ≥ 1.5, kaj falsa malkovra proporcio (fdr) <0.07. Por qPCR-datumoj, unudirekta ANOVA estis uzita por kompari datumojn por ĉiu geno. Statistika signifo estis fiksita je p <0.05. Por Fos kaj Arc-imunohistoochememio, t-testo supozanta neegalan variancon estis uzata por kalkuli statistikan signifon, starigita je p <0.05.

trans-genaj ratoj cfos-lacZ

la cfos-lacZ transgeno en ĉi tiuj ratoj estas reguligita de a c-fos iniciatinto simila al tiu en la endogeno c-fos geno kaj estas tiel same aktiva en neŭronoj per altaj niveloj de ekscitita sinaptia enigoShin et al., 1990; Labiner et al., 1993; Sgambato et al., 1997). La proteina produkto de la cfos-lacZ transgeno, β-galactosidase (βgal), ko-esprimita kun c-Fos en forte aktivigitaj neŭronoj (Koya et al., 2009) kaj kutimis etikedi striajn neŭronojn en la sekva FACS-puriga proceduro.

FACS-purigado de aktivigitaj striaj neŭronoj sekvante unuopajn akrajn kokainajn injektojn

Tuta striato estis akirita de cfos-lacZ Rato 90-minutoj post akraj injektoj de 30 mg / kg kokaino aŭ salo ekster sia hejma kaĝo. Disigitaj striataj ĉeloj de simile traktitaj ratoj estis kunmetitaj antaŭ purigado de FACS por ĉiu el la biologiaj replikoj en postaj analizoj de microarray kaj kvanta PCR (qPCR). Disigitaj striaj ĉeloj estis komence analizitaj laŭ iliaj antaŭaj kaj flankaj lum-disvastigaj trajtoj [Figuro 1a]. La plimulto de NeuN-markitaj neŭronoj estis trovitaj ene de strio de eventoj laŭ la malsupra parto de la intrigo. Tiel, ĉiuj postaj analizoj estis plusenditaj por inkludi nur eventojn trovitajn en ĉi tiu strio.

 

figuro 1

Fluoreska aktivigita ĉela ordigo de βgal-markitaj neŭronoj el ratoj traktitaj per ununura injekto de kokaino

La ĉeloj ene de ĉi tiu pordego estis disigitaj laŭ sia grado de imunombrado kun la neurona markilo NeuN kaj la neŭra aktivigo-markilo βgal. En histo akirita de kokainaj injektitaj ratoj, proksimume 15% de NeuN-markitaj neŭronoj havis altajn nivelojn de βgal [Figuro 1b], kiu korespondis al proksimume 100,000 βgal-markitaj neŭronoj per rato. Ĉiuj βgal-markitaj ĉeloj ko-esprimis NeuN, indikante ke nur neŭronoj esprimis βgal. Kontraŭe, tre malmultaj NeŭN-markitaj neŭronoj akiritaj de salo-injektitaj ratoj esprimis la aktivigajn markilojn βgal aŭ Fos, kiu subtenas imunoreaktivecon βgal kaj Fos kiel markiloj de neŭra aktivigo ĉe kokainaj injektitaj ratoj. La malaltaj nombroj da βgal-esprimantaj neŭronoj el salaj injektitaj ratoj ne provizis sufiĉe da ĉeloj por postaj molekulaj analizoj. Tiel, ni uzis nur NeuN-etikedadon por disigi neŭronajn de ne-neuronaj ĉeloj en ĉiuj postaj eksperimentoj kun striata histo akirita de salaj injektitaj ratoj. Entute proksimume 30% de ĉiuj striaj ĉelaj korpoj estis NeuN-pozitivaj, kio korespondis al proksimume 600,000-striataj neŭronoj per rato. Kiam FACS-elpurigitaj ĉeloj estis ekzamenitaj per fluoreska mikroskopo, ĉiuj ĉeloj estis rondaj kaj senproblemaj de procezoj [figuro 2]. Mikroskopa observado konfirmis, ke FACS-ordigitaj ĉeloj estis taŭge etikeditaj por NeuN− kaj βgal-imunoreaktiveco. Provaĵoj de FACS-purigitaj ĉeloj estis trovitaj esti> 90% puraj kiam taksitaj per dua raŭndo de flua citometrio (datumoj ne montritaj).

 

figuro 2

Mikroskopaj fotoj de purigitaj ĉeloj kaj forĵetaĵoj de FACS

Ni determinis selekteblecon de nia puriga proceduro de FACS kun microarray por analizi genajn esprimajn padronojn de la purigitaj ĉeloj de FACS. Ni komparis genan esprimon en βgal-pozitivaj kaj βgal-negativaj neŭronoj de kokainaj injektitaj ratoj same kiel NeuN-pozitivajn kaj NeuN-negativajn ĉelojn de salaj injektitaj ratoj. Ĉefa komponento kaj grupiga analizo indikis, ke la ĉefa diferenca faktoro estis ĉu la ĉeloj estis neŭronoj aŭ gliajFiguro 3a]. La dua diferenciga faktoro estis βgal-esprimo uzata por apartigi aktivigitajn de ne-aktivigitaj neŭronoj. Genoj estis identigitaj kiel diference esprimitaj se p <0.01, absoluta Z-ratio ≥ 1.5, kaj falsa malkovra proporcio (fdr) <0.07. Ni trovis, ke 125 genoj pliiĝis kaj 467 genoj malpliiĝis en βgal-pozitivaj neŭronoj rilate al βgal-negativaj neŭronoj akiritaj de la sama striata histo de kokain-injektitaj ratoj [Figuro 3b]. Kiam la samaj βgal-pozitivaj neŭronoj de kokain-injektitaj ratoj estis komparitaj por kontroli specimenojn de ĉiuj NeuN-etikeditaj neŭronoj de salaj injektitaj ratoj, 133 genoj estis pliigitaj kaj 890 genoj malpliigitaj en la βgal-pozitivaj neŭronoj. Precipe la du kontrolgrupoj - βgal-negativaj neŭronoj de kokain-injektitaj ratoj kaj ĉiuj NeuN-markitaj neŭronoj de salo-injektitaj ratoj - produktis tre similajn genajn esprimajn ŝablonojn; gena esprimo ne estis signife malsama inter ĉi tiuj kontrolaj grupoj [Figuro 3b].

 

figuro 3

Microarray-analizo de ĉeloj ordigitaj el rat-striata post sola injekto de kokaino aŭ salo

Specifaj genoj trovitaj en la malsamaj specimenoj konfirmis apartigon de aktivigitaj de neaktivaj neŭronoj, same kiel neŭronajn de ne-neuronaj ĉeloj uzantaj FACS [tablo 2]. βgal-pozitivaj neŭronoj de kokainaj injektitaj ratoj esprimis pli altajn nivelojn de multaj neŭraj aktivigaj markadaj genoj rilate al βgal-negativaj neŭronoj de la samaj injektitaj ratoj de kokaino aŭ ĉiuj neŭronoj kun NeuN-etikeditaj de salaj injektitaj ratoj [Figuro 3c]. Ĉi tiuj aktivecoj markas genon c-fos, junB, arko, ekz familio (1, 2, 4), kaj nr4a3 (Guzowski et al., 2005). Interese, ĉi tiuj βgal-pozitivaj neŭronoj ankaŭ esprimis signife pli altajn nivelojn de la specifa markanta prodynorfina geno de D1-dopamina-ricevilo kaj signife pli malaltajn nivelojn de la geno D2-dopamina-receptoro.

 

tablo 2

Resumo de mikroarray kaj qPCR-datumoj de la akra kokaino-eksperimento.

Datenoj pri esprimo de genoj Microarray estis validigitaj uzante qPCR. La genoj por markilo de aktivecoj fosB, arkoKaj nr4a3 estis esprimitaj ĉe pli altaj niveloj en βgal-pozitivaj neŭronoj de ratoj injektitaj kun kokaino relative al ambaŭ βgal-negativaj neŭronoj de la samaj injektitaj ratoj de kokaino kaj al ĉiuj neŭronoj el salaj injektitaj ratoj [Figuro 4a; datumoj kaj statistikaj informoj en tablo 2]. βgal-pozitivaj neŭronoj ankaŭ esprimis pli altajn nivelojn de la geno prodynorphin [Figuro 4b]. Dum βgal-pozitivaj neŭronoj havis ŝajne pli malaltajn nivelojn de esprimo por pluraj genoj, inkluzive de la A2A-adenosin-ricevilo, la Kv3.1-kalia kanalo, kaj map2k6 / MEKK6 genoj, nur Kv3.1 kaj map2k6 / MEKK6-genaj esprimoj estis statistike malsamaj [statistikaj niveloj qP]Figuro 4c]. Entute, genaj esprimaj ŝanĝoj taksitaj per qPCR estis preskaŭ identaj al genaj esprimaj ŝanĝoj taksitaj de mikroarray-eksperimentoj.

 

figuro 4

Kvanta PCR pruvas malsaman genekspresion por βgal-pozitivaj neŭronoj post akutaj kokainaj injektoj, kompare kun βgal-negativaj neŭronoj de la samaj ratoj, aŭ al ĉiuj neŭronoj de salaj injektitaj ratoj.

Por determini ĉu mRNA-ŝanĝoj en aktivigitaj neŭronoj reflektiĝis ĉe la proteina nivelo, ni uzis imunohistoocheemian analizon de koronaj cerbaj sekcioj de kokinaj kaj salaj injektitaj sovaĝaj virinaj ratoj [figuro 5]. Ĉi tiuj sekcioj ne spertis disigon aŭ FACS, kaj tial imunohistokemia analizo ne estis tuŝita de la ĉela diso trovita en la FACS-proceduro. En ventra striato el kokainaj injektitaj ratoj [Figuro 5a], la neŭra agado markiloj Fos kaj Arko estis ko-esprimitaj en la samaj ĉeloj: 85 ± 4% de ĉiuj Fos-pozitivaj ĉeloj estis Arc-pozitivaj, dum 82 ± 3% de ĉiuj Arko-pozitivaj ĉeloj estis Fos-pozitivaj. Kokainaj injektoj produktis 2.7-obla pliigo en Fos-etikedaj neŭronoj kaj 2.7-obla pliiĝo en Arko-markitaj neŭronoj. En dorsal striato el kokainaj injektitaj ratoj [Figuro 5b], 80 ± 2% de ĉiuj Fos-pozitivaj ĉeloj estis Arc-pozitivaj, dum 86 ± 3% de ĉiuj Arc-pozitivaj ĉeloj estis Fos-pozitivaj. Kokainaj injektoj produktis 4.4-obla pliigo en Fos-etikedaj neŭronoj kaj 3.8-obla pliiĝo en Arko-markitaj neŭronoj.

 

figuro 5

Fos kaj Arko estas ko-esprimitaj en (a) ventral-striatum kaj (b) dorsal-striatum post ununura injekto de kokaino

FACS-Purigado de aktivigitaj striaj neŭronoj de kokain-sentivigitaj ratoj

En la dua FACS-eksperimento, ĉiuj ratoj estis sentivigitaj per ripetaj kokainaj injektoj. Repetita kokainadministrado en la lokomotora skatolo plibonigis kokain-induktitan lokomotion: lokomotio dum tago 7 estis 180 ± 18% de tago 1-lokomotivo (ĉefa efiko de tempo super 4-ripetitaj injektoj, F_{3, 363} = 24.9, p <0.001), kiu indikis signifan psikomotoran sentivecon. Sep tagojn poste en testotago, kokaino aŭ salo estis administritaj al ratoj en la sama lokomotora skatolo. Naŭdek minutojn poste, stria histo inkluzive NAc estis ĉerpita kaj ĉeloj estis purigitaj per FACS per la proceduro priskribita supre.

La ĉeloj ene de la sama malpeza disĵetita strio de eventoj kiel en la antaŭa eksperimento estis apartigitaj laŭ ilia grado de imunomarkado per la neurona markilo NeuN kaj la neŭra aktivigo-markilo βgal. En histo akirita de kokainaj injektitaj ratoj, proksimume 10% de NeuN-markitaj neŭronoj havis altajn nivelojn de βgal [figuro 6], kiu korespondis al proksimume 60,000 βgal-markitaj neŭronoj per rato. Ĉiuj βgal-markitaj ĉeloj ko-esprimis NeuN, indikante ke nur neŭronoj esprimis βgal. Denove, histo akirita de ratoj injektitaj kun salo en la tago de testo produktis tre malmultajn neuronojn βgal- aŭ Fos-esprimantajn, kaj do ne sufiĉe da ĉeloj por postaj molekulaj analizoj. Tial ni uzis nur NeuN-etikedadon por disigi neŭronajn de ne-neuronaj ĉeloj akiritaj de salaj injektitaj ratoj. Proksimume 30% de ĉiuj ĉelaj korpoj en salaj injektitaj ratoj estis NeuN-pozitivaj, kiuj en ĉi tiu eksperimento korespondis al proksimume 400,000-striataj neŭronoj per rato.

 

figuro 6

Fluoreska aktivigita ĉela ordigo de βgal-markitaj neŭronoj de sentivaj ratoj defiitaj kun kokaino 7 tagojn post ripetita kokaino

Ni uzis qPCR por kompari genan esprimon en βgal-pozitivaj kaj βgal-negativaj neŭronoj de kokainaj injektitaj ratoj kaj ankaŭ ĉiuj NeuN-pozitivaj neŭronoj de salaj injektitaj ratoj post kokaina sentiveco. βgal-pozitivaj neŭronoj de kokain-injektitaj ratoj esprimis pli altajn nivelojn de tri genoj de neŭrala agado - fosB, arkoKaj nr4a3–Rilate al βgal-negativaj neŭronoj de la samaj kokain-injektitaj ratoj kaj al ĉiuj neŭronoj de salo-injektitaj ratoj [Figuro 7a; datumoj kaj statistikaj informoj en tablo 3]. βgal-pozitivaj neŭronoj ankaŭ esprimis pli altan nivelon de la geno prodynorphin simila al tiu en la eksperimenta injekto de kokaino [Figuro 7b]. En kontrasto, βgal-pozitivaj neŭronoj havis pli malaltajn esprimnivelojn por pluraj genoj [Figuro 7c], inkluzive Drd2 kodiga D2-dopamina receptoro, kaj Map2k6 kodanta la kinaseon, kiu aktivigas p38 MAPK, similan al la ununura akra injekto de kokainina eksperimento. Finfine, βgal-pozitivaj neŭronoj pliigis esprimon de dusp1, ankaŭ konata kiel mkp1 [Figuro 7c], kiu kodas la fosfatase kiu inaktivas p38 MAPK (Sgambato et al., 1998).

 

figuro 7

Kvanta PCR pruvas malsaman genekspresion en βgal-pozitivaj neŭronoj de sentivigitaj kun kokainaj ratoj, kompare kun βgal-negativaj neŭronoj el samaj ratoj, aŭ ĉiuj neŭronoj de salaj defiitaj ratoj.

 

tablo 3

Resumo de qPCR-datumoj de la ripetita kokaineksperimento.

Por determini ĉu mRNA-ŝanĝoj en aktivigitaj neŭronoj reflektas ĉe la proteina nivelo, ni uzis imunohistokemian analizon de koronaj cerbaj sekcioj de sovaĝaj specoj de kokain-sentivigitaj virinaj ratoj sekvantaj ĉu kokainan aŭ salan injektojn en la tago de testo. En ventra striato el kokain-injektitaj ratoj, la neŭra agado-markiloj Fos kaj Arko estis ko-esprimitaj en la samaj ĉeloj: 90 ± 2% de ĉiuj Fos-pozitivaj ĉeloj estis Arc-pozitivaj, kaj 83 ± 2% de ĉiuj Arc-pozitivaj. ĉeloj estis Fos-pozitivaj. Kombinaj testaj injektoj produktis 2.3-obla pliiĝon en Fos-etikedaj neŭronoj kaj 2.2-obla pliiĝo en Arko-markitaj neŭronoj. En dorsal-striato el kokain-injektitaj ratoj, 93 ± 2% de ĉiuj Fos-pozitivaj ĉeloj estis Arc-pozitivaj, kaj 90 ± 3% de ĉiuj Arko-pozitivaj ĉeloj estis Fos-pozitivaj. Kombinaj testaj injektoj produktis 4.4-obla pliiĝon en Fos-etikedaj neŭronoj kaj 4.5-obla pliiĝo en Arko-markitaj neŭronoj. Tiel, tre malmultaj ne-Fos-markitaj ĉeloj esprimis Arkon kaj tre malmultajn ne-etikeditajn ĉelojn esprimis Fos, kio subtenas niajn trovojn de ordigitaj ĉeloj.

Ĉi tiu esplorado estis subtenita de Intramural Research Program de la Nacia Instituto pri Droguzo. D. Guez-Barber estis subtenita de NIH MSTP TG 5T32GM07205, Premio-Nombro F30DA024931 de la Nacia Instituto pri Droguzado, kaj la Charles BG Murphy Katedro pri Psikiatrio en Universitato Yale. Ni dankas Joe Chrest pro sia bonega teknika helpo kun FACS, kaj Chris Cheadle, Tonya Watkins, kaj Alan Berger por sia laboro pri la mikro-furoro. Ni dankas al Yavin Shaham helpajn komentojn pri la manuskripto.

Ne estas interesaj konfliktoj por iuj aŭtoroj de ĉi tiu manuskripto.

1. Badiani A, Oates MM, Tago HE, Watson SJ, Akil H, Robinson TE. Ekologia modulado de esprimo de c-fos, induktita de amfetamino, en D1 kontraŭ D2-stratumaj neŭronoj. Behav Brain Res. 1999: 103: 203-209. [PubMed]
2. Berretta S, Robertson HA, Graybiel AM. La dopamina kaj la glutamato agonistas stimulas specifan neŭronon esprimon de Fos-simila proteino en la striato. J Neurophysiol. 1992: 68: 767-777. [PubMed]
3. Bolshakov VY, Carboni L, Cobb MH, Siegelbaum SA, Belardetti F. Du-MAP-kinazaj vojoj medias kontraŭajn formojn de longdaŭra plasticeco ĉe CA3-CA1-sinapsoj. Nat Neurosci. 2000: 3: 1107-1112. [PubMed]
4. Bowers MS, Chen BT, Bonci A. AMPA-receptoro sinapta plasticeco induktita de psikostimuliloj: la pasinta, nuna kaj terapia estonteco. Neŭrono. 2010: 67: 11-24. [PMC libera artikolo] [PubMed]
5. Cenci MA, Campbell K, Wictorin K, Bjorklund A. Striatal c-fos Indukto de kokaino aŭ Apomorphine okazas prefere en Output Neŭronoj projekciante al la Substantia Nigra en la Rato. Eur J Neurosci. 1992: 4: 376-380. [PubMed]
6. Curran T, Franza BR., Jr Fos kaj Jun: la AP-1-konekto. Ĉelo. 1988: 55: 395-397. [PubMed]
7. Garg S, Nichols JR, Esen N, Liu S, Phulwani NK, Syed MM, Wood WH, Zhang Y, Becker KG, Aldrich A, Kielian T. MyD88-esprimo de CNS-loĝantaj ĉeloj estas fundamenta por provoki protektan imunecon en cerbaj abscesoj. ASN-Neŭro. 2009: 1. [PMC libera artikolo] [PubMed]
8. Gerfen CR, Keefe KA, Gauda EB. D1 kaj D2-dopamina ricevila funkcio en la striato: kunaktivigo de D1- kaj D2-dopaminaj riceviloj sur apartaj loĝantaroj de neŭronoj rezultigas potenciitan tujan fruan genan respondon en D1-enhavantaj neŭronojn. J Neurosci. 1995: 15: 8167-8176. [PubMed]
9. Guzowski JF, Timlin JA, Roysam B, McNaughton BL, Worley PF, Barnes CA. Mapante kondutmanierajn neŭronajn cirkvitojn kun tuja-frua gena esprimo. Curr Opin Neurobiol. 2005: 15: 599-606. [PubMed]
10. Hernandez-Lopez S, Bargas J, Surmeier DJ, Reyes A, Galarraga E. D1-ricevila aktivigo plibonigas elvokitan malŝarĝon en neostriataj mezvundaj neŭronoj per modulado de L-tipo Ca2 + konduktanco. J Neurosci. 1997: 17: 3334-3342. [PubMed]
11. Espero B, Simmons D, Mitchell T, Kreuter J, Mattson B. Aktiveco locomotora induktita de kokaino kaj esprimo de Fos en kerno accumbens estas sentivigitaj por 6 monatoj post ripeta kokaina administrado ekster la hejma kaĝo. Eur J Neurosci. 2006: 24: 867-875. [PubMed]
12. Izumi Kaj, Tokuda K, CF Zorumski. Longtempa potenciga inhibo de malaltnivela N-metil-D-aspartato-aktiviga aktivado konsistas el calcineurino, nítrico, kaj p38-mitogen-aktivigita proteino kinaso. Hipokampo. 2008: 18: 258-265. [PubMed]
13. Jaber M, Cador M, Dumartin B, Normand E, Stinus L, Bloch B. Akutaj kaj kronikaj anfetamino-kuracadoj malsame reguligas neuropeptidajn mesaĝistajn RNA-nivelojn kaj Fos-imunoreŭtenecon en ratoj-strukturaj neŭronoj. NEUROSCIO. 1995: 65: 1041-1050. [PubMed]
14. Kalivas PW. La hipotezo pri glutamato homeostazo. Nat Rev Neurosci. 2009: 10: 561-572. [PubMed]
15. Kasof GM, Mahanty NK, Pozzo Miller LD, Curran T, Connor JA, Morgan JI. Spontana kaj elvokita glutamata signalado influas esprimon de Fos-lacZ kaj piramida ĉela morto en hipokampaj tranĉaĵaj kulturoj de transgenaj ratoj. Brain Res Mol Brain Res. 1995: 34: 197-208. [PubMed]
16. Koya E, Ora S, Harvey B, Guez-Barbiro D, Berkow A, Simmons D, Bossert J, Nair S, Uejima J, Marin M, Mitchell T, Farquhar D, Ghosh S, Mattson B, Espero B. kokain-aktivigita kerno neŭronoj antaŭvidas kuntekston-specifan sentivigon. Nat Neurosci. 2009: 12: U1069. [PMC libera artikolo] [PubMed]
17. Kwon B, Houpt TA. Kombinita metodo de lasero kaptas mikro-kosadon kaj X-Gal histologion por analizi ĝenan esprimon en c-Fos-specifaj neŭronoj. J Neurosci Metodoj. 2010: 186: 155-164. [PMC libera artikolo] [PubMed]
18. Labiner-DM, ĉefservisto LS, Cao Z, Hosford-DA, Shin C, McNamara JO. Indukto de c-fos mRNA per ekbruligitaj krizo: kompleksa rilato kun neŭrona eksplodo. J Neurosci. 1993: 13: 744-751. [PubMed]
19. Liberles SD, Buck LB. Dua klaso de kemiometriaj riceviloj en la olfacta epitelio. Naturo. 2006; 442: 645 – 650. [PubMed]
20. Lobo MK, Karsten SL, Griza M, Geschwind DH, Yang XW. FACS-tabela profilado de subtriaj projektoj de neŭraj neŭronoj en junaj kaj plenkreskaj musaj cerboj. Nat Neurosci. 2006; 9: 443 – 452. [PubMed]
21. Loebrich S, Nedivi E. La funkcio de aktivec-reguligitaj genoj en la nerva sistemo. Fiziol Rev. 2009; 89: 1079 – 1103. [PMC libera artikolo] [PubMed]
22. Mattson B, Koya E, Simmons D, Mitchell T, Berkow A, Crombag H, Espero B. Context-specifa sentivigo de lokomotora aktiveco induktita de kokaino kaj asociitaj neŭronaj ensembloj en rato-kerno. Eur J Neurosci. 2008; 27: 202 – 212. [PubMed]
23. McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: molekula ŝaltilo por longtempa adapto en la cerbo. Brain Res Mol Brain Res. 2004; 132: 146-154. [PubMed]
24. Nestler E, Hope B, Widnell K. Drogmanio - modelo por la molekula bazo de neŭra plasteco. Neŭrono. 1993; 11: 995-1006. [PubMed]
25. Nestler EJ. Molekula bazo de longdaŭra plasticeco dependanta de toksomanio. Nat Rev Neurosci. 2001: 2: 119-128. [PubMed]
26. Nicola SM, Surmeier J, Malenka RC. Dopaminergia modulado de neuronal ekscitemo en la striatum kaj kerno accumbens. Annu Rev Neurosci. 2000; 23: 185 – 215. [PubMed]
27. Nicola SM, Hopf FW, Hjelmstad GO. Kontrasta plibonigo: fiziologia efiko de stria dopamina? Ĉela Tizo Res. 2004; 318: 93 – 106. [PubMed]
28. O'Donnell P. Dopamina enŝteliĝo de neŭra neŭra ensemblo. Eur J Neurosci. 2003; 17: 429 – 435. [PubMed]
29. Paxinos G, Watson C. La cerbo de rato en stereotaksaj koordinatoj. 4 San-Diego: Akademia Gazetaro; 1998
30. Pennartz CM, Groenewegen HJ, Lopes da Silva FH. La kerno kutimas kiel komplekso de funkcie distingeblaj neŭronaj ensembloj: integriĝo de kondutaj, elektrofisiologiaj kaj anatomiaj datumoj. Prog Neurobiol. 1994; 42: 719 – 761. [PubMed]
31. Peters RV, Aronin N, Schwartz WJ. c-Fos-esprimo en la rato intergenikulara flugfolio: fotika regulado, kun-lokalizo kun Fos-B, kaj ĉela identigo. Cerbo Res. 1996; 728: 231 – 241. [PubMed]
32. Sgambato V, Abo V, Rogard M, Besson MJ, Deniau JM. Efiko de elektra stimulado de la cerba kortekso sur la esprimo de la proteino Fos en la basaj ganglioj. Neŭroscio. 1997; 81: 93 – 112. [PubMed]
33. Sgambato V, Paĝoj C, Rogard M, Besson MJ, Caboche J. Ekstela-reguligita kinase (ERK) kontrolas tujan fruan genan indukton sur kortikostriatula stimulo. J Neŭroscio. 1998; 18: 8814 – 8825. [PubMed]
34. Shaham Y, Espero BT. La rolo de neŭroadaptiĝoj en rekupero de drogoj. Nat Neurosci. 2005; 8: 1437 – 1439. [PubMed]
35. Shin C, McNamara JO, Morgan JI, Curran T, Cohen DR. Indukto de c-fos mRNA-esprimo per postdiskutado en la hipokampo de naivaj kaj ekbruligitaj ratoj. J Neurochem. 1990; 55: 1050 – 1055. [PubMed]
36. Wilson CJ, Kawaguchi Y. La originoj de duŝtataj spontaneaj membranaj fluktuoj de neostriataj dornaj neŭronoj. J Neŭroscio. 1996; 16: 2397 – 2410. [PubMed]
37. Lupo ME, Ferrario CR. Plastikeco de riceviloj AMPA en la kerno akumuliĝanta post ripetita ekspozicio al kokaino. Neurosci Biobehav Rev 2010 [PMC libera artikolo] [PubMed]