Ariketa dopamina D2 hartzailea altxatzen du Parkinsons gaixotasuna duen eredu saguarekin (18F) fallypride (2010) in vivo irudiekin.

Uneko azterketaren helburua Dopamina D2 hartzailearen (DA-D2R) adierazpenen azterketa izan zen, treadmill ariketa intentsiboaren menpe dauden MPTP saguen ganglioaren barnean. Western synaptoneurosomes eta immunoblotting analisia erabiliz vivo positroien emisioaren tomografia (PET) irudia DA-D2R berariazko ligandoa erabiliz [¹⁸F] fallypride, intentsitate handiko treadmill ariketak frogatu zuen DA-D2R estrukturalaren adierazpen estrukturala nabarmenagoa izan zela, MPTP-k emandako tratamenduan saguarekin tratatutako saguarekin alderatuta. DA-D2R-ren dardaratutako ganglio baskularraren azpitik egindako aldaketak hartzekodunaren potentzialtasunarekin koherentea izaten da neurona bizkorreko neuronak (MSN) funtzionala eta portaera berreskuratzea modulatzea. Garrantzitsua, ikerketaren emaitzek onartzen dute PET irudiak erabiltzearen arrazoia [¹⁸F] fallypride DA-D2R Parkinsonen gaixotasuna (PD) duten pertsonentzako aldaketak aztertzea, intentsitate handiko treadmill entrenamenduan.

Animaliak, Tratamendu Taldeak eta MPTP Administrazioa

Gizonezkoak C57BL / 6 saguak 8 aste zaharra (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) tenperatura-kontrolatutako gela batean biltzen ziren talde batean zeuden, 12 h / 12 h iluneko zikloaren azpian. Prozedura guztiak Laborategiko Animalien Zaintza eta Erabileraren NIH Gidaren arabera egin ziren, USAC IACUC-k onetsi bezala. 164 saguak guztira lau tratamendu-taldeetan erabili ziren: (1) gatzunean (n = 42), (2) gatz gehi ariketa (n = 55), (3) MPTP (n = 57) eta (4) MPTP plus ariketa (n = 42). Lesioak lortzeko, saguak 20 mg / kg MPTP (free-base; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 0.9% gatzean disolbatutako lau intraperitoneal injekzio jaso zituzten, 2-h tartetan edo lau 0.1 ml 0.9% NaCl injekzio intraperitonealetan kontrol gisa. Lesionatzea Dopamina Estraltarreko HPLC azterketek baliozkotu zuten. 10 egunetan post-MPTP administrazioan, 82.2% dopamina agortzea zegoen MPTP saguetan (48.0 ± 8.4 ng / mg proteina) salina saguarekin (269.5 ± 24.9 ng / mg proteina). Azterketaren amaieran, MPTP plus ariketa sagu (69.8 ± 11.7 ng / mg proteina) artean MPT (77.9 ± 12.0 ng / mg proteina) alderatuz, dopamina estralurtar mailan ezberdintasun nabarmena egon zen. Hala eta guztiz ere, dopamina estralurtaren gehikuntza nabarmena izan zen gatzetan eta ariketa fisikoetan (315.2 ± 9.0 ng / mg proteina), gatzarekin (246.9 ± 19.8 ng / mg proteina) alderatuta (%F_(3,16) = 7.78; P <0.05).

Treadmill Ariketa

Ariketa hasi zen 5 egunetan zauritu ondoren. Bi ariketa-taldeek (saline plus ariketa eta MPTP plus ariketa) saguak trebatu ziren 100-cm motorizatutako treadmill batean exekutatzeko (Exer 6M, Columbus Instruments, OH) 6 asteetarako (5 egun / aste) abiadura gehikorrean exekutatzeko. 60 min / day eta 18-20 m / min abiadura.^5,6

Erresonantzia magnetiko bidezko irudigintza

Sagua garuneko T1-neurri handiko resonantzia magnetikoaren (MR) dimentsioko hiru dimentsioko bolumena 7-T mikro-MRI sistema baten bidez lortzen da (Bruker Biospin, Billerica, MA). Irudiaren erosketaren parametroak hauek ziren: TE = 46.1 ms, TR = 6292.5 ms, 0.4-mm lodierako lodiera, 0.45-mm interslice lodiera, 128 × 128 × 128 matrizearen tamaina.

Radiochemistry

Sintesia [¹⁸F] fallypride aurreko tosil aitzindariaren ordezkapen nukleofilikoaren erreakzioaren bidez deskribatu zen [¹⁸F] iruzkinetako aparatu pertsonalizatua erabiliz.¹² Purifikazioa HPLC alderantzizko fasean lortu zen C8 (2) Phenomenex Luna zutabean aketonitrilo eta sodio fosfatoaren bufferrarekin fase mugikor gisa (55: 45). UV xurgatzeak 254 nm eta AUFS 0.05 neurtu zituen. Igoera erradioaktiboa (atxikitze denbora 17 min) dagokion [¹⁸F] fallypride, biltzen zen eta disolbatzaile bat erauzi zuen purgagailu birakarian. Azken produktua pyrogenicity, sterility, pH, eta disolbatzaile organikoak kromatografia bidez probatu zen. Jarduera espezifikoa eta garbitasun erradioaktiboa Waters HPLC sistemarekin ebaluatu zen C8 (2) Phenomenex Luna analitiko baten bidez. Jarduera espezifikoa 3,000-12,000 Ci / mmol-en zen.

PET neurketak eta irudien analisia

Hogeita hamar sagu PET irudirako erabiltzen ziren (n = 6 gatz; n = 3 gatz gehi ariketa; n = 5 MPTP; eta n = 6 MPTP plus ariketa). Eskaneatzeak Concorde microPET R4 eskanerrarekin (CTI Concorde Microsystems, Knoxville, TN) eskuratu zituzten 60-min zerrenda moduko eskuratze-protokoloarekin, 20-min transmisio-eskaneatze bat lortu zen atenuazio zuzenketaren ondoren. ⁶⁸Ge iturri. [¹⁸F] fallypride (10.92-11.28 MBq) isotopoen irteeran hasitako buztana ildoaren bidez (bolus bakarra) injektatzen da. Saguak 2% isofluorane eta 98% oxigenoko anestesiatuak izan ziren. Zerrenda modu dinamiko moduan 26 fotograma (6 × 20 sec, 4 × 40 min), 6 × 1 min eta 10 × 5 min) eta bi OSDren iterazioak (azpimultzoak aurreikusitako maximizazio maximizatuaren arabera) berreraikitzen dira 18 fotograma (XNUMX × XNUMX sec, XNUMX × XNUMX seg) eta ondoren XNUMX MAParen iterazioak (gehienezko a posteriori) berreraikuntza algoritmoa.¹⁴ Berregin irudiak moztu zituzten burua edukitzeko eta linean interpolatu zuten Z128 × 128 × 63 irudi bat sortzeko 0.4 × 0.4 × 0.4 mm isotropia duen irudia³ voxels. Ebazpen potentzialeko bereizmen handiko loteslea (BP) striatum irudiak berreginatutako irudiak dinamikoak erabiliz kalkulu anitzeko ehun erreferentzia eredu bat erabiliz¹⁵ eta Logan lursailak¹⁶ arratoien jarduera handia eta cerebellumeko jarduera txikia (erreferentziazko eskualdea). Intereseko eskualde anatomikoak (striatum eta cerebellum) eskuz definitu ziren bi hemisferioetan, MRIrekin egindako PET irudiak Rview erabiliz (8.21Beta bertsioa).¹⁷ Lotura espezifikoa zenbatzea [¹⁸F] fallypride saguaren estrukturan BP balioa erabiliz, oreka espezifiko / ez-espezifikoaren ratioa neurtzen duen oreka lortzen da.^18,19 Estratisketan loturarik espezifikoa erakusteko, lau saguak XNUMx min bildu ziren, ligand injekzioaren ondoren, nitrogeno likidoa azkar isurtzen duten garunak, 60-μm lodierako ataleko atalak eta phospho-imaxerarentzako atalak (Typhoon 30, GE Healthcare Inc., Piscataway , NJ) (Irudian 1). Ikasketak erakutsi du [¹⁸F] fallypride DA-D2Rari lotzen zaio zehazki, eta DA-D3R oso txikia denez, loteslea DA-D2R okupazioa adierazten du.^9,10,12,13

 

FIG. 1

[¹⁸F] Fallypride-k sagu-estrukturako eskaintza handia erakusten du. Ezkerreko panelak koronal atalaren errendatze anatomikoa erakusten du, gutxi gorabehera, maila bregma 0.20-ra. Eskuineko panelak dagokien autoradiografo adierazgarria erakusten du, dagokion etiketatze intentsiboa ...

HPLC eta Proteinaren Analisirako ehunen bilduma

Azterketaren amaieran, garunak azkar kendu ziren eta bizkarrezur-estaldura deskonposatu zuten, bregma 1.2-tik 0.6-ra, anatomia-eskualdeekin batera, corpus callosum-a, bizkarrezur-muga gisa, corpus callosum-en alboko markoa eta aurreko komisioaren gainetik bentrikulua.²⁰

HPLC Dopamina eta bere metabolitoen analisia

Dopamina mailak homogeneo estatikokoetan (n = 4 talde bakoitzeko) HPLC bidez zehaztu ziren detekzio elektrokimikoarekin.⁶ Sistema bat izan zen ESA auto-lagatzailea (ESA, Chelmsford, MA), 150 × 3.2 mm alderantzizko fasean (18μm diametroa) eta CoulArray 3A (ESA, Chelmsford, MA) hornituak, lau -5600, 75, 50 eta 220 mV -n oinarritutako potentzial analitikoaren kanala.

Western Immunoblot Analisia

DA-D1R eta DA-D2Rren adierazpen sinagikoko efektuaren efektuak zortzi koloreko dorsolateral estrukturatik eratorritako preparazio sinaptoneurosomikoetan aztertu zen.²¹ Prozedura hau saguaren hiru multzoetan egin zen 24 saguaren guztirako talde esperimental bakoitzeko (n = 3 preps per group). DA-D1R (~ 50 kDa), DA-D2R (~ 50 kDa), tirosina hidroxilasa (58 kDa), dopamina transportadorea (68 kDa) eta α-tubulina (50 kDa) (karga kontrol gisa) proteinen adierazpen erlatiboa. Mendebaldeko immunoblot aztertu ziren²² antigorputz komertzialean erabilgarriak diren antigorputz primarioak (polikoniko eta sagu antigorputz monoklonala, Millipore, Temecula, CA). Proteina-bandak afinitatez garbitutako ahuntz anti-rabbit edo anti-saguaren bigarren mailako antigorputzek IRDye-rekin konbinatu zituzten.₆₈₀ edo IRDye₈₀₀ (Rockland, Gilbertsville, PA). Seinale fluoreszenteak UFO-COR Odyssey-ren infragorrien irudiaren inguruko iragazkiaren eskaneatzea detektatu du eta Odyssey 2.1 softwarearen bidez kuantifikatu (LI-COR Bioteknologia, Lincoln, NE). Emaitzak adierazpen erlatibo gisa erakusten dira, gatz-taldearekin alderatuta (100% ezarri).

Analisi estatistikoa

BP-ko taldeen arteko desberdintasunak [¹⁸F] fallypride, DA-D1R, eta DA-D2R proteina-mailak aztertu ziren bi aldeko bariantzaren analisia (ANOVA) tratamenduarekin, subjektua (salina vs. MPTP) bezalako tratamenduarekin, eta ariketa fisiko gisa (ariketa vs. ariketa). Treadmill abiadura maximoko proba egiteko, denbora erabili zen (faktoreen artean (1 aste, 2, etab.) Eta tratamendua faktorearen barruan erabili zen (salina vs. MPTP). Bonferroni post hoc probak hainbat konparazio zuzendu zituen interesen esanahia ebaluatzean. Zehaztasun maila ezarri zen P <0.05. Taldeko desberdintasunen esanahi praktikoa aztertzeko, taldeen arteko desberdintasunen magnitudearen kalkulua kalkulatu da efektuaren tamaina (ES) erabiliz (ES = Batez bestekoa_{Taldearen 1} - Batez besteko_{Taldearen 2}/ SD_horri). ES intereseko populazioaren tratamenduak duen eragina islatzen du eta ezarritako irizpideen arabera, txikiak (<0.41), ertainak (0.41-0.70) edo handiak (> 0.70) dira.²³ Analisia egin zen Prism5 Windows-en bidez (GraphPad, San Diego, CA).

Goi-intentsitatea treadmill-ean MPTP-Lesioned saguetan portaera motor hobetua

Aurretik MPTP-lesionazioa eta ariketa hasi zirenean, bi ariketa-taldeetako saguen guztien batez besteko abiadura antzekoak izan ziren (gatz gehi ariketa: 11.7 ± 1.1 m / min, eta MPTP plus ariketa: 11.2 ± 1.1 m / min). 6 astean eguneko ariketa handitu treadmill abiadura maximoak bi ariketa-taldeetan, gatz-gehi ariketa-saguekin, gehienezko abiadura handiagoarekin, MPN plus ariketa sagarrak 1 asteetan 4 bidezIrudian 2). Hala eta guztiz ere, MPTP plus ariketa saguek antzeko treadmill abiadura izan zuten astean xNUMX (MPTP plus ariketa: 5 ± 17.2 m / min eta gatz gehi ariketa: 3.6 ± 22.0 m / min) eta aste 1.5 (6 ± 19.2 m / min eta 1.2 ± 22.2 m / min, hurrenez hurren). Aurretik jakinarazi bezala, MPTP-lesioned saguak ez ziren treadmill prestakuntza jasan ez erakutsi motorren portaera espontaneoa berreskuratzeko 0.9 ± 7.0 m / min abiadura maximoa 0.3 aste ariketa bukaeran.⁵

 

FIG. 2

Ariketa MPTP saguaren portaera motoroa hobetzen du. Gatz motoreko abiadura maximoa (n = 12) eta MPTP (n = 12) saguak treadmill motorretan aste bakoitzaren amaieran probatu zen. Azpimarratzeko treadmill abiadura MPTP lesioaren aurretik neurtu zen. ...

Goi-intentsitatearen treadmill-ekin ariketa Striatal DA-D2R handitzea baina DA-D1R proteina

Intentsitate handiko treadmill ariketa DD-D2R eta DA-D1R-ren maila desberdinetako eragina izan du atzeko dentsitatearen estrontzioan ezarritako sintomatoneurosometan (Western blot analisia)Irudian 3). MPTP plus ariketa-saguak 48.8% hazi zen DA-D2R estandarrean, MPTP saguak aldean (%3B irudia), eta DA-D2R proteina-mailan ariketa fisikoaren eta MPTPen arteko elkarrekintza garrantzitsuak (%F_(1,8) = 6.0; P <0.05). Aldiz, ez zen ariketa eraginik DA-D1R proteina mailetan taldeen artean (3A irudia; F_(1,8) = 0.1, P = 0.78). MPTPk bakarrik kaltetu ez zuen DA-D2R (DA)F_(1,8) = 0.0; P = 0.88) edo DA-D1R adierazpena (F_(1,8) = 0.0; P = 0.92). Gainera, zuntz dopaminergikoen osotasuna duten bi proteina bereizle, tirosina hidroxilasa (TH; 3C irudia) eta dopamina transportadora (DAT; 3D irudia), MPTP nabarmen jaitsi da TH tratamendua proteina (F_(1,8) = 757.3; P <0.05) eta DAT adierazpena (F_(1,8) = 218.0; P <0.05).

 

FIG. 3

Ariketa behin eta berriro DA-D2R erregulatzen du, baina DA-D1R proteina estrukturala ez. Panela (A), DA-D1R proteinen dorsal striatum-en larruazaleko estrontzioen sintomatometroaren preparazioen Western immunoblot azterketa erakusten du. Ez zen aldaketarik egonkortu estatistikorik ...

Goi-intentsitatea Treadmill-ekoa Striatal handitzea [¹⁸F] Fallypride Binding Potential (BP)

Mendebaldeko immunoblotting-ek hartzaileen proteina-adierazpenek antigorputz epitopo guztiak neurtu zituzten bitartean (azalera eta barruko zelula-dendak) vivo PET-irudiak irmotasun handiko DA-D2R espezifikoarekin [¹⁸F] fallypride-k DA-D2R erabilgarritasunaren ondorioak delineatu dezake ligandoa lotzeko (Irudian 4). Analisi estatistikoak agerian uzten du ariketa efektu garrantzitsu bat zegoela (F_(1,16) = 12.3; P <0.05), baita MPTP lesioa ere (F_(1,16) = 160.3; P <0.05) MPTP eta ariketaren arteko elkarrekintza esanguratsurik gabe (F_(1,16) = 3.5; P = 0.07) on [¹⁸F] fallypride BP. Bonferroni-ren post hoc analisia MPP eta MPTP plus ariketa saguekin (BP) arteko aldea nabarmena izan zen.t = 1.1, Df = 1, 16; P <0.01), eta ez dago diferentzia nabarmenik gatzaren eta gaziaren gehi ariketa saguen artean (t = 4.1, Df = 1, 16; P > 0.05). Zehazki, MPTP gehi ariketa saguek% 73.1eko hazkundea izan dute [¹⁸F] fallypride BP aldean MPTP saguak (batez besteko BP balioak MPTP plus ariketa: 7.1 ± 0.7; batez besteko BP balioentzat MPTP saguak: 4.1 ± 0.3) (4B irudia). Horrez gain, gatzagoko gehi ariketa-saguak 8.2% igo zen [¹⁸F] fallypride BP (13.2 ± 1.0) salina saguarekin (12.2 ± 0.3). "Eraginaren tamainaren" kalkulu hauei jarraiki, MPTP taldeen (ES = 2.61) efektu arinagoak agerian uzten dira gatz-taldeen artean (ES = 0.94).

 

FIG. 4

Ariketa selektiboan handitzen da [¹⁸F] fallypride lotzeko potentziala (BP) MPTP saguaren estrontzioan. Panela (A) erakusten du [¹⁸F] fallypride BP irudi adierazgarriak koronalaren orientazioan (ezkerraldean) eta orientazio horizontalera (eskuinaldean). Eskala-barra ...

Lan hau, USC CTSI Full Pilot Grant Programaren diru-laguntzarekin eta Parkinsonen gaixotasunen fundazioaren, Team Parkinson (Los Angeles), Parkinsonen Alliance, Whittier Parkinson gaixotasunen hezkuntzako taldea, NINDS RO1 NS44327-1, NIA, AG 21937) eta US Army NETRP W81XWH-04-1-0444. MGV USC Neurozientzia Graduondoko Programa Meritu Beka hartzailea da. Ryan Park eta Peter Conti doktoreak USC Animalia Txikien Core Zentroko laguntza eskuratu nahi dugu, mikro-PET irudien eta Rex Moats doktoreen laguntzarekin, Animal Imaging Research Core-ren oinarrian, Saban Research Institute-k saguarekin MRIri laguntzera. Eskerrak eman nahi dizkiegu Yi-Hsuan (Lilian) Lai treadmill ariketa laguntzeko, eta Avery Abernathy bere esperientzia HPLC azterketarako. USC Parkinson-en gaixotasuna duten ikerlarien Lagunei eskerrak eman diegu, besteak beste George eta MaryLou Boone, Walter eta Susan Doniger, eta Roberto Gonzales, laguntza eskuzabalagatik.

Interes gatazka potentziala: txostena ez da ezer.

Oharra froga batean gehituta: Artikulu hau 19 urrian argitaratu zen 2010-n. Errore bat geroago identifikatu zen. Jakinarazpena linean eta inprimatutako bertsioetan sartzen da, bi zuzendu direla adierazteko.

Finantza txostenak: USC Neuroscience Graduate Program Merit Fellowship (MV), NINDS RO1 NS44327-1 (MV, CW, JW, MJ eta GP), USC CTSI Full Pilot Grant Programaren (QL, AN, MJ, GP).