PMCID: PMC2820240
NIHMSID: NIHMS174679
Abstract
Bidh atharrachaidhean a tha air an toirt a-steach do chocaine ag adhbharachadh atharrachadh ann an morphonas niùclasach agus ann an giùlan a dh ’fhaodadh a bhith fo bhuaidh tràilleachd cocain. Dh'ainmich sinn pàirt deatamach dha dimethylation de eachdraidh 3 lysine 9 (H3K9) agus an lysine dimethyltransferase G9a ann am plaideas structarail agus giùlain co-cheangailte ri cocain. Lùghdaich rianachd còcainn air ais grunn ìrean cruinne H3K9 dimethylation anns an nucleus accumbens. Tchaidh a lùghdachadh ann am methylation histone eadar-mheadhanachadh tro ath-ghairm G9a san roinn eanchainn seo, a bha air a riaghladh leis a ’bhuilg tar-chuir aine cocos. Le bhith a ’cleachdadh mutagenesis co-chòrdail agus gluasad gine a chaidh am mealladh le bhìoras, fhuair sinn a-mach gun do chuir gearradh sìos G9a plathadhachd spine dendritic na niùclas a-mach agus e nas fheàrr do chocaine, agus mar sin a’ stèidheachadh pàirt deatamach dha mealladh eachdraidh ann an gnìomhan fad-ùine chocain.
Ro-ràdh
Tha nochdadh de dh ’a-rithist gu bhith a’ faighinn a-mach mu bhith a ’tighinn am bàrr mar thoradh air atharrachadh leantainneach ann an sloinneadh gine agus morf-eòlas neuronal air atharrachadh taobh a-staigh an nucleus accumbens (NAc), prìomh phàirt de dhuais na h-eanchainn (1-2). Tha ath-dhealbhachadh cromatin cudromach ann an atharrachaidhean tar-chuir de dh'iomadh seòrsa san roinn eanchainn seo a dh ’fhaodadh a bhith a’ cur cuideam air cuid de dhrogaichean cocain (3-9). Tha riaghladh còcain de structar chromatin ann an NAc a ’toradh, gu ìre, bho atharrachadh dìreach air a’ chromatin bho innealachd chromatin, a ’adhbharachadh atharrachaidhean ann an acetylation agus phosphory (eachdraidh).4, 7-9); ach, cha deach sgrùdadh a dhèanamh fhathast air na dreuchdan aig einsím a bhios a ’riaghladh am meirgeadh eachdraidh-sgoile.
Anailis bho chionn ghoirid airson gintinn gu h-iomlan a ’cleachdadh freumhan-craicinn chromatin còmhla ri meanbh-fhonn (CIP-Chip) pàtranan comharraichte de dh’ eachdraidh-dhèanta H3 lysine 9 (H3K9) agus 27 (H3K27) aig luchd-àrdachaidh gine anns an NAc às deidh làimhseachadh còca6). Mar sin, thug sinn prothaid dha mòran mheitioctransferases lysine (KMTan) agus demethylases (KDMs) air a bheil smachd againn air casg H3K9 no H3K27 (Fig. 1A). Cha robh ach dà einsím, G9a agus GLP, a ’taisbeanadh riaghailt tar-sgrìobhadh seasmhach 24 às deidh rianachd a’ chocaine tric, nuair a chaidh aithris a dhèanamh air an dà ghine gu mòr.. Seach gu bheil G9a agus GLP gu sònraichte a ’toirt buaidh air toiseachd H3K9 (H3K9me2), tha an lughdachadh air a bhith aca le cocaine co-chòrdail ri ìrean cruinneil lùghdaichte de HHNUMXK3me9 a chaidh fhaicinn aig an àm seo (Fig. 1B). An coimeas ri sin, mhair ìrean cruinne de methylation heterochromatic H3K27 gun atharrachadh le bhith a ’faighinn a-mach mu bhith a’ chocaine (Fig. S1 ann an taic do stuth air-loidhne). Air sgàth an ìre àrd de ghnìomhachd catalaíoch an dà chuid ann vitro agus ann am vivo (10), chuir sinn an cèill tuilleadh sgrùdadh a dhèanamh air cudrom obrachail gèillidh G9a às deidh do bhith a ’nochdadh faisg air a’ chocaine anns an NAc. Chaidh ìrean G9a pròtain, mar ìrean de a mRNA, a lùghdachadh gu mòr 24 uairean an dèidh rianachd cocain uair is uair (Fig. S2). Ged a chaidh an abairt G9a mRNA a lùghdachadh le 35% anns an NAc, nochd sgrùdadh immunohistochemical lùghdachadh nas lugha 15% ann an ìrean pròta G9a, co-chòrdail ris an lùghdachadh 21% ann an H3K9me2 às dèidh rianachd cocaine ath-ghabhail (Fig. 1B). Chaidh abairt G9a mRNA a lùghdachadh cuideachd san sgìre eanchainn seo le 20% an dèidh fèin-rianachd a-rithist de chocàin (Fig. S3).
Gus faighinn a-mach a bheil atharrachaidhean ann an euchromatic H3K9me2 a ’co-cheangal ri atharrachaidhean gin-ginealach ann an sloinneadh gine anns an NAc, dh'fhastaidh sinn mion-sgrùdaidhean airson sgrùdadh air abairtean gintinn a dh'adhbhraich dùbhlan dùbhlan de chocàin ann an ainmhidhean le no gun eachdraidh nochdadh cocaine roimhe (faic leasach; liostaichean gine ann Clàran X S1 – S3). Chaidh ainmhidhean a bha air ath-chraiceann ath-nochdadh a thaisbeanadh gu mòr le bhith a ’toirt am follais an abairt ghine 1 uair an dèidh dùbhlan cocaine ann an coimeas ri beathaichean a bha gu mòr air an làimhseachadh (Fig. 1C). Bha an nochdadh gine a bharrachd seo air tachairt fhathast mar thoradh air dùbhlan cocain a chaidh a thoirt seachad às deidh seachdain 1 de thoirt air falbh bho bhith a ’reic cocaine. Ann an co-chòrdadh ri aithisgean roimhe seo, bha ceudad beag de ghinean (~ 10%) a ’taisbeanadh freagairtean ath-òrdaichte desensitated às dèidh rianachd cocaine a-rithist (Fig. 1C; faic Clàr S1) (5). Gus sgrùdadh dìreach a dhèanamh air an t-àite a tha an luib sìos G9a ann an riochdachadh gine leasaichte, a chaidh fhaicinn an dèidh ath-dhrugaichean a ’gocain, fhuair luchaichean neadan de bhìorasan Herpes simplex (HSV) a chuir a-steach GFP no G9a agus a chaidh an làimhseachadh le cocan saillte no ath-dhèanamh gus faighinn a-mach an e G9a overexpression bha e gu leòr gus casg a chuir air an àrdachadh de bhith a ’toirt a-steach cocain a thaobh abairtean gine. Bho sheata de ghineadan air an taghadh 12 a tha a ’sealltainn ìrean nas àirde de dh’ riochdachadh às dèidh cocaine ath-aithris, thug sinn fa-near gun do lugh G9a gu mòr an abairt leudaichte de 50% de na ginean sin (Clàr S4).
Gus comharrachadh na tachartasan tar-sgrìobhaidh suas an sruth a tha a ’rèiteachadh ath-aithris leantaichte ann an cocaine air abairt G9a, rinn sinn sgrùdadh air àite a dh'fhaodadh a bhith ann airson ΔFosB, toradh spìosraidh fìor sheasmhach den ghine dhìreach luath. altram. ΔFosB a ’cruinneachadh anns an NAc às deidh dhaibh a bhith an-còmhnaidh còmhla ri cocaine, far a bheil e ceangailte ri àrdachadh ann an duais cocain (11). CanFasB a ’urrainn a bhith an sàs mar neach-gnìomha ath-sgrìobhaidh no mar neach-gleidhidh a’ rèir a ’amas air an targaid (3, 5, 6, 12). A ’cleachdadh NSE bitransgenictTA × tetOP-ΔFosB luchainn, far a bheil ΔFosB abairt air a dhùsgadh gu taghte ann an NAc agus striatum droma bheathaichean inbheach (13), rinn sinn sgrùdadh air buaidh ΔFosB a chur an cèill air riaghladh cocaine air H3K9me2 agus KMTs anns an NAc. Bha ΔFosB thar-èigneachadh gu leòr gus ìrean an dà chuid H3K9me2 a lùghdachadh (Fig. 1D) agus G9a abairt (Fig. 1E), mar sin a ’tarraing beachd air na buaidhean a th’ aig cocaine ath-aithris. Ann an coimeas ri sin, cha do lugh ΔFosB an abairt GLP san roinn eanchainn seo, agus cha tug e buaidh sam bith air SUV39H1 agus EZH2, na prìomh shiopaichean trimethylating airson H3K9 agus H3K27, fa leth (Fig. S4). Gus dearbhadh an dàta sin le bhith a ’cleachdadh siostam thar-èasgaidh ressionFosB neo-eisimeileach, fhuair luchagan inbheach wildtype in-steallaidhean dà-thaobhach taobh a-staigh de bhìorasan bhìoras (AAV) co-cheangailte ri Adeno a’ nochdadh GFP no ΔFosB. Dh ’fhuaradh lùghdachadh air ìre ΔFosB anns an roinn G9a anns an roinn seo den eanchainn (ris an canar ro-dhuilgheadas le Viral)Fig. 1E).
Lean riaghladh leithid seo a chaidh a chuir an cèill agus a chaidh a chuir an cèill gun dèan sinn sgrùdadh a dh ’a bheil co-dhùnadh G9a gu sònraichte ann an neurons NAc a’ riaghladh freagairtean giùlain dha cocaine. Fhuair luchagan Wildtype in-steallaidhean taobh a-staigh NAc de lobhragan HSV a ’nochdadh GFP no G9a agus an uairsin chaidh an sgrùdadh a’ cleachdadh paraigigm roghainn àite co-cheangailte ri cocaine, a tha a ’toirt tomhas neo-dhìreach air duais dhrogaichean. Chaidh ro-dhuilgheadas Viral air G9a ann an neurons NAc a dhaingneachadh an dèidh deuchainn giùlan (Fig. 2A). Bha G9a overexpression gu mòr a ’ciallachadh nach robh roghainn aig a’ chocàin an coimeas ri beathaichean a bha a ’gabhail thairis ro-mhòr (GFP)Fig. 2B), agus àrdachadh ann an ìrean H3K9me2 anns an NAc (Fig. 2C). A ’cur ro-dh’ ionnsaigh air mutant G9a a tha marbh le catalyt (G9aH1093K) (14) nach tug buaidh air roghainn cocaine (Fig. 2B) agus gun buaidh sam bith aige air ìrean H3K9me2 anns an roinn eanchainn seo (Fig. 2C).
Gus tuilleadh sgrùdadh a dhèanamh air àite G9a ann am buaidhean giùlain cocaine, agus gu sònraichte gus aithris a dhèanamh air an ath-aithris de dh ’cocain a dh'adhbhraicheadh abairt G9a anns an NAc, inbheach G9afl / fl luchan (14) fhuair iad in-steallaidhean taobh a-staigh na NAc de veicearan AAV a ’nochdadh recombinase Cre no GFP mar smachd. AAV-Cre knockdown de G9a anns an NAc, a chaidh a dhearbhadh mar immunohistochemically (Fig. S5), a ’mheudachadh gu mòr na buaidhean a th’ aig cocaine ann an deuchainnean suidheachadh cungaidh agus lughdaich H3K9me2 ìrean anns an NAc (Fig. 2D, E). Neach-toghair eòlas-inntinn a tha ri fhaotainn gu coimearsalta air G9a agus GLP, BIX01294 (15-16), a chaidh a chleachdadh gus faighinn a-mach a bheil casg einsím a ’toirt buaidh air freagairtean giùlain ann an cocaine. Gu dearbh, thug toirmeasg ceimigeach air G9a agus GLP barrachd buaidh air roghainn airson cocaine agus lùghdachadh H3K9me2 anns na NAc (Fig. 2F, G).
Le bhith a ’riarachadh co-dhiù uair de chocàin bidh barrachd d’ dhuilleag de spritic dendritic air neòinean bàn-mheadhanach aig NAc (17), pròiseas co-cheangailte ri atharrachaidhean obrachail aig synapster glutamatergic drùidhteach air na neòinean seo (18-19agus) freagairtean giùlain ceangailte ri drogaichean (17, 20). Mar sin bha sinn a ’smaoineachadh gun toireadh briseadh air gnìomhachd G9a anns an NAc le cocaine ath-aithris comas a’ chocan air cuingeas cnàimh dendritic neurons na NAc a riaghladh. Le bhith a ’cleachdadh chnatan-mhòr-chnàmh (SIP) le antibody anti-G9a, chomharraich sinn grunn thargaidean g9a gintinneach anns an NAc, a bha roimhe air a bhith ceangailte ann am plasticity dendritic air a dh’ ionnsaigh le cocaine (Fig. 3A) (20-26). Fhuair sinn a-mach gun do shoirbhich le rianachd cocaine a-rithist gu mòr G9a ceangaltach, a bharrachd air ìrean H3K9me2, aig na luchd-àrdachaidh gine seo (Fig. 3B). An coimeas ri sin, thòisich rianachd chocain dhruga G9a gu luath gu cuid de na h-aon luchd-àrdachaidh gine sin, co-chòrdail le barrachd abairt G9a a chaidh fhaicinn ann an uair NAN 1 às deidh dòs geur de chocàin (Fig. S6). Ged a tha G9a ceangaltach aig luchd-brosnachaidh gine sònraichte co-ionann ri atharrachaidhean san dòigh-labhairt aige, tha e fhathast mì-shoilleir co-dhiù a tha tachartasan leithid seo air an eadar-mheadhanachadh le ìrean cruinne air atharrachadh de G9a anns an NAc agus / no le eadar-dhealachaidhean ann an trusadh G9a às a dhèidh. vs. rianachd a-rithist airson cocain.
Stèidhichte air riaghladh G9a de dh'iomadh gineachan a bha co-cheangailte ri plasticity anns an NAc, sgrùd sinn gu dìreach an robh cumail suas abairt G9a san roinn eanchainn seo às deidh làimhseachadh còca a chaidh ath-aithris gu leòr airson cruthachadh spine dendritic air a thòiseachadh le cocain. A ’cleachdadh protocal leigheas cocaine a chunnacas roimhe seo gus inntreadh cnàimh dall-dhiadhaidh a bhrosnachadh anns an NAc (20), rinn sinn sgrùdadh air dùmhlachd ann an ainmhidhean a bha air an stealladh le HSV-GFP no HSV-G9a. Ann an co-aonta ri toraidhean roimhe seo, chunnaic sinn àrdachadh mòr ann an dùmhlachd cnàimh droma anns an NAc às deidh làimhseachadh cocain, buaidh a chaidh a bhacadh gu tur le G9a overexpression (Fig. 3C). Cha robh g9a overexpression fhèin gu leòr airson dùmhlachd droma spàinidh NAC a lùghdachadh ann an dìth chocain. Gus cur ris an dàta seo, G9afl / fl chaidh luchain a fhuair in-stealladh às-NAc a thoirt a-mach à dùmhlachd ann an HSV-Cre agus le cnàimh-droma agus an coimeas ri beathaichean a bha a ’faighinn HSV-GFP às aonais cocaine. Le bhith a ’dùnadh a-mach air G9a cur an cèill gu mòr chaidh dùmhlachd droma a mheudachadh air niùclan spìceach meadhanach NAc (Fig. 3C).
Leis an fhianais gu bheil briseadh G9a anns an NAc às deidh do chocaine ath-aithris a bhith air a chuir ann an ΔFosB, ath-sgrùd sinn an ath ’co-dhiù a tha am factar tar-sgrìobhaidh seo cuideachd an sàs ann an riaghladh spìcean dendritic NAc. Ged nach robh ΔFosB air a bhith ceangailte le inneal plastaigeach dendritic roimhe seo, tha grunn de na h-amasan aige, nam measg Cdk5 agus fo-ghoireasan NFκB, air a bhith cho ceangailte. (20-23), agus expression bidh an abairt leantainneach ΔFosB ann an neurons NAc a ’co-cheangal ri dùmhlachd cnàimh droma dendritic meudaichte an-dèidh làimhseachadh còcaine uair is uair (27). An toiseach, fhuair sinn a-mach gun robh ΔFosB ann an luchagan bitransgenic seach nach robh cocaine ann, a lughdaich an abairt G9a agus H3K9me2 (Fig. 1D, E), lùghdaich G9a ceangaltach do dh'iomadh gineachan a bha co-cheangailte ri plasticity, le mòran dhiubh cuideachd air an nochdadh mar thargaidean dìreach ΔFosB fhèin (Fig. 3D) (3, 6). Sheall sinn an-dèidh gun do chuir ro-dhuilgheadas viral de ΔFosB anns an NAc gu mòr ri dùmhlachd cnàimh dendritic fo chumhaichean bunaiteach, coltach ris an t-sealladh a chaidh a leantainn às dèidh rianachd cocain a dhol air adhart (Fig. 3E). Air an taobh eile, chuir casg air cJunD, cunnart pròta mì-àicheil as motha a dh ’atharraicheas activityFosB gnìomh transal, bacadh air comas a bhith a’ cumail air ais a ’chocaine de bhith a’ fàs cruth dendritic anns an NAc (Fig. 3C).
Thug am beachd againn gu bheil ΔFosB a ’rèiteach abairt G9a sa NAc, agus gun robh ΔFosB agus G9a a’ riaghladh cuid de na h-aon ginean targaid, a thug oirnn sgrùdadh a dhèanamh air eadar-obrachaidhean eile eadar ΔFosB agus G9a. An dèidh coileach cruaidh, nuair a chaidh ìrean G9a àrdachadh, a ’ceangal G9a ris altram chaidh gine àrdachadh, fhad's a bha i air a ’chocàin uair is uair, nuair a chaidh abairt G9a a chuir fodha, G9a ceangaltach don altram chaidh gine a lùghdachadh (Fig. 3A). Cha robhas a ’coimhead airson co-dhùnadh G9a a chaidh ìsleachadh às deidh sin c-fos, far a bheil G9a ceangaltach air àrdachadh le cocan ath-chraolaidh (Fig. S7). Tha seo co-chòrdail ris a ’sin, a chaochladh altram, c-fos a tha air a mhilleadh, gun a bhith air a mhilleadh, le nochdadh psychostimulant cronach (5). Bha ΔFosB overexpression ann an lucha bitransgenic gu leòr airson lùghdachadh G9a gu ceangaltach ris na altram gine (Fig. 3D). A bharrachd air an sin, bha cus-gluasaid G9a gu leòr gus osFosB a mheudachadh nas motha às deidh rianachd cocaine ath-aithris (Clàr S4). Tha na dàta sin a ’moladh lùb fèin-obrachail far a bheil G9a an toiseach a’ cur bacadh air inntrigeadh ΔFosB le bhith a ’rianachd a’ chocain gheur. Ach, mar a bhios ΔFosB a ’cruinneachadh le bhith ag ath-nochdadh dhrugaichean tro-dhèanta, bidh e a’ seasamh troimhe air G9a agus mar sin bidh e a ’toirt a h-ath-inntrigeadh a bharrachd.
Ann an co-dhùnadh, tha sinn air nochdadh gu bheil mealladh crith-thalmhainn eachdraidh anns an NAc gu mòr an sàs ann an riaghladh abairt ginte neuronal mar fhreagairt do chocan. Le bhith a ’cur an aghaidh G9a agus H3K9me2 às dèidh rianachd cocain a-rithist ag adhartachadh roghainn cocaine, gu ìre, tro ghnìomhachadh tar-chuir de dh'iomadh ginealach a tha aithnichte a bhith a’ riaghladh cruthan de phlasantachd dendritic. Bheir a bhith a ’faighinn tuigse nas fheàrr air na ginean a tha air an riaghladh tro mheadhanan mar sin piseach air an eòlas againn air bunait iom-fhillte bith-eòlasach tràilleachd dhrogaichean agus dh’ fhaodadh e cuideachadh le leasachadh làimhseachadh nas èifeachdaiche de thinneasan tràilleachd.
Stuthan agus Dòighean-obrach
Ainmhidhean agus leigheasan
Mura canar an caochladh, bha luchaichean a ’faighinn ceithir gu còig gach cèidse ann an coloinidh le cuairt solas / dorcha dorcha 12 (solais bho 7: 00 AM gu 7: 00 PM) aig teòthachd sheasmhach (23 ° C) le ad libitum cothrom air uisge agus biadh. Chaidh gach pròtacal bheathaichean aontachadh le IACUC aig Ionad Meidigeach UT Southwestern agus Sgoil Leigheasaidh Mount Sinai.
Airson deuchainnean cocaine [immunohistochemitry, blochdadh an àird, PCR uimhireil (qPCR), mion-sgrùdadh micrarray agus in-bhlothadh chromatin (CIP)], chaidh 8- gu luchag fireann C10BL / 57J a tha 6-seachdainn a chleachdadh. Fhuair ainmhidhean èididhean làitheil gach cuid 'saline' (leigheasan 7 salann, ip), cocain 'geur' (làimhseachadh 6 salann + aon leigheas 20 mg / coc cocan HCl, ip) no 'ath-chraiceann' cocain (làimhseachadh 7 20 mg / kg cocaine-HCl, ip). Bha luchagan air an ìobairt aig aon uair 1 uair no 24 uairean às deidh an làimhseachadh mu dheireadh. Airson sgrùdaidhean microarray, chaidh beathaichean a làimhseachadh gach latha le 'saline' (leigheasan 15 salann, ip), cocain 'geur' (leigheasan 14 salann + leigheas 1 20 mg / coc cocaine-HCl, ip), cocaine 'ath-ghinnichte' Leigheasan 7 saline + làimhseachaidhean 8 20 mg / coc cocaine HCl, ip) no 'ath-tharraing a-mach + drugaidh' cocaine (làimhseachadh 7 20 mg / coc cocaine HCl + 7 làimhseachaidhean saline + làimhseachadh dùbhlan 1 mg / kg cocan HCl, ip) agus chaidh an toirt seachad mar ìobairt 20 uair an dèidh an leighis mu dheireadh. Ann an deuchainnean giùlain, bha luchainn air an àiteach gu h-aon ann an dachaigh an dèidh obair-lannsa agus chaidh dèiligeadh riutha le 1 mg / kg cocaine-HCl, ip mar a tha air a mhìneachadh gu h-ìosal. Airson sgrùdadh droma dendritic agus dearbhachadh micrarray às deidh gabhaltas HSV-GFP agus HSV-G10a-GFP, chaidh luchagan a làimhseachadh le 'saline' (làimhseachadh 9 salann, ip) no 'cocaine ath-aithris' (làimhseachadh 5 5 mg / kg cocain HCl, ip (b) thairis air na làithean 20, oir chaidh am pròtachadh seo a nochdadh roimhe seo gus dùmhlachd droma a mheudachadh air neurons nucleus accumbens (NAc) taobh a-staigh clàr-ama abairt víreas Herpes simplex (HSV) (Tag a bharrachd S1). Chaidh luchagan a bhite a ’cleachdadh airson sgrùdadh cnàimh droma bìodach a’ toirt na h-’uairean 4 a’ leantainn às deidh an leigheis mu dheireadh.
Gus an sguabadh às gu h-ionadail an tar-sgrìobhadh G9a air a chuingealachadh gu neurons NAc, chleachd sinn luchain mutant homozygous airson aileallan lx G9a, a chaidh a mhìneachadh gu mionaideach ann an àiteachan eile (S2). Bidh ath-choimeasadh air a stiùireadh le creachan a ’toirt a-mach spleòg a-mach 22 gu 25 air splicing taobh a-muigh a’ frèama a dh'adhbhraicheas crìonadh anns an ath-sgrìobhadh mu-thionndaichte gun mheadhan. Chleachd sinn luchagan le lusan G9a a chaidh a chuir air ais gu lèir gu luchainn C57BL / 6J. Bha luchainn air an cur a-steach gu sòghail a-steach don NAc le bheactoran bhìoras (AAV) co-cheangailte ri Adeno (serotype 2) ag innse GFP no Cre-GFP eadar aois 7 agus 10 seachdainean. Chaidh mion-sgrùdadh immunohistochemical a chleachdadh gus èifeachdas ath-choimeasachadh Cra-mediaed a dhearbhadh (faic Figear. F. S5). Chleachd sinn làithean 21 bho bheathaichean air an srianadh às dèidh obair-lannsa oir bha ath-choimeasadh ann an luchaichean lus an G9a seasmhach agus aig an ìre-ama seo, co-chòrdail ri aithisgean foillsichte (S3-S4). Chaidh deuchainnean thar-sparradh G9a agus ΔJunD a dhèanamh anns an aon dòigh a ’cleachdadh feadan Víreas HSV a chuir an cèill GFP, wildtype G9a-GFP, marbh marbhàtach G9aH1093K-GFP no ΔJunD-GFP (faic S2 airson fiosrachadh mu leasachadh G9a constructs). Bha luchagan ro-mhòr na HSV a ’cleachdadh 3 làithean an dèidh obair-lannsa seach gu robh cus bruthadh air an ìre as àirde aig an àm seo, mar a chaidh fhaicinn tro immunohistochemistry. Air sgàth nàdar neo-ghluasadach an dòigh-labhairt HSV, agus an nàdar mòran nas seasmhaiche a thaobh abairt AAV, chaidh veicearan HSV a chleachdadh ann an deuchainnean a dh ’fheumadh abairt transgene luath, geàrr-ùine, ach chaidh feadanan AAV a chleachdadh ann an deuchainnean a bha a’ toirt air gluasadan fad-fhaclan. Chaidh an dà bheactar a shealltainn, ann an rannsachaidhean farsaing ro-làimh, gus a bhith a ’toirt buaidh air dìreach cuirp nan cealla neuronumach taobh a-staigh sgìre na h-eanchainn sgaoilte, gun ghalair sam bith bho neurons afferent no efferent.
Airson deuchainnean giùlain le bhith a ’cleachdadh an cungaseòlais G9a / GLP, BIX01294 (25 ng / μl), chaidh dà phump de phumpaichean beaga fo-nàdarra, a bharrachd air canulae iùil dà-thaobhach, a thoirt a-steach gu na NAc. Chaidh mion-phumpaichean a chur an gnìomh 12 uair mus deach an cur a-steach a thòiseachadh le lìbhrigeadh leantainneach (0.25 μl / uair) de gach cuid den charbad (5 hydroxypropyl β-cyclodextrin) no drogaichean airson làithean 14, agus an uair sin chaidh measaidhean giùlain a dhèanamh.
Airson ΔFosB deuchainnean os-èasgaidh [bloting an iar, qPCR, agus ChIP], NSE fireann bitgengenic-tTA × tetOP-ΔFosB gun deigheadh luchagan a chleachdadh (10 seachdain-seachdain), far nach robh an dexycycline tetracycline dí-thaobhach (seachdainean 8 dheth doxycycline), gun robh ainmhidhean air an taisbeanadh gu cruaidh cuingealaichte de ΔFosB (S5). Chaidh ressionFosB thar-èigneachadh anns na luchain sin a dhearbhadh tro qPCR. Airson toraidhean a dhearbhadh a ’cleachdadh NSE-tTA × tetOP-ΔFosB luchainn, bha luchainn fhireann wildtype 8-seachtain-C57BL / 6J air an stealladh taobh a-staigh na NAc le feasairean AAV a ’cur an cèill GFP no ΔFosB-GFP. Chaidh feamainn AAV a chleachdadh, anns an t-suidheachadh seo, gus dèanamh cinnteach gu bheil an ΔFosB as motha aig abairtean 8 an dèidh an obair-lannsa, a ’toirt cothrom airson coimeas dìreach eadar luchain a tha a’ luathachadh gu víreasach agus ransFosB rexFosB. Chaidh dearcadh fuilteach a dhearbhadh le qPCR aig seachdainean 8 an dèidh obair-lannsa (chaidh pucaidean NAc 15-thomhas a thoirt a-mach fon làrach stealladh). Chaidh luchaichean ro-osraideach AAV-GFP agus AAV-ΔFosB-GFP nach deach a chleachdadh airson qPCR a làimhseachadh le siùcair (leigheasan 14 salann, ip) no cocaine ath-aithris (làimhseachadh 14 30 mg / kg cocaine HCl, ip) a ’tòiseachadh aig 6 seachdainean às dèidh lannsaireachd. Làithean 4 às dèidh an làimhseachadh mu dheireadh, chaidh eanchainn a shuidheachadh le 4% paraformaldehyde, air an sgrìobadh air vibratome agus air an cleachdadh airson sgrùdadh spine dendritic.
Mion-sgrùdadh blot an Iar
14-gauge Chaidh pucaichean NAc a thoirt bho earrannan crùbach 1 mm a fhuaireadh le matrix eanchainn stàilinn nach meirg agus a bhith air an sparradh anns am bufair 1 M HEPES lysis (1% SDS) anns an robh protease agus casgan phosphatase. 10-Chaidh 30 μg shamplaí de phròtain iomlan a bhrath-èididh air gathan 18% SDS. Chaidh pròtainean a ghluasad gu seicichean PVDF agus an dùsgadh le an dà chuid H3K9me2 (monoclonal luch, 1: 500), anti-β-tubulin (monoclonal luch, 1: 60,000), h-eachdraidh-làn H3 (coineanag polyclonal, 1: 5,000), anti-GFP (air a chleachdadh airson dearbhadh co-fhaireachdainn bhìorasach ann am fìnein pinn) (coineanach polyclonal, 1: 1000), anti-H3K27me3 (coineanach polyclonal, 1: 500) no antibodies an aghaidh-actin (monoclonal luch, 1: 60,000) thar oidhche aig 4 ° C (bha na meamranan uile air an casg ann am bainne 5% no album serum buadhach 5%). Chaidh na bileagan an uairsin a ghintinn le antibodies àrd-ìre le leannain peroxidase (1: 15,000-1: 60,000 a ’crochadh air a’ bhun-antibody a chaidh a chleachdadh) agus bha còmhlain air am faicinn le bhith a ’cleachdadh SuperSignal West Dura fo-fhilleadh. Chaidh còmhlain a thomhas le NIH Image J Software agus chaidh còmhlain H3K9me2 a dhèanamh riaghailteach gu actin no β-tubulin agus gu H3 làn eachdraidh gu smachd a thoirt airson luchdadh co-ionann. Cha robh buaidh sam bith aig còcag air ais air ìrean actin (Fig. S8no) eachdraidh iomlan 3 (Fig. S1) anns an NAc. A bharrachd, cha robh buaidh aig gabhaltas HSV-G9a-GFP agus HSV-G9aH1093K-GFP air na h-ìrean iomlan de β-tubulin sa NAc (Fig. S8).
Immunohistochemistry
Bha luchainn air an gluasad le dòs marbhtach de hydrate chloral agus air an tilgeadh sìos le 4% paraformaldehyde mus deidheadh an anailis le immunohistochemistry singilte no dùbailte mar a chaidh a mhìneachadh roimhe (S6). Gu h-aithghearr, chaidh eanchainn iar-shuidhichte a ghrùdadh aig teòthachd seòmar thar oidhche ann an sioncron 30% mus deach an roinn aig 35 μm (chaidh na h-eanchainn a bhithear a ’cleachdadh airson sgrùdadh cnàmh droma bhìodach a chuir air roinn le pìosan 100 μm às aonais sòcag 30%). Nochd na h-earrannan NAOL a th ig gu saor-thoileach le 1X PBS, air a bhacadh (serum asal àbhaisteach 3%, 0.1% tritonX, 1X PBS) agus an uairsin a ghoradh le anti-GFP (cearc polyclonal, 1: 8000) agus / no anti-G9a (coineanag polyclonal). , 1: 500) antibodies ann am bacadh bacadh. Chaidh na h-earrannan a chaidh an sgrùdadh airson cnàimhean dall-droma a ghintinn le antibodach anti-GFP coin-polial polyclonal aig 1: 200. A ’leantainn air guir gu h-oidhche, chaidh earrannan NAC a chuairteachadh uairean 3 airson mionaidean 10 le 1X PBS, agus an uair sin le guir le Cy2 agus / no antibodies àrd-ìre le Cy3 le cas-chrann flùranach ann am fuasgladh blocadh 1X PBS airson uairean 2. Chaidh roinnean a chaidh a chleachdadh airson sgrùdaidhean morf-eòlais a ghoid ann an antibody àrd-ìre tron oidhche aig teòthachd an t-seòmair. Chaidh co-shalachadh niùclasach a choileanadh le bhith a ’toirt a-steach earrannan ann an 1X PBS anns a bheil DAPI (1: 50,000) airson mionaidean 10. Nochd na h-earrannan a-rithist, agus an uairsin thàinig ethanol dehydration agus ruith le DPX. Chaidh dealbh a dhèanamh de gach roinn le bhith a ’cleachdadh micreascopaidh earbsach.
RNA aonaranach agus qPCR
Chaidh punches dà-thaobhach 14-tomhas NAc a cho-sheòrsachadh ann an Trizol agus air an giullachd a rèir stiùireadh an neach-dèanamh. Chaidh RNA a ghlanadh le colbhan RNAesy Micro agus dhearbh spectroscopy gu robh cuibhreannan RNA 260/280 agus 260/230> 1.8. Chaidh RNA an uairsin ath-sgrìobhadh le bhith a ’cleachdadh Kit iScript Bio-Rad. Chaidh cDNA a thomhas le qPCR a ’cleachdadh SYBR Green. Chaidh gach ath-bhualadh a ruith ann an dà uiread no trì-fhillte agus air a sgrùdadh a ’leantainn an dòigh ΔΔCt mar a chaidh a mhìneachadh roimhe le bhith a’ cleachdadh glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) mar smachd gnàthachaidh (S7). Faic Clàr leasachail S5 airson sreathan de phreasan mRNA.
Mion-sgrùdadh DNA microarray
Chaidh ceithir buidhnean (3 samhlaidhean bith-eòlasach neo-eisimeileach gach buidheann) a chleachdadh airson an sgrùdadh microarray, anns an robh micreafonan 12 uile gu lèir. 1 uair an dèidh an stealladh cnòca mu dheireadh, chaidh beathaichean a theicheadh gu luath agus chaidh eanchainnean a thoirt air falbh agus an cur air deigh. Chaidh gearradh na NAc a thoirt a-mach le bhith a ’cleachdadh le snàthad 15-gauge agus chaidh an reothadh gu luath air deigh tioram gus an deach RNA a thoirt a-mach. Chaidh puingean dà-thaobhach a thoirt còmhla bho cheithir bheathaichean gach mac-samhail, gu h-iomlan luchag 12 gach buidheann. Chaidh iomallachd RNA, giullachd microarray, agus anailis dàta a dhèanamh mar a chaidh a mhìneachadh roimhe (S8). Goirid, chaidh RNA a sgaradh agus a ghlanadh mar a chaidh a mhìneachadh gu h-àrd agus chaidh a sgrùdadh airson càileachd a ’cleachdadh Bioanalyzer Agilent. Chaidh ath-sgrìobhadh cas, leudachadh, lipéadú agus tar-ghintinn gu arrays Illumina MouseWG-6 v2.0 a dhèanamh a ’cleachdadh modhan àbhaisteach le cridhe microarray UT Southwestern. Chaidh dàta amh a thoirt air falbh agus an tomhas a dhèanamh àbhaisteach le bhith a ’cleachdadh bathar-bog Beadstudio. Chaidh dàta àbhaisteach a sgrùdadh le bhith a ’cleachdadh bathar-bog GeneSpring agus chaidh genelists a chruthachadh a’ cleachdadh slatan-tomhais brìgh de ghearradh atharrachaidh 1.3 fillte còmhla ri gearradh luach p-luach neo-teann de p <0.05.
Bidh sinn a ’cumail suas ìre àrd de mhisneachd anns na dàta sin airson grunn adhbharan. An toiseach, chaidh na beathaichean uile a làimhseachadh, a làimhseachadh agus a mharbhadh aig an aon àm, fo na h-aon shuidheachaidhean. A bharrachd air an sin, chaidh giullachd an RNA agus an arraidh a choileanadh aig an aon àm. San dàrna àite, choilean sinn ar-a-mach trì-thaobhach agus ioma-bheathaichean aonaichte anns gach samhla de dh'atharrachadh, mar sin a ’lùghdachadh eadar-dhealachaidhean mar thoradh air caochlaidheachd fa leth agus meudachadh cumhachd staitistigeilS9). Anns an treas àite, tha pròiseact Riaghladh Càileachd MicroArray a ’moladh na slatan-tomhais airson dàta a chaidh a chleachdadh airson an sgrùdaidh againn, oir chaidh na slatan-tomhais sin a dhearbhadh gus ìre àrd de in-ghinte-ath-ghinteachd a dhèanamh agus eadar-ghinteachd eadar-is-chlaodach (S10-S11).
A ’togail mheicearan viral
Air sgàth dìth meud an bhìoras feòla, chaidh sreathan còdaidh airson wildtype G9a (G9a) no marbh catalach le G9a (G9aH1093K) a chuir a-steach don pxNUMX + HSV plasmid a ’cur an GFP an cèill fo smachd an neach-brosnachaidh anns an t-sùilean luatha anns an luibheanas (CMV) (an G1005a). bha meud an cur a-steach ~ 9 kb, a tha nas motha na meud an ìre as àirde a chuir thu a-steach airson bheactaran AAV-3.96). Bidh an neach-brosnachaidh IE2 / 4 a ’cur G5a an cèill. Chaidh bloighean a shnaidheadh a-steach dhan pxNUMX + HSV plasmid tro cheanglan aig deireadh blàth le Pmeow air a làimhseachadh le Klenow agus EcoRI digested G9a (bho pcDNA1005) agus CIP air a làimhseachadh p9 + às deidh dìleab EcoRI. Airson a bhith a ’dèanamh HSV--JunD-GFP, chaidh sreath còdachaidh ingJunD le gach làrach EcoRI a chruthachadh le PCR a’ cleachdadh làrach oligonucleotides anns a bheil làrach EcoRI. An uair sin chaidh am bathar PCR a cheangal ri làrach EcoRI an p3.1 + vector. Chaidh an aithris ionadail de re rebinbinase Cre ann an neurons NAc fhaighinn le lìbhrigeadh gutha a chaidh am meadhan le víreas a ’cleachdadh vector AAV mar a chaidh a mhìneachadh (S12). Chaidh GFP no aonadh N-terminal de GFP gu Cre a shnaidheadh a-steach do vector AAV-2 ath-cho-chuimseach anns a bheil brosnaiche CMV le sreath deicheadair deicheal splice agus comharra polyadenylation. Chaidh a h-uile leum a chuir air an vector a dhearbhadh le bhith a ’leantainn dideoxy. Chaidh veicearan Viral a dhèanamh a ’cleachdadh inneal-gluasad trì-fhillte, dòigh gun thaic, mar a chaidh a mhìneachadh roimhe (S13). Bha bhìoras puro air a stòradh aig −80 ° C. Chaidh càileachd Viral a mheas le titer gabhaltach air a mheasadh ann an ceallan HEK293. Chaidh na bhìorasan AAV-ΔFosB-GFP ullachadh aig an aon àm. Airson HSV-Cre, chaidh ìomhaigh a chuir air adhart le neach-brosnachaidh IRES, an àite an luchd-àrdachaidh IE4 / 5, gus cuir-sìos Creim a lùghdachadh agus bacadh a chuir air tocsaineachd niùclasach (faic S14 airson togail viral). Anns a h-uile cùis, chaidh dearbhachadh viral a dhearbhadh, an dà chuid ann vitro agus ann an vivo tro qPCR, agus chaidh bhìorasan a dhearbhadh gu dìonach a chuir dreach a-steach dhan NAC às dèidh obair-lannsa.
Inneal-lannsa stereotaxic
Fo ketamine (100 mg / kg) / xylazine (10 mg / kg) anaesthesia, bha luchagan air an suidheachadh ann an ionnsramaid stereotaxic beag-beathach, agus bha uachdar a ’chraicinn air nochdadh. Chaidh trì snàthadan tomhas-àirde trì-deug a chleachdadh gus an 0.5 virusl de bhìoras a thoirt a-steach gu dà-thaobhach don NAc aig ceàrn 10 ° (AP + 1.6; ML + 1.5; DV - 4.4) aig ìre 0.1 μl / min. Chaidh leigeil le beathaichean a bha a ’faighinn banachdach HSV faighinn air ais airson latha 2 às deidh an obair-lannsa, agus chaidh cead a thoirt dha luchainn a bha air an cleachdadh airson deuchainn giùlain fhaighinn le bhith a’ faighinn eacarsaich AAV airson latha 20 mus deigheadh an dìon airson àite. Tha na h-amannan sin co-chòrdail ris na h-amannan aig an abairt transgene as motha a thigeadh air an víreas airson an dà bheactar. Airson an in-ghabhail BIX01294, bha gach aon de dhà phump-pumpaidh air an cur fo chraiceann air druim na luchaige. Chaidh obraichean Cannulae a choileanadh le bhith a ’drileadh dà thuill cranialach os cionn na NAc, agus le lìbhrigeadh an canula bho bregma (AP + 1.5; ML + 1.0; DV - 5.4). Bha cead aig luchagan faighinn air ais bho obair-lannsa airson 4 gu 5 lathaichean mus tòisich iad air a ’phròiseas co-chuir àite gu cocaine mar a tha air a mhìneachadh gu h-ìosal.
Roghainn àite sònraichte
Chaidh am modh suidheachadh suidheachadh a dhèanamh mar a chaidh a mhìneachadh roimhe, leis na h-atharrachaidhean a leanas (S7). Goirid, 3 latha às deidh in-ghabhail taobh a-staigh NAc de HSV-G9a-GFP, HSV-G9aH1093K-GFP no HSV-GFP, chaidh luchagan a chuir a-steach do na seòmraichean suidheachaidh, anns a bheil trì àrainneachdan sònraichte. Chaidh luchagan a bha a ’nochdadh roghainn mhòr airson aon de na dà sheòmar suidheachaidh a thoirmeasg bhon sgrùdadh (<10% de gach beathach). Chaidh buidhnean suidheachadh an uairsin a chothromachadh gus atharrachadh a thaobh claonadh seòmar sam bith a dh ’fhaodadh a bhith ann fhathast. Air na làithean às deidh sin, chaidh beathaichean a thoirt a-steach le saline agus chaidh an cuingealachadh ri aon seòmar feasgar airson 30 mionaid agus an uairsin a stealladh le cocaine (10 mg / kg, ip) agus a chuingealachadh airson 30 mionaid chun t-seòmar eile san fheasgar airson 2 latha (dhà) saline agus dà phaidhir cocaine). Air latha an deuchainn, chaidh luchagan a chuir air ais don inneal gun làimhseachadh airson 20 mionaid agus deuchainn a dhèanamh orra gus measadh dè an taobh a b ’fheàrr leotha. Chaidh freagairtean locomotor gu cocaine a mheasadh tro bhriseadh beam anns na seòmraichean le càraid cocaine gus dèanamh cinnteach à èifeachdas làimhseachadh dhrogaichean. Airson deuchainnean AAV agus BIX01294 CPP, chaidh protocol beagan atharraichte fhastadh. Chaidh beathaichean a thoirt a-steach a-rithist le saline no cocaine (10 mg / kg, ip) agus chaidh an cuingealachadh ri seòmraichean sònraichte airson seiseanan 30 mionaid, ach an àite sin cha robh iad air an suidheachadh ach aon uair san latha airson 4 latha, agus an uairsin an deuchainn air latha 5 (bha beathaichean air an suidheachadh air an fheasgar agus chaidh leigheasan gnàthachaidh atharrachadh. Airson a h-uile buidheann, chaidh locomotaibh bun-loidhne mar fhreagairt air saline a mheasadh gus dèanamh cinnteach nach biodh buaidh aig làimhseachadh viral no inhibitor air locomotion.
Fèin-riaghladh cocain taobh a-staigh
Chaidh radain fireann-Evans Long-Evans, le cuideam 230 – 250 g aig toiseach an deuchainn, fhaighinn. Bha iad air an cumail ann an àrainneachd le taiseachd agus teòthachd air cearcall solais / dorcha 12 a chaidh an tionndadh air ais (solais aig 9: 00 am) le ad libitum cothrom air biadh agus uisge. Chaidh cead a thoirt dha radain a dhol don àrainneachd ùr aca agus chaidh an làimhseachadh gach latha airson 1 seachdain ro thoiseach na deuchainn. Chaidh na modhan uile a dhèanamh a rèir Stiùireadh an Institiud Nàiseanta airson Cùram agus Cleachdadh Làraich-deuchainn Salann agus chaidh an aontachadh le Comataidh Cùram is Cleachdadh Ainmhidhean Mount Sinai. Chaidh geatagan fo-dhearg a chuir air an uidheam fèin-rianachd gus tomhas a dhèanamh air giùlan einnseanan. Chaidh fèin-rianachd a dhèanamh mar a chaidh a mhìneachadh roimhe (S15-S16) le catheters air an cuir a-steach don vein jugular ceart fo anesthesia isoflurane (2.4–2.7%). Chaidh catheters a shruthladh le 0.1 ml de fhuasgladh saline anns a bheil 10 U heparin agus ampicillin (50 mg / kg). Às deidh aon seachdain de shlànachadh bho obair-lannsa, thòisich trèanadh fèin-rianachd aig ìre dorcha a ’chearcall aotrom / dorcha. Bha cead aig beathaichean faighinn a-steach gach latha 3-uair gu cocaine (0.75 mg / kg / infusion) fo chlàr neartachaidh co-mheas stèidhichte-1 (FR1), far an robh 1 preas luamhan gnìomhach a ’leantainn gu aon fhilleadh de dhroga. Shuidhich radain an in-ghabhail cocaine aca an dèidh 6 latha (<15% eadar-dhealachadh anns an ìre freagairt thairis air 3 latha leantainneach, le co-dhiù 75% a ’freagairt air an luamhan ath-neartaichte). 24 uairean às deidh an seisean fèin-rianachd mu dheireadh, chaidh radain a chuir dheth gu sgiobalta, chaidh brains a thoirt air falbh gu sgiobalta agus an giullachd airson aonaranachd RNA agus qPCR.
Cnàimh-droma (CIP)
B 'e puingean ùra CSO a chaidh a chrois-cheangal agus a dhèanamh deiseil airson CIP mar a chaidh a mhìneachadh roimhe (S17-S18) le mion-atharrachaidhean. Gu h-aithghearr, chaidh 4 14-gauge a chruinneachadh, air an ceangal le 5% formailde agus air a chòmhdachadh le glycine 1 M mus reothadh iad aig −2 ° C. 80 latha mus téid an sònrachadh, caoraich anti-rabbit / lucha (a ’crochadh air gainead gladh) Chaidh grìogagan magnaiteach IgG ullachadh le bhith a’ toirt grìogagan magnatach iomchaidh le bhith a ’faighinn an aghaidh anti-G1a (ìre CIP polyclonal) no an aghaidh-H9K3me9 (ìre sgàil-uinneig monoclonal luch) antibodies tron oidhche aig 2 ° C fo chuairteachadh cunbhalach ann am fuasgladh bloc. Chaidh an sònadh feòil agus rùsgadh chromatin an dèanamh mar a chaidh a mhìneachadh roimhe (S17). An dèidh lagachadh bha gluasad co-ionann de chromatin air a ghluasad gu tiùbanan ùra agus ~ Chaidh 5% de na toraidhean deireannach a shàbhaladh gus a bhith mar smachdan 'in-chuir'. As dèidh glanadh agus ath-chuir a-mach air a ’mheasgaichean bead / antibody co-chuimichte, chaidh an aon ìre de mheasgachaidhean antibod / grìog (~ 7.5 μg antibody / samplach) a chuir ri gach samhla cromatin agus an adhradh airson ~ 16 uairean fo chuairteachadh cunbhalach aig 4 ° C. Nochd na h-eisimpleirean tuilleadh agus chaidh an atharrachadh air ais thar-chèile aig 65 ° C thar oidhche ro glanadh DNA a ’cleachdadh uidheam purrachaidh PCR. An dèidh glanadh DNA, chaidh sampallan an toirt gu qPCR agus chaidh an àbhaisteachadh gu na riaghailtean 'cur-a-steach' iomchaidh mar a chaidh a mhìneachadh roimhe (S17). Chaidh smachd a thoirt air in-labhagan àbhaisteach luchag IgG le bhith a ’cleachdadh antibody anti-IgG le polyclonal luch airson smachd a chumail air barrachd sùbailteachd airson comharran a thoirt am meud. Chaidh phosphoribosyltransferase (APRT) adenine a chleachdadh mar smachd àicheil air dearbhaidhean mu chocàin agus ΔFosB thar-strù. Faic Clàr Leasachail S5 airson sreathan prògraim brosnachaidh.
Sgrùdadh spine dendritic
Gus sgrùdadh a dhèanamh air àite G9a ann an riaghladh morf-eòlas neuronal ann an vivo, chleachd sinn dòighean a bha air am mìneachadh roimhe seo leis na h-atharrachaidhean a leanas (S1). Trì latha an dèidh stealladh de HSV-GFP, HSV-G9a-GFP, HSV-ΔJunD-GFP (chaidh na bhìorasan uile a chleachdadh ann an wildtype C57Bl / 6J luchainn), no HSV-Cre-GFP (a chaidh a chleachdadh ann an G9afl / fl luchainn), nuair a bha fìor fhaireachdainn fìor, bha luchainn air an luasgadh, bha na h-eanchainn air an gearradh agus an dèidh sin air an sgrìobadh aig 100 μm air vibratome. Chaidh roinnean an uairsin a thoirt a-steach le dìonachd a ’cleachdadh an aghaidh GFP mar a th’ air a mhìneachadh gu h-àrd (faic Immunohistochemistry). Gus measadh a dhèanamh air buaidh g9a overexpression agus buille air àireamhan spine, cho math ris a ’bhuaidh ressionDomhas ro mhòr, thomhais sinn àireamh nan cnàimhean air mu neurites 1-2 gach neuron co-ionann ri co-dhiù 299 ofm de dhiadhan àrd-sgoile bho GFP-riochdachaidh meadhanach NAc niùclasach glic (MSNs). Seach gu bheil MSNs eadar-dhealaichte bho mhor-eòlas bho àireamhan neointeach eile anns an NAc, a bharrachd air aithisgean roimhe seo a tha a ’sealltainn gu bheil HSV gu mòr a’ toirt a-steach DARPP-32 a ’cur na neòinean an cèill san roinn eanchainn seo (S19), tha sinn cinnteach gun deigheadh measadh a dhèanamh air MSNan anns na sgrùdaidhean sin a-mhàin. Airson gach beathach, rinn sinn sgrùdadh air niùcran 6 – 8 ann an ainmhidhean 3-4 anns gach buidheann (buidhnean 7), agus às dèidh sin fhuaireadh luach cuibheasach airson gach beathach airson mion-sgrùdadh staitistigeil. Chaidh deuchainnean a chaidh a dhealbhadh gus sgrùdadh a dhèanamh air buaidh oveFosB thar-sparradh air dùmhlachd spine NAc a ghiùlain mar an ceudna ris an fheadhainn a chaidh a mhìneachadh gu h-àird, ach a-mhàin gun robhar a ’cleachdadh veicearan AAV gus GFP no ΔFosB-GFP a chur an cèill airson ùine fada (seachdainean 8). Chaidh na h-ìomhaighean HSV uile a ghlacadh a ’cleachdadh micreascop co-aontaichte le amas bogaidh ola 100X (chaidh dealbhan AAV a ghlacadh le amas bogaidh ola 63X). Chaidh dealbhan fhaighinn leis an toll-phrongan air a shuidheachadh aig aonad treallach 1 agus meud meud 1024 × 1024. Chaidh fad dendritic a thomhas a ’cleachdadh NIH Image J software, agus chaidh àireamhan an spine a thomhas leis a’ bhun-dheuchainniche, leis gun deach còtaichean a chòdadh mus deach an deuchainn a dhèanamh. Chaidh àireamh chuibheasach de chnàimhean-droma gach 10 μm de dendrite a chunntas.
Mion-sgrùdadh staitistigeil
Chaidh ANOVAs aon-agus dà-rathad a choileanadh gus faighinn a-mach dè cho cudromach agus a bha roghainn àite agus sgrùdadh spine dendritic le barrachd air dà bhuidheann. Chaidh deuchainnean nan oileanach a chleachdadh airson coimeasan eile, nam measg qPCR, blocadh san àird an iar, sgrùdadh cnàmh droma dendritic a ’dèanamh coimeas eadar HSV-GFP agus HSV-Cre ann an G9a.fl / fl luchagan, mion-sgrùdaidhean microarray (faic gu h-àrd) agus deuchainnean immunoprecipitation chromatin. Chaidh deuchainnean-t oileanach dealbhaichte a chleachdadh às deidh sgrùdadh ANOVA dà-thaobh dùmhlachd dendritic an spine às deidh overexpression ΔFosB le dearbhadh air prìomh bhuaidhean mòra de làimhseachadh dhrogaichean agus bhìoras. Tha na luachan uile a tha air an toirt a-steach do na h-uirsgeulan figear a ’riochdachadh a’ ciallachadh ± SEM (* p ≤ 0.05; ** p <0.001). Mion-sgrùdaidhean staitistigeil mionaideach airson Figsichean. 1-3 anns a ’phrìomh theacsa, tha e air a thoirt seachad ann an: Legeadairean Figear mionaideach a’ toirt a-steach Staitistig.
Footnotes
Tha mi a ’dearbhadh nach eil gin de na stuthan a tha taobh a-staigh an làmh-sgrìobhainn sa chòir Riatanas deatamach na h-eachdraidh eachdraidh-d ns ns ra X X X X air a bhith air am foillseachadh roimhe no gan beachdachadh ann an àiteachan eile, a ’gabhail a-steach air an Eadar-lìon.
Chaidh a h-uile obair a bha a ’toirt a-steach cleachdadh ainmhidhean a dhèanamh a rèir molaidhean institiùideach agus IACUC aig Ionad Slàinte Oilthigh Texas Texas Southwestern agus Sgoil Mheidigeach Mount Sinai.
Tùsan is Notaichean
;