Cdk5 Phosphorylates Dopamine Glacadair D2 agus Attenuates Signaling Downstream (2013)

Luaidh: Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, et al. (2013) Cdk5 Phosphorylates Dopamine D2 Receptor agus Attenuates Downstream Signal. PLoS AON 8 (12): e84482. doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

Deasaiche: Seumas Porter, Oilthigh Dakota a Tuath, Stàitean Aonaichte Ameireagaidh

Fhuair thu: Cèitean 20, 2013; Air a ghabhail: Samhain 14, 2013; Foillsichte: Dùbhlachd 31, 2013

Dlighe-sgrìobhaidh: © 2013 Jeong et al. Is e seo artaigil ruigsinneachd fosgailte air a chuairteachadh fo chumhachan an Ceadachas Togail Creative Commons, a tha a ’ceadachadh cleachdadh gun bhacadh, sgaoileadh, agus ath-riochdachadh ann am meadhan sam bith, fhad's a thèid creideas a thoirt don ùghdar agus an tùs tùsail.

Maoineachadh: Fhuair an obair seo taic bho na tabhartasan (NRF-2012R1A2A2A01012923 agus NRF-2012R1A4A1028200) bho riaghaltas Corea (MSIP) agus fhuair iad taic cuideachd fo fhrèam prògram co-obrachaidh eadar-nàiseanta air a riaghladh le NRF à Korea (2012K2AUM Prògram Rannsachaidh Bunasach de MSIP (1-2033117). Fhuair SKP Duaisean Rannsachaidh Òga 2031 agus 415 airson Rannsachadh air Sgitsophrenia agus Ìsleachadh (NARSAD). Cha robh pàirt aig an luchd-maoineachaidh ann an dealbhadh sgrùdaidh, cruinneachadh is sgrùdadh dàta, co-dhùnadh foillseachadh, no ullachadh an làmh-sgrìobhainn.

Ùidhean farpaiseach: Tha na h-ùghdaran air innse nach eil com-pàirtean sam bith ann.

Ro-ràdh

Tha soidhneadh dopamine an sàs ann an grunn dhleastanasan eanchainn a ’gabhail a-steach co-òrdanachadh motair, smachd mood agus uidheamachdan duais [1]. Tha prìomh phàirt de chomharradh dopamine ann an cnàmhan-droma air a thoirt gu buil le neurons spìosrach meadhanach striatal (MSNs) a tha gu roghnach a ’cur an cèill fo-sheata de gabhadairean dopamine agus a’ faighinn cur-a-steach dopaminergic sa mhòr-chuid bhon sgìre teasach ventral (VTA) agus substantia nigra (SN) [2]. Tha gabhadairean dopamine nan gabhadairean pròtain-G (GPCR) le seachd raointean transmembrane agus tha dà subtypes ann, Gabhadairean coltach ri D1 agus coltach ri D2, a bhios a ’tomhas gnìomhan dà-thaobhach ann an comharrachadh dopamine [1]. Mar eisimpleir, bidh gabhadairean coltach ri dopamine D1 (D1, D5) a ’gnìomhachadh adenylyl cyclase tro G_αs agus àrdaich ìre intracellular de cAMP, ach tha gabhadairean coltach ri dopamine D2 (D2, D3, D4) a ’cur bacadh air cyclase adenylyl tro G_αi agus lughdaich an ìre intracellular de cAMP [1], [3].

Am measg gabhadairean dopamine, tha an gabhadair D2 (DRD2) an sàs ann am pathophysiology ioma-dhuilgheadasan inntinn-inntinn a ’toirt a-steach sgitsophrenia agus tràilleachd dhrogaichean [4], mar sin gu bheil mòran de dhrogaichean antipsicotic co-dhiù gu ìre ag amas air DRD2. Tha fios cuideachd gu bheil gnìomhachd DRD2 a ’ceangal gu math ri builean giùlain dhrogaichean mì-ghnàthachaidh ann am modalan beathach [5]. Tha antidepressants agus èifeachdas stabilizer mood cuideachd air a bhith ceangailte ri atharrachaidhean ann an abairt uachdar cealla de DRD2 no comharran intracellular sìos an abhainn air am meadhanachadh le PKA, ERK agus GSK3 [1], [4], [6]. A dh ’aindeoin na dreuchdan riatanach sin airson DRD2 san eanchainn, chan eilear a’ tuigsinn gu tur na h-innleachdan riaghlaidh mionaideach a bheir heterogeneity agus iom-fhillteachd do thogalaichean DRD2.

Tha loidhnichean fianais connspaideach a ’nochdadh gu bheil grunn atharrachaidhean posttranslational an sàs ann a bhith a’ gleusadh gnìomhachd DRD2. Chaidh glycosylation farsaing de DRD2 a nochdadh ann an sgrùdaidhean labeling tràth-dàimh [7], agus chaidh cruthachadh bannan disulfide taobh a-staigh DRD2 a chomharrachadh cuideachd mar atharrachadh cudromach airson ceangal ligand [8]. A bharrachd air an sin, chaidh làraich fosphorylation de DRD2 a chomharrachadh an toiseach le ann vitro assay le radioisotopes, a ’toirt seachad slighean airson diofar shlighean riaghlaidh air am meadhanachadh le diofar kinases [9]. Gu dearbh, tha protein kinase C (PKC) a ’riaghladh gluasad DRD2-meadhanaichte de chalcium intracellular agus ag atharrachadh eadar-obrachadh DRD2 le pròtanan cytoskeletal [10]. Bidh fosphorylation le GPCR kinase 2 (GRK2) a ’riaghladh pàtranan ath-mhothachaidh agonist-brosnaichte de DRD2 [11].

Tha kinase 5 a tha an urra ri cyclin (Cdk5) na serine / threonine kinase air a stiùireadh le proline aig a bheil gnìomhachd fàbharach air sgàth faireachdainn sònraichte eanchainn de na gnìomhaichean riatanach aige, p35 agus p39 [12]. Tha Cdk5 an sàs ann an grunn phròiseasan neuronal a ’toirt a-steach imrich neuronal agus stiùireadh axon, agus tha luchagan Cdk5 agus p35 null a’ nochdadh lochdan ann an laigheachadh cortical [13]. O chionn ghoirid, chaidh a shealltainn gu bheil fosphorylation de WAVE1 agus ephexin le Cdk5 a ’riaghladh morphogenesis spine dendritic [14]. A bharrachd air an sin, tha Cdk5 cuideachd a ’riaghladh ìrean faireachdainn uachdar an gabhadair NMDA, NR2B, agus sruthan NMDA-meadhanaichte NR2A. [15], [16]. Bu chòir a thoirt fa-near gu bheil grunn phìosan fianais a ’nochdadh dàimh dlùth eadar Cdk5 agus an siostam dopamine. Cdk5 phosphorylates tyrosine hydroxylase (TH), a ’riaghladh a sheasmhachd, agus mar sin a’ cumail suas homeostasis dopaminergic [17]. Ann an neurons postynaptic, nuair a tha fuigheall T75 de dopamine agus fosphoprotein-32kD riaghlaichte cyclic-AMP (DARPP-32) air a phosphorylated le Cdk5, faodaidh e bacadh a chuir air gnìomhachd PKA agus mar sin antagonize dopamine DRD1-mediated PKA signall [18]. Gu inntinneach, nuair a thèid cocaine, agonist neo-dhìreach de gabhadairean dopamine, a rianachd gu cronail ann am radain, mRNA agus ìrean pròtain de Cdk5 àrdachadh ann an neurons spìosrach meadhanach [19]. Còmhla, tha coltas gu bheil Cdk5 an sàs ann an atharrachaidhean synaptic air a bhrosnachadh le drogaichean. Anns an sgrùdadh seo, tha sinn a ’sealltainn eadar-obrachadh obrachail de DRD2 agus Cdk5 a tha a’ leudachadh tuilleadh àite Cdk5 ann an comharrachadh dopamine.

Stuthan agus Dòighean-obrach

Antibodies

Chaidh searmonan an-aghaidh coineanach a thogail an aghaidh peptidean anns a bheil fospho-serine 321 (pS321) den treas lùb intracellular de DRD2 (D2i3). Chaidh fospho-peptide, CNPDpSPAKPEK (PEPTRON), a chleachdadh gus colbh peptide-conjugated a dhèanamh airson glanadh dàimh (20401, PIERCE). Chaidh antibody anti-pS321 a shaidhbhreachadh le siostam glanaidh dàimh a ’leantainn stiùireadh an neach-dèanamh. Chaidh fospho-antibody purichte a stòradh ann am PBS le 0.1% sodium azide agus gelatin 0.1%. Chaidh antibody anti-luch anti-Cdk5 (sc-249) agus antibody anti-coineanach anti-p35 (sc-820) a chleachdadh airson blotadh an Iar agus immunocytochemistry Cdk5 / p35. Chaidh antibody anti-GFP an aghaidh na luchaige (sc-9996) a chleachdadh airson dìon-dìon agus blotadh an Iar de DRD2-GFP. Frith-dhìon an aghaidh coineanach anti-FLAG (sc-807), antibody anti-coineanach anti-HA (sc-805), antibody anti-GST anti-luch (sc-138), agus antibody anti-luch anti-GAPDH (sc- Chaidh 32293) a cheannach bho Santa Cruz Biotechnologies.

Animals

Bha an luchag bualadh p35 na thiodhlac math bhon Dr. Katsuhiko Mikoshiba aig Institiùd Saidheans Brain RIKEN ann an Iapan agus air a chleachdadh airson cultar neuron bun-sgoile. B ’e seataichean primer airson gintinneachd 5′- GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG, 5′-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC agus 5′- TCCATCT GCACGAGACTAGT mar a chaidh a mhìneachadh roimhe [20]. Chaidh luchagan ICR agus radain Sprague Dawley a chleachdadh airson ullachadh lysate eanchainn. Chaidh a h-uile modh beathach aontachadh le Comataidh Cùram agus Cleachdadh Ainmhidhean Institiùd Oilthigh Saidheans agus Teicneòlas Pohang.

Bidh Plasmid a ’togail

Chaidh isoform fada daonna DRD2 ann an vectar plasmid EGFP-N1 agus an treas lùb intracellular de DRD2 (fuigheall amino-aigéad 212 - 373 a ’toirt a-steach na fuigheall amino-aigéad 29 a bharrachd a tha sònraichte do DRD2 fada isoform) ann an vectar plasmid pFLAG-CMV-2. Chaidh Cdk5 daonna a chuir a-steach ann an vectar plasmid pCMV-HA agus chaidh p35 daonna a chuir a-steach ann an vectar plasmid pcDNA 3.1. Chaidh Cdk5 daonna a chuir a-steach fo neach-adhartachaidh cytomegalovirus (CMV) còmhla ri p35 daonna ann an vectar pcDNA 3.1 gus abairt dùbailte a dhèanamh (Cdk5 / p35) airson immunocytochemistry, assay in-ghabhail gabhadain, [³⁵S] -GTP_γS assay ceangailteach, assay ceangailteach radioligand agus immunoassay enzyme cAMP.

Ann an Vitro Kinase Assay

Ceangal IP ann vitro chaidh assay kinase a dhèanamh mar a leanas. Chaidh aon eanchainn luch iomlan a chòmhdach ann am bufair lysis erythrocytes 3 mL (ELB) (50 mM Tris (pH 8.0), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40) le stròcan 20 de homogenizer Dounce gus lysates eanchainn homogenized fhaighinn . Chaidh na lysates a thoirt a-steach air deigh airson 30 min, sonicated, agus centrifuged aig 16,000 × g airson 10 min. Chaidh na h-uachdarain a dhìon le dìon an-aghaidh p35 an-aghaidh coineanach gus ionad gnìomhach Cdk5 / p35 fhaighinn. Chaidh pròtain fusion Cdk5 / p35 iom-fhillte agus purraichte GST a mheasgachadh le adenosine 5′-triposphate, [γ-³²P] (NEG-502H, PerkinElmer) agus air a bhrosnachadh ann am bufair kinase (30 mM HEPES (pH 7.2), 10 mM MgCl₂, 0.2 mM DTT) airson 1 h aig teòthachd an t-seòmair [18], [21]. Chaidh iom-fhillte Cdk5 / p25 purraichte (14 - 516, Millipore) a chleachdadh cuideachd airson ann vitro kinase assay mar a chaidh a mhìneachadh gu h-àrd. Chaidh am bufair luchdadh sampall 2 × a chur ris a ’mheasgachadh ath-bhualadh agus air a ghoil aig 100 ° C. Chaidh na samples a thoirt a-steach do SDS-PAGE an uairsin agus chaidh an gel tiormaichte a mheasadh le autoradiography.

Chromatography Liquid (LC) -Mass Spectrometry (MS) / MS Analysis

Chaidh am pròtain ath-chuairteachaidh GST-D2i3 a sgrùdadh le LC-MS / MS às deidh ceangal le IP ann vitro kinase assay. Rinn sinn comharrachadh peptide air dàta LC-MS / MS a ’cleachdadh X !! Tandem (dreach Dec-01-2008). Chaidh gach faidhle dàta RAW a thionndadh gu mzXML an-toiseach a ’cleachdadh an loidhne-phìoban tar-proteomic (TPP; dreach 4.3). Chaidh sganaidhean MS / MS anns na mzXMLs a chaidh a thionndadh an uairsin a sgrùdadh an aghaidh stòr-dàta sreath pròtain luch UniProt (leig às 2010_07) a ’toirt a-steach sreath GST-D2i3 a’ cleachdadh X !! Tandem. Chaidh an fhulangas a shuidheachadh gu 3 Da airson ions ro-ruithear agus 2 Da airson ions criomag. Chaidh sònrachas enzyme airson trypsin a chleachdadh. Chaidh roghainnean atharrachaidh caochlaideach a chleachdadh airson carbamidomethylation cysteine ​​(57.021 Da), oxidation methionine (15.995 Da), hydrolysis asparagine (0.987 Da) agus fosphorylation de serine (79.966 Da).

Immunoprecipitation

Chaidh immunoprecipitation a dhèanamh air lysates cealla ann am bufair lysis ELB. Chaidh antibody anti-GFP a chur ris na lysates agus air a bhrosnachadh airson 3 h aig 4 ° C. Chaidh immunocomplexes a ghlanadh le bhith a ’cleachdadh agarose protein-A. Bha na precipitates air an toirt a-steach le bufair luchdadh sampall SDS airson 30 min aig 37 ° C, agus fo smachd SDS-PAGE agus blots an Iar.

GST Tarraing-sìos Assay

Chaidh 10 µg de GST purraichte agus GST - D2i3 a thoirt a-steach le lysate eanchainn radan airson 1.5 h aig 4 ° C. Chaidh 30 µL de ghrìogagan glutathione (GSH) -conjugated Sepharose 4B (17-0756-01, GE Healthcare) a cho-chothromachadh le bufair lysis a chur ris agus a bhrosnachadh airson 1 h a bharrachd. Chaidh grìogagan a chruinneachadh le centrifugation aig 2,000 ×g agus air a roladh le bufair lysis 4 amannan [22], [23]. Chaidh precipitates a sgrùdadh le blotadh an Iar a ’cleachdadh antibodies anti-Cdk5 agus anti-p35.

Immunocytochemistry

Chaidh ceallan HEK 293 tar-chuir agus neurons striatal a chaidh an àiteachadh air còmhdaichean còmhdaich a nighe aon uair le saline bufair fosfáit (PBS) agus air a chàradh le bogadh ann an fuar 4% paraformaldehyde / PBS airson 30 min. Chaidh antibody bun-sgoile a lagachadh anns an fhuasgladh bacaidh (2% serum each agus 1% Triton X-100 ann am PBS). Chaidh antibody anti-luch Alexafluor-647-conjugated (A20990, Invitrogen) agus antibody anti-coineanach Alexafluor-568-conjugated (A11011, Invitrogen) a chleachdadh mar antibodies àrd-sgoile. Chaidh Hoechst a chleachdadh airson staining niuclas. Chaidh dealbhan fhaighinn le microscopy confocal (Olympus, FluoView-1000).

Measadh in-ghabhail gabhadair

24 h às deidh an tar-chuir, chaidh ceallan a làimhseachadh le 1 µM ​​quinpirole (Q102, Sigma) airson 30 min agus 90 min aig 37 ° C. Chaidh ceallan a chuir dheth a-rithist ann an PBS fuar 2 mL agus chaidh aliquots 200 µL a chleachdadh airson gach ath-bhualadh. Chaidh làimhseachadh dhrogaichean a dhèanamh aig teòthachd an t-seòmair airson 3 h aig na dùmhlachdan a leanas; 3 nM [³H] -spiperone (NET-565, PerkinElmer), 3 µM ​​sulpiride (895, TOCRIS), 10 µM ​​haloperidol (H1512, Sigma). Hydrophobic [³Chaidh H] -spiperone a chleachdadh gus bileagan gabhadain iomlan a chlàradh agus chaidh sulpiride hydrophilic a chleachdadh an àite gabhadan membranous ceangailte [³H] -spiperone comharran. Chaidh comharran gabhadain co-cheangailte ri meur a thomhas le bhith a ’toirt air falbh luachan gabhadan intracellular bho na luachan gabhadain iomlan a chaidh an cur an cèill. Chaidh ceallan a shìoladh air sìoltachan GF / B (Millipore) agus chaidh an nighe 3 amannan le bufair nighe (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Chaidh sìoltachain a thiormachadh agus chaidh rèidio-beò a bha air fhàgail a thomhas a ’cleachdadh cuntar scintillation leaghan [24].

Ullachadh Membrane Cell

Chaidh ceallan confluent ann an soithichean-cultair 100 mm às deidh an tar-chuir a nighe le PBS fuar-deighe agus a bhuain ann am bufair 1 mL HME (25 mM HEPES (pH 7.5), 2 mM MgCl₂, 1 mM EDTA). Chaidh lysates homogenized a centrifug le 500 × g airson 15 min agus an dèidh sin chaidh na h-os-fhilltean a chuir a-steach le 36,000 × g airson 30 min. Chaidh peilearan ath-chrochadh ann am bufair HME a chleachdadh airson measaidhean.

[³⁵S] -GTP_γS Ceangal ceangail

Chaidh bloighean membran cealla a thoirt a-steach ro-làimh le 1 µM ​​quinpirole (Q102, Sigma) anns a ’bhufair assay (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA agus 0.01 mM GDP) airson 10 min. [³⁵S] -GTP_γChaidh S (NET-030H, PerkinElmer) a chur ris a ’cho-chruinneachadh deireannach de 3 nM ann an 30 µL agus air a bhrosnachadh a-rithist airson 90 min. 170 µL de bhufair fuar-deighe (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, agus chaidh 0.1 mM GTP) a chuir ris gus stad a chuir air an ath-bhualadh. Chaidh pilearan a shìoladh air sìoltachan GF / B (Millipore) agus chaidh an nighe 3 amannan le bufair nighe (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Chaidh sìoltachain a thiormachadh agus chaidh rèidio-beò a thomhas a ’cleachdadh a’ chunntair scintillation [25], [26].

Radioligand Binding Assay

Chaidh buill-bodhaig ullaichte a thoirt a-steach le 0.01 nM [³H] -spiperone (NET-565, PerkinElmer) agus dùmhlachdan nas motha de quinpirole (Q102, Sigma) airson 30 min anns a ’bhufair assay (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Chaidh pilearan a shìoladh air sìoltachan GF / B (Millipore) agus chaidh an nighe 3 amannan le bufair nighe (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Chaidh an ath-bhualadh a thoirt gu crìch le sìoladh luath tro shìoltachain GF / C. Chaidh radioactivity iarmharach a thomhas le bhith a ’cleachdadh cuntar scintillation leaghan [27]-[29].

cAMP Enzyme Immunoassay

Chaidh ceallan HEK 293 tar-chuir a ro-innse le rolipram 10 µM ​​(R6520, Sigma) airson 1 h, agus an uairsin air an làimhseachadh le 0.1 µM ​​forskolin (F6886, Sigma) agus dùmhlachdan nas motha de quinpirole (Q102, Sigma) airson 30 min. Chaidh neurons striatal cultarach bun-sgoile a làimhseachadh le rolipram 10 µM ​​airson 1 h, agus an uairsin dopamine 1 µM ​​airson 1 h [22]. Chaidh lysates cealla ullachadh le 0.1 M HCl agus chaidh ìrean cAMP a lorg le cAMP enzyme immunoassay kit (Sapphire Bioscience) a ’leantainn stiùireadh an neach-dèanamh.

Neuron Striatal Cultar Bun-sgoile

Bha sgìre striatal air a sgaradh bho eanchainn embryonic na luchaige (E15). Chaidh teannachadh sgaoilte a sgaradh anns na meadhanan riatanach as ìsle (MEM) (11095, Invitrogen) anns a bheil 0.25% trypsin (T4549-100, Sigma) agus 0.1% DNase I airson 6 min aig 37 ° C. Chaidh ceallan ath-chrochadh anns na meadhanan plating (MEM le 0.01 M HEPES (pH 7.4) agus serum each 10% (vol / vol) (16050-122, GIBCO)). Bha neurons air an àiteachadh airson làithean 7 ann vitro (DIV 7) ann am MEM le cur-ris B27 (17504-044, Invitrogen) mus tèid a chuir an sàs ann an immunoassays enzyme cAMP.

toraidhean

Cdk5 Phosphorylates Serine 321 anns an treas lùb intracellular de DRD2 ann vitro

Gus fo-stratan nobhail Cdk5 a chomharrachadh, rinn sinn sgrùdadh eagarach a ’cleachdadh (S / T) PX (K / H / R) mar na sreathan co-aontachd aithne Cdk5 [30] agus chomharraich e DRD2 mar substrate tagraiche. Tha an sreath co-aontachd, a ’toirt a-steach serine 321, suidhichte anns an treas lùb intracellular de DRD2 (D2i3) far an deach grunn dhòighean riaghlaidh a thoirt a-steach [3], [10], [11]. Tha an t-sreath air a ghleidheadh ​​gu mean-fhàs ann an DRD2 ann an cnàmhan-droma, a ’ciallachadh cudromachd gnìomh a’ fhuigheall (Fig. 1A).

Luchdaich a-nuas:   

• PPT

  Slideadh PowerPoint

• PNG

  dealbh nas motha (2.08MB)

• TIFF

  an dealbh tùsail (4.36MB)

Figear 1. Cdk5 phosphorylates serine 321 anns an treas lùb intracellular de DRD2 in vitro.

(A) Co-thaobhadh sreath searbhag amino a ’sealltainn roinnean glèidhte den DRD2 bho ghrunn ghnèithean (fo sgàil). Tha an làrach Cdk5 fosphorylation air a chomharrachadh le rionnag. (B) IP-cheangailte ann vitro assay kinase le proteinichean mutant GST-D2i3 agus GST-D2i3 mutant. Chaidh iom-fhillte Cdk5 / p35 a bha air a bheairteachadh bho chuibhreann eanchainn luch le immunoprecipitation anti-p35 a chleachdadh airson ath-bheachdan kinase. Tha autoradiograph de phròtainean fosphorylated air a shealltainn còmhla ri staining gorm sgoinneil Coomassie den aon gel. Tha ceann-saighead a ’comharrachadh comharra rèidio-beò a tha a’ freagairt ri GST-D2i3s agus tha ceann saighead fosgailte a ’comharrachadh comharran rèidio-beò bho p35. (C) Speactram MS / MS den chriomag peptide fosphorylated de D2i3. Tha na pàtranan criomag teòiridheach air an sealltainn fon speactram. Am measg nan ianan criomag, tha na y- agus b-ions a lorgar air an comharrachadh anns an speactram. An y₆ agus y₇ tha ions gu làidir a ’comharrachadh fosphorylation de serine 321. (D) In vitro assay kinase le iom-fhillte purraichte Cdk5 / GST-p25 a ’cleachdadh pròtainean mutant GST-D2i3 agus GST-D2i3. Chaidh pròtanan fosphorylated a nochdadh ann an autoradiograph, còmhla ri staining gorm sgoinneil Coomassie. Tha ceann-saighead a ’comharrachadh comharra rèidio-beò a’ freagairt GST-D2i3 agus tha ceann saighead fosgailte a ’comharrachadh comharran rèidio-beò bho GST-p25.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g001

Gus comas Cdk5 a mheasadh gus fosphorylate D2i3 a dhèanamh, rinn sinn ceangal le IP ann vitro measaidhean kinase le bhith a ’cleachdadh pròtacal gnìomhach Cdk5 / p35 air a bheairteachadh bho lysate eanchainn luch le immunoprecipitation p35 le GST-D2i3 ath-leasaichte purichte (fuigheall amino-aigéad 212 - 373) mar na fo-stratan. Chunnaic sinn comharran fosphorylation anns na pròtanan GST-D2i3 agus GST-D2i3 S297A, ach chaidh an comharra a lughdachadh gu mòr le bhith a ’cleachdadh GST-D2i3 S321A (Fig. 1B). Gus tuilleadh dearbhaidh a dhèanamh air fosphorylation de serine 321 anns an GST-D2i3, rinn sinn mion-sgrùdadh LC-MS / MS air na sampallan bho cheangal IP. ann vitro measaidhean kinase a ’cleachdadh mais-speactram LTQ XL. Gu cunbhalach, chaidh fospho-peptides a rèir meud peptidean 321 fospho-serine fhaighinn air ais (Fig. 1C). A ’beachdachadh gu bheil an togail a tha an urra ri dàta rè mion-sgrùdadh LC-MS / MS buailteach a bhith a’ lorg pailteas phròtainean san t-sampall [31], tha an dàta seo a ’moladh gur e fuigheall serine 321 am prìomh làrach fosphorylation de Cdk5 ann an sgìre D2i3. Gus fosphorylation dìreach de serine 321 a dhearbhadh anns an GST-D2i3 le Cdk5, ann vitro Chaidh assay kinase a ’cleachdadh iom-fhillte Cdk5 / GST-p25 purnta le pròtainean GST-D2i3 ath-leasaichte. Chomharraich sinn comharra fosphorylation cudromach anns an GST-D2i3 a bha neo-làthaireach anns an GST-D2i3 S321A (Fig. 1D). Air an toirt còmhla, tha na toraidhean sin a ’sealltainn gu bheil fuigheall D2i3 S321 na thargaid roghnach airson fosphorylation Cdk5-mediated.

Cdk5 Phosphorylates Serine 321 anns an treas lùb intracellular de DRD2 ann an ceallan

Gus fosphorylation de serine 321 a chomharrachadh, thog sinn antibody sònraichte airson fospho-serine 321 (pS321). Sampaill bhon cheangal IP ann vitro Chaidh assay kinase a sgrùdadh le blotadh an Iar a ’cleachdadh antibody anti-pS321. Sheall blots còmhlan sònraichte anns an ath-bhualadh kinase a bha an urra ri GST-D2i3 (Fig. 2A). Gus dearbhadh an fosphorylation a dh’fhaodadh a bhith ann de serine 321 ann an DRD2 le Cdk5 ann an ceallan, chaidh immunoprecipitates anti-GFP bho cheallan HEK 293 a ’cur an cèill DRD2-GFP agus DRD2 S321A-GFP le no às aonais HA-Cdk5 agus p35 a’ cleachdadh G-blot. antibodies anti-pS321. Thathas a ’cumail sùil air comharran còmhlan smeartha caractar le antibody anti-GFP a tha aithnichte mar thoradh air cus glycosylation de DRD2 a-mhàin ann an làthaireachd DRD2-GFP, agus lorg antibody anti-pS321 comharran coltach DRD2 a-mhàin le co-abairt Cdk5 / p35 (Fig. 2B) [7]. Gus tuilleadh dearbhaidh a dhèanamh air fosphorylation de serine 321 le Cdk5, D2i3 (FLAG-D2i3) agus cruth mutant de D2i3 (FLAG-D2i3 S321A). Chaidh FLAG-D2i3 agus FLAG-D2i3 S321A a chuir an cèill le no às aonais HA-Cdk5 agus p35 ann an ceallan HEK 293 a sgrùdadh le assay gluasad gluasaid SDS-gel. Chaidh gluasad gluasad mòr a bha an urra ri Cdk5 a choimhead airson FLAG-D2i3, ach chan ann airson FLAG-D2i3 S321A (Fig. 2C). Rinn sinn measadh cuideachd air an ìre fosphorylation de DRD2 aig Ser321 air brosnachadh agonist. Chaidh ceallan HEK 293 a bha a ’cur an cèill DRD2-GFP agus Cdk5 / p35 iom-fhillte a bhrosnachadh le quinpirole, agus chaidh immunoprecipitates anti-GFP bho na lysates cealla a sgrùdadh le blotadh an Iar a’ cleachdadh antibodies anti-GFP agus anti-pS321. Fhuair sinn a-mach nach robh brosnachadh agonist a ’toirt buaidh air fosphorylation Cdk5-mediated de DRD2 aig Ser321, a tha a’ nochdadh eadar-dhealaichte bho fosphorylations GRK- agus PKC-mediated (Fig. 2D) [32], [33]. Còmhla, tha na toraidhean sin a ’sealltainn gum faod Cdk5 fosphorylate an serine 321 fuigheall de DRD2 anns an àrainneachd cheallach.

Luchdaich a-nuas:   

• PPT

  Slideadh PowerPoint

• PNG

  dealbh nas motha (1.92MB)

• TIFF

  an dealbh tùsail (3.5MB)

Figear 2. Cdk5 phosphorylates serine 321 anns an treas lùb intracellular de DRD2 ann an ceallan.

Chaidh fosphorylation Cdk5-mediated de serine 321 a sgrùdadh le bhith a ’cleachdadh antibody anti-pS321. (A) Sampaill bho IP ceangailte ann vitro Chaidh assay kinase a ’cleachdadh pròtainean GST-D2i3 a sgrùdadh le blotadh an Iar (WB) le antibodies comharraichte. Tha cinn-cinn a ’comharrachadh GST-D2i3s. (B) Chaidh DRD2-GFP agus DRD2 S321A-GFP a chuir an cèill le no às aonais HA-Cdk5 agus p35 ann an ceallan HEK 293. Chaidh immunoprecipitates anti-GFP a sgrùdadh le blotadh an Iar a ’cleachdadh antibodies anti-GFP agus anti-pS321. Tha an camag a ’comharrachadh comharran DRD2 agus tha ceann saighead fosgailte a’ comharrachadh comharran nonspecific bho na immunoprecipitates anti-GFP. Is e '% toirt a-steach'% toirt de lysate iomlan airson ath-bhualadh IP. Chaidh comharran lag Cdk5 lag a chomharrachadh le reultan. (C) Assay gluasad gluasaid gel. Chaidh ceallan HEK 293 a chaidh an gluasad mar a chaidh an comharrachadh a sgrùdadh le blotadh an Iar. (D) Chaidh ceallan tar-chuir HEK 293 a làimhseachadh le quinpirole agus chaidh immunoprecipitates anti-GFP a sgrùdadh le blotadh an Iar le antibodies anti-GFP agus anti-pS321. Tha ceann saighead fosgailte a ’comharrachadh comharran nonspecific bho immunoprecipitates anti-GFP.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g002

Tha Cdk5 / p35 Complex agus DRD2 co-cheangailte gu corporra

Rinn sinn sgrùdadh air an eadar-obrachadh corporra a dh’fhaodadh a bhith ann eadar an toinnte Cdk5 / p35 agus DRD2 oir tha fios gu bheil ceangal corporra aig mòran de shubstridean Cdk5 le Cdk5 / p35. [23], [34], [35]. An toiseach, chaidh deuchainn tarraing-sìos GST a dhèanamh. Chaidh pròtain GST-D2i3 ath-leasaichte a thoirt a-steach le lysate eanchainn radan agus chaidh sgrùdadh a dhèanamh air precipitates slaodadh GST airson blotadh an Iar. Mar a chithear ann an Fig. 3A, chaidh endogenous Cdk5 agus p35 a chomharrachadh anns na precipitates slaodadh sìos, a ’nochdadh eadar-obrachadh corporra eadar DRD2 agus an Cdk5 / p35 iom-fhillte (Fig. 3A). A bharrachd air an sin, lorgar HA-Cdk5 agus p35 anns na immunoprecipitates anti-GFP bho lysates cealla HEK 293 a ’cur an cèill DRD2-GFP agus Cdk5 / p35 (Fig. 3B). A bharrachd air an sin, rinn sinn mion-sgrùdaidhean immunocytochemical agus chunnaic sinn gu bheil DRD2-GFP, HA-Cdk5 agus p35 a ’nochdadh comharran co-ionadachaidh cudromach aig an sgìre membranous de cheallan HEK 293 (Fig. 3C, pannalan àrda). Rinn sinn sgrùdadh cuideachd air co-ionadachadh DRD2 agus Cdk5 / p35 ann an co-theacsa neuronal. Gu cunbhalach, sheall DRD2-GFP cuideachd co-ionadachadh mòr le Cdk5 endogenous agus p35 anns na neurons striatal cultarach (DIV7), a ’toirt tuilleadh taic do cheanglaichean gnìomh eadar DRD2 agus Cdk5 / p35 (Fig. 3C, pannalan ìosal). Tha na toraidhean a ’sealltainn gum faod DRD2 agus Cdk5 / p35 iom-fhillte a chruthachadh agus mar sin, a’ toirt taic don bheachd gu bheil DRD2 na substrate fiosaigeach de Cdk5.

Luchdaich a-nuas:   

• PPT

  Slideadh PowerPoint

• PNG

  dealbh nas motha (3.91MB)

• TIFF

  an dealbh tùsail (5.35MB)

Figear 3. Faodaidh Cdk5 / p35 iom-fhillte a dhèanamh le DRD2.

(A) Assay tarraing-sìos GST a ’cleachdadh pròtain GST-D2i3 ath-leasaichte le cuibhreann eanchainn radan. Chaidh precipitates slaodadh GST a thoirt do mhion-sgrùdaidhean blotting an Iar. Tha 'bead' a 'comharrachadh an dùmhlachd tarraing sìos às aonais pròtainean GST. (B) Immunoprecipitation de DRD2 agus Cdk5 / p35 iom-fhillte. Chaidh IP anti-GFP bho lysates bho cheallan tar-chuir a thoirt do mhion-sgrùdaidhean blotadh an Iar. Tha an camag a ’comharrachadh comharran DRD2 agus tha ceann saighead fosgailte a’ comharrachadh comharran nonspecific bho na immunoprecipitates anti-GFP. Tha blot overexposed airson cuir a-steach cuideachd air a shealltainn air an taobh cheart. (C) Mion-sgrùdaidhean immunocytochemical de DRD2 agus Cdk5 / p35. Chaidh ceallan HEK 293 a bha a ’cur an cèill DRD2-GFP agus Cdk5 / p35 a smàladh le antibodies anti-Cdk5 agus anti-p35 (Pannalan àrda). Chaidh DRD2-GFP a chuir an cèill leis fhèin anns na neurons striatal cultarach agus air an staining le antibodies anti-Cdk5 agus anti-p35 (Pannalan as ìsle). Chaidh Hoechst a chleachdadh airson staining niuclas. Is e am bàr sgèile 5 µm. Chaidh na h-ìomhaighean uile fhaighinn le bhith a ’cleachdadh miocroscop confocal (Olympus, FluoView-1000).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g003

Phosphorylation Cdk5-mediated de DRD2 Attenuates Receptor Activity

Chaidh aithris gu bheil fosphorylation ag atharrachadh feartan riatanach GPCRn leithid ceangal pròtain G, in-ghabhail gabhadain, sgìreachadh intracellular, agus co-cheangal ri pròtanan modulator [9], [11], [24]. ThaTha in-ghabhaltachd gabhadair air a bhrosnachadh le gonist na phròiseas riaghlaidh deatamach de ghluasad chomharran. Rinn sinn sgrùdadh air modaladh Cdk5-meadhanaichte de in-smachd DRD2. Chaidh ceallan HEK 293 a bha a ’cur an cèill DRD2-GFP agus DRD2 S321A-GFP le no às aonais Cdk5 / p35 a thoirt a-steach le quinpirole 1 µM ​​gus brosnachadh a-staigh DRD2 a bhrosnachadh le agonist (Fig. 4A). [³Chaidh comharran H] -spiperone de DRD2-GFP a ’cur an cèill ceallan a lughdachadh gu mòr aig làimhseachadh quinpirole 30 min agus chaidh fhaighinn air ais aig 90 min. Gu inntinneach, [³Chaidh comharran H] -spiperone de DRD2-GFP agus Cdk5 / p35 a ’cur an cèill ceallan a lughdachadh cuideachd aig làimhseachadh 30 min quinpirole ach cha deach fhaighinn air ais aig 90 min (Fig. 4A, an dàrna roinn). Air an làimh eile, [³Chaidh comharran H] -spiperone de cheallan cur an cèill DRD2 S321A-GFP a lughdachadh aig 30 min agus chaidh an toirt air ais aig 90 min, ge bith dè an co-mhìneachadh le Cdk5 / p35. Tha sgrùdaidhean roimhe air sealltainn gu bheil an DRD2 a-staigh ag ath-chuairteachadh air ais chun membran plasma air brosnachadh agonist fada [11]S an Iar- Thus tha e coltach gu bheil fosphorylation Cdk5-mediated de DRD2 an sàs anns na pròiseasan ath-mhothachaidh às deidh in-stealladh DRD2 a tha air a bhrosnachadh le agonist.

Luchdaich a-nuas:   

• PPT

  Slideadh PowerPoint

• PNG

  dealbh nas motha (387KB)

• TIFF

  an dealbh tùsail (1.31MB)

Figear 4. Bidh fosphorylation Cdk5-meadhanaichte a ’lagachadh abairt uachdar DRD2 agus comharran sìos an abhainn.

(A) abairt uachdar DRD2 air a thomhas le [³H] -spiperone ceangailteach assay. Chaidh ceallan tar-chuir HEK293 a bhrosnachadh le quinpirole 1 µM ​​airson na h-ùine ainmichte agus air am buain, agus an uairsin 3 nM [³H] -spiperone làimhseachadh airson 3 h. Chaidh radioactivity a thomhas agus chaidh comharran uachdar a thomhas. Tha bàraichean mearachd a ’riochdachadh cuibheas ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01; ANOVA aon-shligheach le deuchainn post hoc Dunnett: dèan coimeas eadar na colbhan uile vs colbh smachd). (B) [³⁵S] -GTP_γS ceangaltach assay. Chaidh memblan cealla ullachadh bho na ceallan a chaidh an gluasad mar a chaidh a chomharrachadh. Chaidh ullachaidhean meur a thoirt a-steach le quinpirole 1 µM ​​agus an uairsin 3 nM [³⁵S] -GTP_γS airson 90 min. Tha bàraichean mearachd a ’riochdachadh cuibheas ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; ANOVA aon-shligheach le deuchainn post hoc Bonferroni: dèan coimeas eadar gach paidhir colbhan). (C) Quinpirole-farpaiseach [³H] -spiperone ceangailteach assay. Chaidh ullachaidhean meur bho cheallan tar-chuir a thoirt a-steach le 0.01 nM [³H] -spiperone agus dùmhlachdan nas motha de quinpirole airson 30 min. Chaidh ais-tharraing neo-loidhneach fhaighinn le GraphPad. Tha bàraichean mearachd a ’comharrachadh cuibheas ± SE (n = 3). (D) immunoassays cAMP enzyme ann an ceallan tar-chuir HEK 293. Chaidh ceallan tar-chuir a ro-innse le rolipram 10 µM airson 1 h, agus an uairsin air an co-làimhseachadh le forskolin 0.1 µM agus a ’sìor fhàs dùmhlachdan de quinpirole airson 30 min. Chaidh ais-tharraing neo-loidhneach fhaighinn le GraphPad. Tha bàraichean mearachd a ’riochdachadh cuibheas ± SE (n = 4; ** p <0.01; dà-earball t-tests). (E) Chaidh neurons striatal cultarach bho sheòrsa fiadhaich agus embryos bualadh p35 (DIV 7) a làimhseachadh le rolipram 10 µM ​​airson 1 h agus an uairsin 1 µM ​​dopamine airson 1 h. Tha bàraichean mearachd a ’riochdachadh cuibheas ± SE (n = 4; **p<0.01; dà-earball t-tests).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g004

Rinn sinn tuilleadh measaidh air atharrachadh a dh’fhaodadh a bhith ann an ceangal pròtain G a tha air a bhrosnachadh le agonist gu DRD2 co-cheangailte ri fosphorylation Cdk5-mediated a ’cleachdadh [³⁵S] -GTP_γS ceangaltach assay [25], [26]. Chaidh DRD2-GFP agus DRD2 S321A-GFP le no às aonais Cdk5 / p35 a chur an cèill ann an ceallan HEK 293. Chaidh pilearan ullachadh agus a bhrosnachadh le quinpirole 1 µM ​​agus chaidh a cheadachadh tuilleadh [³⁵S] -GTP_γS in-ghabhail. Sheall DRD2-GFP agus Cdk5 / p35 a ’cur an cèill ball-bodhaig gu mòr [³⁵S] -GTP_γS ceangaltach an coimeas ris na buill cealla eile (Fig. 4B). Tha na toraidhean sin a ’sealltainn gu bheil fosphorylation Cdk5-mediated sìos-riaghladh a’ riaghladh ceangal pròtain G agonist-brosnaichte aig DRD2.

A bharrachd air an sin, farpais quinpirole [³Chaidh measaidhean ceangailteach H] -spiperone a dhèanamh gus sgrùdadh a dhèanamh air atharrachadh sam bith a dh ’fhaodadh a bhith ann an dàimh agonist aig DRD2 le Cdk5-mediated phosphorylation. Ceangal farpaiseach de [³Chaidh H] -spiperone nuair a chaidh dèiligeadh ri dùmhlachdan nas motha de quinpirole gu ullachadh membran bho transfected a thomhas. Ceangal farpaiseach de quinpirole agus [³Rinn H] -spiperone aig DRD2-GFP agus DRD2 S321A-GFP logK coltach ris_i luachan (−9.789 airson DRD2-GFP; −9.691 airson DRD2 S321A-GFP), a ’nochdadh nach eil buaidh mhòr aig dàimh ligand ri DRD2 le fosphorylation Cdk5-mediated aig DRD2 (Fig. 4C).

Bidh Phosphorylation Cdk5-mediated Down-a ’riaghladh an t-slighe chomharran DRD2-cAMP

An ath rud, rinn sinn sgrùdadh a bheil atharrachadh DRD2 le Cdk5 a ’toirt buaidh air slighean comharran sìos an abhainn. Rinn sinn sgrùdadh air bacadh DRD2-meadhanaichte air cinneasachadh cAMP air a bhrosnachadh le forskolin le cyclase adenylyl anns na ceallan a ’cur an cèill DRD2-GFP agus DRD2 S321A-GFP a’ cleachdadh cAMP enzyme immunoassay. Sheall ceallan DRD2-expressing ìrean cAMP lùghdaichte mar fhreagairt do quinpirole ann an dòigh a tha an urra ri dòsan. Gu h-iongantach, lùghdaich co-mhìneachadh de Cdk5 / p35 gu mòr an casg as motha a thaobh cruthachadh cAMP (Fig. 4D, pannal clì). Air an làimh eile, anns na ceallan DRD2 S321A-GFP, chaidh na cumaidhean cAMP a bhacadh gu h-èifeachdach mar fhreagairt air làimhseachadh quinpirole ge bith dè an abairt Cdk5 / p35 (Fig. 4D, pannal deas). Tha na toraidhean sin a ’sealltainn gu bheil fosphorylation Cdk5-meadhanaichte de DRD2 a’ lughdachadh gnìomhachd bacaidh DRD2 air an t-slighe chomharran cAMP sìos an abhainn. Gus tuilleadh dearbhaidh a dhèanamh air na h-uinneanan ann an suidheachadh a tha nas buntainniche gu corporra, rinn sinn feum de neurons cultair bun-sgoile bho embryos cnagadh easbhaidheach ann am p35, gnìomhaiche Cdk5 riatanach. Chaidh neurons striatal cultarach bun-sgoile a làimhseachadh le 1 µM ​​dopamine agus air an sgrùdadh le enzyme cAMP immunoassay. Bha neurons bho luchagan bualadh p35 a ’taisbeanadh ìrean cAMP nas ìsle an coimeas ri neurons seòrsa fiadhaich nuair a bha iad air am brosnachadh le dopamine (Fig. 4E). TA rèir a chèile, thàinig sinn chun cho-dhùnadh gu bheil fosphorylation Cdk5-meadhanaichte de DRD2 a ’leantainn gu lùghdachadh ann an tòna bacaidh air an t-slighe cAMP air a chuir DRD2 an sàs.

Deasbaireachd

Chomharraich sinn DRD2 mar substrate ùr de Cdk5. Tha coltas gu bheil am fosphorylation a ’riaghladh abairt uachdar DRD2 le bhith a’ toirt buaidh air mar a tha DRD2 a ’leantainn air taobh a-staigh gabhadan agus mar sin a’ lughdachadh DRD2 G_i- a ’ceangal agus slighe cAMP sìos an abhainn. Leis gu bheil fuigheall fosphorylation S321 ann an dà chuid ann an isofoirmean fada agus goirid DRD2, dh ’fhaodadh gum bi an uidheamachd a chaidh a mholadh san sgrùdadh seo mar dhòigh riaghlaidh coitcheann ann an comharrachadh meadhan-mheadhanaichte DRD2.

Chan e a-mhàin gu bheil DRD2 ann an neurons spìosrach meadhanach air a mheas mar phrìomh subtype gabhadair dopamine ach tha e cuideachd air aithneachadh airson a bhith buailteach atharrachaidhean ann an ruigsinneachd mar fhreagairt do bhrosnachaidhean àrainneachd. Chaidh sgrùdadh farsaing a dhèanamh air desensitization agus ath-mhothachadh DRD2 [11], [24]. Gu sònraichte, tha grunn sgrùdaidhean air sealltainn gu bheil atharrachaidhean fiùghantach de DRD2 postynaptically an cois buaidhean nochdaidh psychostimulant cronach, leithid cocaine agus amphetamine, a thogas an ìre extracellular de dopamine anns an synapse striatal. [36]. Gu dearbh, tha fios gu bheil luchd-cleachdaidh cocaine cronail air ìrean DRD2 a lughdachadh anns an sgìre striatal, agus tha cothrom DRD2 anns na nucleus accumbens (NAcc) a ’sealltainn co-dhàimh àicheil leis an droga a’ sireadh agus a ’daingneachadh giùlan ann an luchagan agus primates [37]-[39]. Tha na co-dhùnaidhean sin a ’sealltainn gu bheil comasachd DRD2 gu math buailteach do riaghladh atharrachail no dìolaidh mar fhreagairt do dhiofar bhrosnachaidhean a’ toirt a-steach foillseachadh dhrogaichean cronach. Tha na toraidhean againn a ’sealltainn gum faod fuigheall S321 anns an treas lùb intracellular de DRD2 a bhith air a phosphorylated le Cdk5, a tha a’ leantainn gu lùghdachadh ann am buaidh bacaidh DRD2 air an t-slighe cAMP. Tha an eadar-obrachadh seo a ’moladh dòigh riaghlaidh ùr-nodha co-cheangailte ri Cdk5 ann an neurons dopaminoceptive a dh’ fhaodadh a bhith ceangailte ri nàdar fiùghantach ruigsinneachd uachdar DRD2.

Bu chòir a thoirt fa-near gu bheil fios gu bheil Cdk5 mar phrìomh phàirt ann a bhith a ’meadhanachadh atharrachaidhean atharrachail san àrainneachd neuronal. Mar eisimpleir, tha atharrachaidhean structarail agus gnìomhach de spìcean dendritic ann an neurons a ’chuairt limbic mar aon de na toraidhean bho bhith a’ nochdadh psychostimulant a-rithist [40]. An cois na h-atharrachaidhean sin tha grunn atharrachaidhean moileciuil a ’gabhail a-steach inntrigeadh pròtain freagairt cAMP freagairt-ceangail (CREB) agus ΔFosB, factaran tar-sgrìobhaidh a tha a’ nochdadh ùrachadh leantainneach mar fhreagairt air rianachd cronach cocaine. [41], [42]. Gu cudromach, tha Cdk5 na thargaid de ΔFosB [19], agus chaidh mòran de phàirtean riatanach a bha an sàs ann an dinamics spine dendritic, leithid PSD-95, p21-activated kinase (PAK), β-catenin, agus spinophilin, aithris mar substrathan Cdk5 [43]-[46]. Gu cunbhalach, bidh làimhseachadh ginteil no cungaidh-leigheis de ghnìomhachd Cdk5 a ’faighinn atharrachaidhean ann am morf-eòlas dendritic an spine agus freagairtean giùlain do chocaine, a’ ciallachadh dreuchdan riatanach airson Cdk5 ann an atharrachaidhean molecol agus morphologach de chuairtean dopamine mesolimbic [47], [48]. Tha na toraidhean againn a tha a ’sealltainn gu bheil DRD2 na thargaid ùr-nodha de Cdk5 a’ toirt sealladh a bharrachd do dh ’atharrachaidhean atharrachail an t-siostam dopamine mar fhreagairt air nochdaidhean dhrogaichean cronail air sgàth an ath-riaghladh ΔFosB-meadhanaichte de Cdk5 a dh’ fhaodadh àrdachadh tonic ann am fosphorylation DRD2 . A bharrachd air an sin, tha fios gu bheil DRD2 a ’toirt buaidh air grunn phròiseasan cealla, a’ gabhail a-steach riaghladh slighean cAMP agus MAP kinase agus tachartasan tar-sgrìobhaidh sìos an abhainn [42], [49]. Mar sin, is dòcha nach e a-mhàin gu bheil na co-dhùnaidhean san sgrùdadh seo a ’nochdadh riaghladh dìreach de DRD2 le Cdk5 ach cuideachd a’ toirt sealladh ùr dhut air freagairtean atharrachail siostam dopamine gu foillseachadh dhrogaichean cronach.

Cuibhreannan Ùghdar

Chruthaich agus dhealbhaich na deuchainnean: JJ YUP DH SKP. Rinn e na deuchainnean: JJ YUP DKK YK. Mion-sgrùdadh air an dàta: JJ YUP DKK SL YK SAL HL YSG DH SKP. Ath-bheachdan / stuthan / innealan sgrùdaidh co-cheangailte: YHS. Sgrìobh am pàipear: JJ SKP.