DeltaFosB secara tidak langsung mengatur aktivitas promotor Cck (2010)

Res Otak. 2010 Mei 6; 1329: 10 – 20.

Diterbitkan secara online 2010 Maret 11. doi: 10.1016 / j.brainres.2010.02.081

PMCID: PMC2876727

John F. Enwright, III,¹ Megan Wald,¹ Madison Paddock,¹ Elizabeth Hoffman,¹ Rachel Arey,² Scott Edwards,² Sade Spencer,² Eric J. Nestler,³ dan Colleen A. McClung^{2, *}

Informasi penulis ► Informasi Hak Cipta dan Lisensi ►

Versi editan terakhir penerbit untuk artikel ini tersedia di Otak Res

Lihat artikel lain di PMC itu mengutip artikel yang diterbitkan.

Abstrak

Beberapa perubahan biokimia, struktural, dan perilaku penting yang disebabkan oleh paparan kronis terhadap penyalahgunaan obat-obatan tampaknya dimediasi oleh faktor transkripsi yang sangat stabil ΔFosB. Pekerjaan sebelumnya telah menunjukkan bahwa exFosB ekspresi berlebih pada tikus selama 2 minggu mengarah ke peningkatan ekspresi banyak gen di striatum, yang sebagian besar kemudian diregulasi setelah 8 minggu ekspresi ΔFosB. Menariknya, sejumlah besar gen ini juga diregulasi pada tikus yang mengekspresikan faktor transkripsi CREB secara berlebihan. Namun, tidak jelas dari penelitian ini, apakah ΔFB jangka pendek mengatur gen-gen ini melalui CREB. Di sini kami menemukan bahwa 2 minggu dari ΔFosB overexpression meningkatkan ekspresi CREB di striatum, sebuah efek yang hilang oleh 8 minggu. Induksi awal dikaitkan dengan peningkatan ikatan CREB dengan promotor gen target tertentu di wilayah otak ini. Anehnya, satu gen yang diduga target CREB berdasarkan laporan sebelumnya, cholecystokinin (Cck), tidak dikendalikan oleh CREB di striatum. Untuk menyelidiki lebih lanjut peraturan PT Cck berikut ΔFosB overexpression, kami mengkonfirmasi bahwa osFosB overexpression jangka pendek meningkatkan keduanya Cck aktivitas promotor dan ekspresi gen. Ini juga meningkatkan aktivitas pengikatan pada situs pengikatan CREB yang diduga (CRE) di Internet Cck promotor. Namun, sementara situs CRE diperlukan untuk ekspresi basal normal Cck, itu tidak diperlukan untuk induksi ΔFosB dari Cck. Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa sementara induksi jangka pendek osFosB meningkatkan ekspresi dan aktivitas CREB pada promotor gen tertentu, ini bukan satu-satunya mekanisme di mana gen diregulasi di bawah kondisi ini.

Kata kunci: nucleus accumbens, transkripsi, kecanduan

PENGANTAR

Paparan kronis terhadap penyalahgunaan obat-obatan menyebabkan perubahan biokimia dan struktural di beberapa daerah otak. Perubahan ini diduga melibatkan perubahan dalam profil ekspresi gen dalam sistem mesolimbik. Sistem ini terdiri dari neuron dopaminergik yang diproyeksikan dari ventral tegmental area (VTA) di otak tengah ke neuron berduri sedang dalam nucleus accumbens (NAc) (ventral striatum) serta sejumlah daerah otak lainnya. Perubahan dalam aktivitas dua faktor transkripsi, protein pengikat elemen respons cAMP (CREB) dan ΔFosB (protein keluarga Fos), telah diusulkan untuk memediasi banyak perubahan biokimia, struktural, dan perilaku yang terlihat dengan paparan kronis terhadap penyalahgunaan obat ( diperiksa oleh Nestler, 2005).

CREB adalah faktor transkripsi yang diekspresikan di mana-mana yang merupakan anggota keluarga CREB / ATF. Homodimer CREB mengikat variasi sekuens CRE (konsensus: TGACGTCA) yang ditemukan dalam promotor banyak gen. Fosforilasi CREB (terutama di serine 133, meskipun situs lain telah diidentifikasi) dapat dirangsang oleh beberapa kaskade pensinyalan termasuk yang di hilir reseptor dopamin (Cole et al., 1995). Setelah fosforilasi pada serine 133, CREB merekrut co-aktivator CREB binding protein (CBP) atau protein terkait yang mengarah pada peningkatan ekspresi gen (ditinjau oleh Johannessen et al., 2004). Paparan kronis terhadap penyalahgunaan obat opiat atau psikostimulan menginduksi peningkatan sementara aktivitas CREB di nucleus accumbens (Barrot et al., 2002; Shaw-Lutchman et al., 2002, 2003), suatu pemikiran adaptasi untuk mengurangi sifat-sifat bermanfaat dari obat-obatan ini dan untuk berkontribusi pada keadaan emosi negatif dari penarikan obat (Nestler, 2005).

Ladaptasi jangka panjang terhadap obat-obatan pelecehan diduga dimediasi sebagian oleh ΔFosB, varian sambatan FosB yang sangat stabil (Nestler et al., 1999; McClung et al., 2004; Nestler, 2008). Anggota keluarga Fos dimerize dengan anggota keluarga Jun untuk membentuk protein aktivator 1 (AP-1). Kompleks transkripsi AP-1 mengikat variasi elemen respons AP-1 (konsensus: TGACTCA) untuk mengatur transkripsi (ditinjau oleh Chinenov dan Kerppola, 2001). Sementara paparan akut terhadap penyalahgunaan obat-obatan mengarah ke induksi jangka pendek (jam) dari anggota keluarga Fos (serta peningkatan aktivitas CREB), paparan obat berulang menyebabkan akumulasi toFosB yang sangat stabil (Hope et al., 1994; Perrotti et al., 2008), ekspresi yang bertahan selama berminggu-minggu.

Tikus bi-transgenik yang diekspresikan berlebih eitherFosB atau CREB pada striatum dewasa menunjukkan banyak fenotip biokimia dan perilaku yang terlihat pada hewan yang terpapar berulang kali pada psikostimulan atau obat pelecehan lainnya. SEBUAHnalisis perubahan ekspresi gen pada hewan transgenik ini mengidentifikasi banyak gen yang diregulasi oleh jangka pendek (2 minggu) ekspresi berlebih dari changesFosB, perubahan yang terkait dengan penurunan hadiah obat secara bersamaan. Perubahan dalam ekspresi gen dan respons perilaku dengan ΔFosB jangka pendek sangat mirip dengan yang terlihat pada hewan yang mengekspres CREB berlebih selama minggu 2 atau 8 (McClung dan Nestler, 2003). Sebaliknya, overekspresi jangka panjang (8 minggu) ΔFosB menurunkan ekspresi banyak gen yang sama ini dan menyebabkan peningkatan hadiah obat (Kelz et al., 1999; McClung dan Nestler, 2003).

Satu gen yang diidentifikasi dalam penelitian ini adalah kolecystokinin (Cck), neuropeptida yang diproduksi di beberapa daerah otak, termasuk striatum (Hokfelt et al., 1980). CCK dapat memodulasi transmisi dopaminergik (Vaccarino, 1992), terlibat dalam pemberian dan penguatan narkoba (Josselyn et al., 1996; Josselyn et al., 1997; Hamilton, et al., 2000; Beinfeld et al., 2002; Rotzinger et al., 2002), dan diinduksi dalam striatum oleh kokain kronis (Ding dan Mocchetti, 1992). Selain itu Cck promotor telah terbukti responsif terhadap kompleks CREB dan AP-1 (Haun dan Dixon, 1990; Deavall, et al., 2000; Hansen, 2001). Karena banyak gen (termasuk Cck) yang menunjukkan peningkatan ekspresi setelah CREB dan ΔFosB ekspresi jangka pendek diketahui atau diduga gen target CREB (McClung dan Nestler, 2003), kami ingin menentukan apakah ekspresi ΔFosB jangka pendek mengarah pada regulasi gen-gen ini (dengan fokus pada Cck) melalui regulasi CREB atau melalui mekanisme regulasi gen yang lebih kompleks.

HASIL

ΔFosB ekspresi berlebih secara sementara meningkatkan level CREB

Kami menggunakan Western blotting untuk menyelidiki apakah ekspresi berlebih osFosB meningkatkan kadar protein CREB di striatum tikus. Untuk penelitian ini, kami menggunakan tikus bi-transgenik (jalur 11A) yang membawa transgen NSE-tTA dan transgen TetOp-ΔFosB. Dengan tidak adanya doksisiklin, tikus-tikus ini menunjukkan peningkatan kuat dalam ekspresi ΔFosB di neuron positif dinorfin di striatum (Kelz et al., 1999). Metode overexpressing ΔFosB ini telah didokumentasikan secara luas dan memungkinkan untuk overexpression spesifik-wilayah, yang paralel dengan induksi ΔFosB yang terlihat pada hewan yang terpapar kokain kronis (Hope et al., 1994; Kelz et al., 1999). Kami menemukan bahwa pada tikus 11A yang mengekspresikan ΔFosB, kadar protein CREB secara signifikan diregulasi setelah 2 minggu berekspresi dan level ini kembali ke garis dasar setelah 8 minggu berekspresi (Gambar 1A, n = 8). Untuk menentukan apakah perubahan dalam level CREB dengan ekspresi berlebih ΔFosB jangka pendek dapat direplikasi di sistem lain, kami secara sementara mengekspresikan ΔFosB dalam sel PC12 dan menemukan bahwa level CREB meningkat secara signifikan (p <0.05) jika dibandingkan dengan kontrol (Gambar 1B, n = 4). Hasil ini menunjukkan bahwa ekspresi ΔFosB jangka pendek meningkatkan kadar protein CREB.

Level CREB meningkat dengan ekspresi berlebih osFosB. Analisis noda Western dari lisat dari (A) mouse striata dari 11A mouse off dox selama 2 atau 8 minggu atau (B) Sel PC12 yang mengekspresikan exFB secara berlebihan. Data dalam A ditampilkan sebagai persentase perubahan dalam dox dibandingkan ...

Baik osFosB dan CREB mengikat promotor gen target spesifik di striatum setelah jangka pendek ΔFosB diekspresikan

Kami menggunakan uji ChIP (chromatin imunopresipitasi) jaringan striatal untuk menentukan apakah pengikatan BFosB atau CREB terjadi pada promotor gen target tertentu dan jika pengikatan ini meningkat setelah pengekspresan ΔFosB jangka pendek yang singkat. Kami menganalisis ikatan di BDNF dan Cck promotor, karena kedua gen sangat diregulasi setelah jangka pendek osFosB overexpression, CREB overexpression, atau pengobatan kokain kronis (McClung dan Nestler, 2003). Kami juga menganalisis ikatan pada CDK5 promotor, karena merupakan target langsung yang diketahui dari ΔFosB (Chen et al., 2000; Bibb et al., 2001; Kumar et al., 2005). Akhirnya, kami mengukur ikatan di prodynorphin promotor, karena penelitian sebelumnya telah menemukan bahwa ia dapat diikat oleh ΔFosB dan CREB dalam kondisi yang berbeda (Andersson et al., 2001; Zachariou et al., 2006).

Analisis ChIP dilakukan pada striata dari tikus 11A yang mengekspresikan ΔFosB selama 2 minggu menggunakan antibodi yang mengenali CREB atau ΔFosB. Dalam kondisi normal, kami menemukan bahwa ΔFosB berikatan dengan CDK5 dan prodynorphin promotor, sementara tidak ada ikatan yang terdeteksi di BDNF or Cck promotor (Tabel 1). Selain itu, exFosB berlebih meningkatkan pengikatan ΔFosB di CDK5 promotor, tetapi tidak di prodynorphin promotor. Kami selanjutnya mengukur CREB mengikat pada promotor ini dan menemukan bahwa CREB mengikat ke CDK5, BDNF dan prodynorphin promotor, tetapi tidak untuk Cck promotor, dalam striatum normal, dan bahwa ekspresi berlebih osFB untuk 2 minggu meningkatkan ikatan CREB di BDNF dan prodynorphin promotor, tetapi tidak CDK5 promotor. Secara bersama-sama, hasil ini menunjukkan bahwa osFosB dan CREB keduanya dapat berikatan dengan promotor gen tertentu seperti prodynorphin dan CDK5Namun, pengikatan CREB khusus untuk promotor lain seperti BDNF. Lebih lanjut, exFosB yang berlebihan mengungkapkan peningkatan toFosB yang mengikat pada promotor tertentu, seperti yang diharapkan, tetapi juga pada CREB yang mengikat pada promotor tertentu, konsisten dengan induksi CREB yang dimediasi -FosB yang diamati pada titik waktu ini.

Mengikat protein pengatur diduga ke berbagai promotor pada tikus yang mengekspresikan ΔFosB berlebih selama dua minggu.

Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa perubahan dalam ekspresi gen yang disebabkan oleh ΔFosB ekspresi berlebih jangka panjang dikaitkan dengan modifikasi kromatin, khususnya, asetilasi histone H3, pada promotor gen spesifik (Kumar et al., 2005). Untuk menentukan apakah ini dapat menjelaskan perubahan ekspresi gen pada jangka pendek ΔFosB ekspresi berlebih, kami mengukur pengikatan histone asetilasi H3 (modifikasi histone terkait dengan kromatin aktif transkripsi), atau histone teralkilasi H3 (Lys9, modifikasi histone yang terkait dengan transkripsi secara transkripsi kromatin tidak aktif). Kami menemukan bahwa ekspresi berlebih dari osFosB selama 2 minggu tidak menghasilkan perubahan pada pengikatan H3 asetat pada salah satu gen promotor yang diteliti (Tabel 1). Kami memang menemukan penurunan yang signifikan dalam pengikatan H3 yang dimetilasi dengan metil di prodynorphin promotor, tetapi tidak mengikat pada Cck promotor dan tidak ada perubahan dalam pengikatan pada CDK5 dan BDNF promotor, menunjukkan bahwa ini bukan mekanisme umum dimana osFosB, dalam jangka pendek, mengatur ekspresi gen. Kami terkejut dan tertarik pada kenyataan bahwa kami tidak menemukan perbedaan dalam pengujian ChIP kami yang dapat menjelaskan peningkatan Cck Ekspresi mRNA pada tikus 11A setelah minggu 2 ekspresi ΔFosB dan memutuskan untuk menyelidiki mekanisme ini lebih lanjut.

Jangka pendekΔFosB meningkat Cck ekspresi dalam berbagai sistem

Karakterisasi microarray dari tikus 11A bi-transgenik yang mengekspresikan ΔFosB dalam striatum menemukan bahwa Cck tingkat ekspresi meningkat setelah 2 minggu ekspresi berlebih dan kemudian secara bertahap menurun dengan periode yang lebih lama dari ekspresi osFosB (Gambar 2A, n = 3). Kami memvalidasi efek ini untuk Cck menggunakan PCR waktu nyata pada kelompok hewan yang berbeda pada minggu 2 dan 8 dan menemukan hasil pada dua titik waktu yang serupa dengan analisis microarray (data tidak ditampilkan).

Overekspresi jangka pendek overFosB meningkat Cck ekspresi gen. (A) Cck Ekspresi mRNA dalam striatum mengikuti ΔFosB ekspresi berlebih pada tikus 11A untuk 1, 2, 4, atau 8 minggu. Analisis microarray dilakukan pada sampel striatal dan Cck adalah ide yang bagus ...

Untuk menyelidiki lebih lanjut kemampuan ΔFosB untuk mengatur Cck ekspresi, kami menggunakan sel PC12 yang ditransfusikan secara sementara dengan a Cck-luciferase reporter plasmid dan plasmid ekspresi ΔFosB atau jumlah pCDNA yang sama. Dua (n = 5-9) dan tiga (n = 11-13) dua hari dari ΔFosB overexpression menghasilkan peningkatan signifikan dalam Cckekspresi -luciferase. Selain itu, overekspresi ΔFosB selama tiga hari menghasilkan lebih banyak Cck-luciferase induksi bila dibandingkan dengan dua hari dari overexpression (Gambar 2B). Ekspresi ΔFosB yang berlebihan tidak menginduksi ekspresi konstruk luciferase yang tidak dapat dipromosikan (data tidak ditampilkan). Dalam kondisi tanpa perawatan adalah pengurangan CckAktivitas -luciferase jelas. Hasil ini menunjukkan bahwa ekspresi ΔFosB jangka pendek meningkatkan aktivitas Cck promotor, dan meninggalkan mekanisme yang tidak terjawab di mana ΔFosB jangka panjang menekan berlebih Cck ekspresi.

Ekspresi berlebih overFosB meningkatkan pengikatan pada situs pengikatan CREB yang diduga di Cck promotor

Analisis kami menemukan itu Cck Ekspresi meningkat mengikuti jangka pendek ΔFosB ekspresi, namun, tes ChIP kami menemukan bahwa CREB atau ΔFosB tidak mengikat ke Cck promotor. Untuk menentukan apakah ada perubahan pada pengikatan protein di Cck promotor setelah exFosB berlebih, kami menggunakan uji pergeseran mobilitas elektroforesis (EMSA) dengan probe yang berisi situs seperti CRE yang diduga ada di dalam Cck promotor. Menggunakan ekstrak nuklir dari striata tikus 11A yang diekspresikan berlebih ΔFosB selama 2 minggu, kami menemukan peningkatan pengikatan pada situs CRE yang diduga di Cck promotor (Gambar 3 A, C, n = 4). Menariknya, tikus 11A mengekspresikan exFosB berlebih untuk minggu 8, yang menunjukkan penurunan Cck ekspresi, juga menunjukkan peningkatan ikatan di situs ini (Gambar 3B, C, n = 4). Sebagai perbandingan, kami memeriksa pengikatan pada situs konsensus CRE pada tikus yang mengekspresikan ΔFosB selama 2 minggu dan menemukan pengikatan CRE yang kuat dalam ekstrak striatal, tetapi tidak ada peningkatan pengikatan setelah induksi ΔFosB (Gambar 3F, n = 4). Dengan demikian, meskipun terdapat peningkatan ΔFosB yang diinduksi dalam total level CREB yang terlihat pada titik waktu ini, hasil ini sejalan dengan pengujian ChIP kami yang menemukan bahwa peningkatan pengikatan CREB pada promotor setelah exFosB yang diekspresikan spesifik hanya untuk gen tertentu dan bukan merupakan fenomena global. . Untuk menentukan apakah CREB terikat ke Cck promotor dalam analisis EMSA kami, kami melakukan tes supershift dengan antibodi spesifik CREB. Dalam perjanjian dengan pengujian ChIP kami, kami tidak menemukan ikatan CREB dengan a Cck penyelidikan yang mengandung situs CRE putatif dalam pengujian EMSA, sementara CREB benar-benar mengikat dan menggantikan situs CRE konsensus (Gambar 3D, E, n = 4). Aktivitas pengikatan DNA di Cck promotor juga tidak terpengaruh oleh antibodi terhadap ΔFosB (data tidak ditampilkan), dalam kondisi yang ditunjukkan dalam beberapa penelitian sebelumnya untuk memblokir ΔFosB mengikat untuk situs AP-1 yang dapat dipercaya (Hope et al., 1994a, 1994b; Chen et al., 1995, Hiroi et al., 1998). Kami juga melakukan tes ChIP pada striata hewan 11A setelah minggu 8 ekspresi ΔFosB dan masih tidak menemukan pengikatan CREB atau ΔFosB di Cck promotor (data tidak ditampilkan). Dengan demikian, ekspresi osFosB memang mengarah pada peningkatan pengikatan protein di Cck promotor setelah minggu ekspresi 2 dan 8; Namun, identitas faktor-faktor ini masih belum diketahui.

Pengikatan protein pada Cck promotor. (A, B) Uji pergeseran mobilitas elektroforesis menggunakan Cck Situs mirip CRE dengan jaringan striatal dari hewan yang mengekspres berlebihan ΔFosB selama 2 minggu (A) atau 8 minggu (B). Dalam (A), persaingan dengan pesaing berlabel berlebih ...

Situs CRE diduga di Cck promotor tidak bertanggung jawab atas peningkatan aktivitas promotor

Karena kami memang menemukan peningkatan pengikatan protein menggunakan fragmen dari Cck promotor, yang berisi situs CRE putatif, mengikuti osFosB berlebih, kami ingin menentukan apakah situs ini diperlukan untuk peningkatan Cck ekspresi berikut ΔFosB ekspresi berlebih. Untuk menguji kemungkinan ini, kami mentransfeksi sel PC12 dengan a Cck-luciferase plasmid yang mengandung situs seperti CRE yang utuh atau yang mengandung mutasi di situs yang akan menghapus interaksi apa pun dengan CREB. Menariknya, mutasi situs seperti CRE menurun basal Cck aktivitas promotor oleh 32% (Gambar 4A, n = 9), tetapi tidak memengaruhi Cck induksi promotor dengan ekspresi berlebih ΔFosB (Gambar 4B, n = 11-13). Ini menunjukkan bahwa, meskipun Cck promotor memerlukan situs seperti CRE yang utuh untuk aktivitas dasar penuh, peningkatan aktivitas promotor yang disebabkan oleh ΔFosB ekspresi berlebih tidak memerlukan urutan seperti CRE.

Grafik Cck-seperti situs CRE tidak diperlukan Cck induksi oleh ΔFosB. (A) CckAktivitas luciferase diukur 2 hari setelah transfeksi dengan normal Cck-luciferase atau yang situs mirip CRE telah dimutasi. * p <0.05 (B) Cck-Luciferase ...

cFos mengikat ke Cck promotor

Penelitian sebelumnya telah menemukan itu cFos mRNA meningkat dengan ΔFosB ekspresi jangka pendek, namun, setelah ekspresi ΔFosB yang berkepanjangan, kemampuan pengobatan kokain untuk menginduksi cFos di striatum berkurang (McClung dan Nestler, 2003; Renthal et al., 2008). Karena itu, mungkin saja cFos berkontribusi pada peningkatan Cck ekspresi berikut expressionFosB ungkapan jangka pendek. Kami melakukan tes ChIP dengan antibodi spesifik untuk cFos dan mengukur cFos yang mengikat di Cck promotor dengan dan tanpa ekspresi ΔFosB jangka pendek. Sementara kami menemukan bahwa cFos tidak mengikat ke Cck promotor, pengikatan ini tidak meningkat secara signifikan setelah exFosB berlebih (Gambar 5, n = 5). Ini menunjukkan bahwa sejak cFos mengikat Cck promotor, dapat berkontribusi pada peraturan umum Cck ekspresi, tetapi kemungkinan tidak terlibat dalam regulasi Cck promotor oleh ΔFosB.

cFos mengikat ke Cck promotor. Tes imunopresipitasi Chromatin dilakukan dengan antibodi spesifik untuk cFos menggunakan jaringan striatal dari ΔFosB tikus yang diekspresikan baik pada dox, atau setelah 2 minggu pengangkatan dox. Analisis PCR waktu nyata adalah ...

PEMBAHASAN

Studi ini mengkonfirmasi dan memperluas temuan sebelumnya yang menunjukkan bahwa osFosB mengatur ekspresi gen dalam striatum dan kami menemukan bahwa hal itu dilakukan melalui beberapa mekanisme setelah ekspresi jangka pendek. Kami menunjukkan bahwa, setelah 2 minggu ekspresi berlebih, ΔFosB mengikat langsung ke promotor dalam gen tertentu yang mengarah pada perubahan ekspresi (yaitu CDK5). Lebih lanjut, itu meningkatkan kadar protein CREB, suatu efek yang diamati pada sel-sel yang dikultur serta dalam striatum, yang mengarah pada peningkatan pengikatan CREB pada promotor gen lainnya (yaitu dynorphin dan BDNF). Dalam penelitian sebelumnya, kami menemukan bahwa ekspresi berlebih jangka pendek dari ΔFosB di striatum menyebabkan banyak perubahan ekspresi gen yang sama yang ditemukan ketika CREB diekspresikan berlebihan, dan mengarah pada respons perilaku yang serupa dalam ukuran preferensi kokain (McClung dan Nestler, 2003). Dengan demikian, temuan saat ini bahwa BFosB mengarah pada induksi CREB, serta pengikatan CREB dengan promotor gen tertentu, membantu menjelaskan mengapa begitu banyak perubahan ekspresi gen dibagi oleh dua faktor transkripsi ini.

Induksi CREB oleh ΔFosB menarik, karena telah ditunjukkan bahwa obat penyalahgunaan menginduksi perubahan kadar CREB serin 133-terfosforilasi (Mattson et al., 2005) dan meningkatkan transkripsi yang dimediasi CRE (Barrot et al., 2002; Shaw-Lutchman et al., 2002, 2003), tanpa mengubah level CREB secara keseluruhan. Ada kemungkinan bahwa perubahan level CREB mungkin bersifat sementara, dan, oleh karena itu, mudah terlewatkan dalam penelitian lain. Di tangan kami, kami telah melihat peningkatan yang diinduksi kokain dalam CREB mRNA dalam percobaan tertentu, namun, efek ini sangat bervariasi (pengamatan tidak dipublikasikan). Karena kedua tikus transgenik 11A dan sel PC-12 menunjukkan induksi CREB setelah exFosB ekspresi berlebih jangka pendek, ini menunjukkan bahwa CREB memang diinduksi oleh ΔFosB (atau target ΔFosB), menyediakan mekanisme lain untuk menjelaskan perubahan yang disebabkan oleh obat dalam gen ekspresi.

Anehnya, kami menemukan bahwa baik CREB maupun ΔFosB tidak terikat pada Cck promotor sekalipun Cck Ekspresi jelas diregulasi setelah ekspresi ΔFosB jangka pendek. Cck adalah neuropeptida yang banyak diekspresikan dalam VTA dan NAc (Hokfelt et al., 1980) dan kemungkinan terlibat dalam respons perilaku terhadap penyalahgunaan obat (Josselyn et al., 1996; Josselyn et al., 1997; Hamilton, et al., 2000; Beinfeld et al., 2002; Rotzinger et al., 2002). Dalam pengujian kultur sel, Cck promotor telah dikarakterisasi secara luas dan terbukti responsif terhadap anggota keluarga CREB dan AP-1 (ditinjau oleh Hansen, 2001). Haun dan Dixon (1990) menunjukkan bahwa kompleks AP-1 dapat mengikat ke Cck Situs seperti CRE in vitro, dan kemudian ditunjukkan, menggunakan sel neuroblastoma SK-N-MC, bahwa mutasi situs seperti CRE mengurangi respons promotor terhadap cFos / cJun yang diekspresikan secara berlebihan (Rourke et al., 1999). Memang, kami juga menemukan peningkatan Cck kegiatan promotor (Gambar 2) dan mengikat pada atau di sekitar elemen seperti CRE (Gambar 3) pada ekspresi berlebih dari ΔFosB, anggota keluarga AP-1 yang lain, tetapi kami tidak menemukan pengikatan langsung ΔFosB dengan Cck promotor in vivo or in vitro, bahkan pada overekspresi.

Banyak pekerjaan telah menunjukkan peran CREB dalam regulasi Cck kegiatan promotor. Itu Cck Situs mirip CRE dikonservasi lintas vertebrata (Hansen, 2001) dan, dalam beberapa tes kultur sel, baik kompleks CREB dan AP-1 mengikat ke situs ini dan diperlukan untuk Cck kegiatan promotor (Haun dan Dixon, 1990; Deavall, et al., 2000; Hansen, 2001). Selain itu, beberapa aktivator diketahui Cck ekspresi (termasuk bFGF, PACAP, pepton, dan depolarisasi) telah terbukti bertindak melalui CREB (Hansen, et al., 1999; Deavall, et al, 2000; Bernard, et al., 2001; Gevrey, et al., 2002; Hansen, et al., 2004). Kami Cck-luciferase data gen reporter mendukung peran penting untuk situs seperti CRE dalam regulasi Cck kegiatan promotor, karena mutasi situs ini mengurangi basal Cck aktivitas promotor dan CckEkspresi luciferase yang diinduksi oleh VP16-CREB, bentuk CREB yang aktif secara konstitutif, hilang ketika situs ini dimutasi (pengamatan tidak dipublikasikan). Jadi, kami terkejut menemukan bahwa CREB tampaknya tidak mengikat ke Cck promotor dalam ekstrak striatal baik pada awal atau pada jangka pendek osFosB ekspresi berlebih ketika tingkat CREB meningkat. Ini berpendapat bahwa tingkat CREB sendiri bukan satu-satunya faktor dalam menentukan jumlah ikatan di situs ini, dan ini didukung oleh karya orang lain (Cha-Molstad, et al., 2004). Karena promotor lain, gen target CREB yang sebelumnya diidentifikasi, seperti BDNF dan prodynorphin, apakah mengikat CREB, kami yakin dengan temuan kami bahwa CREB tidak mengikat pada Cck promotor dalam ekstrak nuklir striatal. Selanjutnya, induksi Cckaktivitas -luciferase oleh ΔFosB tidak tergantung pada situs CRE seperti utuh, menunjukkan bahwa ΔFosB tidak mengatur Cck ekspresi dengan mengatur pengikatan langsung CREB ke Cck promotor.

Ketidakmampuan kami mendeteksi CREB berinteraksi dengan Cck promotor didukung oleh Renthal et al. (2009), yang menggunakan pendekatan chip ChIP untuk melihat perubahan global dalam CREB terfosforilasi (pCREB) dan pengikatan osFosB dalam striatum setelah paparan kokain kronis. Dalam percobaan ini, kompleks DNA-protein secara imunopresipitasi dengan ΔFosB atau pCREB antibodi dan DNA yang diendapkan, setelah pelabelan, diseragamkan ke microarray promotor. Sementara banyak gen target CREB yang sebelumnya ditandai diidentifikasi dengan pendekatan ini (misalnya, BDNF, prodynorphin), Cck tidak diidentifikasi. Selain itu, telah ditunjukkan bahwa pengikatan CREB ke situs CRE konsensus sangat bervariasi antara garis sel yang dikultur (Cha-Molstad, et al., 2004). Semua studi sebelumnya yang menemukan interaksi CREB dengan Cck promotor dilakukan dalam kultur sel (bukan otak dari mana sampel EMSA dan ChIP kami berasal) dan menggunakan uji pergeseran gel untuk menyelidiki interaksi protein-DNA. Sementara EMSA dapat menilai potensi suatu faktor untuk mengikat pada urutan DNA, tes ChIP memberikan pandangan baru pada interaksi ini. in vivo. Selain itu, banyak data yang menunjukkan induksi Cck aktivitas promotor atau CREB mengikat ke Cck promotor diperoleh dari sel-sel yang telah dirangsang oleh faktor-faktor seperti pepton (Bernard et al., 2001), depolarisasi (Hansen, et al., 2004), atau berbagai aktivator kaskade pensinyalan intraseluler termasuk cAMP dan ERK (Hansen et al., 1999). Dalam percobaan kami, satu-satunya "stimulus" yang digunakan adalah ekspresi berlebih dari ΔFosB, yang cukup untuk menginduksi Cck ekspresi. Secara keseluruhan, ini menunjukkan bahwa kemampuan CREB untuk mengikat (dan berpotensi mengatur) Cck promotor sangat tergantung pada jenis sel dan aktivasi jalur pensinyalan tertentu. Selain itu, Cck Elemen promotor mirip CRE (setidaknya dalam sel PC12 yang tidak diinduksi dan di mouse striatum) bukan target langsung baik CREB atau ΔFosB. Menariknya, peraturan PT FosB Ekspresi oleh CREB juga spesifik untuk tipe sel dan tipe stimulasi. Sebuah studi oleh Andersson et al. menemukan bahwa injeksi oligonukleotida antisense CREB ke dalam tikus striatum secara parsial menghambat induksi FosB setelah pemberian kokain (Andersson et al., 2001). Namun, mereka juga menemukan bahwa kemampuan L-Dopa untuk diinduksi FosB ekspresi dalam striatum lesi 6-OHDA tidak dipengaruhi oleh keberadaan oREtrukleotida antisense CREB.

Karena CREB dan ΔFosB tampaknya secara tidak langsung mengatur Cck promotor, dan perubahan struktur kromatin telah didokumentasikan sebagai respons terhadap berbagai rangsangan yang menginduksi ΔFosB (Tsankova et al., 2004; Kumar et al., 2005; Renthal et al., 2008), kami beralasan bahwa ΔFosB mungkin secara tidak langsung memodulasi aktivitas promotor dengan mengubah struktur kromatin. Namun, pada tikus yang mengekspresikan ΔFosB selama 2 minggu, tidak ada perubahan dalam asetilasi H3 histone pada Cck promotor (Tabel 1). Ini didukung oleh data chip ChIP dari Renthal et al. (2009), yang melaporkan tidak ada perubahan dalam ikatan H3 asetat di Cck promotor pada tikus yang terpapar kokain kronis. Sejak Cck promotor aktif dalam striatum, tidak ada ikatan histone metilasi H3 represif yang diharapkan atau diamati. Menariknya, kami juga melihat tidak ada perubahan karena ΔFosB berlebih pada H3 yang terikat pada BDNF promotor (yang memang menunjukkan peningkatan ikatan CREB) atau di CDK5 dan prodynorphin promotor (yang menunjukkan peningkatan ΔFosB mengikat). Karena ada banyak modifikasi histone yang terkait dengan perubahan dalam aktivitas promotor (ditinjau oleh Rando dan Chang, 2009), ada kemungkinan modifikasi kromatin lain yang berhubungan dengan induksi gen-gen ini. Setiap modifikasi kromatin tunggal, meskipun sering memprediksi tingkat aktivitas promotor, mungkin tidak berubah selama aktivasi gen tertentu. Dalam pekerjaan masa depan, akan menarik untuk melihat perubahan potensial lain dalam struktur kromatin di sekitar Cck promotor mengikuti exFosB yang berlebihan. Menariknya, kokain kronis (kemungkinan melalui Δ Induksi FOSB) telah terbukti menginduksi ekspresi sirtuin 1 dan 2, deasetilase histone kelas III yang tampaknya mengubah fisiologi neuron, pensinyalan ERK, dan respons perilaku terhadap kokain (Renthal et al., 2009). Induksi histone deacetylase akan memiliki kemampuan untuk secara simultan mengatur ekspresi sejumlah besar gen melalui perubahan global dalam struktur kromatin.

Satu kemungkinan kandidat yang terlibat dalam Cck peraturan setelah exFosB berlebih adalah anggota keluarga AP-1 cFos. Ekspresi cFos diatur oleh CREB (Sheng et al., 1990; Impey et al., 2004), dan overekspresi cFos (sesuai dengan overekspresi dari mitra yang mengikat cJun) meningkat Cck kegiatan promotor (Rourke et al., 1999). Oleh karena itu, peningkatan level CREB karena jangka pendek ΔFosB berlebih dapat meningkatkan level cFos dan menghasilkan peningkatan pengikatan pada Cck Situs seperti CRE. cfos mRNA diinduksi pada tikus setelah dua minggu dari ekspresi berlebih twoFosB (McClung dan Nestler, 2003) dan penurunan pada tikus yang terpapar kokain kronis atau ekspresi berlebih ΔFosB jangka panjang (Renthal et al., 2008). Di sini kami menemukan bahwa cFos mengikat langsung ke Cck promotor dalam jaringan striatal, bagaimanapun, ekspresi berlebih osFosB tidak secara signifikan meningkatkan pengikatan. Ini menunjukkan bahwa sementara cFos dapat terlibat dalam pengaturan Cck ekspresi secara umum, perubahan dalam pengikatan cFos saja tidak mungkin mekanisme yang mengatur ΔFosB Cck ekspresi. Namun, dimungkinkan bahwa ΔFosB dapat menginduksi perubahan post-translational cFos (misalnya perubahan fosforilasi) atau menginduksi ekspresi dari mitra pengikatan (seperti cJun) atau protein co-aktivator. Namun, karena situs seperti CRE yang utuh (yang sebelumnya telah terbukti sebagai situs yang mengikat untuk kompleks AP-1, lihat Haun dan Dixon, 1990) tidak diperlukan untuk peningkatan Cck aktivitas promotor terlihat dengan ekspresi berlebih osFosB (seperti yang dinilai dalam eksperimen gen reporter kami), masuk akal bahwa faktor-faktor akting-trans lainnya juga diatur oleh ΔFosB.

Grafik Cck fragmen promotor yang digunakan dalam eksperimen gen reporter luciferase kami berisi situs pengikatan Sp1 yang dilestarikan dan kotak-E (ditinjau oleh Hansen, 2002). Secara khusus, urutan E-box telah terbukti mengikat banyak faktor transkripsi (ditinjau oleh Forrest dan McNamara, 2004). Menggunakan sel PC12, kita telah melihat bahwa mutasi E-box berkurang Cck kegiatan promotor, tetapi tidak mengubah respons promotor terhadap ΔFosB (data tidak ditampilkan). Menariknya, a Cck-Luciferase reporter yang mengandung mutasi di kedua situs CRE dan E-box tidak memiliki aktivitas basal yang dapat dideteksi dan tidak responsif terhadap ekspresi berlebih osFB (observasi tidak dipublikasikan). Mediator potensial lain dari aksi osFosB pada Cck promotor adalah ATF, bentuk-bentuk tertentu yang diketahui diinduksi dalam striatum oleh paparan psikostimulan kronis (Green et al., 2008). Namun, kami tidak menemukan bukti untuk induksi osFosB dari ATF ini (data tidak ditampilkan), dan ATF tidak akan diharapkan untuk mengikat ke situs seperti CRE yang bermutasi di Cck promotor.

Salah satu peringatan dari penelitian ini adalah bahwa kami menggunakan sistem bi-transgenik untuk mengekspresikan ΔFosB secara berlebihan dan karenanya seseorang harus konservatif dalam menarik kesejajaran antara paradigma ini dan pemberian kokain kronis. Namun, tikus transgenik 11A memberikan peluang unik untuk melihat efek spesifik ΔFosB di striatum, karena ekspresi berlebih terbatas pada wilayah otak ini (Chen et al., 1998), sementara pemberian kokain menginduksi perubahan dalam berbagai daerah otak lain yang kemudian secara tidak langsung dapat mempengaruhi striatum. Selain itu, beberapa penelitian telah mendokumentasikan fenotip perilaku dan molekul yang serupa pada tikus 11A bila dibandingkan dengan hewan non-transgenik yang diobati dengan kokain kronis (Kelz et al., 1999; McClung dan Nestler, 2003; Renthal et al., 2009). Selain itu, Bibb et al. (2001) melaporkan tingkat striatal yang serupa Gʻotr mRNA dan induksi protein dalam galur 11A yang sama ini bila dibandingkan dengan littermate non-transgenik yang diobati dengan kokain, serta perubahan serupa pada target CDK5, p35 dan DARPP-32.

Sebagai kesimpulan, kami menemukan bahwa ekspresi ΔFosB jangka pendek mengarah pada induksi gen dalam striatum melalui berbagai mekanisme. Ini termasuk pengikatan promotor langsung, induksi protein dan aktivitas CREB, modifikasi kromatin, selain jalur yang belum ditentukan.

PROSEDUR PERCOBAAN

hewan

Hewan 11A bi-transgenik jantan (NSE-tTA x TetOP-ΔFosB) digunakan dalam penelitian ini dan dikarakterisasi dalam Kelz et al., 1999. Untuk mengekspresikan ΔFosB secara berlebihan, tikus dikeluarkan dari doksisiklin antara usia 3 dan 6 minggu, sedangkan tikus kontrol dipertahankan pada doksisiklin. Semua tikus dikelompokkan dan dipelihara pada 12: 12 siklus terang / gelap, lampu menyala pada 7 pagi dan lampu mati pada 7 sore, dengan ad lib akses ke makanan dan air. Semua percobaan tikus sesuai dengan protokol yang disetujui oleh komite perawatan dan penggunaan hewan dari University of Texas Southwestern Medical Center di Dallas.

Reporter dan ekspresi plasmid

The wildtype (WT) Cck reporter promoter-luciferase disiapkan dengan memasukkan sekitar 200 bp PCR fragmen ke vektor pGL3-luc (Promega). Fragmen ini diperoleh dari DNA genomik tikus (primer: 5 'TATCCTCATTCACTGGGACGC 3' hulu, dan 5 'TACCTTTGGATGGGAGAATAT 3' hilir) dan awalnya dimasukkan ke dalam vektor pGEM-T Easy (Promega, #A1360). Fragmen promotor kemudian dikloning ke situs enzim restriksi Kpn1 / Xho1 dari pGL3-luc.

Untuk membuat mutasi titik CRE di Cck promotor, primer mutagenik yang diarahkan ke situs mirip CRE yang dilaporkan sebelumnya (primer sense: 5'CGTGTCCTGCTGGACTGAGCTCGCACTGGGTAAACA 3 ', primer antisense: 5'CTGTTTACCCAGTGCGCGCTGAGTCCAGCAGGACGACG 3') digunakan dalam kombinasi dengan kit instruksi mutagenesis pabrik . Tindakan ini mengubah situs mirip CRE yang dilaporkan (ACTGCGTCAGC) menjadi ACTGAGCTCC. Semua plasmid reporter dikonfirmasi dengan sekuensing DNA. Plasmid ekspresi ΔFosB berisi sekuens ΔFosB panjang penuh yang dimasukkan ke dalam beberapa situs kloning pCDNA 3.1 dan telah dijelaskan sebelumnya (Ulery dan Nestler, 2007).

Kultur sel dan transeksi DNA

Sel pheochromocytoma tikus (PC12) dipertahankan dalam media Eagle F-12 yang dimodifikasi Dulbecco, ditambah dengan 10% serum kuda, 5% serum janin sapi, dan 1% penisilin / streptomisin pada 37 ° C dan 5% CO₂. Sel ditransfeksi dengan elektroporasi menggunakan elektroporator BTX 360 (350V, 0 ohm, dan 850 μF) dalam larutan buffer fosfat 800 μL Dulbecco dalam kuvet celah 4 mm dengan 10 μg reporter dan 5 μg dari konstruksi ekspresi. Plasmid vektor kosong (pCDNA) digunakan untuk menormalkan jumlah total DNA. Setelah transfeksi, sel-sel itu ditumbuhkan pada cawan berlapis kolagen 35 mm selama waktu yang ditentukan.

Tes Luciferase

Dua atau tiga hari setelah transfeksi, sel dicuci 3 kali dalam larutan buffer fosfat saline Dulbecco, dilisis (menggunakan 25 mM glycylglycine, 15 mM MgSO₄, 4 mM EGTA, 1% Triton X-100, pH 7.8, 1 mM DTT), dikumpulkan, dan dibersihkan melalui sentrifugasi. 30 μL lisat dikombinasikan dengan 140 μL luciferase assay buffer (25 mM glycylglycine, 15 mM MgSO₄, 4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 1 mM kalium fosfat, 1 mM koenzim A, pH 7.8). Aktivitas luminescence diukur menggunakan FLx-800 microplate pembaca fluoresensi setelah injeksi otomatis 40 μL 1 mM luciferin per sumur. Aktivitas luciferase dinormalisasi menjadi kandungan protein total sebagaimana ditentukan oleh uji protein BioRad.

Uji pergeseran mobilitas elektroforesis

Ekstrak nuklir dari irisan bilateral striatum dari tikus 11A bi-transgenik (yang dipertahankan atau dimatikan doksisiklin selama minggu 2 atau 8) (McClung dan Nestler, 2003) disiapkan sesuai dengan Huang dan Walters (1996). ³²Probe oligonukleotida untai ganda berlabel P disiapkan menggunakan protokol sistem Promega Gel Shift Assay (#E3300) dan probe dimurnikan menggunakan Roche Quick Spin Columns. Urutan penyelidikan konsensus CRE dan AP-1 masing-masing berasal dari Promega (#E328A dan E320B) dan Cck Urutan CRE adalah (Cck-CRE sense: CTAGCGAGCTCTGGACTGCGTCAGCACTGGGTGCA; Antisense Cck-CRE: CCCAGTGCTGACGCGCAGTCCAGAGCTCGCTAGCTTT).

Reaksi mengikat dan elektroforesis dilakukan dengan menggunakan modifikasi prosedur sistem Promega Gel Shift Assay (#E3300). 50,000 CPM dari probe berlabel dikombinasikan dengan 10 μg ekstrak striatal nuklir. DNA pesaing dingin atau antibodi ditambahkan sebelum pengenalan radiolabeled probe. Untuk eksperimen supershift, 2 μg antibodi CREB (Upstate Biotechnology # 06-083) digunakan. Reaksi dielektroforesis pada gel poliakrilamida 4%, dikeringkan, dan terpapar ke film (menggunakan layar pengerasan selama 1 jam hingga 2 hari).

Immunoblotting

Untuk sel PC12, pelat 35 mm dari sel yang ditransfeksi dicuci dalam larutan garam penyangga fosfat Dulbecco dingin dan lisat disiapkan dalam penyangga lisis RIPA dingin (50 mM Tris pH 7.4, 5 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% deoksikolat, 1 % Triton X-100, 0.1% natrium dodesil sulfat) yang mengandung protease inhibitor. Setelah sonikasi, pembersihan, dan uji protein Bradford, lisat didenaturasi sepenuhnya dan 50 μg dari setiap sampel dielektroforesis pada gel poliakrilamida 10% SDS. Protein dipindahkan ke membran PVDF, diblok selama 1 jam dalam 3% susu kering non-lemak dalam larutan garam dengan buffer Tris yang mengandung 0.1% Tween-20 (susu TBS-T), dan diperiksa semalaman pada suhu 4 ° C dengan antibodi primer (CREB- Bioteknologi Bagian Atas # 06-083, digunakan pada 1: 1,000; GAPDH- Sigma # G8795, digunakan pada 1: 80,000) diencerkan dalam susu TBS-T. Setelah beberapa kali pencucian di TBS-T, bercak diperiksa selama satu jam pada suhu kamar menggunakan antibodi sekunder terkonjugasi alkali fosfatase (Sigma) yang diencerkan 1: 5,000 dalam susu TBS-T. Setelah beberapa kali pencucian dalam larutan garam dengan buffer Tris, reaksi warna dilakukan sesuai dengan petunjuk BioRad (# 170-6432). Membran dikeringkan semalaman, dipindai pada pemindai alas datar dan densitometri dilakukan menggunakan ImageJ (lihat di bawah).

Untuk ekstrak striatal, tes Western blot dilakukan seperti yang diterbitkan sebelumnya (Hope et al., 1994). Jaringan dikeluarkan dari tikus yang dipenggal kepalanya, diletakkan di atas es dan dipotong pada matriks otak pada ketebalan 1 mm. Pukulan tisu kemudian diambil dan dibekukan pada -80 ° C sampai digunakan. Jaringan disonikasi pada es dalam buffer berbasis deterjen yang dimodifikasi yang mengandung fosfatase dan protease inhibitor (Roche, Sigma). Setelah sonication, sampel didenaturasi dalam air mendidih dan disentrifugasi pada 15,000xg selama 15 menit; supernatan kemudian dikumpulkan dan diproses; jumlah konsentrasi protein kemudian diukur dengan menggunakan uji Bradford (Bio-Rad). Sampel dijalankan pada gel 10% akrilamida / bisakrilamida, ditransfer ke membran PVDF, diblokir dalam susu 5% dan diinkubasi dengan antibodi primer (Anti-CREB, Upstate, Lake Placid, NY). Bercak kemudian divisualisasikan menggunakan sistem chemiluminescence (Pierce). Semua sampel dinormalisasi ke GAPDH (Fitzgerald, Concord, MA). Kurva standar dijalankan untuk memastikan bahwa kami berada dalam kisaran linier pengujian.

Analisis densitometri

Untuk imunoblot PC12, analisis densitometri dilakukan menggunakan ImageJ dengan kalibrasi rodbard. Sinyal latar belakang rata-rata dikurangkan dari setiap pengukuran dan rasio sinyal CREB ke GAPDH dihitung untuk setiap sampel. Untuk imunoblot striatal dan analisis EMSA, Scion Image 1.62c digunakan dengan pengurangan latar belakang.

Chromatin imunopresipitasi (ChIP)

Pengujian ChIP dilakukan sesuai dengan metode Tsankova et al. (2004) dan Kumar et al. (2005). Secara singkat, sampel striatal bilateral dari mencit 11A yang dipelihara dengan atau tanpa doksisiklin diikat silang dengan formaldehida 1% dan pengikatan silang dipadamkan dengan glisin (konsentrasi akhir 0.125 M). Sampel-sampel ini berasal dari seluruh irisan otak yang diambil pada tingkat nukleus accumbens dengan korteks dihilangkan. Kromatin dipotong menjadi sekitar 0.2 hingga 1 kb fragmen melalui sonikasi, dibersihkan dengan manik-manik Protein G (Thermo Scientific # 22852), dan sampel masukan dibekukan pada -80 ° C. Antara 60 dan 100 μg kromatin digunakan untuk setiap presipitasi. 5-10 μg dari setiap antibodi primer digunakan (CREB: Upstate Biotechnology # 06-863, ΔFosB: Santa Cruz Biotechnology # SC-48x, acetylated H3: Upstate Biotechnology # 06-599, methylated H3 (LYS9): Cell Signaling Technology, cFos: Bioteknologi Santa Cruz # SC-7202x). Kompleks antibodi-kromatin diimunopresipitasi dengan Protein G plus manik-manik sesuai dengan petunjuk pabrik (Thermo Scientific # 22852). Setelah pengikatan silang balik dari input dan sampel yang diendapkan, masing-masing sampel dikenakan PCR kuantitatif (qPCR). Penggunaan semua antibodi ini untuk ChIP telah divalidasi secara ekstensif (Tsankova et al., 2004; Kumar et al., 2005; Renthal et al., 2009).

Tingkat pengikatan protein pada masing-masing gen penarik minat ditentukan dengan mengukur jumlah DNA terkait dengan qPCR (Applied Biosystems (ABI) Prism 7700, Foster City, CA). Input atau DNA total (nonimmunoprecipitated) dan DNA immunoprecipitated diamplifikasi dalam rangkap tiga di hadapan SYBR Green (Applied Biosystems, CA). Nilai Ct dari setiap sampel diperoleh menggunakan perangkat lunak Sequence Detector 1.1. Kuantifikasi relatif DNA templat dilakukan dengan menggunakan metode ΔΔCt (Tsankova et al., 2004). Primer yang digunakan: promotor BDNF 4: CTTCTGTGTGCGTGAATTTGCT; AGTCCACGAGAGGGCTCCA promotor CDK5: GCTGAAGCTGTCAGGAGGTC; GTGCCCCGCTCTTGTTATTA Promotor Cck: CTTGGGCTAGCCTCATTCACTG; TTAAATAGCTCCTCCCGGTTCG Promotor Prodinorfin: GGCTTCCTTGTGCTTCAGAC; GCGCTGTTTGTCACTTTCAA.

Analisis statistik

Semua data disajikan sebagai mean ± standard error dari mean. Perbedaan statistik ditentukan dengan uji-t dua sisi Student (p <0.05). Ketika beberapa perbandingan dibuat, nilai-p disesuaikan menggunakan koreksi Bonferroni.

Ucapan Terima Kasih

Kami ingin mengucapkan terima kasih kepada Will Renthal dan Arvind Kumar untuk diskusi yang bermanfaat. Kami juga ingin mengucapkan terima kasih kepada NIDA karena mendanai percobaan ini.

Catatan kaki

Penafian Penerbit: Ini adalah file PDF dari manuskrip yang belum diedit yang telah diterima untuk publikasi. Sebagai layanan kepada pelanggan kami, kami menyediakan naskah versi awal ini. Naskah akan menjalani penyalinan, penyusunan huruf, dan peninjauan bukti yang dihasilkan sebelum diterbitkan dalam bentuk citable akhir. Harap perhatikan bahwa selama proses produksi, kesalahan dapat ditemukan yang dapat memengaruhi konten, dan semua penafian hukum yang berlaku untuk jurnal tersebut.

Ketentuan klasifikasi:

Bagian: #1 Biologi Seluler dan Molekuler sistem Saraf

Referensi

Andersson M, Konradi C, Cenci MA. Protein pengikat elemen respons cAMP diperlukan untuk ekspresi gen yang tergantung dopamin dalam keadaan utuh tetapi tidak pada striatum yang dopamin-denervasi. J Neurosci. 2001; 21: 9930 – 43. [PubMed]
Barrot M, Olivier JD, Perrotti LI, DiLeone RJ, Berton O, Eisch AJ, Impey S, Storm DR, Neve RL, Yin JC, Zachariou V, Nestler EJ. Aktivitas CREB dalam nukleus accumbens shell mengontrol gating respon perilaku terhadap rangsangan emosional. Proc Natl Acad Sci US A. 2002; 99: 11435 – 40. [Artikel gratis PMC] [PubMed]
Beinfeld MC, Connolly KJ, Pierce RC. Pengobatan kokain meningkatkan cholecystokinin ekstraselular (CCK) dalam nukleus accumbens shell yang terjaga, tikus yang bergerak bebas, efek yang ditingkatkan pada tikus yang peka terhadap perilaku terhadap kokain. J Neurochem. 2002; 81: 1021 – 7. [PubMed]
Bernard C, Sutter A, Vinson C, Ratineau C, Chayvialle J, Cordier-Bussat M. Peptone menstimulasi transkripsi gen cholecystokinin usus melalui faktor-faktor pengikat elemen respon siklik adenosin monofosfat. Endokrinologi. 2001; 142: 721 – 9. [PubMed]
Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A, Snyder GL, Yan Z, Sagawa ZK, Ouimet CC, Nairn AC, Nestler EJ, Greengard P. Efek paparan kronis terhadap kokain diatur oleh protein neuron Cdk5. Alam. 2001; 410: 376 – 80. [PubMed]
Cha-Molstad H, DM Keller, Yochum GS, Impey S, Goodman RH. Ikatan tipe sel spesifik dari faktor transkripsi CREB ke elemen respons cAMP. Proc Natl Acad Sci US A. 2004; 101: 13572 – 7. [Artikel gratis PMC] [PubMed]
Chen J, Nye HE, MB Kelz, Hiroi N, Nakabeppu Y, Hope BT, Nestler EJ. Regulasi delta FosB dan protein mirip-FosB dengan kejang elektrokonvulsif dan perawatan kokain. Mol Pharmacol. 1995; 48: 880 – 9. [PubMed]
Chen J, MB Kelz, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, MR Picciotto, Duman RS, Nestler EJ. Hewan transgenik dengan ekspresi gen target yang dapat diinduksi di otak. Mol Pharmacol. 1998; 54: 495 – 503. [PubMed]
Chen J, Zhang Y, MB Kelz, Steffen C, ES ES, Zeng L, Nestler EJ. Induksi cyclin-dependent kinase 5 dalam hippocampus oleh kejang electroconvulsive kronis: peran ΔFosB. J Neurosci. 2000; 20: 8965 – 71. [PubMed]
Chinenov Y, Kerppola TK. Berbagai pertemuan dekat: interaksi Fos-Jun yang memediasi spesifisitas pengaturan transkripsi. Onkogen. 2001; 20: 2438 – 52. [PubMed]
Cole RL, Konradi C, Douglass J, Hyman SE. Adaptasi neuron terhadap amfetamin dan dopamin: mekanisme molekuler regulasi gen prodynorphin pada tikus striatum. Neuron. 1995; 14: 813 – 23. [PubMed]
Deavall DG, Raychowdhury R, Dockray GJ, Dimaline R. Kontrol transkripsi gen CCK oleh PACAP dalam sel STC-1. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2000; 279: G605 – 12. [PubMed]
Ding XZ, Mocchetti I. Regulasi dopaminergik dari kandungan mRNA cholecystokinin pada tikus striatum. Brain Res Mol Brain Res. 1992; 12: 77 – 83. [PubMed]
Forrest S, McNamara C. Id keluarga faktor transkripsi dan pembentukan lesi vaskular. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004; 24: 2014 – 20. [PubMed]
Gevrey JC, Cordier-Bussat M, Némoz-Gaillard E, Chayvialle JA, Abello J. Co-persyaratan AMP siklik dan protein kinase yang bergantung kalsium untuk aktivasi transkripsi gen kolesistokinin oleh protein hidrolisat. J Biol Chem. 2002; 277: 22407 – 13. [PubMed]
TA Hijau, Alibhai IN, Unterberg S, Neve RL, Ghose S, Tamminga CA, Nestler EJ. Induksi Activating Transcription Factor (ATFs) ATF2, ATF3, dan ATF4 dalam nucleus accumbens dan regulasi perilaku emosional mereka. J Neurosci. 2008; 28: 2025 – 32. [PubMed]
Hamilton ME, Redondo JL, Freeman AS. Overflow dopamin dan kolesistokinin dalam nukleus akumbens sebagai respons terhadap pemberian obat akut. Sinaps. 2000; 38: 238 – 42. [PubMed]
Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. Protein kinase yang diaktivasi oleh mitogen dan jalur pensinyalan protein kinase A menstimulasi transkripsi kolesistokinin melalui aktivasi protein pengikat elemen respon siklik adenosin 3 ', 5' monofosfat. Mol Endocrinol. 1999; 13: 466–75. [PubMed]
Hansen TV, Nielsen FC. Regulasi transkripsi gen neuronal cholecystokinin. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 2001; 234: 61 – 7. [PubMed]
Hansen TV. Transkripsi gen Cholecystokinin: elemen promotor, faktor transkripsi dan jalur pensinyalan. Peptida. 2001; 22: 1201 – 11. [PubMed]
Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. KCl dan forskolin secara sinergis mengatur ekspresi gen cholecystokinin melalui aktivasi koordinat CREB dan co-aktivator CBP. J Neurochem. 2004; 89: 15 – 23. [PubMed]
Haun RS, Dixon JE. Penambah transkripsional penting untuk ekspresi gen cholecystokinin tikus mengandung sekuens yang identik dengan elemen -296 dari gen c-fos manusia. J Biol Chem. 1990; 265: 15455 – 63. [PubMed]
Hiroi N, Marek GJ, Brown JR, Ye H, Saudou F, Vaidya VA, RS Duman, Greenberg ME, Nestler EJ. Peran penting gen fosB dalam aksi molekuler, seluler, dan perilaku kejang electroconvulsive kronis. J Neurosci 1998. 1998; 18: 6952 – 62. [PubMed]
Hokfelt T, Rehfeld JF, Skirboll L, Ivemark B, Goldstein M, Markey K. Bukti untuk koeksistensi dopamin dan CCK dalam neuron meso-limbik. Alam. 1980; 285: 476 – 8. [PubMed]
Hope BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ. Pengobatan kejang electroconvulsive (ECS) kronis menghasilkan ekspresi kompleks AP-1 yang tahan lama di otak dengan komposisi dan karakteristik yang berubah. J Neurosci. 1994; 14: 4318 – 28. [PubMed]
Hope BT, Nye HE, MB Kelz, DW Sendiri, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, RS Duman, Nestler EJ. Induksi kompleks AP-1 yang tahan lama terdiri dari perubahan protein mirip-Fos di otak oleh kokain kronis dan perawatan kronis lainnya. Neuron. 1994; 13: 1235 – 44. [PubMed]
Huang KX, Walters JR. Regulasi dopaminergik aktivitas transkripsi faktor transkripsi AP-1 pada tikus striatum. Ilmu saraf. 1996; 75: 757 – 75. [PubMed]
Impey S, McCorkle SR, Cha-Molstad H, Dwyer JM, Yochum GS, Boss JM, McWeeney S, Dunn JJ, Mandel G, Goodman RH. Mendefinisikan regulator CREB: analisis genom seluruh wilayah regulasi faktor transkripsi. Sel. 2004; 119: 1041 – 54. [PubMed]
Johannessen M, Delghandi MP, Moens U. Apa yang menyalakan CREB? Sinyal Sel. 2004; 16: 1211 – 27. [PubMed]
Josselyn SA, Vaccarino FJ. Efek berlawanan dari antagonis CCK (A) dan CCK (B) pada pengembangan aktivitas terkondisi pada tikus. Behav Pharmacol. 1996; 7: 505 – 512. [PubMed]
Josselyn SA, De Cristofaro A, Vaccarino FJ. Bukti untuk keterlibatan reseptor CCK (A) dalam perolehan aktivitas terkondisi yang dihasilkan oleh kokain pada tikus. Res Otak. 1997; 763: 93 – 102. [PubMed]
MB Kelz, Chen J, Carlezon WA, Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, DW Diri, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Piccotto MR , Nestler EJ. Ekspresi faktor transkripsi deltaFosB di otak mengontrol sensitivitas terhadap kokain. Alam. 1999; 401: 272 – 6. [PubMed]
Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DE, Truong HT, Russo SJ, Laplant Q, Sasaki TS, Penyapu KN, Neve RL, DW Sendiri, Nestler EJ. Renovasi kromatin adalah mekanisme kunci yang mendasari plastisitas yang diinduksi kokain dalam striatum. Neuron. 2005; 48: 303 – 14. [PubMed]
Mattson BJ, Bossert JM, Simmons DE, Nozaki N, Nagarkar D, Kreuter JD, Hope BT. Fosforilasi CREB yang diinduksi kokain dalam nucleus accumbens dari tikus yang peka terhadap kokain dimungkinkan oleh peningkatan aktivasi kinase yang berhubungan dengan sinyal ekstraseluler, tetapi bukan protein kinase A. J Neurochem. 2005; 95: 1481 – 94. [PubMed]
McClung CA, Nestler EJ. Regulasi ekspresi gen dan hadiah kokain oleh CREB dan DeltaFosB. Nat Neurosci. 2003; 6: 1208 – 15. [PubMed]
McClung CA, PG Ulery, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: saklar molekuler untuk adaptasi jangka panjang di otak. Brain Res Mol Brain Res. 2004; 132: 146 – 54. [PubMed]
Nestler EJ, Kelz MB, Chen JS. ΔFosB: Mediator molekuler dari plastisitas saraf dan perilaku jangka panjang. Res Otak. 1999; 835: 10 – 17. [PubMed]
Nestler EJ. Apakah ada jalur molekuler yang umum untuk kecanduan? Nat Neurosci. 2005; 8: 1445 – 9. [PubMed]
Nestler EJ. Mekanisme transkripsi kecanduan: peran DeltaFosB. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008; 363: 3245 – 55. [Artikel gratis PMC] [PubMed]
Perrotti LI, Penenun RR, Robison B, Renthal W, Labirin I, Yazdani S, Elmore RG, DJ Knapp, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, DW Send, Nestler EJ. Pola yang berbeda dari induksi DeltaFosB di otak oleh obat-obatan pelecehan. Sinaps. 2008; 62: 358 – 69. [Artikel gratis PMC] [PubMed]
Rando OJ, Chang HY. Pemandangan struktur kromatin yang luas genom. Annu Rev Biochem. 2009; 78: 245 – 71. [Artikel gratis PMC] [PubMed]
Renthal W, Carle TL, Labirin I, Covington HE, 3rd., Truong HT, Alibhai I, Kumar A, Montgomery RL, Olson EN, Nestler EJ. Delta FosB memediasi desensitisasi epigenetik dari gen c-fos setelah paparan amfetamin kronis. J Neurosci. 2008; 28: 7344 – 9. [Artikel gratis PMC] [PubMed]
Renthal W, Kumar A, Xiao G, Wilkinson M, Covington HE, 3rd, Labirin I, Sikder D, AJ Robison, LaPlant Q, Dietz DM, Russo SJ, Vialou V, Chakravarty S, Kodadek TJ, Stack A, Kabbaj M, Nestler EJ. Analisis genome luas regulasi kromatin oleh kokain mengungkapkan peran untuk sirtuins. Neuron. 2009; 62: 335 – 48. [Artikel gratis PMC] [PubMed]
Rotzinger S, Bush DE, Vaccarino FJ. Modulasi cholecystokinin fungsi dopamin mesolimbik: regulasi perilaku termotivasi. Pharmacol Toxicol. 2002; 91: 404 – 13. [PubMed]
Rourke IJ, Hansen TV, Nerlov C, Rehfeld JF, Nielsen FC. Kooperativitas negatif antara juxtaposed E-box dan elemen respons cAMP / TPA dalam promotor gen cholecystokinin. FEBS Lett. 1999; 448: 15 – 8. [PubMed]
Shaw-Lutchman TZ, Barrot M, Wallace T, Gilden L, Zachariou V, Impey S, RS Duman, Storm D, Nestler EJ. Pemetaan regional dan seluler dari transkripsi yang dimediasi CRE selama penarikan morfin yang diendapkan naltrexone. J Neurosci. 2002; 22: 3663 – 3672. [PubMed]
Shaw-Lutchman TZ, Impey S, Storm D, Nestler EJ. Regulasi transkripsi yang dimediasi CRE di otak tikus oleh amfetamin. Sinaps. 2003; 48: 10 – 7. [PubMed]
Sheng M, McFadden G, Greenberg ME. Depolarisasi membran dan kalsium menginduksi transkripsi c-fos melalui fosforilasi faktor transkripsi CREB. Neuron. 1990; 4: 571 – 82. [PubMed]
Tsankova NM, Kumar A, Nestler EJ. Modifikasi histone di daerah promoter gen pada hippocampus tikus setelah kejang elektrokonvulsif akut dan kronis. J Neurosci. 2004; 24: 5603 – 10. [PubMed]
Ulery PG, Nestler EJ. Regulasi aktivitas transkripsi DeltaFosB oleh fosforilasi Ser27. Eur J Neurosci. 2007; 25: 224 – 30. [PubMed]
Vaccarino FJ. Nucleus accumbens interaksi dopamin-CCK dalam penghargaan psikostimulan dan perilaku terkait. Neurosci Biobehav Rev. 1992; 18: 207 – 14. [PubMed]
Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, LJ Sim-Selley, RJ DiLeone, Kumar A, Nestler EJ. ΔFosB: Peran penting untuk ΔFosB dalam nukleus accumbens dalam aksi morfin. Alam Neurosci. 2006; 9: 205 – 11. [PubMed]