Formasi dendritik tulang belakang yang diinduksi kokain dalam neuron berduri medium yang mengandung reseptor D1 dan D2 dopamin dalam nucleus accumbens (2006)

Proc Natl Acad Sci US A. Feb 28, 2006; 103 (9): 3399 – 3404.
Diterbitkan online Februari 21, 2006. doi:  10.1073 / pnas.0511244103
PMCID: PMC1413917
Neuroscience
Artikel ini telah dikutip oleh artikel lain di PMC.

Abstrak

Perubahan psikostimulan yang disebabkan oleh duri dendritik pada neuron dopaminoseptif pada nucleus accumbens (NAcc) telah dihipotesiskan sebagai respons neuron adaptif yang terkait dengan perilaku adiktif yang bertahan lama. NAcc sebagian besar terdiri dari dua subpopulasi berbeda dari neuron berduri berukuran sedang yang mengekspresikan tingkat tinggi reseptor dopamin D1 atau D2. Dalam penelitian ini, kami menganalisis kepadatan tulang belakang dendritik setelah perawatan kokain kronis di D1 atau D2 yang mengandung reseptor neuron berduri berukuran sedang di NACC. Studi-studi ini menggunakan tikus transgenik yang mengekspresikan EGFP di bawah kendali D1 atau promotor reseptor D2 (Drd1-EGFP atau Drd2-EGFP). Setelah 28 hari pengobatan kokain dan 2 hari penarikan, kepadatan tulang belakang meningkat di kedua neuron positif Drd1-EGFP- dan Drd2-EGFP. Namun, peningkatan kepadatan tulang dipertahankan hanya dalam neuron Drd1-EGFP-positif 30 hari setelah penghentian obat. Khususnya, peningkatan ekspresi osFosB juga diamati pada Drd1-EGFP- dan Drd2-EGFP-positif neuron setelah 2 hari penghentian obat tetapi hanya pada Drd1-EGFP-neuron positif setelah 30 hari penarikan obat. Hasil ini menunjukkan bahwa peningkatan kepadatan tulang belakang yang diamati setelah pengobatan kokain kronis stabil hanya pada neuron yang mengandung reseptor D1 dan bahwa ekspresi osFosB dikaitkan dengan pembentukan dan / atau pemeliharaan duri dendritik di D1 serta neuron yang mengandung reseptor D2 dalam NAcc.

Jalur dopaminergik mesolimbik terdiri dari neuron di daerah tegmental ventral yang menginervasi nukleus accumbens (NAcc), tuberkel olfaktorius, korteks prefrontal, dan amigdala (1), sedangkan neuron dopaminergik nigrostriatal pada substantia nigra (pars compacta) memberikan proyeksi naik ke striatum punggung (2). Psikostimulan meningkatkan konsentrasi sinaptik dopamin dalam NAcc: kokain, dengan menghalangi penyerapan dopamin dari celah sinaptik, dan amfetamin, dengan mempromosikan pelepasan dopamin dari terminal saraf (3-5). Pemberian psikostimulan yang intermiten menghasilkan respons perilaku yang meningkat (sensitisasi) terhadap efek stimulasi akut dari obat-obatan ini (6-8). Sebagian besar bukti menunjukkan bahwa perubahan adaptif di daerah tegmental ventral - sistem dopaminergik NACC merupakan pusat perubahan pada plastisitas tergantung pengalaman yang mendasari perilaku yang diinduksi oleh obat.

Selain dopamin, glutamat diperlukan untuk pengembangan kepekaan perilaku sebagai respons terhadap psikostimulan (9, 10). Neuron berduri ukuran sedang (MSNs) di ventral striatum menerima proyeksi glutamatergik yang merangsang dari korteks prefrontal yang disinkronkan ke kepala duri dendritik. MSN juga merupakan target utama akson dopaminergik yang menyelaraskan ke leher tulang belakang (1, 11, 12). Oleh karena itu, duri dendritik pada MSN mewakili kompartemen seluler tempat transmisi dopaminergik dan glutamatergik awalnya terintegrasi.

Dopamin bertindak pada dua subfamili reseptor utama, subfamili D1 (subtipe D1 dan D5) dan subfamili D2 (subtipe D2, D3, dan D4) (13). Dalam striatum dorsal, studi anatomi telah menunjukkan bahwa striatonigral MSNs mengandung reseptor D1 tingkat tinggi (bersama dengan zat P dan dynorphin), sedangkan striatopallidal MSNs umumnya mengekspresikan reseptor D2 (bersama dengan enkephalin) (14-17). Proyeksi dari NAcc lebih kompleks daripada di dorsal striatum, dengan kulit dan bagian inti dari NAcc yang memproyeksikan ke subkawasan yang berbeda dari pallidum ventral dan ke daerah tegmental ventral dan substantia nigra (18). Sedangkan reseptor D2 dan enkephalin sangat diekspresikan dalam proyeksi ke ventral pallidum, reseptor D1 dan substansi P ditemukan merata dalam proyeksi ke ventral pallidum dan area tegmental ventral (19). Studi agonis dan antagonis selektif untuk reseptor D1 atau D2 menunjukkan bahwa baik reseptor D1 dan D2 diperlukan untuk perubahan perilaku yang tergantung pada psikostimulan (20-25). Namun, peran reseptor ini tampaknya berbeda. Misalnya, stimulasi reseptor D1 melemahkan pencarian kokain yang diinduksi oleh suntikan prima kokain dan isyarat lingkungan terkait kokain, sedangkan stimulasi reseptor D2 memfasilitasi pemulihan yang diinduksi kokain (26-28).

Kelainan perilaku yang terkait dengan kecanduan psikostimulan sangat berumur panjang. Oleh karena itu, ada banyak minat dalam mengidentifikasi perubahan yang diinduksi oleh obat yang tahan lama pada tingkat molekul dan struktural dalam sirkuit neuron yang diatur oleh dopamin dan glutamat (29-32). Khususnya, paparan jangka panjang untuk kokain atau amfetamin telah ditemukan untuk meningkatkan jumlah titik cabang dendritik dan duri MSN di NAcc (33-35). Perubahan struktural ini telah terbukti bertahan hingga ≈1 – 3.5 bulan setelah paparan obat terakhir (30, 35) dan telah disarankan untuk mendasari perubahan jangka panjang dalam plastisitas sinaptik yang terkait dengan paparan psikostimulan.

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memeriksa perubahan struktural yang diinduksi kokain duri dendritik dalam subpopulasi MSN aksumbal yang mengekspresikan reseptor D1 atau D2. Dalam studi ini, kami telah menggunakan tikus transgenik kromosom bakteri (BAC) yang mengekspresikan EGFP di bawah kendali D1 (Drd1-EGFP) atau promotor reseptor dopamin D2 (Drd2-EGFP) (36). Hasil penelitian menunjukkan bahwa, meskipun peningkatan kepadatan tulang belakang pada awalnya terjadi pada MSN yang mengandung reseptor D1 dan MSN yang mengandung reseptor DXNUM, perubahan kepadatan tulang belakang stabil hanya pada neuron yang mengandung reseptor D2. Selain itu, kami menemukan perubahan yang sama dalam ekspresi faktor transkripsi ΔFosB, menunjukkan bahwa ΔFosB mungkin terlibat dalam pembentukan dan / atau pemeliharaan duri dendritik di D1 serta neuron yang mengandung reseptor D1 di NAcc.

Hasil

Analisis MSN pada Drd1-EGFP dan Drd2-EGFP BAC Transgenic Mice.

Pola proyeksi MSNs dari dorsal dan ventral striatum di Drd1-EGFP atau Drd2-EGFP BAC tikus transgenik telah dikarakterisasi melalui analisis ekspresi GFP (36). Ekspresi diferensial GFP di MSNs dari dorsal striatum umumnya sesuai dengan reseptor D1 atau D2 endogen, masing-masing (36). Kami selanjutnya menganalisis ekspresi diferensial GFP dalam NAcc pada tikus Drd1-EGFP atau Drd2-EGFP (Ara. 1a dan b). Meskipun ≈58% neuron dalam NAcc mengekspresikan GFP pada tikus Drd1-EGFP (Ara. 1a), ≈48% dari neuron dalam NAcc mengekspresikan GFP pada tikus Drd-2-EGFP (Ara. 1b). MSN mewakili 90 – 95% dari semua neuron dalam NAcc (12, 37). Reseptor D1 hanya diekspresikan dalam MSN, dan reseptor D2 diekspresikan dalam MSN dan pada interneuron kolinergik, yang mewakili 1-3% dari neuron striatal (37). Dengan mempertimbangkan faktor-faktor ini, hasilnya menunjukkan bahwa, minimal, ≈10-15% dari MSNs di NAcc cenderung mengekspresikan reseptor D1 dan D2.

Ara. 1. 

Analisis MSN pada tikus Drd1-EGFP dan Drd2-EGFP. (a dan b) Memperbaiki irisan otak dari NACC dari Drd1-EGFP (a) atau Drd2-EGFP (b) BAC tikus transgenik diimunisasi untuk GFP dan NeuN (sebagai penanda neuronal umum). Gambar yang digabungkan menunjukkan, dalam warna kuning, colocalization ...

Analisis Duri Dendritik pada Tikus Drd1-EGFP dan Drd2-EGFP.

Ekspresi GFP pada tikus Drd1-EGFP dan Drd2-EGFP bermanfaat untuk menodai badan sel saraf. Namun, sinyal GFP dalam dendrit dan duri dendritik terlalu lemah untuk memungkinkan analisis mereka setelah imunostaining dengan antibodi anti-GFP. Pengiriman balistik yang dimediasi partikel dengan pewarna neon baru-baru ini telah digunakan untuk memberi label populasi neuron dengan cara yang cepat dan efisien (38). Seluruh neuron dapat diberi label menggunakan teknik ini, dan metode ini tampaknya sebanding dengan pewarnaan Golgi-Cox. Untuk menganalisis morfologi dendritik neuron dalam NAcc, irisan akumbal tetap diberi label dengan pewarna fluoresensi lipofilik 1,1′-diotadecyl-3,3,3 ′, 3′-tetramethylindocarbocyanine perklorat (DiI) dengan menggunakan senjata gen. Contoh MSN bernoda DiI ditunjukkan pada Ara. 1c. Dalam kondisi yang digunakan, kami umumnya mengamati neuron berlabel tanpa dendrit yang tumpang tindih dari neuron berlabel lainnya. Pada perbesaran yang lebih tinggi, morfologi dendritik terperinci, termasuk duri dendritik, dapat diamati (Ara. 1d).

Kami kemudian menggunakan kombinasi pelabelan DiI dan imunohistokimia untuk GFP di Drd1-EGFP atau Drd2-EGFP tikus transgenik, yang dimungkinkan dengan menggunakan deterjen konsentrasi rendah untuk permeabilisasi jaringan (lihat metode). Melalui perbandingan yang hati-hati dari noda DII dan ekspresi GFP di dalam sel tubuh MSN, kami dapat mengidentifikasi DiI dan GFP-positif atau DiI-positif dan GFP-negatif neuron di Drd1-EGFPAra. 2a) atau Drd2-EGFP (Ara. 2b) tikus. Untuk penelitian berikut, kami menganalisis morfologi dendritik hanya pada neuron positif DiI dan GFP dari Drd1-EGFP atau Drd2-EGFP tikus.

Ara. 2. 

Analisis duri dendritik pada tikus Drd1-EGFP dan Drd2-EGFP. Neuron dalam NAcc dari tikus Drd1-EGFP (a) atau tikus Drd2-EGFP (b) pertama kali diberi label dengan DiI (merah) dan kemudian dikenakan imunohistokimia menggunakan antibodi anti-GFP (EGFP, hijau). Hanya ...

Pengobatan Kokain Kronik menghasilkan Peningkatan Kepadatan Tulang Belakang pada MSN Aksumbal yang Mengekspresikan Drd1-EGFP atau Drd2-EGFP.

Tikus Drd1-EGFP atau Drd2-EGFP disuntikkan berulang kali dengan kokain (30 mg / kg) atau salin selama empat minggu berturut-turut (lihat metode). Dua hari (2WD) atau 30 hari (30WD) setelah perawatan obat terakhir, otak diproses untuk pelabelan DiI dan imunohistokimia seperti dijelaskan di atas. Sebuah studi sebelumnya melaporkan bahwa pengobatan kronis dengan amfetamin meningkatkan kepadatan tulang belakang pada dendrit MSNs distal tetapi tidak proksimal dalam NACC (35). Oleh karena itu kami membatasi analisis kami pada dendrit distal (yaitu cabang dengan cabang orde kedua atau ketiga), termasuk daerah terminal. Ketika dianalisis di 2WD, kepadatan tulang ditemukan meningkatkan MSNs Drd1-EGFP-positif (128% dari kelompok saline) (Ara. 3a dan c) dan pada tingkat lebih rendah pada neuron Drd2-EGFP-positif (115% dari kelompok saline) (Ara. 3 b dan d). Setelah 30WD, peningkatan kepadatan tulang belakang dipertahankan dalam neuron Drd1-EGFP-positif (118% dari kontrol saline) (Ara. 3 a dan c) tetapi tidak dalam neuron Drd2-EGFP-positif (Ara. 3 b dan d).

Ara. 3. 

Peningkatan kokain kronis yang diinduksi dalam kepadatan tulang belakang pada MSN positif-Drd1-EGFP- atau Drd2-EGFP-positif di NAcc. (a dan b) Drd1-EGFP (a) atau Drd2-EGFP (b) tikus diobati dengan saline (Sal) atau kokain (Coc, 30 mg / kg) selama 4 minggu. Otak tikus 2WD atau 30WD diproses ...

Morfologi duri dendritik bervariasi dalam hal panjang dan lebar kepala tulang belakang. Oleh karena itu kami mengklasifikasikan tonjolan dendritik ke dalam empat kelas tulang belakang (gemuk, jamur, tipis, dan filopodia) di 2WD dari kokain (data tidak ditampilkan). Kerapatan jenis jamur (119.7 ± 4.0%, P <0.01) dan duri tipis (120.0 ± 3.4%, P <0.01) meningkat dengan pengobatan kokain pada MSNs positif Drd1-EGFP, sedangkan kepadatan gemuk (182.4 ± 21.6%, P <0.05) dan duri jamur (122.5 ± 5.0%, P <0.01) meningkat pada MSN positif Drd2-EGFP. Tidak ada peningkatan signifikan pada duri pendek pada neuron positif Drd1-EGFP atau duri tipis pada neuron positif Drd2-EGFP.

Kokain Kronis Menginduksi Ekspresi osFosB pada Drd1-EGFP- atau Drd2-EGFP-MSN Positif dalam NAcc.

ΔFosB adalah anggota keluarga Fos faktor transkripsi. Sementara pemberian kokain akut menginduksi induksi cepat dan sementara dari beberapa isoform Fos di NAcc, paparan berulang terhadap kokain meningkatkan tingkat osFosB. Selain itu, peningkatan ekspresi osFosB bertahan dalam NAcc selama berminggu-minggu hingga berbulan-bulan setelah penghentian paparan obat dan telah disarankan untuk terlibat dalam regulasi ekspresi gen yang bertahan lama, bahkan setelah penggunaan obat berhenti (29, 39, 40).

Untuk memeriksa induksi ΔFosB dalam NAcc dari tikus Drd1-EGFP atau Drd2-EGFP setelah perawatan kokain, kami menganalisis ekspresi FosB dan GFP dengan label ganda (Ara. 4 dan Tabel 1) Antibodi anti-FosB mengenali semua bentuk FosB, tetapi kami mengasumsikan bahwa peningkatan imunostain mewakili ΔFosB (lihat metode untuk diskusi lebih lanjut). Pada tikus yang diberi saline, 16% dari neuron positif Drd1-EGFP dan 15% dari neuron positif Drd2-EGFP mengekspresikan imunoreaktivitas FosB dengan intensitas yang relatif lemah (Ara. 4 a dan b dan Tabel 1). Pengobatan berulang kokain diikuti oleh 2WD menghasilkan peningkatan yang signifikan dalam jumlah neuron Drd1-EGFP-positif yang bersama-sama mengekspresikan ΔFosB (55% dari neuron positif GFP) (Ara. 4c dan Tabel 1). Peningkatan yang lebih kecil, tetapi masih signifikan dalam ekspresi osFosB ditemukan pada neuron Drd2-EGFP-positif (25% dari neuron positif GFP) (Ara. 4d dan Tabel 1). Seperti dengan perubahan kepadatan tulang belakang, peningkatan ekspresi ΔFosB dipertahankan dalam neuron Drd1-EGFP-positif (46% dari neuron positif GFP) tetapi tidak dalam neuron positif Drd2-EGFP (15% dari GFP-neuron positif) setelah 30WD (Ara. 4 e dan f dan Tabel 1). Perhatikan bahwa ekspresi ΔFosB yang meningkat diamati di Ara. 4f hadir dalam neuron Drd2-EGFP-negatif.

Ara. 4. 

Kokain kronis menginduksi ekspresi osFosB dalam Drd1-EGFP- atau Drd2-EGFP-positif MSNs dalam NAcc. Drd1-EGFP (a, c, dan e) atau Drd2-EGFP (b, d, dan f) tikus diobati dengan saline atau kokain kronis seperti yang dijelaskan dalam Ara. 3. 2WD (c dan d) atau 30WD (e dan ...
Tabel 1. 

Kuantifikasi neuron EGFP-positif yang mengekspresikan ΔFosB

Diskusi

Adaptasi jangka panjang dalam neurotransmisi dopaminergik diyakini mendasari perilaku adiktif yang terkait dengan obat-obatan psikostimulan. Secara khusus, peningkatan yang diinduksi psikostimulan dalam kepadatan tulang belakang dendritik MSNs di NAcc telah dihipotesiskan akan dikaitkan dengan reorganisasi konektivitas sinaptik (30). NAcc sebagian besar terdiri dari dua subpopulasi berbeda dari MSN yang mengekspresikan reseptor dopamin D1 atau D2 tingkat tinggi. Dalam penelitian ini, kami telah menganalisis kepadatan tulang belakang dalam MSN yang mengandung reseptor D1 atau D2 yang berbeda dalam NAcc setelah pengobatan kokain kronis. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa, meskipun peningkatan kepadatan tulang belakang pada awalnya terjadi pada MSN yang mengandung reseptor D1 dan MSN yang mengandung reseptor DXNUM, perubahan kepadatan tulang belakang stabil hanya pada neuron yang mengandung reseptor D2. Selain itu, kami menemukan pola perubahan yang mirip dalam ekspresi faktor transkripsi ΔFosB di D1 dan MSN yang mengandung reseptor D1.

Studi-studi ini menggunakan tikus transgenik BAC yang mengekspresikan GFP dalam subpopulasi spesifik MSN di bawah kendali promotor reseptor D1 atau D2. Selain itu, kami mengembangkan metode pelabelan ganda yang menggabungkan imunohistokimia untuk GFP dengan pelabelan balistik neuron menggunakan DiI. Penelitian sebelumnya telah menggunakan metode Golgi-Cox untuk menganalisis efek psikostimulan pada kepadatan tulang belakang (34), dan metode DII yang digunakan di sini memberikan hasil yang sebanding secara kuantitatif. Kami mengembangkan metode pelabelan ganda karena pewarnaan Golgi tidak kompatibel dengan imunohistokimia. Imunostaining biasanya memerlukan permeabilisasi jaringan dengan deterjen, suatu proses yang biasanya mengarah pada pelarutan pewarna lipofilik dari membran (38). Namun, dalam penelitian kami saat ini, immunostaining GFP tidak memerlukan konsentrasi deterjen yang tinggi untuk permeabilisasi jaringan dan dengan demikian dapat digunakan bersama dengan pelabelan pewarna lipofilik. Metode pelabelan ganda kami umumnya berguna untuk studi perubahan struktural duri dendritik, misalnya ketika digunakan untuk analisis garis tikus transgenik BAC di mana GFP diekspresikan dalam populasi spesifik neuron di korteks (36).

Meskipun masih agak kontroversial, diyakini bahwa reseptor D1 dan D2 sebagian besar secara anatomis dipisahkan ke neuron proyeksi striatal langsung (striatonigral) dan tidak langsung (striatopallidal), masing-masing (17, 41). Karakterisasi awal lokalisasi GFP pada tikus Drd1-EGFP dan Drd2-EGFP konsisten dengan kesimpulan ini (36). Selain itu, analisis kami tentang jumlah neuron positif-GFP pada NAcc dari Drd1-EGFP dan tikus Drd2-EGFP konsisten dengan kesimpulan bahwa ≈50% dari MSNs hanya mengekspresikan reseptor D1, bahwa ≈35-40% hanya mengekspresikan reseptor D2. dan bahwa ≈10 – 15% bersama-sama mengekspresikan reseptor D1 dan D2. Nilai koekspresi ini mirip dengan yang tersirat oleh studi dorsal striatum yang menggabungkan analisis patch-clamp neuron striatal tunggal dengan teknik RT-PCR untuk mengisolasi dan memperkuat mRNA (≈17% koekspresi enkephalin dan substansi P) (42). Perlu dicatat bahwa penelitian kami saat ini tidak membahas pertanyaan tentang ekspresi reseptor D3, D4, dan D5, juga tidak membahas masalah rendahnya tingkat ekspresi reseptor D1 di MSN yang mengekspresikan reseptor D2 tingkat tinggi atau sebaliknya.

Beberapa penelitian sebelumnya telah meneliti lokalisasi neuron dari ekspresi Fos yang diinduksi psikostimulan dan peran reseptor D1 dan D2 (43-45). Studi-studi tersebut mendukung kesimpulan bahwa induksi Fos dan osFosB dimediasi oleh aktivasi reseptor D1. Namun, lokalisasi seluler ekspresi Fos dipengaruhi oleh konteks lingkungan di mana obat-obatan psikostimulan diberikan (46, 47). Misalnya, amfetamin atau kokain yang diberikan dalam kandang dapat menginduksi gen awal langsung (termasuk Fos) secara istimewa dalam sel P-positif substansi yang hidup bersama reseptor D1. Sebaliknya, obat-obatan ini dapat menginduksi ekspresi Fos pada MSN yang mengandung reseptor D1 dan D2 ketika diberikan dalam lingkungan yang baru. Protokol yang digunakan dalam penelitian kami saat ini tidak termasuk memasangkan injeksi obat dengan pajanan pada lingkungan baru. Namun, kami tidak dapat mengesampingkan semacam stres yang bergantung pada konteks yang bertanggung jawab untuk ekspresi osFosB di MSN yang mengandung reseptor D2.

Fitur penting dari hasil ini adalah pola paralel peningkatan kepadatan tulang belakang dan ekspresi osFosB. Peningkatan kepadatan tulang belakang dan ekspresi osFosB awalnya terjadi pada MSN yang mengekspresikan Drd1-EGFP dan Drd2-EGFP. Namun, perubahan ini hanya stabil pada neuron yang mengandung reseptor D1. Satu penjelasan yang mungkin untuk pengamatan bahwa peningkatan kepadatan tulang belakang dan ekspresi osFosB sementara ditemukan dalam neuron yang mengandung reseptor D2 adalah bahwa hal ini terjadi pada fraksi kecil MSN yang bersama-sama mengekspresikan reseptor dopamin D1 dan D2. Dengan demikian, sifat sementara peningkatan ini dapat dikaitkan dengan efek antagonis dari aktivasi reseptor D2 pada jalur pensinyalan yang bergantung pada D1 (48). Yang menarik adalah bahwa perubahan kepadatan tulang belakang dan ekspresi ΔFosB adalah reversibel, yang mungkin mencerminkan kemampuan jalur pensinyalan yang bergantung pada reseptor D2 untuk mempengaruhi stabilitas ΔFosB.

Pengamatan bahwa ada perubahan paralel dalam ekspresi ΔFosB dan kepadatan tulang belakang konsisten dengan gagasan bahwa ΔFosB terlibat dalam pembentukan awal dan pemeliharaan duri dendritik selanjutnya dalam neuron yang mengandung reseptor D1 di NAcc. Ekspresi ΔFosB dikendalikan oleh jalur pensinyalan yang bergantung pada D1 / DARPP-32 / PP1 di MSNs (49). Beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa osFosB memainkan peran penting dalam tindakan psikostimulan yang bermanfaat dan mengaktifkan lokomotor (39), kemungkinan dengan mempengaruhi ekspresi beberapa gen yang meliputi reseptor neurotransmitter, protein pemberi sinyal, dan protein yang terlibat dalam regulasi morfologi neuron (50). Namun, mekanisme molekuler spesifik yang terlibat dalam pembentukan tulang belakang kronis yang diinduksi kokain belum diketahui saat ini. Studi kami sebelumnya telah menunjukkan bahwa infus intraaccumbal dari penghambat Cdk5 roscovitine melemahkan peningkatan yang diinduksi kokain dalam kepadatan tulang belakang (51). Selain itu, Cdk5 adalah gen target hilir untuk ΔFosB dan telah terlibat dalam perubahan adaptif kompensasi yang terkait dengan pengobatan kokain kronis (52). Oleh karena itu, perubahan fosforilasi dependen Cdk5 adalah mekanisme yang masuk akal yang mendasari pembentukan tulang belakang yang diinduksi kokain dan / atau stabilitas tulang belakang. PAK (53), β-catenin (54), PSD-95 (55), dan spinophilin (56) adalah substrat untuk Cdk5 dan semuanya terlibat dalam regulasi morfogenesis tulang belakang (57-60). Karakterisasi lebih lanjut dari ini dan substrat Cdk5 lainnya di duri diharapkan akan menjelaskan mekanisme yang terlibat dalam regulasi pembentukan tulang belakang oleh psikostimulan.

metode

Binatang.

Tikus yang membawa transgen EGFP di bawah kendali reseptor dopamin D1 atau D2 dihasilkan oleh proyek transgenik Gensat BAC (36). Tikus transgenik yang digunakan dalam penelitian ini berumur 4-5 minggu dan berada di latar belakang Swiss-Webster. Tikus dipelihara dalam siklus 12: 12-h terang / gelap dan ditempatkan dalam kelompok 2-5 dengan makanan dan air tersedia ad libitum. Semua protokol hewan sesuai dengan Panduan Institut Kesehatan Nasional untuk Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium dan disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusional Universitas Rockefeller.

Perawatan Obat.

Pengobatan kokain kronis (30 mg / kg, setiap hari) dilaporkan menghasilkan peningkatan kuat dalam kepadatan tulang belakang MSNs baik pada inti dan kulit NAcc dari tikus, tetapi dosis yang lebih rendah (15 mg / kg) meningkatkan kepadatan tulang belakang hanya di kerang (61). Oleh karena itu kami menggunakan dosis kokain yang lebih tinggi untuk menginduksi modifikasi struktural pada kedua bagian NACC. Tikus menerima satu injeksi (ip) 30 mg / kg kokain-HCl (atau saline) setiap hari selama 5 hari berturut-turut, diikuti oleh hari bebas injeksi 2, dan prosedur ini diulang selama 4 minggu berturut-turut. Suntikan dilakukan di kandang. 2WD atau 30WD, otak tikus diproses untuk pelabelan DiI dan / atau imunohistokimia.

Pelabelan Balistik dengan Fluorescent Dye DiI.

Mencit dianestesi dengan 80 mg / kg natrium pentobarbital dan perfusi transcardially dengan 5 ml PBS, diikuti oleh perfusi cepat dengan 40 ml 4% paraformaldehyde di PBS (20 ml / menit). Otak dengan cepat dikeluarkan dari tengkorak dan dipasang kembali dalam 4% paraformaldehyde selama 10 min. Irisan otak (100 μm) diberi label dengan pengiriman balistik pewarna fluorescent DiI (Probe Molekul) seperti yang dijelaskan dalam ref. 38. Kombinasi metode pelabelan DiI-imunohistokimia dikembangkan dengan deterjen konsentrasi rendah. Bagian berlabel DiI permeabilisasi dengan 0.01% Triton X-100 dalam PBS selama 15 min dan kemudian diinkubasi dalam 0.01% Triton X-100 dan 10% serum kambing normal di PBS untuk 1 h untuk meminimalkan pelabelan yang tidak spesifik. Bagian jaringan kemudian diinkubasi dengan 1% serum kambing normal / 0.01% Triton X-100 dan antibodi anti-GFP (Abcam, Cambridge, MA) untuk 2 h pada suhu kamar, dicuci, dan diinkubasi dalam 1: 1,000 pengenceran FITC- antibodi sekunder terkonjugasi (Probe Molekul). Bagian ditempatkan pada slide mikroskop dan ditutup dengan media pemasangan. Metode pelabelan balistik memungkinkan analisis rinci struktur tulang belakang dendritik, dan hasil yang diperoleh secara kualitatif dan kuantitatif sebanding dengan penelitian sebelumnya menggunakan metode impregnasi Golgi-Cox dalam irisan otak tikus (34). Namun, berbeda dengan penelitian sebelumnya, kami jarang mengamati duri berkepala dua pada neuron bernoda DiI. Perbedaan ini dapat disebabkan oleh sensitivitas metode pewarnaan atau variabilitas tikus (penelitian ini) dibandingkan jaringan tikus (34).

Imunohistokimia.

Hewan dibius dan diberi perfusi seperti dijelaskan di atas. Otak dihilangkan dan disimpan semalam di 4% paraformaldehyde pada 4 ° C. Otak dipindahkan ke 30% sukrosa dalam larutan PBS untuk krioproteksi. Bagian koronal (12 μm) dipotong pada mikrotom beku (Leica) dan kemudian diproses untuk imunohistokimia. Bagian otak kemudian permeabilisasi dalam 0.3% Triton X-100 dalam PBS selama 15 min dan dibilas dua kali dalam PBS. Bagian-bagian yang dipreinkubasi dalam serum kambing normal 10% dalam PBS untuk 1 h pada 37 ° C, terkena antibodi primer (diencerkan dalam 1% serum kambing normal dalam PBS) semalam pada 4 ° C, dan kemudian dibilas dengan PBS dan diinkubasi dengan sekunder antibodi untuk 1 h pada 37 ° C. Antibodi berikut digunakan: kelinci anti-pan-FosB (SC-48, 1: 500; Santa Cruz Biotechnology), mouse anti-NeuN (Chemicon), kelinci anti-GFP, FITC-konjugasi anti-kelinci IgG, dan rhodamine- IgG anti-mouse terkonjugasi (Probe Molekul). Untuk pelabelan rangkap tiga (ΔFosB, NeuN, dan GFP), bagian otak pertama-tama diimunisasi dengan antibodi anti-pan FosB dan anti-NeuN dan kemudian diinkubasi dengan antibodi sekunder (rhodamin-konjugasi anti-kelinci IgG dan cyan-conjugated anti-mouse IgG ). Bagian otak ganda diwarnai lebih lanjut untuk imunostaining GFP menggunakan teknologi pelabelan Zenon (Zenon Alexa Fluor 488, Molecular Probe). Antibodi anti-pan-FosB dinaikkan ke ujung N dari FosB dan mengenali ΔFosB dan FosB full-length (62). Berdasarkan penelitian sebelumnya yang menunjukkan bahwa osFosB tetapi bukan FosB atau antigen lain yang terkait dengan Fosil diekspresikan secara stabil setelah pengobatan kokain kronis, kami mengasumsikan bahwa peningkatan jangka panjang dalam immunoreaktivitas menunjukkan ekspresi stabil dari BFosB. Namun, identitas sinyal FosB imunoreaktif yang diamati pada tikus yang diberi saline tidak diketahui. Analisis statistik dalam Tabel 1 menggunakan milik Siswa t tes.

Analisis Tulang Belakang Dendritik.

MSN individu dalam NACC dipilih untuk analisis tulang belakang berdasarkan beberapa kriteria. (i) Ada sedikit atau tidak ada tumpang tindih dengan sel berlabel lain untuk memastikan bahwa proses dari sel yang berbeda tidak akan bingung. (ii) Setidaknya tiga dendrit primer perlu terlihat agar sel dapat digunakan untuk analisis. (iii) Dendrit distal (dendrit terminal atau dekat dendrit terminal) diperiksa. Dendrit dari kedua MSN di inti dan shell NAcc dianalisis. Meskipun kami mengamati MSN spinyely spined (spiny tipe II), kami hanya menganalisis MSN spinyely spined (spiny tipe I). Untuk menghitung kerapatan tulang belakang, panjang dendrit (panjang> 20 μm) dijiplak menggunakan mikroskop confocal (Zeiss LSM 510) dengan lensa minyak imersi (× 40). Semua gambar dendrit diambil dengan cara berbeda z level (interval kedalaman 0.5 – 1 μm) untuk memeriksa morfologi duri dendritik. Semua pengukuran dilakukan dengan perangkat lunak analisis gambar metamorf (Universal Imaging, Downingtown, PA). Analisis statistik menggunakan uji Kolmogorov-Smirnov.

Tonjolan dari dendrit diklasifikasikan ke dalam empat jenis berdasarkan panjangnya seperti yang dijelaskan dalam referensi. 63 dan 64. Tonjolan kelas 1, juga disebut tonjolan gemuk, panjangnya <0.5 μm, tidak memiliki kepala tulang belakang yang besar, dan tidak memiliki leher; kelas 2, atau duri berbentuk jamur, memiliki panjang antara 0.5 dan 1.25 μm dan ditandai dengan leher pendek dan kepala tulang belakang yang besar; kelas 3, atau duri tipis, berkisar antara 1.25 dan 3.0 μm dan memiliki leher tulang belakang yang memanjang dengan kepala kecil; kelas 4, atau ekstensi filopodial, adalah tonjolan panjang berserabut yang tidak memiliki kepala tulang belakang yang terlihat.

Ucapan Terima Kasih

Pekerjaan ini didukung oleh Hibah Layanan Kesehatan Masyarakat Amerika Serikat DA10044 (untuk PG dan ACN) dan oleh The Simons Foundation, Peter J. Sharp Foundation, Picower Foundation, dan FM Kirby Foundation.

Singkatan

  • NAcc
  • nukleus accumbens
  • MSN
  • neuron berduri ukuran sedang
  • BAC
  • kromosom buatan bakteri
  • Drd1
  • reseptor dopamin yang digerakkan oleh promotor D1
  • Drd2
  • reseptor dopamin yang digerakkan oleh promotor D2
  • DII
  • 1,1′-diotadecyl-3,3,3 ′, 3′-tetramethylindocarbocyanine perklorat
  • 2WD
  • 2 hari setelah perawatan obat terakhir
  • 30WD
  • 30 hari setelah perawatan obat terakhir.

Catatan kaki

 

Pernyataan benturan kepentingan: Tidak ada konflik yang dideklarasikan.

Referensi

1. Totterdell S., Smith ADJ Chem. Neuroanat. 1989; 2: 285 – 298. [PubMed]
2. Smith Y., Bevan MD, Shink E., Ilmu Syaraf Bolam JP. 1998; 86: 353 – 387. [PubMed]
3. Heikkila RE, Orlansky H., Cohen G. Biochem. Farmakol 1975; 24: 847 – 852. [PubMed]
4. Ritz MC, Lamb RJ, Goldberg SR, Kuhar MJ Science. 1987; 237: 1219 – 1223. [PubMed]
5. Nestler EJ Trends Pharmacol. Sci. 2004; 25: 210 – 218. [PubMed]
6. Kalivas PW, Stewart J. Brain Res. Pdt. 1991; 16: 223 – 244. [PubMed]
7. Pierce RC, Kalivas PW Brain Res. Pdt. 1997; 25: 192 – 216. [PubMed]
8. Robinson TE, Berridge KC Annu. Pendeta Psychol. 2003; 54: 25 – 53. [PubMed]
9. Serigala ME, Khansa MR Brain Res. 1991; 562: 164 – 168. [PubMed]
10. Vanderschuren LJ, Kalivas PW Psychopharmacology. 2000; 151: 99 – 120. [PubMed]
11. Sesack SR, Pickel VMJ Comp. Neurol. 1992; 320: 145 – 160. [PubMed]
12. Smith AD, Bolam JP Trends Neurosci. 1990; 13: 259 – 265. [PubMed]
13. Sibley DR, Monsma FJ, Jr. Tren Pharmacol. Sci. 1992; 13: 61 – 69. [PubMed]
14. Beckstead RM, Cruz CJ Neuroscience. 1986; 19: 147 – 158. [PubMed]
16. Gerfen CR, Young WS, III Brain Res. 1988; 460: 161 – 167. [PubMed]
16. Gerfen CR Trends Neurosci. 2000; 23: S64 – S70. [PubMed]
17. Gerfen CR, Engber TM, Mahan LC, Susel Z., Chase TN, Monsma FJ, Jr, Sibley DR Science. 1990; 250: 1429 – 1432. [PubMed]
18. Zahm DS Neurosci. Biobehav. Pdt. 2000; 24: 85 – 105. [PubMed]
19. Lu X.-Y., Ghasemzadeh MB, Kalivas PW Neuroscience. 1998; 82: 767 – 780. [PubMed]
20. Koob GF, Le HT, Creese I. Neurosci. Lett. 1987; 79: 315 – 320. [PubMed]
21. Woolverton WL, Virus RM Pharmacol. Biokem. Behav. 1989; 32: 691 – 697. [PubMed]
22. Bergman J., Kamien JB, Spealman RD Behav. Farmakol 1990; 1: 355 – 363. [PubMed]
23. Epping-Jordan MP, Markou A., Koob GF Brain Res. 1998; 784: 105 – 115. [PubMed]
24. Caine SB, Negus SS, Mello NK, Bergman JJ Pharmacol. Exp. Ada 1999; 291: 353 – 360. [PubMed]
25. De Vries TJ, Cools AR, Shippenberg TS NeuroReport. 1998; 9: 1763 – 1768. [PubMed]
26. DW Sendiri, Barnhart WJ, Lehman DA, Nestler EJ Science. 1996; 271: 1586 – 1589. [PubMed]
27. TV Khroyan, Barrett-Larimore RL, Rowlett JK, Spealman RDJ Pharmacol. Exp. Ada 2000; 294: 680 – 687. [PubMed]
28. Alleweireldt AT, Weber SM, Kirschner KF, Bullock BL, Neisewander JL Psychopharmacology. 2002; 159: 284 – 293. [PubMed]
29. Nestler EJ Nat. Rev. Neurosci. 2001; 2: 119 – 128. [PubMed]
30. Robinson TE, Kolb B. Neuropharmacology. 2004; 47: 33 – 46. [PubMed]
31. Kalivas PW Curr. Opin. Farmakol 2004; 4: 23 – 29. [PubMed]
32. Hyman SE, Malenka RC Nat. Rev. Neurosci. 2001; 2: 695 – 703. [PubMed]
33. Robinson TE, Kolb BJ Neurosci. 1997; 17: 8491 – 8497. [PubMed]
34. Robinson TE, Kolb B. Eur. J. Neurosci. 1999; 11: 1598 – 1604. [PubMed]
35. Li Y., Kolb B., Robinson TE Neuropsychopharmacology. 2003; 28: 1082 – 1085. [PubMed]
36. Gong S., Zheng C., ML Doughty, Losos K., Didkovsky N., Schambra UB, Nowak NJ, Joyner A., ​​Leblanc G., Hatten ME, et al. Alam. 2003; 425: 917 – 925. [PubMed]
37. Zhou FM, Wilson CJ, Dani JAJ Neurobiol. 2002; 53: 590 – 605. [PubMed]
38. Grutzendler J., Tsai J., Metode Gan WB. 2003; 30: 79 – 85. [PubMed]
39. MB Kelz, Chen J., Carlezon WA, Jr, Whisler K., Gilden L., Beckmann AM, Steffen C., Zhang YJ, Marotti L., Self DW, et al. Alam. 1999; 401: 272 – 276. [PubMed]
40. Nestler EJ Neuropharmacology. 2004; 47: 24 – 32. [PubMed]
41. Le Moine C., Bloch BJ Comp. Neurol. 1995; 355: 418 – 426. [PubMed]
42. Surmeier DJ, Song WJ, Yan ZJ Neurosci. 1996; 16: 6579 – 6591. [PubMed]
43. Nye HE, Hope BT, Kelz MB, Iadarola M., Nestler EJJ Pharmacol. Exp. Ada 1995; 275: 1671 – 1680. [PubMed]
44. Gerfen CR, Keefe KA, Gauda EBJ Neurosci. 1995; 15: 8167 – 8176. [PubMed]
45. Moratalla R., Elibol B., Vallejo M., Graybiel AM Neuron. 1996; 17: 147 – 156. [PubMed]
46. Badiani A., MM Oates, Hari HE, Watson SJ, Akil H., Robinson TE Behav. Otak. Res. 1999; 103: 203 – 209. [PubMed]
47. Uslaner J., Badiani A., Norton CS, Hari HE, Watson SJ, Akil H., Robinson TE Eur. J. Neurosci. 2001; 13: 1977 – 1983. [PubMed]
48. Huff RM, Chio CL, Lajiness ME, Goodman LV Adv. Farmakol 1998; 42: 454 – 457. [PubMed]
49. Zachariou V., Sgambato-Faure V., Sasaki T., P. Svenningsson, Berton O., Fienberg AA, AC Nairn, Greengard P., Nestler EJ Neuropsychopharmacology. 2005 Agustus 3; 10.1038 / sj.npp.1300832.
50. McClung CA, Nestler EJ Nat. Neurosci. 2003; 6: 1208 – 1215. [PubMed]
51. Norrholm SD, Bibb JA, Nestler EJ, Ouimet CC, Taylor JR, Greengard P. Neuroscience. 2003; 116: 19 – 22. [PubMed]
52. Bibb JA, Chen J., Taylor JR, Svenningsson P., Nishi A., Snyder GL, Yan Z., Sagawa ZK, Ouimet CC, Nairn AC, dkk. Alam. 2001; 410: 376 – 380. [PubMed]
53. Nikolic M., Chou MM, Lu W., Mayer BJ, Tsai LH Nature. 1998; 395: 194 – 198. [PubMed]
54. Kesavapany S., Lau KF, McLoughlin DM, Brownlees J., Ackerley S., Leigh PN, Shaw CE, Miller CC Eur. J. Neurosci. 2001; 13: 241 – 247. [PubMed]
55. Morabito MA, Sheng M., Tsai LHJ Neurosci. 2004; 24: 865 – 876. [PubMed]
56. Futter M., Uematsu K., Bullock SA, Kim Y., Hemmings HC, Jr., Nishi A., Greengard P., Nairn AC Proc. Natl. Acad. Sci. AMERIKA SERIKAT. 2005; 102: 3489 – 3494. [Artikel gratis PMC] [PubMed]
57. Hayashi ML, Choi SY, Rao BS, Jung HY, Lee HK, Zhang D., Chattarji S., Kirkwood A., Tonegawa S. Neuron. 2004; 42: 773 – 787. [PubMed]
58. Murase S., Mosser E., Schuman EM Neuron. 2002; 35: 91 – 105. [PubMed]
59. Prange O., Murphy THJ Neurosci. 2001; 21: 9325 – 9333. [PubMed]
60. Feng J., Yan Z., Ferreira A., Tomizawa K., Liauw JA, Zhuo M., Allen PB, Ouimet CC, Greengard P. Proc. Natl. Acad. Sci. AMERIKA SERIKAT. 2000; 97: 9287 – 9292. [Artikel gratis PMC] [PubMed]
61. Li Y., Acerbo MJ, Robinson TE Eur. J. Neurosci. 2004; 20: 1647 – 1654. [PubMed]
62. Perrotti LI, Bolanos CA, Choi KH, Russo SJ, Edwards S., PG Ulery, DL Wallace, DW Sendiri, Nestler EJ, Barrot M. Eur. J. Neurosci. 2005; 21: 2817 – 2824. [PubMed]
63. Harris KM, Jensen FE, Tsao BJ Neurosci. 1992; 12: 2685 – 2705. [PubMed]
64. Vanderklish PW, Edelman GM Proc. Natl. Acad. Sci. AMERIKA SERIKAT. 2002; 99: 1639 – 1644. [Artikel gratis PMC] [PubMed]