(MANUSIA) Respons Perilaku dan Struktural terhadap Kokain Kronis Membutuhkan Lingkaran Pemberian Umpan Balik ke Depan ΔFosB dan Protein Kinase II yang Tergantung Kalsium / Calmodulin-bergantung pada Nucleus Accumbens Shell (2013)

Faktor transkripsi ΔFosB dan kalsium kinase II (CaMKIIα) yang diperkaya kalsium / kaldu yang diperkaya otak diinduksi dalam nucleus accumbens (NAc) melalui paparan kronis pada kokain atau obat pelecehan psikostimulan lain, di mana kedua protein memediasi respons obat yang peka. . Meskipun ΔFosB dan CaMKIIα keduanya mengatur ekspresi dan fungsi reseptor AMPA glutamat dalam NAc, pembentukan tulang belakang dendritik pada neuron berduri medium NAc (MSNs), dan sensitisasi lokomotor terhadap kokain, hingga saat ini belum ada hubungan langsung antara molekul-molekul ini yang dieksplorasi. Di sini, kami menunjukkan bahwa osFosB difosforilasi oleh CaMKIIα pada Ser27 penstabil protein dan bahwa CaMKII adalah diperlukan untuk akumulasi aineFosB yang dimediasi kokain dalam NAc tikus.

Sebaliknya, kami menunjukkan bahwa osFosB diperlukan dan cukup untuk induksi kokain ekspresi gen CaMKIIα in vivo, efek selektif untuk D₁-jenis MSN di subkelompok shell NAc.

Selain itu, induksi duri dendritik pada MSN MSC dan peningkatan respons perilaku terhadap kokain setelah ekspresi berlebih NAF terhadap BFosB keduanya bergantung pada CaMKII.

Yang penting, kami menunjukkan untuk pertama kalinya induksi timeFosB dan CaMKII di NAc of pecandu kokain manusia, menyarankan target yang mungkin untuk intervensi terapeutik di masa depan. Data ini menetapkan bahwa osFosB dan CaMKII terlibat dalam loop umpan-maju positif tipe sel dan wilayah spesifik otak sebagai mekanisme kunci untuk mengatur sirkuit hadiah otak sebagai respons terhadap kokain kronis.

Pengantar

Semakin banyak bukti mendukung pandangan bahwa perubahan ekspresi gen berkontribusi pada mekanisme kecanduan obat (Robison dan Nestler, 2011). Salah satu mediator penting dari perubahan ini adalah ΔFosB, faktor transkripsi keluarga Fos (Nestler, 2008). Administrasi kronis dari hampir semua penyalahgunaan obat menginduksi akumulasi ΔFosB dalam nukleus accumbens (NAc) yang tahan lama, suatu daerah limbik yang penting untuk perilaku hadiah. SInduksi semacam itu tampak spesifik pada kelas neuron spiny media NAc (MSN) yang mengekspresikan reseptor dopamin D1. Ekspresi berlebih ΔFosB yang dapat diinduksi dalam MSN MSC tipe D1 ini meningkatkan lokomotor dan respons yang memuaskan terhadap kokain dan morfin (Kelz et al., 1999; Zachariou et al., 2006), termasuk peningkatan pemberian sendiri kokain (Colby et al., 2003). Lebih lanjut, blokade genetik atau virus dari aktivitas transkrip ΔFB mengurangi efek yang menguntungkan dari obat-obatan ini (Zachariou et al., 2006), menunjukkan bahwa induksi berkelanjutan ΔFosB ini adalah mediator penting dari perubahan yang berlangsung yang diinduksi dalam NAc oleh pemberian obat kronis.

Stabilitas ΔFosB yang tidak biasa (relatif terhadap semua protein keluarga Fos lainnya) merupakan properti intrinsik dari molekul, karena pemotongan domain degron yang terdapat pada FosB full-length (Carle et al., 2007), dan proses yang diatur. OsFosB difosforilasi in vitro dan in vivo di Ser27, dan reaksi ini selanjutnya menstabilkan ΔFosB, ~ 10-fold, dalam kultur sel dan NAc in vivo (Ulery-Reynolds et al., 2009). Meskipun Ser27-ΔFosB telah terbukti menjadi substrat untuk casein kinase-2 in vitro (Ulery et al., 2006), mekanismenya in vivo fosforilasi masih belum diketahui.

Protein kinase II yang tergantung kalsium / kalmodulin (CaMKII) adalah serin / treonin kinase yang sangat diekspresikan dengan α dan β isoform membentuk homo dodekamerik homo- dan hetero-holoenzim in vivo, dan sangat penting untuk berbagai bentuk neuroplastisitas (Lisman et al., 2002; Colbran dan Brown, 2004). CaMKIIα diinduksi secara selektif dalam cangkang NAc oleh amfetamin kronis (Loweth et al., 2010), dan blokade farmakologis dari aktivitas CaMKII dalam cangkang NAc mengurangi kepekaan perilaku terhadap amfetamin (Loweth et al., 2008) dan kokain (Pierce et al., 1998), sementara ekspresi berlebih virus dari CaMKIIα di sub regional NAc ini meningkatkan kepekaan terhadap alat gerak dan pemberian amfetamin secara mandiri (Loweth et al., 2010). CaMKIIα dapat mempengaruhi perilaku hadiah melalui modulasi subunit reseptor glutamat AMPA (Pierce et al., 1998), karena aktivitas CaMKIIα telah lama dikaitkan dengan fungsi reseptor AMPA dan penargetan sinaptik dalam beberapa bentuk neuroplastisitas (Malinow dan Malenka, 2002).

Literatur ini menunjukkan beberapa persamaan antara osFosB dan CaMKII: keduanya diperlukan dan cukup untuk beberapa efek perilaku obat pelecehan, keduanya mengatur duri dendritik dalam berbagai jenis sel neuron. in vivo (Jourdain et al., 2003; Maze et al., 2010), dan keduanya mengerahkan setidaknya beberapa efek perilaku mereka melalui modulasi reseptor AMPA (Kelz et al., 1999; Malinow dan Malenka, 2002; Vialou et al., 2010). Meskipun paralel ini, tidak ada hubungan fungsional antara ΔFosB dan CaMKII yang diketahui. Di sini, kami menetapkan regulasi timbal balik antara osFosB dan CaMKII, dan menunjukkan bahwa kedua protein tersebut membentuk loop umpan maju MSN khusus tipe D1 dalam cangkang NAc yang diinduksi oleh kokain dan mengatur berbagai respons kokain. in vivo.

Pergi ke:

Bahan dan Metode

Eksperimen 1: Analisis Proteom iTRAQ dari Shell NAC dan Core Setelah Perawatan Kokain (Gambar 1A)

Tikus jantan dewasa (8 minggu) diberikan 20 mg / kg kokain atau IP saline vehicle sekali sehari selama tujuh hari. 24 jam setelah injeksi terakhir, cangkang NAc dan inti mikrodiseksi (Gambar 1A) dan flash beku. Analisis iTRAQ dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya (Ross et al., 2004; Davalos et al., 2010).

Gambar 1

Induksi spesifik CaMKII dalam NAc oleh kokain

Eksperimen 2: Mengkuantifikasi Perubahan Protein pada Inti NAc Tikus dan Shell Setelah Perawatan KokainGambar 1B – D)

Tikus jantan dewasa (8 minggu) diberikan 10 mg / kg kokain atau IP saline vehicle sekali sehari selama tujuh hari di ruang rekaman lokomotor. Respons lokomotor terhadap injeksi kokain tunggal (5 mg / kg IP) dicatat pada hewan yang sebelumnya diobati dengan kokain (disebut "kronis") dan sebagian dari mereka yang diobati dengan saline (disebut "akut"), dan respons lokomotor terhadap saline. sendiri tercatat pada sisa hewan yang diberi saline kronis (disebut “saline”). Uji aktivitas alat gerak dilakukan seperti yang dijelaskan (Hiroi et al., 1997). Secara singkat, tikus jantan dewasa ditempatkan di 18 ”× 24” PAS kotak rekaman lapangan terbuka (San Diego Instruments) untuk 30 min untuk digunakan, diberi injeksi IP saline tunggal dan dipantau untuk 30 min tambahan, dan diberi injeksi IP tunggal 5 mg / kg kokain dan dimonitor selama 30 min.

24 jam setelah injeksi akhir ini, tikus dipenggal kepalanya tanpa anestesi untuk menghindari efek anestesi pada tingkat protein neuron dan keadaan fosfo. Otak diiris secara seri dalam matriks 1.2 mm (Braintree Scientific) dan jaringan target dihilangkan dalam fosfat yang mengandung saline yang mengandung protease (Roche) dan inhibitor fosfatase (Sigma Aldrich) menggunakan punch gauge 14 untuk core NAc dan pukulan gauge 12 dari yang tersisa. jaringan untuk cangkang NAc (Lihat Gambar 1A) dan segera dibekukan di atas es kering. Sampel dihomogenisasi dengan sonikasi cahaya dalam buffer RIPA yang dimodifikasi: 10 mM Tris base, 150 mM natrium klorida, 1 mM EDTA, 0.1% natrium dodecyl sulfate, 1% Triton X-100, 1% sodium deoxycholate, pH 7.4% sodium deoxycholate, pH dan inhibitor, protease seperti di atas. Setelah penambahan buffer Laemmli, protein dipisahkan pada 4-15% gel gradien polyacrylamaide (Criterion System, BioRad), dan Western blotting dilakukan menggunakan sistem Odyssey (Li-Cor) sesuai dengan protokol pabrikan.

Eksperimen 3: Mengkuantifikasi Perubahan Protein pada Inti NAc Tikus dan Shell Setelah Penarikan Kokain (Gambar 1E)

Tikus jantan dewasa (8 minggu) diberikan 10 mg / kg kokain atau IP saline vehicle sekali sehari selama tujuh hari. 14 hari setelah injeksi terakhir, hewan yang diberi saline diberi suntikan saline lain (disebut "saline), dan hewan yang diberi kokain diberi suntikan saline lain (disebut penarikan 14 hari atau" 14d WD ") atau injeksi kokain tunggal ( disebut "14d WD Chal" untuk tantangan). Satu jam setelah injeksi terakhir, hewan dipenggal dan Western blotting dilakukan seperti pada percobaan 2.

Eksperimen 4: Mengkuantifikasi Perubahan Protein pada Inti dan Shell NAc Tikus Setelah Swa-Administrasi Kokain (Gambar 2A – C)

Tikus dilatih untuk mengelola sendiri 0.5 mg / kg / infus kokain dalam sesi satu jam di bawah jadwal 1 rasio tetap selama sembilan hari. Setelah sembilan sesi awal, tikus dibagi menjadi dua kelompok diimbangi dengan asupan kokain pada dua sesi terakhir. Satu kelompok tikus diizinkan untuk mengatur sendiri kokain (0.5 mg / kg / infus) dalam sesi satu jam (akses singkat, SHA) sementara kelompok tikus lainnya menggunakan kokain secara mandiri dalam sesi enam jam (akses panjang, LgA ) selama sepuluh hari tambahan (sesi eskalasi).

Bagian otak diproses untuk imunohistokimia seperti yang dijelaskan (Perrotti et al., 2004). Otak difusi 18-24 jam setelah pajanan terakhir terhadap obat, mengakibatkan degradasi sisa protein FosB sepanjang sehingga sisa immunoreactivity mencerminkan ΔFosB. Degradasi ini dikonfirmasi oleh Western blotting, yang menunjukkan tidak ada pewarnaan signifikan dengan antibodi yang diarahkan terhadap terminal C dari panjang-penuh FosB yang tidak mengenali osFosB (data tidak ditunjukkan). Setelah mengiris menjadi bagian 35 µm, jumlah sel opFosB imunopositif dikuantifikasi oleh pengamat yang dibutakan dalam dua bagian melalui NAc masing-masing tikus, dan nilai rata-rata per bidang 40 × kemudian dihitung berdasarkan wilayah untuk masing-masing hewan. Setiap hewan dianggap sebagai pengamatan individu untuk analisis statistik. Wilayah yang menarik diidentifikasi menggunakan Paxinos dan Watson (Paxinos dan Watson, 2007).

Kuantifikasi imunoreaktivitas CaMKIIα dilakukan dengan menggunakan sistem Licor seperti yang dijelaskan (Covington et al., 2009). Intensitas terintegrasi CaMKII dan GAPDH ditentukan dengan perangkat lunak Odyssey. Hasilnya disajikan sebagai nilai intensitas terintegrasi per mm² dan disajikan sebagai sarana ± sem (n = 4 – 10 per grup). Nilai untuk GAPDH digunakan sebagai referensi untuk menormalkan intensitas CaMKII untuk ketebalan dan kondisi irisan.

Gambar 2

Induksi CaMKII dalam cangkang NAC tikus yang mengatur sendiri dan pecandu kokain manusia

Eksperimen 5: Mengukur Tingkat Protein pada Manusia yang Tergantung pada Kokain (Gambar 2D)

Prosedur

Jaringan otak manusia postmortem diperoleh dari Quebec Suicide Brain Bank (Institut Universitas Kesehatan Mental Douglas, Montreal, Quebec, Kanada). Pelestarian jaringan berjalan pada dasarnya seperti yang dijelaskan (Quirion et al., 1987). Secara singkat, setelah diekstraksi, otak diletakkan di atas es basah dalam kotak Styrofoam dan dilarikan ke fasilitas Bank Bunuh Diri Otak Quebec. Belahan segera dipisahkan oleh potongan sagital di tengah otak, batang otak, dan otak kecil. Pembuluh darah, kelenjar pineal, pleksus koroid, setengah otak kecil, dan setengah batang otak biasanya dibedah dari belahan kiri yang kemudian dipotong secara koronal menjadi irisan setebal 1 setebal cm sebelum pembekuan. Setengah otak kecil yang terakhir dipotong secara sagital menjadi irisan setebal 1cm sebelum dibekukan. Jaringan flash dibekukan dalam 2-methylbutane pada −40 ° C selama ~ 60 dtk. Semua jaringan beku disimpan secara terpisah dalam kantong plastik di −80 ° C untuk penyimpanan jangka panjang. Daerah otak tertentu dibedah dari irisan koron beku pada pelat baja stainless dengan es kering di sekelilingnya untuk mengendalikan suhu lingkungan. Western blotting dilakukan seperti yang dijelaskan pada percobaan 2.

Kelompok

Kohort terdiri dari subjek 37 pria dan wanita 3, berkisar usia antara 15-66 tahun. Semua subjek meninggal secara tiba-tiba tanpa keadaan nyeri yang berkepanjangan atau penyakit medis yang berkepanjangan. Dalam setiap kasus, penyebab kematian dipastikan oleh kantor Pemeriksa Quebec, dan pemeriksaan toksikologis dilakukan dengan sampel jaringan untuk mendapatkan informasi tentang pengobatan dan penggunaan zat terlarang pada saat kematian. Kelompok subjek terdiri dari individu 20 yang memenuhi kriteria SCID-I untuk ketergantungan kokain. Kelompok kontrol terdiri dari subjek 20 tanpa riwayat ketergantungan kokain dan tidak ada diagnosa psikiatris utama. Semua subjek mati mendadak karena sebab yang tidak memiliki pengaruh langsung pada jaringan otak. Kelompok dicocokkan dengan usia subjek rata-rata, penundaan pendinginan, dan pH. Untuk semua subjek, otopsi psikologis dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya (Dumais et al., 2005), memungkinkan kita untuk memiliki akses ke informasi kasus terperinci tentang riwayat psikiatris dan medis, serta data klinis dan sosiodemografi lainnya yang relevan. Singkatnya, pewawancara terlatih melakukan Wawancara Klinis Terstruktur untuk DSM-IV Psychiatric Disorders (SCID-I) dengan satu atau lebih informan dari almarhum. Panel dokter meninjau penilaian SCID-I, laporan kasus, catatan koroner, dan catatan medis untuk mendapatkan diagnosis psikiatrik konsensus.

Eksperimen 6: Chromatin Immunoprec presipitasi untuk NAc Tikus (Gambar 3A – C)

Tikus jantan dewasa (8 minggu) diberikan 10 mg / kg kokain atau IP saline vehicle sekali sehari selama tujuh hari. 24 jam setelah injeksi terakhir, cangkang NAc dan inti mikrodiseksi. Chromatin imunopresipitasi (ChIP) dilakukan pooling pukulan bilateral NAc shell atau inti dari tujuh tikus per kelompok dalam kelompok total 14 (total hewan 98, kolam kokain 7, kolam saline 7, kolam saline 80) Jaringan dihubungkan silang, dicuci, dan disimpan pada suhu −280 ° C hingga geser kromatin melalui sonikasi. Kromatin yang dicukur diinkubasi semalaman dengan antibodi yang sebelumnya terikat dengan manik-manik magnetik (Dynabeads M-1, Invitrogen). IgG non-imun digunakan sebagai kontrol. Setelah membalikkan hubungan silang dan pemurnian DNA, qPCR digunakan untuk mengukur kadar DNA promoter CaMKIIα. Primer dirancang untuk memperkuat wilayah yang berisi urutan konsensus AP-450 yang terletak ~ XNUMX bp sebelum situs awal transkripsi (Teruskan: ACTGACTCAGGAAGAGGGATA; Balik: TGTGCTCCTCAGAATCCACAA).

Gambar 3

Induksi MFosB tipe-spesifik-wilayah dan spesifik CaMKIIα in vivo

Eksperimen 7: Mengukur Transkrip CaMKII dan Ekspresi Protein dengan Jenis Sel-Spesifik ΔFosB Overexpression (Gambar 3D)

Tikus bitransgenik jantan berasal dari NSE-tTA (baris A) × TetOp-ΔfosB (baris 11) dan NSE-tTA (baris B) × TetOp-FLAG-ΔfosB (baris 11) tikus (Chen et al., 1998; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002; Zachariou et al., 2006) dikandung dan dibesarkan pada 100 µg / ml doksisiklin untuk menekan ΔFosB ekspresi selama pengembangan. Littermate dibagi saat menyapih: separuh tetap menggunakan doksisiklin dan separuhnya beralih ke air, dan hewan-hewan tersebut digunakan 8 hingga 11 beberapa minggu kemudian ketika efek transkripsi ΔFosB maksimal (Kelz et al., 1999; McClung dan Nestler, 2003). Untuk analisis transkripsi, tikus dipenggal dengan cepat, dan otak dihilangkan dan diletakkan di atas es. Diseksi NAc diambil dengan tusukan jarum pengukur 14 dan dengan cepat dibekukan di atas es kering sampai RNA diekstraksi. Isolasi RNA, qPCR, dan analisis data dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya (LaPlant et al., 2009). Secara singkat, RNA diisolasi dengan reagen TriZol (Invitrogen), selanjutnya dimurnikan dengan kit mikro RNAeasy dari Qiagen, dan diperiksa kualitasnya dengan Bioanalyzer Agilent. Transkripsi terbalik dilakukan menggunakan iScript (BioRad). qPCR dilakukan dengan sistem PCR 7900HT RT PCR Terapan dengan parameter siklus berikut: 10 menit pada 95 ° C; 40 siklus 95 ° C untuk 1 min, 60 ° C untuk 30 dtk, 72 ° C untuk 30 dtk; pemanasan bertingkat ke 95 ° C untuk menghasilkan kurva disosiasi untuk konfirmasi produk PCR tunggal. Analisis imunohistokimia ekspresi protein ΔFosB dan CaMKIIα dilakukan seperti yang dijelaskan dalam percobaan 4.

Eksperimen 8: Efek Antagonis Reseptor Dopamin D1 dan D2 Intra-NAc pada Perubahan Protein Mediasi Kokain (Gambar 3H)

Tikus jantan dewasa (minggu 8) diberikan 10 mg / kg kokain atau kendaraan saline (kelompok "kendaraan") IP satu kali per hari selama tujuh hari. 30 min sebelum setiap injeksi kokain, tikus diberikan IP baik antagonis reseptor D1 SCH 23390 (0.5 mg / kg, kelompok "Ant D1"), atau antagonis reseptor antagonis D2 eticlopride (0.5 mg / kg, "Ant" D2 Ant) , atau injeksi kontrol saline (kelompok "kokain"). 24 jam setelah injeksi terakhir, hewan dipenggal dan protein dikuantifikasi oleh Western blotting sesuai percobaan 2.

Eksperimen 9: Pengaruh AAV-Mediated ΔFosB Overexpression pada Ekspresi Protein (Gambar 4 A – C)

Pembedahan stereotoksik dilakukan pada tikus jantan dewasa (minggu 8) untuk menyuntikkan AAV-GFP (protein fluoresen hijau) atau AAV-GFP-ΔFosB (Maze et al., 2010). Jarum pengukur 33 (Hamilton) digunakan untuk semua operasi, di mana 0.5 μl virus titer tinggi yang dimurnikan diinfusikan secara bilateral selama periode min 5, diikuti oleh periode istirahat tambahan pasca-infus 5 tambahan. Semua jarak diukur relatif terhadap Bregma: sudut 10 °, AP = + 1.7 mm, Lat = 2.5 mm, DV = −6.7 mm. 14 hari setelah operasi, hewan diberi suntikan IP tunggal 10 mg / kg kokain di ruang pemantauan lokomotor untuk menilai efek perilaku dari ΔFosB berlebih. 24 jam setelah injeksi akhir ini, tikus dipenggal sesuai percobaan 2, dan mikrodiseksi jaringan dilakukan di bawah bimbingan mikroskopis fluoresensi untuk mendapatkan jaringan NAc-positif GFP. Western blotting kemudian dilakukan sesuai Eksperimen 2.

Gambar 4

OsFosB diperlukan dan cukup untuk induksi CaMKIIα yang bergantung pada reseptor-D1 yang dimediasi dalam cangkang NAc

Eksperimen 10: Efek Overekspresi unJunD yang Dimediasi-AAV pada Ekspresi Protein Bergantung pada Kokain (Gambar 4 D – F)

Injeksi Stereotaxic AAV-GFP atau AAV-GFP-ΔJunD dilakukan sesuai Eksperimen 8. 14 hari setelah operasi, hewan diberikan 10 mg / kg kokain atau IP saline setiap hari selama tujuh hari di ruang rekaman lokomotor. Respons lokomotor terhadap injeksi tunggal kokain (5 mg / kg IP) atau saline dicatat. 24 jam setelah injeksi akhir ini, tikus dipenggal, jaringan dipanen, dan Western blots dilakukan seperti pada Eksperimen 9.

11 percobaan: In Vitro Uji Protein Kinase (Gambar 5A – D)

CaMKIIα dan ΔFB B rekombinan dimurnikan dari sel serangga (Brickey et al., 1990; Jorissen et al., 2007), dan uji protein kinase dilakukan (Colbran, 1993), seperti yang dijelaskan sebelumnya. Secara singkat, CaMKII dipreinkubasi di atas es dengan 2.5 µM ​​(atau konsentrasi yang ditunjukkan) ΔFosB, 1 mM Ca²⁺, 40 mM Mg²⁺, 15 µM ​​calmodulin, dan 200 mM HEPES pH 7.5. Fosforilasi dimulai dengan penambahan 200 µM ​​ATP dengan atau tanpa [γ-³²P] ATP dan diizinkan untuk melanjutkan selama 10 min pada suhu kamar (Gambar 5A & B) atau 2 min di atas es (Gambar 5C & D). Produk diselesaikan dengan Western blotting (Gambar 5A & B) atau dengan autoradiogram dan penghitungan kilau (Gambar B – D).

Gambar 5

ΔFosB adalah substrat kuat untuk CaMKIIα

Eksperimen 12: Identifikasi Ser27 ΔFosB Fosforilasi (Gambar 5E)

Secara in vitro tes kinase dilakukan sesuai percobaan 11, protein dipisahkan oleh SDS-PAGE, dan pita yang sesuai dengan toFosB dipotong dan dikenakan spektrometri massa tandem. Penugasan m / z dari fragmen ion yang sesuai di semua panel diberi label di atas puncak ion. Tidak semua ion fragmen diberi label karena keterbatasan ruang. Secara umum, teks untuk label ion fragmen berwarna hitam kecuali ketika mereka secara langsung mengkonfirmasi atau menambahkan bukti keberadaan situs fosforilasi yang menarik, dalam hal ini mereka ditandai dengan warna merah. Bukti untuk produk fragmentasi tulang punggung disajikan dalam urutan pembacaan fosfopeptida dengan situs terdeteksi residu fosforilasi ditunjukkan dalam warna merah dengan penunjukan huruf asam amino tunggal. Deskripsi numerik dari ion fragmen yang diamati juga ditandai pada urutan peptida sebagai ion b dan y. Faktor zoom untuk bagian sumbu m / z untuk menunjukkan ion fragmen intensitas rendah ditandai di bagian atas setiap spektrum massa fragmen. Ion fragmen yang ditunjukkan pada panel H mengkonfirmasi keberadaan Ser27 isoform terfosforilasi, namun, dalam campuran isoform terfosforilasi lainnya di situs Ser28, Ser31, Ser34, dan Thr37. Kehadiran ion pa5, pa5-P, pb5, dan pb5-P secara unik mengkonfirmasi fosforilasi residu Ser27.

Eksperimen 13: Kuantifikasi Ser27 fosforilasi (Gambar 5F)

Peptida standar dirancang meniru bentuk SeroNUMX XFosB fosfo dan non-fosfat. Setelah sintesis dan pemurnian, masing-masing peptida idiotipik “berat” dilarutkan dalam buffer asetonitril 27 / 50 / air dan dikirim untuk analisis asam amino untuk menentukan konsentrasi absolut pada larutan stok peptida sintetis. Setiap peptida "berat" kemudian secara langsung dimasukkan ke dalam spektrometer massa 50 QTRAP (MS) untuk menentukan energi tumbukan terbaik untuk fragmentasi MS / MS dan dua hingga empat transisi MRM. Selanjutnya, peptida “berat” yang rapi menjadi sasaran LCMS pada 4000 QTRAP untuk memastikan pemisahan peptida. Instrumen dijalankan dalam mode triple quadrupole, dengan Q4000 ditetapkan pada nilai m / z prekursor spesifik (Q1 tidak memindai), dan Q1 diatur ke nilai m / z spesifik yang sesuai dengan fragmen spesifik peptida itu. Dalam mode MRM, serangkaian reaksi tunggal (transisi ion prekursor / fragmen di mana energi tumbukan disetel untuk mengoptimalkan intensitas ion fragmen yang menarik) diukur secara berurutan, dan siklus (biasanya 3-1 dtk) dilingkarkan di seluruh sepanjang waktu pemisahan HPLC. Transisi MRM ditentukan dari spektrum MS / MS dari peptida yang ada. Dua transisi per peptida, yang sesuai dengan ion fragmen intensitas tinggi, kemudian dipilih dan energi tumbukan dioptimalkan untuk memaksimalkan kekuatan sinyal transisi MRM menggunakan perangkat lunak otomasi. Puncak yang dihasilkan dari peptida standar dan sampel BFosB yang terpapar CaMKII atau kontrol kemudian dibandingkan untuk menentukan kelimpahan absolut dari setiap bentuk peptida dalam reaksi. Analisis data pada data LC-MRM dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak AB Multiquant 2.

Eksperimen 14: Induksi ΔFosB pada Tikus Overekspress CaMKII (Gambar 5G & H.)

Tikus transgenik mengekspresikan T286D CaMKII secara berlebihan (Mayford et al., 1996; Kourrich et al., 2012) dan tipe littermates liar dibesarkan tanpa adanya doksisiklin untuk memungkinkan ekspresi transgen. Tikus dewasa diberikan 20 mg / kg kokain atau saline IP satu kali sehari selama 14 hari. 24 jam setelah injeksi akhir, hewan dipenggal dan imunohistokimia dan kuantifikasi ekspresi osFosB dilakukan seperti pada percobaan 4.

Eksperimen 15: Efek HSV-Mediated ΔFosB Overexpression dan CaMKII Inhibition pada Duri Dendritik NAc (Gambar 6A – E)

Tikus jantan dewasa (8 minggu) disuntikkan secara stereotoksik dalam NAc dengan HSV-GFP, HSV-GFP-ΔFosB (Olausson et al., 2006), HSV-GFPAC3I, atau HSV-GFPAC3I-ΔFosB. Dalam konstruksi ini, AC3I, penghambat aktivitas CaMKII berbasis peptida, dipadukan ke terminal-C dari GFP. GFPAC3I dikloning oleh PCR menggunakan pMM400-vektor yang berisi GFPAC3I sebagai templat dengan primer berikut: GFP-AC3I-F: 5 'CC GCTAGC GCCGCCACC ATGGTGAGCAAGGGCGAGNGAMAK GFP-AC3I-R: 3 'CC TCCGGA TTACAGGCAGTCCACGGCCT 5' (clampBspEIstop). Produk PCR yang dihasilkan dimasukkan ke dalam vektor FosB p3 + dan p1005 + -Δ menggunakan situs NheI dan BspEI. Konstruksinya divalidasi oleh pengurutan. Koordinat stereotoksik adalah: 1005 ° sudut, AP = + 10 mm, Lat = + 1.6 mm, DV = −1.5 mm (Barrot et al., 4.4). Perfusi dan pembelahan otak dilakukan sesuai percobaan 4.

Analisis tulang belakang dilakukan seperti yang dijelaskan (Christoffel et al., 2011). Secara singkat, segmen dendritik 50 – 150 µm jauh dari soma dipilih secara acak dari sel yang terinfeksi HSV yang mengekspresikan GFP. Gambar diperoleh pada LSM 710 confocal (Carl Zeiss) untuk analisis morfologis menggunakan NeuronStudio dengan algoritma rayburst. NeuronStudio mengklasifikasikan duri sebagai tipis, jamur, atau gemuk berdasarkan nilai-nilai berikut: (1) aspek rasio, (2) rasio head to neck, dan (3) diameter head. Duri dengan leher dapat diklasifikasikan sebagai kurus atau jamur, dan mereka yang tidak memiliki leher signifikan diklasifikasikan sebagai gemuk. Duri dengan leher diberi label tipis atau jamur berdasarkan diameter kepala.

Gambar 6

Blokade aktivitas CaMKII mencegah efek morfologis dan perilaku ΔFosB di NAc

Eksperimen 16: Pengaruh HSV-Mediated ΔFosB Overexpression dan CaMKII Inhibition pada Respons Kokain (Gambar 6F)

Tikus jantan dewasa disuntik dengan virus sesuai percobaan 15, dan respons alat gerak terhadap satu injeksi kokain 5 mg / kg diukur sesuai Eksperimen 9. Data lokomotor dinyatakan sebagai total sinar yang terputus pada 30 min setelah injeksi kokain.

Informasi Tambahan

Tempat tinggal hewan

Tikus Sprague Dawley jantan (250 – 275 g; Laboratorium Charles River) berpasangan. Tikus jantan C57BL / 6J yang berusia delapan minggu (Laboratorium Jackson) dikelompokkan dengan maksimal lima hewan per kandang. Semua hewan dibiasakan ke fasilitas hewan selama ≥1 minggu sebelum manipulasi eksperimental dan ditempatkan di ruangan yang dikontrol iklim (23 – 25 ° C) pada siklus cahaya / gelap 12 (lampu menyala di 7: 00 AM) dengan akses ke makanan dan air ad libitum. Eksperimen dilakukan sesuai dengan pedoman dari Society for Neuroscience dan komite perawatan dan penggunaan hewan institusional (IACUC) di Gunung Sinai.

Obat-obatan

Obat diberikan IP dan dilarutkan dalam salin steril, termasuk kokain (5-20 mg / kg per 10 μl untuk tikus, per 1 ml untuk tikus, NIDA) dan SCH 23390 atau eticlopride hidroklorida (0.5 mg / kg per 1 ml, Tocris) . Untuk operasi stereotoksik, tikus dibius dengan "koktail" ketamin (100 mg / kg) dan xylazine (10 mg / kg) (Henry Schein) dalam larutan salin steril.

Antibodi

CaMKIIα (total): Bagian utara 05 – 532, 1: 5,000

CaMKII phospho-Thr286: Promega V111A, 1: 1,000

ΔFosB (total): Sinyal Sel 5G4, 1: 250

ΔFosB phospho-Ser27: Fosfosolusi, 1: 500

GluA1 (total): Abcam, Ab31232, 1: 1,000

GluA1 phospho-Ser831: Millipore N453, 1: 1,000

GluA1 phospho-Ser845: Chemicon Ab5849, 1: 2,000

GluA2: Millipore 07 – 598, 1: 2,000

NR2A: Sigma HPA004692, 1: 2,500

NR2B: Millipore Ab1557P, 1: 1,000

Analisis Statistik

Semua analisis statistik dilakukan dengan menggunakan paket perangkat lunak Prism 6 (GraphPad). Uji-t siswa digunakan untuk semua perbandingan pasangan-bijaksana (ditunjukkan dalam Hasil di mana nilai t diberikan), dan ANOVA satu arah digunakan untuk semua perbandingan multipel (ditunjukkan di bagian hasil di mana nilai F diberikan).

Pergi ke:

Hasil

Kokain Kronis Menginduksi CaMKII di Shell NAc

Banyak penelitian telah menunjukkan bahwa MSN dalam cangkang dan inti NAc memiliki respons biokimia dan fisiologis yang berbeda terhadap paparan kronis terhadap obat pelecehan (Kourrich dan Thomas, 2009; Loweth et al., 2010) dan bahwa dua subregional secara berbeda mengatur perilaku mencari obat (Ito et al., 2004). Untuk menentukan efek diferensial kokain pada konstituen protein cangkang NAc vs inti, kami menggunakan Multiplexed Isobaric Tagging (iTRAQ) dan spektroskopi massa tandem (MS / MS). Tikus jantan dewasa disuntikkan IP dengan kokain (20 mg / kg) atau saline setiap hari selama 7 hari; 24 jam setelah injeksi terakhir, cangkang NAc dan inti mikrodiseksi (Gambar 1A) dan flash beku. Protein dalam sampel ini kemudian diukur menggunakan iTRAQ. Keempat isoform CaMKII menunjukkan peningkatan besar dalam ekspresi setelah pengobatan kokain yang spesifik untuk kulit NAc dibandingkan dengan inti. Beberapa protein fosfatase, termasuk PP1 katalitik dan subunit pengatur dan PP2A, yang sebelumnya telah dikaitkan dengan berbagai substrat CaMKII dalam sistem lain (Colbran, 2004), mengikuti pola yang sama. Temuan-temuan ini memberikan bukti baru dan tidak bias bahwa jalur pensinyalan CaMKII secara jelas diatur oleh kokain dalam NAc dengan cara yang spesifik pada kulit.

Untuk memvalidasi temuan ini secara lebih kuantitatif, kami memperlakukan tikus seperti di atas dengan kokain (dengan dosis bervariasi) atau salin dan mengukur respons lokomotor terhadap kokain (5 mg / kg) atau dosis tantangan salin. Pemaparan berulang terhadap 10 mg / kg kokain menghasilkan pola khas kepekaan alat gerak (Gambar 1B). Studi lebih lanjut dengan rejimen dosis ini mengungkapkan, dengan menggunakan Western blotting, bahwa kokain berulang menginduksi CaMKIIα secara selektif dalam cangkang NAc 24 jam setelah injeksi kokain terakhir (Gambar 1C dan D; p = 0.0019; F = 7.943; df = 29). Selain itu, fosforilasi substrat CaMKII kanonik Ser831 dari subunit GluA1 dari reseptor AMPA secara signifikan meningkat dalam cangkang NAc dan bukan inti (p = 0.0261; d = 4.208; df = 28), sementara CaMKIIα Thr286 autofosfor tren signifikan terhadap induksi hanya dalam shell (Gambar 1D). Beberapa reseptor glutamat lainnya tidak terpengaruh. Berbeda dengan langkah-langkah CaMKII ini, sampel jaringan yang sama menampilkan induksi ΔFosB di kedua shell (p = 0.0260; F = 4.189; df = 29) dan inti (p = 0.0350; F = 3.807; df = 29) dari NAc (Gambar 1C dan D), konsisten dengan temuan sebelumnya (Perrotti et al., 2008).

Karena beberapa penelitian sebelumnya mengenai regulasi kokain dari reseptor AMPA menganalisis hewan setelah ~ 14 hari penarikan dari kokain kronis (lihat Diskusi), kami mengulangi analisis biokimia ini pada titik waktu ini. Kami menemukan bahwa, 14 hari setelah injeksi akhir kokain, osFosB tetap meningkat dalam NAc (p = 0.0288; F = 4.258; df = 22), sementara CaMKII atau fosforilasi GluA1 Ser831 tetap tidak meningkat (Gambar 1E). Namun, 1 jam setelah dosis tunggal tantangan 10 mg / kg kokain, kadar total CaMKII (p = 0.0330; F = 3.947; df = 26) dan GluA1 Ser831 (p = 0.0213; F = 4.509; df = 27) fosforilasi keduanya meningkat ke tingkat yang sama dengan yang ditemukan setelah paparan kokain kronis awal (Gambar 1E). Data ini menunjukkan bahwa neuron cangkang NAc diprioritaskan untuk induksi CaMKII selama periode pantang yang lama, mungkin melalui priming langsung promotor gen CaMKII (lihat Diskusi). Selain itu, fakta bahwa induksi osFosB lebih persisten daripada induksi CaMKII menunjukkan adanya mekanisme tambahan, apakah berbasis kromatin atau sebaliknya, yang mengerahkan “rem” pada regulasi CaMKII, sebagaimana dibahas dalam Diskusi.

Untuk lebih memperkuat pengamatan ini, kami mengeksplorasi model pemberian kokain secara mandiri, yang melibatkan asupan obat berdasarkan kehendak. Tikus jantan dewasa diberi akses pendek atau panjang ke kokain; seperti yang diharapkan (Ahmed dan Koob, 1998), hanya kondisi akses yang panjang yang menyebabkan peningkatan pemberian sendiri obat (Gambar 2A). ΔFosB diinduksi ke tingkat yang lebih besar oleh lama vs akses singkat ke kokain dalam cangkang NAc (p = 0.0011; F = 11.12; df = 17) dan inti (p = 0.0004; F = 13.86; df = 17). Sebaliknya, CaMKIIα diinduksi dalam cangkang NAc hanya dengan akses panjang ke kokain (Gambar 2B dan C; p = 0.0236; F = 4.957; df = 16). Sangat menarik untuk membandingkan rata-rata asupan kokain harian di antara hewan akses pendek (~ 12 mg / kg IV), hewan akses panjang (~ 70 mg / kg IV), dan hewan yang dikelola eksperimen (10 mg / kg), dan tanyakan mengapa yang terakhir memunculkan induksi kuat ΔFosB dan CaMKII sedangkan akses pendek tidak. Perbedaan ini kemungkinan disebabkan oleh perbedaan kadar kokain puncak (kokain yang diberikan eksperimen diberikan sebagai IP bolus tunggal, sedangkan kokain yang diberikan sendiri diberikan melalui beberapa dosis IV), atau oleh perbedaan lama paparan obat (hari 7 untuk eksperimen) administrasi, 19 hari untuk administrasi mandiri).

Meskipun literatur besar tentang ΔFosB dan CaMKII dalam aksi kokain, tidak ada penelitian tentang protein ini pada pengguna kokain manusia. Di sini, kami menyajikan bukti pertama bahwa tingkat ΔFosB (p = 0.0316; t = 1.921; df = 34) dan CaMKII (p = 0.0444; t = 1.755; df = 32) meningkat pada NAc manusia yang tergantung pada kokain (Gambar 2D, Tabel 1). Data ini menunjukkan bahwa pemeriksaan kami terhadap induksi BFosB dan CaMKII oleh kokain dalam NAC hewan pengerat secara klinis relevan dengan kecanduan kokain manusia.

Tabel 1

Karakterisasi sampel dari pecandu kokain manusia dan kelompok kontrol yang cocok

ΔFosB Mengatur Transkripsi CaMKII Secara Selektif dalam D1-Type MSNs dari NAc Shell

Temuan bahwa baik CaMKII dan osFosB diregulasi oleh kokain dalam NAC tikus membawa kita untuk menentukan apakah whetherFosB dapat mengatur transkripsi gen CaMKII. Kami sebelumnya telah melaporkan CaMKIIα sebagai target yang mungkin untuk ΔFosB dalam analisis microarray yang tidak bias dari NAc (McClung dan Nestler, 2003), tetapi temuan ini tidak divalidasi lebih lanjut dalam penelitian itu. Kami pertama kali menggunakan ChIP kuantitatif (qChIP — ChIP diikuti oleh PCR kuantitatif) untuk menentukan apakah osFosB berikatan dengan promotor gen CaMKIIα pada NAc tikus jantan dewasa, dan menemukan secara mengejutkan bahwa pengikatan ini meningkat secara signifikan, oleh administrasi kokain kronis, di kulit ( p = 0.0133; t = 2.901; df = 12), tetapi bukan inti, subkawasan (Gambar 3A). Untuk lebih memahami mekanisme yang terkait dengan perbedaan subregion-spesifik ini dalam ΔFosB yang mengikat pada promotor CaMKIIα, kami menggunakan qChIP untuk mengkarakterisasi keadaan modfikasi histone di wilayah genomik ini. Studi sebelumnya menunjukkan induksi kokain asetilasi H3 di promotor CaMKIIα total NAc tikus (Wang et al., 2010). Sebaliknya, kami menemukan bahwa kokain menurunkan asetilasi H3 pada promotor CaMKIIα secara selektif dalam inti NAc (Gambar 3B; p = 0.0213; t = 2.726; df = 10), tanpa perubahan yang tampak pada shell, konsisten dengan perubahan kromatin khusus subregion di luar ΔFosB mengikat. qChIP untuk tanda represif, dimetilasi H3 lysine 9 (H3K9me2), mengungkapkan tren penurunan pada subkelompok shell dan core (Gambar 3C).

Untuk menentukan apakah ΔFosB mengatur transkripsi CaMKIIα in vivo, kami menggunakan dua garis mouse bitransgenik yang secara berlebih mengekpresikan ΔFosB khususnya di D1 vs MSN tipe D2 dengan cara yang dikendalikan oleh administrasi doksisiklin dalam air minum (Chen et al., 1998; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002). Tikus jantan dewasa yang mengekspres ΔFosB semata-mata pada MSN tipe D1 secara signifikan telah meningkatkan level CaMKIIα mRNA dalam NAc (p = 0.0337; t = 1.996; df = 13), efek yang tidak terlihat pada tikus yang diekspresikan berlebih ΔFosB terutama pada D2-tipe MSNGambar 3D). Peningkatan CaMKIIα mRNA, yang diinduksi oleh ΔFosB ekspresi dalam D1-tipe MSNs, disertai dengan peningkatan yang bersamaan dalam protein CaMKIIα di kedua cangkang NAc (p = 0.0030; t = 3.578; df = 14) dan inti (p = 0.0392; t = 2.275; df = 14; Gambar 3E dan F). Data ini menunjukkan bahwa ΔFosB mampu mendorong ekspresi gen CaMKIIα di MSN tipe D1 di kedua subregional, meskipun Gambar 3B menunjukkan bahwa perubahan kromatin yang dimediasi kokain pada promotor CaMKIIα (misalnya, berkurangnya asetilasi) mencegah ΔFosB meningkatkan regulasi CaMKII dalam subregion inti setelah kokain.

Karena data tikus transgenik kami menunjukkan bahwa induksi ΔFosB dari ekspresi gen CaMKII spesifik untuk MSN tipe D1 di NAc, kami selanjutnya berusaha untuk menentukan apakah peningkatan regulasi CaMKII yang bergantung pada kokain memerlukan aktivasi reseptor dopamin D1. Tikus jantan dewasa diberikan kokain kronis atau saline seperti sebelumnya, tetapi 30 menit sebelum injeksi, tikus dalam kelompok kokain diberi injeksi IP saline, antagonis D1 SCH 23390 (0.5 mg / kg), atau antagonis reseptor D2 eticlopride. (0.5 mg / kg). Hewan dianalisis 24 jam setelah injeksi kokain terakhir. Western blotting mengungkapkan bahwa D1, tetapi bukan D2, antagonis sepenuhnya memblokir peningkatan yang dimediasi kokain pada ΔFosB (p <0.0001; F = 18.96; df = 18), seperti yang dilaporkan sebelumnya (Nye et al., 1995), juga dalam CaMKII (p = 0.0005; F = 10.99; df = 18; Gambar 3G dan H). Data ini mendukung hipotesis bahwa kokain melibatkan peningkatan ekspresi gen CaMKII yang dimediasi osFosB khususnya dalam MSN tipe D1 dari cangkang NAc. Penting dalam penelitian di masa depan untuk menunjukkan secara langsung efek spesifik tipe sel ini dari kokain pada ekspresi CaMKII dalam wilayah otak ini.

ΔFosB Diperlukan dan Cukup untuk Induksi Kokain CaMKII di Shell NAc

Untuk melengkapi penggunaan tikus bitransgenik, kami selanjutnya mempelajari peran ΔFosB dalam mediasi induksi kokain CaMKIIα dengan menggunakan transfer gen yang dimediasi virus pada tikus. Kami menyuntikkan partikel adeno-related viral (AAV) secara bilateral ke dalam cangkang NAc tikus jantan dewasa (di mana cangkang dapat ditargetkan secara selektif) untuk diekspresikan secara berlebihan ΔFosB ditambah GFP atau GFP saja. Hewan-hewan itu kemudian diberi suntikan IP tunggal 10 mg / kg kokain. Hewan-hewan yang mengekspresikan pressFosB / GFP secara berlebihan menunjukkan peningkatan respon alat gerak dibandingkan dengan hewan yang mengekspresi GFP saja (Gambar 4A). 24 jam setelah injeksi kokain tunggal, jaringan NAc-positif GFP dikeluarkan dari hewan-hewan ini dengan diseksi di bawah sumber cahaya neon. Western blotting jaringan ini (Gambar 4B dan C) mengungkapkan ekspresi berlebih osFosB yang kuat serta peningkatan yang signifikan dalam total protein CaMKIIα dibandingkan dengan hewan GFP (p = 0.0070; t = 2.894; df = 30), mirip dengan induksi yang terlihat pada pemberian kokain kronis. Selain itu, autofosforilasi CaMKIIα di Thr286 (indikasi aktivasi enzim) meningkat dengan ekspresi berlebih osFosB (p = 0.0330; t = 2.243; df = 28), seperti fosforilasi substrat CaMKII, Ser831 dari Glu1; p = 0.0540; df = 2.012), sekali lagi meniru aksi kokain kronis (Gambar 1C dan D). Tbersama-sama, data ini memberikan bukti lebih lanjut bahwa ekspresi osFosB dalam cangkang NAc cukup untuk sensitisasi lokomotor terhadap kokain dan untuk induksi dan aktivasi CaMKII di subkawasan ini.

Kami menggunakan pendekatan yang sama untuk menentukan apakah osFosB juga diperlukan untuk induksi CaMKIIα yang dimediasi kokain dalam cangkang NAc. AAV digunakan untuk mengekspresikan protein JunD terpotong, disebut ΔJunD, yang merupakan regulator negatif dari aktivasi transkripsional ΔFosB (Winstanley et al., 2007) plus GFP atau GFP saja. Dua minggu kemudian, ketika ekspresi transgen maksimal, hewan diberi kokain (10 mg / kg) atau saline setiap hari selama 7 hari, dan diuji untuk respon lokomotor terhadap tantangan kokain (5 mg / kg) 24 jam setelah injeksi kronis terakhir (Gambar 4D). Ekspresi berlebihan pada bulan Juni mencegah sensitisasi alat gerak terhadap kokain, dan juga mencegah induksi dan aktivasi CaMKIIα dalam cangkang NAc (Gambar 4E dan F; p = 0.0437; F = 2.997; total df = 38), yang menunjukkan bahwa aktivitas transkripsi ΔFosB diperlukan untuk induksi CaMKIIα yang dimediasi kokain dalam subkawasan ini. Menariknya, kami menemukan bahwa unJunD mengurangi tingkat ΔFosB di bawah kondisi yang diberikan saline dan kokain (p = 0.0004; F = 8.110; df = 35), meningkatkan kemungkinan baru bahwa ΔFosB bergantung pada aktivitas AP-1 untuk tingkat ekspresinya sendiri.

CaMKII Phosphorylates ΔFosB di Ser27

Menggunakan in vitro uji protein kinase, kami menentukan bahwa ΔFosB yang dimurnikan adalah substrat yang kuat untuk CaMKIIα. Inkubasi-Nya₆-ΔFosB dengan CaMKIIα dan ATP menyebabkan pergeseran ke atas dalam mobilitas elektroforesis ΔFosB (Gambar 5A); beberapa pita yang dihasilkan menyarankan banyak situs fosforilasi. Serupa in vitro tes kinase menggunakan [γ-³²P] ATP menunjukkan penggabungan fosfat radiolabel ke dalam ΔFosB band yang bergeser (Gambar 5B), menunjukkan fosforilasi langsung protein. Kami menghasilkan antibodi spesifik fosfo terhadap Ser27 characterizedFosB yang sebelumnya dikarakterisasi (Ulery et al., 2006). Walaupun antibodi ini tidak menghasilkan sinyal terhadap ekstrak otak yang mengandung Ser27-terfosforilasi ΔFosB (data tidak ditampilkan), kami dapat mendeteksi fosforilasi Ser27 di in vitro uji kinase menggunakan CaMKII (Gambar 5B). Analisis kinetik fosforilasi CaMKII dari ΔFosB menunjukkan bahwa itu adalah substrat kuat untuk kinase (Gambar 5C), dengan K nyata_M dari 5.7 ± 2.0µM dan K_KUCING dari 2.3 ± 0.3min^-1. Hasil ini sebanding dengan banyak yang dikarakterisasi dengan baik in vivo substrat dari CaMKII (Colbran dan Brown, 2004). Selain itu, kami menentukan bahwa CaMKII memfosforilasi ΔFosB dengan stoikiometri 2.27 ± 0.07 mol / mol (Gambar 5D), menunjukkan bahwa setidaknya ada tiga situs fosforilasi CaMKII dalam milik-Nya₆-ΔFosB protein, sesuai dengan Gambar 5A.

Untuk menyelidiki masing-masing situs fosforilasi, kami menggunakan analisis MS sampel dari kami in vitro tes kinase. Gambar 5E menunjukkan fosforilasi osFosB di Ser27 yang sebelumnya berkarakter dan di beberapa lokasi tambahan (data tidak ditampilkan). Mengingat karakterisasi fungsional sebelumnya dari Ser27, kami fokus pada situs ini dengan menghasilkan peptida sintetis berlabel meniru kondisi fosfon dan nonfosfom Ser27, kemudian menggunakan jumlah peptida yang diketahui sebagai standar dalam analisis MRM ΔFosB sebelum dan sesudah in vitro fosforilasi oleh CaMKII. Kuantisasi selanjutnya (Gambar 5F) mengonfirmasi bahwa Ser27 adalah substrat yang kuat untuk CaMKII. Hasil ini menunjukkan bahwa, di antara beberapa residu terfosforilasi dalam ΔFosB, Ser27 adalah substrat yang sangat efektif untuk CaMKII.

CaMKII Memediasi Akumulasi kokain dari ΔFosB di Shell NAc

Karena CaMKII dapat memfosforilasi ΔFosB in vitro di situs yang secara dramatis meningkatkan stabilitasnya in vitro dan in vivo (Ulery et al., 2006; Ulery-Reynolds et al., 2009), kami menentukan apakah aktivitas CaMKII mengontrol level osFosB dalam NAc in vivo. Untuk menjawab pertanyaan ini, pertama-tama kami menggunakan garis mouse yang mengekspresikan mutan CaMKIIα (T286D) kalsium-independen di banyak daerah otak termasuk NAc (Mayford et al., 1996; Kourrich et al., 2012). Kami menyuntikkan pasangan littermate mutan dan wildtype jantan dewasa yang serasi dengan kokain atau saline 20 mg / kg sekali sehari selama 14 hari, kemudian menganalisis hewan satu hari setelah injeksi akhir. Kami menemukan bahwa tingkat basal ΔFosB meningkat pada hewan mutan dalam cangkang NAc (p = 0.0001; F = 9.207; df = 37), tetapi bukan inti (Gambar 5G dan H). Anehnya, induksi aineFosB yang tergantung pada kokain diblokir pada hewan mutan di kulit dan inti, menunjukkan bahwa, meskipun CaMKII dapat secara langsung mengatur stabilitas ΔFB di cangkang NAc, ia juga terletak di hulu ΔFosB di jalur yang diaktifkan kokain di kedua subregional NAc .

Kegiatan CaMKII Diperlukan untuk Plastisitas Perilaku dan Perilaku yang Dimediasi oleh FB

Induksi kokain duri dendritik pada NAc MSNs adalah salah satu adaptasi yang diinduksi obat yang paling mapan di wilayah otak ini, dan induksi tulang belakang seperti itu telah berkorelasi dengan respons perilaku peka terhadap obat (Robinson dan Kolb, 2004; Russo et al., 2010) dan dilaporkan selektif untuk MSN tipe D1 (Lee et al., 2006). Kami telah menunjukkan baru-baru ini bahwa induksi kokain duri dendritik pada NAc tergantung pada ΔFosB dan program transkripsional hilirnya (Maze et al., 2010). Meskipun ada literatur yang luas tentang keterlibatan CaMKII dalam morfologi dan induksi tulang belakang dendritik di daerah otak lain dan sistem eksperimental (Jourdain et al., 2003; Penzes et al., 2008; Okamoto et al., 2009), perannya dalam pembentukan tulang belakang NAN MSN belum diteliti. Oleh karena itu, kami menentukan apakah aktivitas CaMKII diperlukan untuk spFosB yang dimediasi oleh induksi dendritik MSN dengan menggunakan overekspresi termediasi HSV dari inhibitor peptida CaMKII AC3I yang menyatu dengan GFP, sebuah konstruksi yang sebelumnya terbukti menghambat aktivitas CaMKII in vivo (Zhang et al., 2005; Klug et al., 2012). Ekspresi berlebihan virus ΔFosB dalam cangkang NAc mencit dewasa menyebabkan peningkatan yang signifikan dalam kepadatan tulang belakang dendritik MSN (p <0.0001; F = 8.558; df = 59; Gambar 6A dan B) seperti yang dilaporkan sebelumnya (Maze et al., 2010), dan peningkatan ini didorong terutama oleh tipe tulang tipis (p = 0.0027; F = 5.319; df = 59) dan gemuk (p = 0.0378; F = 2.988; df = 59) (keduanya dianggap duri tidak matang) (Gambar 6C – E). Tidak ada efek yang terlihat pada duri berbentuk jamur yang lebih matang. Namun, ketika GFP-AC3I diekspresikan bersama, ΔFosB induksi duri sepenuhnya dibatalkan (Gambar 6A – E), menunjukkan bahwa aktivitas CaMKII diperlukan untuk ΔFosB induksi duri dendritik dalam cangkang NAc.

Kami selanjutnya menggunakan alat viral yang sama untuk menentukan apakah aktivitas CaMKII diperlukan untuk efek ΔFosB pada sensitivitas perilaku terhadap kokain. 72 jam setelah injeksi virus ke cangkang NAc, hewan diberi suntikan tunggal 5 mg / kg kokain dan aktivitas alat gerak mereka dicatat. Seperti yang ditunjukkan sebelumnya dengan overekspresi AAV lebih panjang dari ΔFosB (Gambar 4A), Ekspresi berlebih yang dimediasi HSV dari ΔFosB meningkatkan sensitivitas alat gerak terhadap kokain (p = 0.0002; F = 8.823; df = 37; Gambar 6F). Seperti dengan induksi duri dendritik, penghambatan aktivitas CaMKII dengan koekspresi GFP-AC3I sepenuhnya memblokir peningkatan sensitivitas kokain yang dimediasi osFB, menunjukkan bahwa aktivitas CaMKII diperlukan untuk ΔFosB yang diinduksi perubahan dalam efek perilaku kokain.

Pergi ke:

Diskusi

Penelitian ini menggambarkan mekanisme umpan maju di mana kokain menginduksi ΔFosB dalam NAc, yang mengatur transkripsi gen CaMKIIα secara selektif dalam cangkang NAc.. CaMKIIα selanjutnya memfosforilasi dan menstabilkan osFosB yang mengarah ke akumulasi ΔFosB yang lebih besar dan untuk lebih lanjut induksi CaMKIIα (Gambar 6G). Tingkat peningkatan kedua protein selama paparan kronis kokain kemudian berkontribusi dalam cara-cara penting untuk respon perilaku yang peka terhadap obat. Ini adalah hipotesis yang sangat menarik karena ΔFosB dan CaMKII masing-masing telah ditunjukkan sebelumnya untuk meningkatkan respons perilaku terhadap kokain. (Pierce et al., 1998; Peakman et al., 2003), dan kami mereplikasi temuan ini untuk ΔFosB di shell NAc secara khusus menggunakan pendekatan viral (Gambar 4 dan Dan66).

Meskipun ekspresi berlebih ΔFosB transgenik dalam MSN tipe D1 dapat mendorong induksi CaMKII pada cangkang NAc dan inti hewan naif kokain, dalam konteks kokain, akumulasi osFosB endogen, yang terjadi pada kedua subregional, mendorong induksi CaMKII secara khusus pada cangkang NAc . Perbedaan ini dapat berhubungan dengan tingkat yang lebih tinggi dari ΔFosB yang diinduksi dalam model bitransgenik kami, namun, itu mungkin juga mencerminkan kemampuan kokain untuk secara berbeda mengubah promotor CaMKIIα dalam shell vs MSN inti untuk mempromosikan ΔFosB mengikat di yang sebelumnya atau mengeluarkannya di subkawasan yang terakhir. Faktanya, data ChIP kami, yang mengungkapkan deasetilasi histone yang dimediasi kokain pada promotor gen CaMKIIα hanya dalam inti NAc, mendukung kemungkinan keterlibatan mekanisme kromatin. Sesuai dengan hipotesis ini, ΔFosB overexpression di D1-type MSNs mampu mendorong induksi CaMKIIα di inti NAc tanpa adanya kokain (Gambar 3F), menunjukkan bahwa ada modifikasi aktif dari promotor CaMKIIα yang mencegah induksi ini selama paparan kokain kronis. Regulasi bentang kromatin pada promotor CaMKII mungkin juga menjelaskan mengapa CaMKII diinduksi oleh dosis tantangan kokain dalam cangkang NAC tikus penarik kokain kronis (Gambar 1E) tetapi tidak pada hewan yang naif-narkoba (Gambar 1D). Ini bisa mewakili efek "priming gen" epigenetik dari ΔFosB (Robison dan Nestler, 2011), dan dengan demikian bisa menjadi salah satu mekanisme molekuler dari inkubasi keinginan kokain (Pickens et al., 2011). Namun, agar perubahan kromatin ini terkait secara kausal dengan inkubasi keinginan, ia harus meningkat seiring waktu. Akan menarik untuk menentukan apakah ini masalahnya, dan untuk mempelajari apakah gen lain menunjukkan aineFosB yang bergantung pada regulasi subregion spesifik oleh kokain. Penting juga untuk dicatat bahwa loop umpan-maju yang kami jelaskan tidak mengarah pada akumulasi CaMKII atau ΔFosB yang tak berujung (Gambar 1E); mengungkap "rem" molekuler yang bertanggung jawab untuk ini adalah tujuan penting dari studi masa depan.

Fungsi ΔFosB dan CaMKII yang diketahui dalam beberapa sistem eksperimental dan wilayah otak bertemu pada berbagai tingkatan (Gambar 6F). Kedua molekul terkait erat dengan pertumbuhan tulang belakang dendritik: CaMKII berinteraksi dengan sitoskeleton aktin (Okamoto et al., 2009), mengatur ukuran kepala tulang belakang (Matsuzaki et al., 2004), dan keduanya diperlukan dan cukup untuk peningkatan filopodia dan jumlah sinaps yang diinduksi plastisitas dalam kultur irisan organotip hippocampal (Jourdain et al., 2003), wileFosB diperlukan dan cukup untuk pembentukan tulang belakang dendritik yang diinduksi kokain pada MSN MSC (Maze et al., 2010). Selain itu, kedua molekul telah dikaitkan dengan regulasi reseptor AMPA glutamat. CaMKII tidak mengatur level total subunit reseptor AMPA, tetapi mendorong penyisipan reseptor AMPA ke dalam sinapsis dan meningkatkan konduktansi saluran AMPA dengan memfosforilasi GluA1 di Ser831 dalam neuron piramidal hippocampal dalam kultur dan in vivo (diulas dalam (Malinow dan Malenka, 2002; Colbran dan Brown, 2004)). Peningkatan perdagangan GluA1 ke sinaps telah terlibat dalam aksi kokain kronis juga (Boudreau dan Wolf, 2005). Selain itu, respon perilaku terhadap aktivasi reseptor AMPA di NAc ditingkatkan oleh overekspresi CaMKIIα dalam cara bergantung-reseptor dopamin D1 (Singer et al., 2010). Ekspresi berlebih khusus D1 untuk ΔFosB telah terbukti menginduksi transkripsi GluA2 dalam NAc (Kelz et al., 1999), yang meredam respons AMPA yang dimediasi melalui GluA1, sementara kami menunjukkan di sini bahwa exFosB overexpression jangka pendek — serta paparan kokain jangka pendek — tidak berpengaruh pada subunit ini (Gambar 1). Namun demikian, kami baru-baru ini menemukan bahwa ekspresi berlebih ΔFosB jangka pendek tetap mengurangi respons AMPA dalam MSN tipe D1 di NAc (Grueter et al., 2013). Data-data ini menyarankan mekanisme sementara yang berbeda yang mungkin merupakan rangkaian neuroadaptasi yang tergantung waktu terhadap kokain yang mendasari berbagai aspek perkembangan kecanduan yang belum dipahami dengan baik. Pada tingkat perilaku, baik CaMKII dan ΔFosB diperlukan untuk sensitisasi lokomotor terhadap kokain (lihat di atas), dan keduanya diperlukan untuk administrasi mandiri kokain berkelanjutan pada hewan pengerat (Colby et al., 2003; Wang et al., 2010), menunjukkan bahwa kedua protein itu penting untuk adaptasi perilaku jangka pendek dan jangka panjang terhadap paparan obat, meskipun melalui mekanisme yang mendasari sebagian berbeda. Agaknya, osFosB dan CaMKII mengatur adaptasi perilaku yang kompleks melalui perubahan fungsi sinaptik NAc, meskipun banyak pekerjaan lebih lanjut diperlukan untuk secara langsung menghubungkan fenomena sinaptik dengan perubahan perilaku.

Holoenzim CaMKII secara bersamaan berinteraksi dengan berbagai protein terkait sinaps (Robison et al., 2005) yang dianggap mengatur penargetannya ke densitas postsinaptik (PSD), sebuah fenomena yang disarankan penting untuk plastisitas sinaptik. Secara khusus, interaksi CaMKII dengan subunit GluN2B dari reseptor glutamat tipe-NMDA baru-baru ini ditunjukkan untuk mengatur plastisitas sinaptik dan pembelajaran (Hentikan et al., 2012). Sementara peptida AC3I meniru domain autoinhibitory dari CaMKII, dan dengan demikian menghambat aktivitas katalitik enzim, itu juga memblokir beberapa interaksi protein-protein (Strack et al., 2000; Robison et al., 2005). Dengan demikian, efek perilaku dan morfologis dari HSV-GFP-AC3I yang dilaporkan di sini dapat terjadi melalui pengurangan fosforilasi protein target CaMKII, perubahan target CaMKII, atau perubahan peran struktural yang diusulkan CaMKII di sinapsis (Lisman et al., 2002).

Pembatasan usulan loop ΔFosB-CaMKII ke cangkang NAc menjadi perhatian khusus, karena penelitian terbaru telah menunjukkan beberapa perbedaan fisiologis antara cangkang NAc dan inti dalam menanggapi administrasi kokain, sebuah gagasan yang dikonfirmasi oleh data iTRAQ (Tabel S1) kami yang tidak bias. . MSNs dalam cangkang NAc menunjukkan depresi dalam kapasitas menembak setelah kokain kronis yang bertahan selama berminggu-minggu, sementara MSN inti dari hewan yang sama menampilkan peningkatan sementara (1-3 hari) peningkatan kapasitas menembak yang kembali ke level basal dalam minggu 2 (Kourrich dan Thomas, 2009). Selain itu, banyak protein sinaptik yang diatur berbeda dalam cangkang NAc vs inti hewan yang terpapar kokain kronis, termasuk GluA2 (Knackstedt et al., 2010). Sebagai amfetamin kronis menginduksi CaMKIIα secara khusus dalam cangkang NAc (Loweth et al., 2010), tidak mengherankan bahwa kami menemukan efek yang sama dengan kokain. Namun, karena osFosB diinduksi dalam cangkang NAc dan inti oleh kokain kronis (Perrotti et al., 2008), dan karena kami menunjukkan bahwa induksi CaMKIIα di shell bergantung pada osFosB, temuan kami memberikan bukti baru untuk mekanisme transkripsional yang berbeda pada promotor CaMKIIα antara dua subregion ini, yang bertanggung jawab untuk induksi selektif CaMKIIα di shell.

Banyak pekerjaan baru-baru ini telah memfokuskan pada penggambaran perbedaan antara MSN-DX NAN tipe D1 dan D2. Meskipun kedua reseptor D1 dan D2 terlibat dalam efek bermanfaat dari kokain (Cukup, 2010), pekerjaan terbaru menunjukkan bahwa aktivasi optogenetik MSN tipe D1 meningkatkan respons perilaku terhadap kokain, sedangkan aktivasi MSN tipe D2 memiliki efek sebaliknya (Lobo et al., 2010). Sejalan dengan temuan ini, tikus KO reseptor D1 kekurangan dalam perolehan administrasi kokain (Caine et al., 2007), sedangkan KO D2 tidak (Caine et al., 2002). Administrasi agonis D1 langsung ke NAc memicu perilaku mencari kokain dalam paradigma pemulihan (Cukup, 2010). Menariknya, efek ini memerlukan peningkatan D1 yang bergantung pada reseptor dalam aktivitas CaMKII dalam cangkang NAc, tetapi bukan inti (Anderson et al., 2008), hasil yang cocok dengan loop ΔFosB-CaMKII D1 dan spesifik shell yang diusulkan di sini.

Kami sebelumnya melaporkan bahwa Ser27 dalam ΔFosB dapat difosforilasi oleh casein kinase-2 (Ulery et al., 2006), bagaimanapun, kami menetapkan di sini bahwa CaMKII memfosforilasi ΔFosB di ini dan situs lain dengan kinetika dan stoikiometri yang jauh lebih besar dan dapat meniru M_r diamati untuk ΔFosB (Gambar 5A) dengan paparan kokain in vivo (Nestler, 2008). Kita sudah tahu bahwa fosforilasi Ser27 meningkatkan stabilityFosB stabilitas dan aktivitas transkripsi (Ulery et al., 2006; Ulery dan Nestler, 2007; Ulery-Reynolds et al., 2009). Pekerjaan di masa depan sekarang akan fokus pada identifikasi dan konsekuensi fungsional dari situs baru fosforilasi ΔFB yang ditunjukkan oleh penelitian ini.

Loop umpan-maju yang diuraikan di sini menyediakan mekanisme baru yang masuk akal di mana pemberian berulang kokain mendorong kelainan progresif di NAc. Dengan demikian, jalur biokimia ini dapat memberikan target penting untuk intervensi terapeutik di masa depan pada gangguan kecanduan. Karena CaMKII ada di mana-mana dan diperlukan untuk banyak fungsi neuronal dan perilaku basal, penggunaan langsung inhibitor CaMKII telah dihindari sebagai pengobatan kecanduan. Data kami menunjukkan bahwa penargetan yang lebih halus dari mekanisme induksi CaMKII, yang khusus untuk tipe sel individu dan subregional dari sirkuit hadiah otak, dapat memberikan target terapi yang akan menghindari komplikasi penghambatan CaMKII sistemik.

Pergi ke:

Ucapan Terima Kasih

Pekerjaan ini didukung oleh hibah dari National Institute on Drug Abuse (EJN), NIDA-Yale Proteomics Center DA018343 (AJR dan EJN), dan Hartwell Foundation (AJR). Para penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada Gabby Rundenko atas hadiah dermawan ΔFosB dan Roger Colbran yang dimurnikan atas hadiah dermawan CaMKIIα yang dimurnikan.

Pergi ke:

Referensi

1. Ahmed SH, Koob GF. Transisi dari asupan obat moderat ke berlebihan: perubahan set point hedonis. Ilmu. 1998; 282: 298 – 300. [PubMed]
2. Anderson SM, KR Terkenal, Sadri-Vakili G, Kumaresan V, Schmidt HD, Bass CE, EF Terwilliger, Cha JH, Pierce RC. CaMKII: jembatan biokimia yang menghubungkan accumbens dopamine dan sistem glutamat dalam pencarian kokain. Nat Neurosci. 2008; 11: 344 – 353. [PubMed]
3. Boudreau AC, Serigala ME. Sensitisasi perilaku terhadap kokain dikaitkan dengan peningkatan ekspresi permukaan reseptor AMPA di nucleus accumbens. J Neurosci. 2005; 25: 9144 – 9151. [PubMed]
4. Brickey DA, Colbran RJ, Fong YL, Soderling TR. Ekspresi dan karakterisasi subunit alfa dari Ca2 + / protein kinase II yang tergantung-tenangodulin menggunakan sistem ekspresi baculovirus. Biochem Biophys Res Commun. 1990; 173: 578 – 584. [PubMed]
5. Caine SB, Negus SS, NK Mello, Patel S, Bristow L, J Kulagowski, Vallone D, Saiardi A, Borrelli E. Peran reseptor D2 yang mirip dopamin dalam pemberian sendiri kokain: studi dengan tikus reseptor D2 mutan dan reseptor D2 novel antagonis. J Neurosci. 2002; 22: 2977 – 2988. [PubMed]
6. SB Caine, Thomsen M, Gabriel KI, JS Berkowitz, LH Emas, Koob GF, Tonegawa S, Zhang J, Xu M. Kurangnya pemberian kokain secara mandiri pada tikus knock-out reseptor D1 dopamin. J Neurosci. 2007; 27: 13140 – 13150. [Artikel gratis PMC] [PubMed]
7. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, IN Alibhai, Wilkinson MB, Kumar A, Nestler EJ. Mekanisme yang bergantung pada protein dan tidak tergantung pada destabilisasi FosB: identifikasi domain degron FosB dan implikasinya bagi stabilitas DeltaFosB. Eur J Neurosci. 2007; 25: 3009 – 3019. [PubMed]
8. Chen J, MB Kelz, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, MR Picciotto, Duman RS, Nestler EJ. Hewan transgenik dengan ekspresi gen target yang dapat diinduksi di otak. Mol Pharmacol. 1998; 54: 495 – 503. [PubMed]
9. Christoffel DJ, Golden SA, Dumitriu D, Robison AJ, Janssen WG, Ahn HF, Krishnan V, Reyes CM, Han MH, Dapat JL, Eisch AJ, Dietz DM, Ferguson D, Neve RL, Greengard P, Kim Y, Morrison JH , Russo SJ. IkappaB kinase mengatur kekalahan sosial sinaptis dan perilaku yang disebabkan oleh stres sosial. J Neurosci. 2011; 31: 314 – 321. [Artikel gratis PMC] [PubMed]
10. Colbran RJ. Inaktivasi Ca2 + / protein kinase II yang tergantung-tenangodulin oleh autofosforilasi basal. J Biol Chem. 1993; 268: 7163 – 7170. [PubMed]
11. Colbran RJ. Protein fosfatase dan protein / sinaptik sinaptik dependen bergantung kalsium / protein-tenangodulin. J Neurosci. 2004; 24: 8404 – 8409. [PubMed]
12. Colbran RJ, Brown AM. Protein kinase II tergantung kalsium / kalmodulin dan plastisitas sinaptik. Curr Opin Neurobiol. 2004; 14: 318 – 327. [PubMed]
13. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, DW Sendiri. Ekspresi DeltaFosB tipe spesifik sel striatal meningkatkan insentif untuk kokain. J Neurosci. 2003; 23: 2488 – 2493. [PubMed]
14. Covington HE, 3rd, Labirin I, LaPlant QC, Vialou VF, Ohnishi YN, Berton O, Fass DM, Renthal W, Rush AJ, 3rd, Wu EY, Ghose S, Krishnan V, Russo SJ, Tamminga C, Haggarty SJ, Nestler EJ. Tindakan antidepresan inhibitor histone deacetylase. J Neurosci. 2009; 29: 11451 – 11460. [Artikel gratis PMC] [PubMed]
15. Davalos A, Fernandez-Hernando C, Sowa G, Derakhshan B, Lin MI, Lee JY, Zhao H, Luo R, Colangelo C, Sessa WC. Proteomik kuantitatif dari protein yang diatur caveolin-1: karakterisasi polimerase i dan faktor pelepasan transkrip / CAVIN-1 IN sel endotel. Proteomik Sel Mol. 2010; 9: 2109 – 2124. [Artikel gratis PMC] [PubMed]
16. Dumais A, Lesage AD, Alda M, Rouleau G, Dumont M, Chawky N, Roy M, Mann JJ, Benkelfat C, Turecki G. Faktor-faktor risiko untuk penyelesaian bunuh diri dalam depresi berat: studi kasus-kontrol perilaku impulsif dan agresif di laki-laki. Am J Psikiatri. 2005; 162: 2116 – 2124. [PubMed]
17. Grueter BA, Robison AJ, Neve RL, Nestler EJ, Malenka RC. ΔFosB secara berbeda memodulasi nucleus accumbens fungsi jalur langsung dan tidak langsung. Proc Natl Acad Sci USA. 2013 di tekan. [Artikel gratis PMC] [PubMed]
18. Menghentikan AR, RF Dallapiazza, Zhou Y, Stein IS, Qian H, S Juntti, S Wojcik, Brose N, Silva AJ, Hell JW. Mengikat CaMKII ke GluN2B sangat penting selama konsolidasi memori. EMBO J. 2012; 31: 1203 – 1216. [Artikel gratis PMC] [PubMed]
19. Hiroi N, Brown JR, Haile CN, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ. Tikus mutan FosB: hilangnya induksi kokain kronis dari protein terkait Fos dan peningkatan kepekaan terhadap psikomotorik kokain dan efek yang menguntungkan. Proc Natl Acad Sci US A. 1997; 94: 10397–10402. [Artikel gratis PMC] [PubMed]
20. Ito R, Robbins TW, Everitt BJ. Kontrol diferensial atas perilaku mencari kokain oleh nukleus accumbens core dan shell. Nat Neurosci. 2004; 7: 389 – 397. [PubMed]
21. Jorissen HJ, Ulery PG, Henry L, Gourneni S, Nestler EJ, Rudenko G. Dimerisasi dan sifat pengikatan DNA dari faktor transkripsi DeltaFosB. Biokimia. 2007; 46: 8360 – 8372. [PubMed]
22. Jourdain P, Fukunaga K, Muller D. Kalsium / protein kinase II yang tergantung kalsium -odinodulin berkontribusi terhadap pertumbuhan filopodia yang bergantung pada aktivitas dan pembentukan tulang belakang. J Neurosci. 2003; 23: 10645 – 10649. [PubMed]
23. MB Kelz, Chen J, Carlezon WA, Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, DW Diri, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ. Ekspresi faktor transkripsi deltaFosB di otak mengontrol sensitivitas terhadap kokain. Alam. 1999; 401: 272 – 276. [PubMed]
24. Klug JR, BN Mathur, TL Kash, HD Wang, Matthews RT, AJ AJ, Anderson ME, Deutch AY, DM Lovinger, Colbran RJ, Winder DG. Penghambatan Genetik CaMKII di Dorsal Striatal Medium Spiny Neuron Mengurangi Sinapsis Eksitasi Fungsional dan Meningkatkan Kegembiraan Intrinsik. PLoS Satu. 2012; 7: e45323. [Artikel gratis PMC] [PubMed]
25. Knackstedt LA, Moussawi K, Lalumiere R, Schwendt M, Klugmann M, Kalivas PW. Pelatihan kepunahan setelah pemberian sendiri kokain menginduksi plastisitas glutamatergik untuk menghambat pencarian kokain. J Neurosci. 2010; 30: 7984 – 7992. [Artikel gratis PMC] [PubMed]
26. Kourrich S, Thomas MJ. Neuron yang serupa, adaptasi yang berlawanan: pengalaman psikostimulan secara berbeda mengubah sifat-sifat pembakaran dalam inti yang terakumulasi versus cangkang. J Neurosci. 2009; 29: 12275 – 12283. [Artikel gratis PMC] [PubMed]
27. Kourrich S, Klug JR, Mayford M, Thomas MJ. AMPAR-Efek Independen Striatal alphaCaMKII Meningkatkan Sensitisasi Hadiah Kokain. J Neurosci. 2012; 32: 6578 – 6586. [Artikel gratis PMC] [PubMed]
28. LaPlant Q, Chakravarty S, Vialou V, Mukherjee S, Koo JW, Kalahasti G, Bradbury KR, Taylor SV, Labirin I, Kumar A, Graham A, Birnbaum SG, Krishnan V, Truong HT, Neve RL, Nestler EJ, Russo SJ . Peran faktor nuklir kappaB dalam hipersensitivitas stres yang dimediasi hormon hormon ovarium pada tikus betina. Psikiatri Biol. 2009; 65: 874 – 880. [Artikel gratis PMC] [PubMed]
29. Lee KW, Kim Y, Kim AM, Helmin K, Nairn AC, Greengard P. Cocaine yang membentuk dendritik tulang belakang di D1 dan D2 yang mengandung neuron duri medium yang mengandung reseptor dopamin di nukleus accumbens. Proc Natl Acad Sci US A. 2006; 103: 3399 – 3404. [Artikel gratis PMC] [PubMed]
30. Lisman J, Schulman H, Cline H. Basis molekul fungsi CaMKII dalam memori sinaptik dan perilaku. Nat Rev Neurosci. 2002; 3: 175 – 190. [PubMed]
31. Lobo MK, Covington HE, 3rd, Chaudhury D, Friedman AK, Sun H, Damez-Werno D, Dietz DM, Zaman S, Koo JW, Kennedy PJ, Mouzon E, Mogri M, Neve RL, Deisseroth K, Han MH, Nestler EJ. Hilangnya tipe sel spesifik dari pensinyalan BDNF meniru kontrol optogenetik dari hadiah kokain. Ilmu. 2010; 330: 385 – 390. [Artikel gratis PMC] [PubMed]
32. Loweth JA, Baker LK, T Guptaa, Guillory AM, Vezina P. Penghambatan CaMKII dalam cangkang nucleus accumbens mengurangi peningkatan asupan amfetamin pada tikus yang peka. Neurosci Lett. 2008; 444: 157 – 160. [Artikel gratis PMC] [PubMed]
33. Loweth JA, Penyanyi BF, Baker LK, Wilke G, Inamin H, Bubula N, Alexander JK, Carlezon WA, Jr, Neve RL, Vezina P. Ekspresi transien alfa-Ca2 + / protein kinase yang tergantung-tenangodulin-tergantung pada shell nucleus accumbens shell meningkatkan respons perilaku terhadap amfetamin. J Neurosci. 2010; 30: 939 – 949. [Artikel gratis PMC] [PubMed]
34. Malinow R, Malenka RC. Perdagangan reseptor AMPA dan plastisitas sinaptik. Annu Rev Neurosci. 2002; 25: 103 – 126. [PubMed]
35. Matsuzaki M, Honkura N, Ellis-Davies GC, Kasai H. Basis struktural dari potensiasi jangka panjang dalam duri dendritik tunggal. Alam. 2004; 429: 761 – 766. [PubMed]
36. Mayford M, Bach ME, Huang YY, Wang L, RD Hawkins, Kandel ER. Kontrol pembentukan memori melalui ekspresi transgen CaMKII yang diatur. Ilmu. 1996; 274: 1678 – 1683. [PubMed]
37. Labirin I, Covington HE, 3rd, Dietz DM, LaPlant Q, Renthal W, Russo SJ, Mekanik M, Mouzon E, Neve RL, Haggarty SJ, Ren Y, Sampath SC, Hurd YL, Greengard P, Tarakhovsky A, Schaefer A Nestler EJ. Peran penting dari histone methyltransferase G9a dalam plastisitas yang diinduksi kokain. Ilmu. 2010; 327: 213 – 216. [Artikel gratis PMC] [PubMed]
38. McClung CA, Nestler EJ. Regulasi ekspresi gen dan hadiah kokain oleh CREB dan DeltaFosB. Nat Neurosci. 2003; 6: 1208 – 1215. [PubMed]
39. Nestler EJ. Ulasan. Mekanisme transkripsi kecanduan: peran DeltaFosB. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008; 363: 3245 – 3255. [Artikel gratis PMC] [PubMed]
40. Nye HE, Hope BT, Kelz MB, Iadarola M, Nestler EJ. Studi farmakologis tentang regulasi induksi antigen terkait FOS kronis oleh kokain di striatum dan nucleus accumbens. J Pharmacol Exp Ther. 1995; 275: 1671 – 1680. [PubMed]
41. Okamoto K, Bosch M, Hayashi Y. Peran CaMKII dan F-actin dalam plastisitas struktural duri dendritik: identitas molekuler potensial dari tag sinaptik? Fisiologi (Bethesda) 2009; 24: 357 – 366. [PubMed]
42. Olausson P, Jentsch JD, Tronson N, Neve RL, Nestler EJ, Taylor JR. DeltaFosB dalam nucleus accumbens mengatur perilaku dan motivasi instrumental yang diperkuat makanan. J Neurosci. 2006; 26: 9196 – 9204. [PubMed]
43. Paxinos G, Watson C. Otak tikus dalam koordinat stereotaxic. Edisi 6th. Amsterdam; Boston: Academic Press / Elsevier; 2007.
44. Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, P Ulery, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E. Ekspresi spesifik wilayah otak yang dapat diinduksi dari mutan negatif dominan c-Jun pada tikus transgenik menurunkan sensitivitas terhadap kokain. Res Otak. 2003; 970: 73 – 86. [PubMed]
45. P Penzes, Cahill ME, Jones KA, Srivastava DP. Sinyal CaMK dan RacGEF yang konvergen mengontrol struktur dan fungsi dendritik. Tren Biol Sel. 2008; 18: 405 – 413. [PubMed]
46. Perrotti LI, Hadeishi Y, PG Ulery, Barrot M, Monteggia L, RS Duman, Nestler EJ. Induksi deltaFosB dalam struktur otak yang berhubungan dengan hadiah setelah stres kronis. J Neurosci. 2004; 24: 10594 – 10602. [PubMed]
47. Perrotti LI, Penenun RR, Robison B, Renthal W, Labirin I, Yazdani S, Elmore RG, DJ Knapp, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, DW Send, Nestler EJ. Pola yang berbeda dari induksi DeltaFosB di otak oleh obat-obatan pelecehan. Sinaps. 2008; 62: 358 – 369. [Artikel gratis PMC] [PubMed]
48. Pickens CL, Airavaara M, Theberge F, Fanous S, Hope BT, Shaham Y. Neurobiologi dari inkubasi keinginan obat. Tren Neurosci. 2011; 34: 411 – 420. [Artikel gratis PMC] [PubMed]
49. Pierce RC, EA Cepat, Reeder DC, Morgan ZR, Kalivas PW. Utusan kedua yang dimediasi kalsium memodulasi ekspresi kepekaan terhadap kokain. J Pharmacol Exp Ther. 1998; 286: 1171 – 1176. [PubMed]
50. Quirion R, Robitaille Y, Martial J, Chabot JG, P Lemoine, Pilapil C, Dalpe M. Autoradiografi reseptor otak manusia menggunakan seluruh belahan otak: metode umum yang meminimalkan artefak jaringan. Sinaps. 1987; 1: 446 – 454. [PubMed]
51. Robinson TE, Kolb B. Plastisitas struktural terkait dengan paparan obat pelecehan. Neurofarmakologi. 2004; 47 (Suppl 1): 33 – 46. [PubMed]
52. Robison AJ, Nestler EJ. Mekanisme kecanduan transkripsi dan epigenetik. Nat Rev Neurosci. 2011; 12: 623 – 637. [Artikel gratis PMC] [PubMed]
53. Robison AJ, Bass MA, Jiao Y, MacMillan LB, Carmody LC, Bartlett RK, Colbran RJ. Interaksi multivalen dari protein kinase II yang tergantung kalsium / kalmodulin-dependen dengan protein densitas pascasinaps, NR2B, densin-180, dan alpha-actinin-2. J Biol Chem. 2005; 280: 35329 – 35336. [PubMed]
54. Ross PL, Huang YN, Marchese JN, Williamson B, Parker K, Hattan S, Khainovski N, Pillai S, Dey S, Daniels S, S Purkayastha, Juhasz P, Martin S, Bartlet-Jones M, F Pappin DJ. Kuantisasi protein multipleks dalam Saccharomyces cerevisiae menggunakan reagen penandaan isobarik amina reaktif. Proteomik Sel Mol. 2004; 3: 1154 – 1169. [PubMed]
55. Russo SJ, Dietz DM, Dumitriu D, Morrison JH, Malenka RC, Nestler EJ. Sinaps kecanduan: mekanisme plastisitas sinaptik dan struktural dalam nucleus accumbens. Tren Neurosci. 2010; 33: 267 – 276. [Artikel gratis PMC] [PubMed]
56. DW sendiri. Dalam: Reseptor Dopamin. Neve KA, editor. New York: Humana Press; 2010. hlm. 479 – 524.
57. Penyanyi BF, Loweth JA, Neve RL, Vezina P. Ekspresi transien yang dimediasi virus transien protein alfa-kalsium / kalmulin kinase II dalam nukleus accumbens shell mengarah pada peningkatan fungsi fungsional jangka panjang alfa-amino-3-hydroxyl-5 -methyl-4-reseptor isoxazole-propionate: tipe dopamin-reseptor 1 dan ketergantungan protein kinase A. Eur J Neurosci. 2010; 31: 1243 – 1251. [Artikel gratis PMC] [PubMed]
58. Strack S, McNeill RB, Colbran RJ. Mekanisme dan regulasi protein kinase II yang bergantung pada kalsium / kalmodulin yang menargetkan subunit NR2B dari reseptor N-metil-D-aspartat. J Biol Chem. 2000; 275: 23798 – 23806. [PubMed]
59. Ulery-Reynolds PG, Castillo MA, Vialou V, Russo SJ, Nestler EJ. Fosforilasi DeltaFosB memediasi stabilitas in vivo. Ilmu saraf. 2009; 158: 369 – 372. [Artikel gratis PMC] [PubMed]
60. Ulery PG, Nestler EJ. Regulasi aktivitas transkripsi DeltaFosB oleh fosforilasi Ser27. Eur J Neurosci. 2007; 25: 224 – 230. [PubMed]
61. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ. Regulasi stabilitas DeltaFosB oleh fosforilasi. J Neurosci. 2006; 26: 5131 – 5142. [PubMed]
62. Vialou V, dkk. DeltaFosB di sirkuit imbalan otak memediasi ketahanan terhadap stres dan respons antidepresan. Nat Neurosci. 2010; 13: 745 – 752. [Artikel gratis PMC] [PubMed]
63. Wang L, Lv Z, Hu Z, Sheng J, Hui B, Sun J, Ma L. Asetilasi H3 yang diinduksi oleh kokain dan aktivasi transkripsi CaMKIIalpha dalam nukleus accumbens sangat penting untuk memotivasi penguat obat. Neuropsikofarmakologi. 2010; 35: 913 – 928. [Artikel gratis PMC] [PubMed]
64. Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S. Delta FosB mengatur roda berjalan. J Neurosci. 2002; 22: 8133 – 8138. [PubMed]
65. Winstanley CA, LaPlant Q, Theobald DE, TA Hijau, Bachtell RK, Perrotti LI, RJ DiLeone, Russo SJ, Garth WJ, DW Sendiri, Nestler EJ. Induksi DeltaFosB dalam korteks orbitofrontal memediasi toleransi terhadap disfungsi kognitif yang diinduksi kokain. J Neurosci. 2007; 27: 10497 – 10507. [PubMed]
66. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchman T, Berton O, Sim-Selley LJ, Dileone RJ, Kumar A, Nestler EJ. Peran penting untuk DeltaFosB dalam nukleus accumbens dalam aksi morfin. Nat Neurosci. 2006; 9: 205 – 211. [PubMed]
67. Zhang R, Khoo MS, Wu Y, Yang Y, Grueter CE, Ni G, Harga EE, Jr, Thiel W, Guatimosim S, Lagu LS, Madu EC, Shah AN, Vishnivetskaya TA, Atkinson JB, Gurevich VV, Salama G, Lederer WJ, Colbran RJ, Anderson ME. Penghambatan Calmodulin kinase II melindungi terhadap penyakit jantung struktural. Nat Med. 2005; 11: 409 – 417. [PubMed]