Proc Natl Acad Sci US A. 2005 Februari 1; 102(5): 1737-1742.
Abstrak
Kokain, obat pelecehan, meningkatkan kadar dopamin sinaptik di striatum dengan menghalangi pengambilan kembali dopamin di terminal akson. Cyclin-dependent kinase 5 (Cdk5) dan aktivatornya p35, protein yang terlibat dalam fosforilasi substrat dalam neuron postmitotik, telah ditemukan diatur kembali setelah paparan kronis terhadap kokain. Untuk meneliti lebih lanjut efek induksi Cdk5 dan p35 pada pensinyalan striatal dopamin, kami menghasilkan dua garis mouse transgenik independen di mana Cdk5 atau p35 diekspresikan secara berlebihan dalam neuron. Kami melaporkan di sini bahwa peningkatan aktivitas Cdk5, sebagai hasil dari p35 tetapi bukan dari overekspresi Cdk5, mengarah pada pelemahan pensinyalan dopamin yang dimediasi kokain. Peningkatan fosforilasi dopamin yang dimediasi Cdk5 yang dimediasi dan camp-phosphoprotein yang diatur oleh cAMP, massa molekul 32 kDa (DARPP-32) di Thr-75, disertai dengan penurunan fosforilasi DARPP-32 di Thr-34. Peningkatan fosforilasi yang dimediasi oleh Cdk5 dari kinase kinase kinase 1 yang diatur sinyal ekstraseluler di Thr-286 disertai dengan penurunan aktivasi kinase yang diatur sinyal ekstraseluler 1 / 2. Efek-efek ini berkontribusi terhadap pelemahan fosforilasi yang diinduksi kokain dari protein pengikat elemen respons cAMP serta lebih sedikit induksi c-fos dalam striatum. Hasil ini mendukung gagasan bahwa aktivitas Cdk5 terlibat dalam mengubah ekspresi gen setelah paparan kronis terhadap kokain dan karenanya berdampak pada perubahan jangka panjang fungsi neuron yang mendasari kecanduan kokain.
Kokain meningkatkan kadar dopamin sinaptik di striatum dan mengubah ekspresi gen di neuron dopaminoseptif dengan mengaktifkan jalur intraseluler yang menyebarkan sinyal awal dari reseptor D1 dopamin ke nukleus (1). Paparan kronis terhadap kokain mengatur beberapa faktor transkripsi, menghasilkan perubahan ekspresi gen yang dianggap mendasari adaptasi neuron dalam kecanduan kokain yang bertahan lama (2). ΔFosB, diidentifikasi sebagai faktor transkripsi seperti itu (3), telah terbukti meningkatkan respons perilaku hewan terhadap kokain (4, 5). Oleh karena itu, identifikasi gen target yang diatur oleh induksi osFosB diharapkan berkontribusi untuk pemahaman yang lebih besar tentang mekanisme molekuler yang mendasari kecanduan kokain. Baru-baru ini, pengobatan kronis pada hewan dengan kokain telah terbukti meningkatkan pengaturan ekspresi cyclin-dependent kinase 5 (Cdk5) dan aktivatornya p35 dalam striatum melalui induksi ΔFosB (6, 7).
Cdk5 adalah anggota keluarga Cdk dari serin / treonin kinase. Tidak seperti Cdks lain yang merupakan regulator utama dari perkembangan siklus sel, Cdk5 terutama terlibat dalam fosforilasi substrat dalam neuron postmitotik (8). Kekhasan neuronal dari aktivitas Cdk5 dicapai melalui hubungan dengan aktivatornya, baik p35 atau p39, yang sebagian besar diekspresikan dalam neuron postmitotic (8). Selain peran penting Cdk5 dalam perkembangan otak (9, 10), sayat juga terlibat dalam transmisi dopaminergik di otak pascanatal (11, 12). Penghambatan aktivitas Cdk5 menghasilkan peningkatan pelepasan dopamin di striatum, menunjukkan fungsi presynaptic dari Cdk5 sebagai regulator negatif pelepasan dopamin (11). Lebih lanjut, Cdk5 memodulasi kemanjuran pensinyalan dopamin post-sinaptik dengan fosforilasi dopamin- dan fosfoprotein teregulasi-cAMP, massa molekul 32 kDa (DARPP-32) di Thr-75, yang mengubah DARPP-32 menjadi penghambat cAMP-a (PKAMP-dependent) (12).
Pengamatan ini menunjukkan bahwa Cdk5 dan p35 adalah regulator hilir dari aktivasi yang lama dari pensinyalan dopamin setelah paparan kronis terhadap kokain dan karenanya dalam kecanduan kokain. Untuk lebih jauh membahas peran Cdk5 pada pensinyalan driamin striatal, kami menghasilkan dua garis tikus transgenik di mana Cdk5 atau p35 diekspresikan secara berlebihan khususnya dalam neuron di bawah kendali promotor p35. Temuan kami menunjukkan bahwa aktivitas Cdk5 diatur dengan peningkatan kadar protein p35 tetapi tidak pada protein Cdk5, menunjukkan bahwa tingkat protein p35 membatasi laju aktivitas Cdk5. Kami sediakan di sini in vivo bukti bahwa peningkatan aktivitas Cdk5, sebagai hasil dari ekspresi berlebih p35, mengarah pada pelemahan pensinyalan dopamin yang dimediasi kokain ke nukleus melalui penghambatan cascade kinase regulated regulated signal (ERK) PKA dan ekstraseluler.
Bahan dan Metode
Antibodi. Antibodi poliklonal untuk Cdk5 (C-8) dan p35 (C-19) dibeli dari Santa Cruz Biotechnology. Antibodi yang bergantung pada fosforilasi dan independen terhadap ERK kinase (MEK) 1 / 2, ERK1 / 2, dan protein pengikat elemen respons-cAMP (CREB) diperoleh dari Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Antibodi terhadap phospho-Thr-34 DARPP 32 (13), phospho-Thr-75 DARPP-32 (12), total DARPP-32 (12), dan c-fos (14) digunakan seperti yang dijelaskan. Antibodi terhadap aktin dibeli dari Sigma.
Hewan Eksperimental. Kami sebelumnya mengkloning gen p35 tikus Gʻotr5r1, yang mengkode protein p35, dan mengkarakterisasi struktur genomiknya (15). Untuk menghasilkan tetikus transgenik dengan ekspresi berlebih neuronal p35 (Tgp35), 6-kb EcoRI-EcoFragmen RI yang berisi wilayah promotor 1.2-kb disubklonkan menjadi plasmid pGEM9Z (-), dan tag 45-bp yang berasal dari SV40 dimasukkan ke dalam KpnSaya situs hilir poli (A+) sinyal (Ara. 1A). Tag berisi a SpeSaya situs untuk genotyping hewan. Fragmen 6-kb dikeluarkan dari plasmid dan dimurnikan, diikuti oleh injeksi transgen pronuklear untuk menghasilkan tikus transgenik. Untuk memeriksa profil ekspresi transgen di bawah kendali regulasi promotor 1.2-kb p35 in vivo, tikus transgenik ganda (Tgp35; p35 - / -) selanjutnya dihasilkan dengan menggunakan strategi pemuliaan dua langkah dimana tikus Tgp35 diregenerasi dalam latar belakang p35-null endogen. Model tikus lain yang digunakan dalam penelitian ini termasuk p35 +/–, p35 - / -, Cdk5 +/–, dan mouse transgenik dengan neuronal overexpression Cdk5 (TgCdk5) (9, 16, 17). Genotipe tikus ini ditentukan dengan melakukan analisis Southern blot atau PCR pada DNA genom yang diisolasi dari biopsi ekor. Tikus ditempatkan di bawah siklus gelap 12-h / 12-h. Semua perawatan diberikan sesuai dengan pedoman National Institutes of Health tentang perawatan dan penggunaan hewan percobaan dan laboratorium.
Analisis Southern Blot. DNA genomik yang diekstraksi dari biopsi ekor dicerna EcoRI dan SpeSaya, secara elektroforesis pada gel agarosa 0.9%, dan dipindahkan ke membran nilon. Membran hibridisasi dengan acak-prima 32Probe berlabel P pada 42 ° C semalam. Probe 485-bp untuk genotipe knockout p35 (p35 - / -) dan Tgp35 dihasilkan oleh PCR dengan menggunakan primer berikut: 5′-ACATCCTGCTGCCACGGGACGGACACGGTGAC-3 ′ dan 5′ -AGACAAA Membran hibridisasi dicuci dua kali dalam 3 × SSC / 2% SDS pada 0.1 ° C selama 42 min, dan dua kali dalam 10 × SSC / 0.1% SDS pada 0.1 ° C untuk 65 min, dan terkena film sinar-X.
Perawatan Obat. Kokain (Sigma) dilarutkan dalam larutan garam steril. Hewan disuntik dengan kokain (15 mg / kg) atau volume salin yang sama pada usia bulan 3 dan dibunuh dengan pemenggalan kepala pada titik waktu yang berbeda (15, 30, 60, dan 120 min) setelah injeksi. Otak dengan cepat diangkat dan didinginkan dalam PBS dingin. Striata kemudian dibedah dan dilakukan analisis blot Utara atau Barat. Untuk analisis imunohistokimia, bagian striatal diperoleh dari tikus 2 jam setelah injeksi.
Analisis Blot Utara. Total RNA diekstraksi dari striata dengan reagen TRIzol (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) dan dikenai analisis Northern blot seperti yang dijelaskan (18). Untuk mendeteksi c-fos mRNA, sebuah fragmen 189-bp dari mouse c-fos cDNA digunakan sebagai penyelidikan seperti yang dijelaskan (19). Tingkat c-fos mRNA dikuantifikasi dengan mengukur kepadatan optik pita spesifik dengan menggunakan sistem analisis gambar dengan perangkat lunak nih image, Versi 1.62.
Analisis Western Blot. Jaringan striatal disonikasi dalam 1% SDS dan direbus selama 10 min. Konsentrasi protein dalam setiap sampel ditentukan oleh BCA protein assay (Pierce). Jumlah protein yang sama dipisahkan oleh SDS / PAGE sebelum dipindahkan ke membran nitroselulosa. Membran diblokir dalam 1 × PBS yang mengandung 5% susu skim dan 0.05% Tween 20 dan diinkubasi dengan antibodi primer semalaman pada 4 ° C. Inkubasi dengan anti-tikus atau kelinci IgG (Sigma) terkonjugasi peroksidase dilakukan pada suhu kamar selama 60 min. Sinyal terdeteksi oleh chemiluminescence yang ditingkatkan (Pierce), dan densitas optik dari pita dikuantifikasi seperti dijelaskan di atas.
Cdk5 Kinase Assay. Lisat striatal disiapkan dengan buffer lisis yang terdiri dari 50 mM Tris · HCl, pH 7.4 / 50 mM NaCl / 5 mM EDTA / 1% Triton X-100 / 1mMDTT / 1 mM fenilmetilXmg / mg / mg / mg / mg / mg ml leupeptin / inhibitor fosfatase (phosphatase inhibitor campuran I dan II, Sigma). Lisat di imunopresipitasi dengan antibodi anti-Cdk1 (C-1) atau anti-p5 (C-8). Immunoprecipitates Cdk35 disiapkan dengan inkubasi 19 μl dari lisat (sesuai dengan 5 μg protein) dengan antibodi anti-Cdk300 (300 μg) semalaman di 5 ° C diikuti dengan inkubasi lebih lanjut dengan 3 μl dari Manik-manik (Agar-agar Protein A-agar) % bubur dalam buffer lisis; Santa Cruz Biotechnology) untuk 4 jam pada 25 ° C. Untuk persiapan p50 immunoprecipitates, 3 μl dari lisat (sesuai dengan 4 mg protein) diinkubasi dengan antibodi anti-p35 (500 μg) seperti dijelaskan di atas. Imunopresipit dicuci dua kali dengan buffer lisis dan dua kali dengan buffer kinase yang terdiri dari 1 mM Tris · HCl, pH 35 / 3 mM MgCl2/ 1 mM EDTA / 1 mM EGTA / 1 mM DTT, diresuspensi dalam 60 μl buffer kinase. Aktivitas kinase diukur dengan menggunakan histone H1 sebagai substrat (18).
Imunohistokimia. Tikus dibius dengan injeksi ip avertin (250 mg / kg, Fluka) dan diperfusi transkartial dengan buffer natrium fosfat 0.1 M, pH 7.4, diikuti oleh Fixative Tissue Tissue (Laboratorium Streck, La Vista, NE), fiksatif yang tidak saling berkaitan. Otak yang dibedah selanjutnya diperbaiki dalam fiksatif yang sama pada malam hari di 37 ° C. Kemudian, otak tertanam dalam parafin, dipotong menjadi bagian koronal setebal 5-μm dan dikenakan imunohistokimia dengan menggunakan teknik kompleks avidin-biotin-peroksidase (Laboratorium Vektor) dengan diaminobenzidine sebagai substrat. Bagian diinkubasi dengan antibodi poliklonal yang dimurnikan afinitas terhadap c-fos semalaman di 4 ° C. Spesifisitas pewarnaan dinilai dengan menghilangkan antibodi primer.
Hasil
Generasi Mencit Transgenik dengan Ekspresi Neuronal p35. Transgen yang digunakan untuk mencapai peningkatan ekspresi neuron p35 terdiri dari fragmen 6-kb dari gen p35 tikus kloning yang mengandung promotor 1.2-kb dan seluruh urutan kode pengkodean p35 (Ara. 1 A). Genotipe tikus ditentukan dengan analisis Southern blot dengan menggunakan probe yang dirancang untuk membedakan tikus p35 - / - dan Tgp35 dari tikus tipe liar (Ara. 1 A dan B). Untuk memeriksa ekspresi transgen di bawah kendali promotor 1.2-kb p35, kami menghasilkan tikus transgenik ganda (Tgp35; p35 - / -) di mana ekspresi p35 didorong hanya dari transgen. Ekspresi p35 di Tgp35; p35 - / - tikus diamati hanya di otak (Ara. 1C), di mana pola ekspresi spasial mirip dengan tikus tipe liar (Ara. 1D). Kurangnya p35 telah terbukti menyebabkan struktur lapisan abnormal di korteks serebral dan hippocampus tikus (10). Namun, tikus Tgp35; p35 - / - menunjukkan penyelamatan lengkap fenotipe otak p35 - / - (Ara. 1E). Data ini menunjukkan bahwa promotor 1.2-kb p35 mengendalikan ekspresi transgen dengan profil ekspresi yang mirip dengan p35 dari gen p35 endogen.
Tingkat Protein p35 Adalah Pembatas-Tingkat untuk Pengaturan-Atas Kegiatan Cdk5. Kami memeriksa efek dosis gen dari gen yang mengkode p35 dan Cdk5 pada ekspresi protein dalam ekstrak striatal dari p35 - / -, p35 +/–, tipe liar, Tgp35, Cdk5 +/–, dan TgCdk5 tikus pada usia X bulan. Tingkat protein p3 dan Cdk35 berkorelasi baik dengan dosis gen, masing-masing (Ara. 2 A dan B). Tikus Tgp35 menunjukkan peningkatan protein1.6 kali lipat dalam tingkat protein p35 dibandingkan dengan tikus tipe liar, sedangkan kadar protein Cdk5 tidak terpengaruh oleh berbagai tingkat protein p35. Tikus TgCdk5 menunjukkan peningkatan protein1.9 kali lipat dalam tingkat protein Cdk5 dibandingkan dengan tikus tipe liar, sedangkan kadar protein p35 tidak terpengaruh oleh berbagai tingkat protein Cdk5. Untuk menguji efek dari jumlah protein p35 yang berbeda pada aktivitas Cdk5, Cdk5 di imunopresipitasi dari ekstrak striatal dengan antibodi anti-Cdk5 dan aktivitas kinase diukur. Demikian juga, untuk menguji efek dari jumlah protein Cdk5 yang berbeda pada aktivitas kinase, p35 diimunisasi secara resipien dari ekstrak striatal dengan antibodi anti p35, dan aktivitas kinase diukur. Aktivitas Cdk5 berkorelasi baik dengan tingkat protein p35 tetapi tidak dengan tingkat protein Cdk5 (Ara. 2 C dan D). Hasil ini menunjukkan bahwa jumlah protein p35 adalah faktor pembatas laju untuk aktivitas Cdk5. Oleh karena itu kami menggunakan tikus Tgp35 untuk menyelidiki efek dari peningkatan aktivitas Cdk5 pada pensinyalan dopamin striatal.
Fosforilasi DARPP-32 yang Diinduksi Kokain di Thr-34 Dilemahkan pada Tikus Tgp35 Fungsi DARPP-32 tergantung pada keadaan fosforilasi di beberapa situs (20). PKA memfosforilasi DARPP-32 di Thr-34, sedangkan Cdk5 memfosforilasi DARPP-32 di Thr-75. Dengan demikian, kami memeriksa keadaan fosforilasi DARPP-32 dalam ekstrak striatal dari tikus tipe-liar dan Tgp35. Tingkat phospho-Thr-75 DARPP-32 lebih tinggi pada tikus Tgp35 (Ara. 3A; 1.6 ± 0.2 - lipat di atas nilai tikus tipe liar). Kami selanjutnya menilai efek dari peningkatan aktivitas Cdk5 pada pensinyalan striatal dopamin. Kami memeriksa aktivasi PKA yang diinduksi kokain pada tikus Tgp35 dengan menganalisis keadaan fosforilasi DARPP-32 di Thr-34. Tingkat phospho-Thr-34 DARPP-32 meningkat pada tikus tipe liar 15 menit setelah injeksi kokain (Ara. 3B; 1.8 ± 0.2-lipat di atas level basal). Namun, efek kokain pada fosforilasi Thr-34 dari DARPP-32 dilemahkan pada tikus Tgp35 (1.2 ± 0.3-lipat di atas level basal). Hasil ini menunjukkan bahwa peningkatan aktivitas Cdk5 melemahkan aktivasi PKA yang diinduksi kokain mungkin melalui fosforilasi DARPP-32 di Thr-75 (6, 12). Mungkin juga bahwa peningkatan aktivitas Cdk5 presinaptik menyebabkan penurunan pelepasan dopamin, dan bahwa hal ini berkontribusi terhadap berkurangnya efek kokain. Khususnya, satu suntikan kokain tidak mempengaruhi kadar protein p35 dan Cdk5 serta aktivitas kinase (Ara. 3 C dan D). Ini berbeda dengan penelitian sebelumnya di mana paparan kronis terhadap kokain telah terbukti meningkatkan ekspresi p35 dan Cdk5 (6).
Pengaturan-Up Kegiatan Cdk5 Melemahkan Aktivasi ERK1 / 2 yang Diinduksi Kokain. Bukti terbaru menunjukkan bahwa aktivasi reseptor dopamin di striatum juga mengaktifkan kaskade pensinyalan lainnya, termasuk jalur ERK (21, 22), yang memiliki peran penting dalam respons perilaku terhadap kokain (23). Karena itu kami memeriksa apakah aktivitas Cdk5 dapat memengaruhi aktivasi jalur ERK yang diinduksi kokain. Aktivasi jalur ERK diamati setelah injeksi kokain dalam ekstrak striatal dari tikus tipe liar, terbukti dengan peningkatan fosforilasi MEK1 / 2 di Ser-217 dan Ser-221 (1.5 ± 0.2-lipat di atas tingkat basal) dan dari ERK1 / 2 pada Thr-202 dan Tyr-204 (ERK2 fosforilasi: 1.5 ± 0.2-lipat di atas level basal) (Ara. 4 A dan B). Namun, aktivasi MEK1 / 2 yang diinduksi kokain (1.2 ± 0.2-lipat di atas level basal) dan ERK1 / 2 (ERK2 fosforilasi: 1.2 ± 0.2-lipat di atas level basal) dilemahkan dalam TgpXNXAra. 4 A dan B). Selain itu, kadar basal fosfo-ERK1 / 2 lebih rendah pada tikus Tgp35 (0.8 ± 0.2-lipat di bawah nilai tikus tipe liar), sedangkan tren ini tidak signifikan secara statistik. Hasil terakhir ini mungkin dikaitkan dengan fosforilasi MEK5 yang bergantung pada Cdk1 di Thr-286, yang mengakibatkan penurunan aktivitas katalitik (24). Untuk menilai kemungkinan ini, kami menguji keadaan fosforilasi MEK1 di Thr-286 dan menemukan bahwa kadar fosfo-Thr-286 MEK1 yang lebih tinggi hadir dalam ekstrak striatal dari tikus Tgp35 (Ara. 4C; 1.3 ± 0.1 - lipat di atas nilai tikus tipe liar). Selain itu, keadaan fosforilasi MEK1 di Thr-286 tidak diubah dengan injeksi kokain tunggal, konsisten dengan temuan bahwa aktivitas Cdk5 tidak terpengaruh oleh pengobatan (Ara. 3D).
Propagasi Pensinyalan Dopamin ke Inti Diperburuk dengan Peningkatan Aktivitas Cdk5. Aktivasi yang diinduksi kokain dari kaskade pensinyalan multipel yang melibatkan PKA dan ERK mengarah ke aktivasi selanjutnya dari faktor transkripsi CREB dalam nukleus melalui fosforilasi di Ser-133 (22, 25). Untuk menyelidiki apakah efek penghambatan yang dimediasi Cdk5 pada kaskade aktivasi PKA dan ERK dapat menyatu pada fosforilasi CREB dalam nukleus, kami memeriksa keadaan fosforilasi CREB di Ser-133 dalam ekstrak striatal dari tikus tipe-liar dan Tgp35. Level basal fosfo-CREB lebih rendah pada tikus Tgp35 (0.7 ± 0.1-lipat dari nilai tikus tipe liar) (Ara. 5). Menanggapi injeksi kokain, tingkat fosfo-CREB meningkat pada striatum tikus tipe liar (1.5 ± 0.1-lipat di atas tingkat basal), tetapi respons terhadap kokain ini dilemahkan pada tikus Tgp35 (1.2 ± 0.1- lipat di atas level basal) (Ara. 5).
Fosforilasi CREB di Ser-133 menambah aktivitas transkripsionalnya melalui elemen respons cAMP di wilayah promotor gen tertentu, termasuk gen c-fos (26). Oleh karena itu kami memeriksa induksi c-fos di striatum tikus tipe liar dan Tgp35 setelah injeksi kokain. Pada tikus tipe liar, level c-fos mRNA meningkat ke nilai puncak (1.8 ± 0.2-lipat di atas level basal) 30 menit setelah injeksi kokain, dan kemudian kembali ke level basal oleh 120 menit setelah injeksi (Ara. 6 A dan B). Namun, kadar c-fos mRNA adalah ≈30% lebih rendah pada tikus Tgp35 daripada pada tikus tipe liar sampai 30 menit setelah injeksi (Ara. 6 A dan B). Induksi c-fos yang lebih rendah pada tikus Tgp35 diperkuat oleh imunohistokimia (Ara. 6 C-F). Pemberian kokain meningkatkan imunoreaktivitas c-fos, kuat di bagian dorsomedial-dorsocentral striatum dan lemah di bagian lateral, pada tikus tipe-liar dan Tgp35. Namun, peningkatan yang diinduksi kokain dalam jumlah sel c-fos-imunopositif terutama dilemahkan dalam striatum tikus Tgp35 (Ara. 6G). Bersama-sama, hasil ini menunjukkan bahwa peningkatan pemberian sinyal dopamin striatal yang dimediasi kokain ke nukleus dihambat pada tikus Tgp35, kemungkinan hasil dari peningkatan aktivitas Cdk5.
Diskusi
Cdk5 dan aktivatornya p35 telah diidentifikasi sebagai gen target yang diatur oleh paparan kronis terhadap kokain (6). Kami melaporkan di sini bukti bahwa peningkatan aktivitas Cdk5, sebagai hasil dari regulasi p35 dan bukan pengaturan Cdk5, mengarah pada pelemahan pensinyalan dopamin yang dimediasi kokain dalam neuron striatal. Untuk menguji konsekuensi ekspresi up-regulated dari Cdk5 atau p35 pada pensinyalan striatal dopamine, dua garis tikus transgenik, tikus TgCdk5 dan Tgp35, dianalisis. Kami menemukan bahwa aktivitas Cdk5 diatur secara proporsional dengan peningkatan level protein p35 tetapi tidak terpengaruh oleh peningkatan level protein Cdk5. Laporan kami sebelumnya juga menunjukkan bahwa aktivitas Cdk5 di otak tikus TgCdk5 lebih rendah daripada di otak tikus tipe liar ketika aktivitas diukur dengan menggunakan Cdk5 immunoprecipitates (17), menunjukkan bahwa overekspresi Cdk5 menghasilkan peningkatan level Cdk5 monomer jika level p35 tidak meningkat. Hasil ini menunjukkan bahwa tingkat protein p35 adalah faktor pembatas laju untuk aktivitas Cdk5.
Tikus Tgp35 menunjukkan induksi yang lebih rendah baik dari fosforilasi CREB dan c-fos di striatum setelah injeksi kokain akut, menunjukkan bahwa respon striatal terhadap kokain dihambat oleh peningkatan aktivitas Cdk5. Pelemahan pensinyalan dopamin yang dimediasi kokain pada tikus Tgp35 kemungkinan dicapai melalui penghambatan yang dimediasi oleh Cdk5 dari kaskade pensinyalan multipel yang melibatkan DARPP-32, PKA, dan ERK. Administrasi kokain meningkatkan fosforilasi PKA dari DARPP-32 di Thr-34 pada tikus tipe liar, sedangkan respons ini dilemahkan pada tikus Tgp35. Fosforilasi PKA dari DARPP-32 di Thr-34 telah terbukti menghambat aktivitas protein fosfatase 1 (PP1), enzim yang bertanggung jawab untuk defosforilasi Ser-133 dari CREB (27). Dengan demikian, aktivitas PP1 tidak akan dimusuhi melalui jalur DARPP-32 / PP1 pada tikus Tgp35.
Aktivasi ERK1 / 2 yang diinduksi kokain juga dilemahkan pada tikus Tgp35. Ada beberapa mekanisme berbeda dimana Cdk5 dapat menghambat aktivasi ERK1 / 2 yang diinduksi kokain. Pertama, fosforilasi DARPP-5 yang bergantung pada Cdk32 di Thr-75 dapat menghambat PKA, yang mengarah ke penghambatan selanjutnya dari setiap aktivasi MEK1 / 2 yang dimediasi PKA yang diperlukan untuk aktivasi ERK1 / 2. Sebuah studi baru-baru ini juga menemukan bahwa fosforilasi DARPP-32 di Thr-34 diperlukan untuk aktivasi ERK1 / 2 yang dimediasi kokain oleh beberapa jalur yang melibatkan regulasi tidak langsung dari aktivasi MEK serta melibatkan regulasi fosfatase yang diperkaya striatal, tyrosine fosfatase yang bertindak langsung pada ERK1 / 2 (28). Dukungan untuk kemungkinan ini disarankan oleh temuan bahwa fosforilasi MEK1 / 2 yang diinduksi kokain pada Ser-217 dan Ser-221 dihapuskan pada tikus Tgp35. Jalur lain yang mungkin dilakukan adalah melalui fosforilasi MEK5 yang bergantung pada Cdk1 di Thr-286, yang akan menghasilkan penurunan aktivitas katalitiknya dan menyebabkan penghambatan aktivitas ERK1 / 2 (24).
Penghambatan aktivitas Cdk5 di striatum telah terbukti mempotensiasi efek perilaku pengobatan kokain kronis pada hewan (6). Konsisten dengan hipotesis bahwa pengaturan aktivitas Cdk5 dapat berkontribusi pada adaptasi neuron untuk menangkal efek dari pemberian kokain berulang. (6), kami menemukan bahwa fosforilasi DARPP-5 dan MEK32 yang dimediasi Cdk1 berkontribusi pada pelemahan aktivasi ERK1 / 2 yang diinduksi kokain, menghasilkan induksi fosforilasi CREB yang lebih rendah dan c-fos dalam striatum. Temuan kami mendukung gagasan bahwa peningkatan aktivitas Cdk5, sebagai hasil dari pengaturan p35, dapat mengubah ekspresi gen di striatum setelah paparan kronis terhadap kokain. Ini dapat terjadi melalui perubahan dalam aktivitas faktor-faktor transkripsi seperti CREB dan c-fos. Dengan demikian, aktivator Cdk5 p35, berdasarkan efek pembatasan kecepatan pada aktivitas Cdk5, dapat berkontribusi pada perubahan jangka panjang pada fungsi neuron yang mendasari kecanduan kokain..
Ucapan Terima Kasih
Kami berterima kasih kepada Drs. Mary Jo Danton, Philip Grant, dan Sashi Kesavapany untuk membaca naskah secara kritis. Pekerjaan ini didukung oleh National Institutes of Health Grant Z01DE00664-05 (untuk ABK), Hibah Layanan Kesehatan Masyarakat AS DA10044, dan hibah dari Yayasan Simons, Yayasan Peter J. Sharp, dan Yayasan Picower (untuk PG).
Catatan
Singkatan: Cdk5, kinase-dependen 5; ERK, kinase yang diatur sinyal ekstraseluler; DARPP-32, fosfoprotein yang diatur dopamin dan cAMP, massa molekul 32 kDa; PKA, kinase tergantung cAMP; MEK, ERK kinase; CREB, protein yang mengikat elemen respons cAMP.
Referensi
;