sumber
Institut Nathan Kline, Orangeburg, New York, 10962, AS. [email dilindungi]
Abstrak
Anak-anak dan remaja semakin terpapar dengan psikostimulan, baik secara ilegal atau untuk pengobatan kondisi neuropsikiatri yang umum, seperti gangguan defisit perhatian dengan dan tanpa hiperaktif. Meskipun penggunaan stimulan psikomotor secara luas pada kelompok usia yang lebih muda, sedikit yang diketahui mengenai tanggapan neuroadaptif molekuler kronis terhadap agen ini di otak yang belum matang. Di sini kami menunjukkan bahwa, setelah pemberian psikostimulan kronis kokain dan amfetamin, faktor transkripsi DeltaFosB diregulasi dalam nucleus accumbens dari periadolescent tikus tetapi tidak pada pasca-weanling atau dewasa tikus. Induksi DeltaFosB juga terjadi secara eksklusif pada putamen kaudatus periadolescent tikus setelah amfetamin administrasi. Hasil ini menunjukkan plastisitas unik di otak remaja dari molekul kritis yang mengatur aksi psikostimulan dan menunjukkan bahwa perubahan neuroadaptif ini mungkin terlibat dalam mediasi ditingkatkan kecenderungan kecanduan pada remaja relatif terhadap orang dewasa.
Pengantar
Psikostimulan digunakan dalam pengobatan gangguan anak yang umum, seperti gangguan hiperaktif defisit perhatian. Selain itu, penyalahgunaan stimulan, termasuk amfetamin dan kokain, adalah umum di kalangan remaja, usia di mana ada bukti untuk kecenderungan kecanduan meningkat relatif terhadap orang dewasa (Estroff et al., 1989; Myers dan Anderson, 1991). Terlepas dari data yang menunjukkan efek perilaku yang diatur secara perkembangan, sedikit yang diketahui mengenai respons neuroadaptif molekuler di otak yang belum matang yang terjadi selama masa pemberian agen-agen ini. Kokain dan amfetamin dapat memengaruhi perubahan perilaku jangka panjang sebagian melalui stimulasi dopamin D1reseptor dan peningkatan kadar faktor transkripsi, termasuk osFosB, di striatum punggung (yaitu, putamen caudate) dan ventral striatum (yaitu, nucleus accumbens) (Chen et al., 1997). Peningkatan kadar ΔFosB, mungkin melalui stabilisasi produk protein, dipertahankan selama beberapa minggu setelah paparan kronis terhadap kokain atau amfetamin dan diatur setidaknya sebagian oleh jalur transduksi sinyal dopamin (Chen et al., 1997; Nestler et al., 2001).
Sistem dopaminergik sentral hewan muda sangat berubah-ubah akibat perubahan tingkat molekul kritis selama perkembangan normal, termasuk dopamin D1reseptor DARPP-32 (dopamin dan cAMP mengatur fosfoprotein; Mr 32 kDa) dan cAMP (Ehrlich et al., 1990;Teicher et al., 1993; Perrone-Capano et al., 1996; Tarazi et al., 1999;Andersen, 2002). Paparan selama periode ini untuk psikostimulan, yang meningkatkan neurotransmisi dopaminergik, karena itu dapat menghasilkan respons molekuler yang berbeda secara kuantitatif dan / atau kualitatif, termasuk perubahan dalam ekspresi ΔFosB. Untuk menguji hipotesis bahwa ada respons neuroadaptif yang bergantung pada usia selama pajanan kronis terhadap psikostimulan, tiga kelompok tikus dianalisis dalam eksperimen serial: orang dewasa (60 yang berusia saat onset injeksi), periadolesen (33 yang berusia saat onset injeksi), dan post-weanling (24 lama pada saat injeksi). Ini adalah perbandingan langsung pertama dari respons neuroadaptif molekuler terhadap paparan psikostimulan kronis pada ketiga kelompok umur ini. Kami menemukan bahwa, setelah paradigma pengobatan yang identik, tikus periadolescent menunjukkan peningkatan regulasi ΔFosB sebagai respons terhadap kokain dan amfetamin.
BAHAN DAN METODE
Pemberian hewan dan obat-obatan. Tikus CD-1 jantan (Laboratorium Charles River, Kingston, NY) ditempatkan pada siklus terang / gelap 12 jam (6: 00 AM hingga 6: 00 PM) dengan ad libitumakses ke makanan dan air. Hewan diizinkan untuk mengakomodasi ke ruang hewan untuk minimum 10 d sebelum dimulainya injeksi. Hewan-hewan ditangani oleh dua penyelidik yang melakukan semua suntikan di ruangan yang sama tempat hewan-hewan itu ditempatkan. Semua hewan disapih pada usia 21 d. Suntikan dimulai pada 24 (post-weanling), 33 (periadolescent), atau 60 (dewasa) pada usia. Hewan menerima 20 mg / kg kokain (Sigma, St. Louis, MO), 5 mg / kg amfetamin (Sigma), atau volume salin yang sama secara intraperitoneal antara 4: 00 dan 5: 00 PM setiap hari untuk 7 d. Hewan-hewan dibunuh oleh pemenggalan kepala setelah paparan singkat dengan CO2 di 10: 00 AM pada hari setelah injeksi terakhir. Otak segera dikeluarkan dari tengkorak, dan putamen caudate dan nucleus accumbens dengan cepat dibedah di atas es. Semua pembedahan dilakukan dari irisan otak koronal oleh seorang penyelidik tunggal, dan ekstrak protein dibuat dari jaringan segar tanpa pembekuan. Semua prosedur hewan disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusional dan sesuai dengan Institut Kesehatan Nasional Panduan untuk Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium.
Analisis western blot. Untuk analisis Western blot, jumlah protein yang sama (40 μg untuk caudate putamen dan 20 μg untuk nucleus accumbens) dari masing-masing sampel dimuat di setiap jalur gel 10% SDS-poliakrilamida setelah pengukuran konsentrasi protein dengan uji BCA (Pierce, Rockford, IL). Pemuatan protein yang sama juga diverifikasi oleh visualisasi protein total oleh Ponceau Red setelah transfer ke nitroselulosa dan / atau blotting dengan antibodi anti-aktin (1: 500; Sigma). Antiserum terkait Fos (FRA), yang mengenali isFosB isoform, diberikan dengan murah hati oleh Dr. M. Iadarola (Institut Kesehatan Nasional, Bethesda, MD) dan digunakan pada konsentrasi 1: 4000. Pelajaran sebelumnya (Chen et al., 1997; Hiroi et al., 1997), termasuk preadsorpsi antiserum FRA dengan imunogen M-peptida, menunjukkan spesifisitas antiserum ini. Antibodi monoklonal DARPP-32 5a, yang digunakan di 1: 10,000, dengan murah hati disediakan oleh Drs. Hugh Hemmings dan Paul Greengard (The Rockefeller University, New York, NY). Antibodi transporter dopamin (DAT) berasal dari Chemicon (Temecula, CA). Bercak bereaksi dengan sistem chemiluminescence NEN-DuPont (Boston, MA) dan terkena film. Nilai densitometri untuk oreFosB immunoreactivity diperoleh dengan menggunakan ScanAnalysis untuk Apple (Biosoft, Ferguson, MO). Signifikansi statistik ditentukan dengan menggunakan ANOVA satu arah, diikuti oleh post hoc Tes perbandingan berganda Tukey atau Student dua sisi yang tidak berpasangan t Tes seperti yang ditunjukkan pada gambar legenda. Untuk percobaan terapi obat, analisis setiap kelompok umur dilakukan pada blot yang terpisah, dan, oleh karena itu, masing-masing kelompok saline secara sewenang-wenang diberi nilai 100% untuk perbandingan antara kelompok umur. Untuk studi ontogeni, sampel dari semua kelompok umur dianalisis bersama dalam satu blot tunggal.
HASIL
Induksi ΔFosB setelah kokain dan amfetamin terjadi pada nukleus accumbens hanya tikus periadolescent
Ekspresi ΔFosB diukur dalam nucleus accumbens dan caudate putamen dari post-weanling, periadolescent, dan tikus dewasa setelah 7 d pemberian amfetamin atau pemberian kokain. Nukleus accumbens adalah daerah otak yang diyakini paling kritis untuk memediasi efek bermanfaat dari psikostimulan. ImmunFosB immunoreactivity (35 kDa) secara selektif diinduksi dalam nucleus accumbens hewan periadolescent setelah pemberian amfetamin kronis (Gbr. 1 A) atau kokain (Gbr. 1 B). Sebaliknya, kadar Î ”FosB (35 kDa) tidak berubah secara signifikan dalam nukleus accumbens hewan post-weanling atau hewan dewasa (Gbr.1 A,B). Dalam putamen kaudat, kadar Î ”FosB (35 kDa) juga secara signifikan diregulasi setelah pemberian amfetamin kronis hanya pada hewan periadolescent (Gbr.2 A). Ketiga kelompok umur menunjukkan peningkatan signifikan dalam ekspresi Fos ”FosB (35 kDa) dalam putamen kaudat setelah pemberian kokain kronis (Gbr.2 B). Besarnya induksi, bagaimanapun, adalah terbesar pada hewan periadolescent, terutama dibandingkan dengan post-weanlings (Gbr. 2 B). Isoform FRA dan Fos lainnya tidak berubah pada semua kelompok umur (data tidak ditampilkan).
ImmunFosB imunoreaktivitas dalam nukleus accumbens setelah pemberian psikostimulan kronis. Tikus CD-1 disuntikkan sekali sehari dengan saline, amfetamin, atau kokain untuk 7 d mulai pada hari 24 (P24; pasca penyapihan), hari 33 (P33; periadolescent), atau hari 60 (Dewasa). Tingkat imunoreaktivitas ΔFosB (35 kDa) dalam nucleus accumbens ditunjukkan setelah amfetamin kronis (A) atau kokain (B) administrasi. Perwakilan imunoblot dari saline- (S), amfetamin- (A), dan kokain- (C) disuntikkan pasca penyapihan (P24), periadolescent (P33), dan tikus dewasa ditunjukkan dalam panel atas. Panel bawah menunjukkan rata-rata ± persentase SEM dari ekspresi dasar ΔFosB. n nilai untuk masing-masing kelompok ditunjukkan dalam bar. Peningkatan signifikan pada ΔFosB ditemukan pada nucleus accumbens hanya tikus periadolescent. *p <0.05; **p <0.01 (Mahasiswa t uji; saline vs obat).
ΔFosB imunoreaktivitas pada putamen kaudat setelah pemberian psikostimulan kronis. Tikus CD-1 disuntikkan sekali sehari dengan saline, amfetamin, atau kokain untuk 7 d mulai pada hari 24 (P24; pasca penyapihan), hari 33 (P33; periadolescent), atau hari 60 (Dewasa). Tingkat imunoreaktivitas ΔFosB (35 kDa) dalam putamen kaudat ditunjukkan setelah amfetamin kronis (A) atau kokain (B) administrasi. Perwakilan imunoblot dari saline- (S), amfetamin- (A), dan kokain- (C) tikus disuntikkan periadolescent (P33) ditunjukkan dalampanel atas. Panel bawah menunjukkan rata-rata ± persentase SEM dari ekspresi dasar ΔFosB. n nilai untuk masing-masing kelompok ditunjukkan dalam bar. Peningkatan signifikan yang diinduksi amfetamin dalam oreFosB imunoreaktivitas ditemukan pada putamen kaudat dari hanya tikus periadolescent (A). Administrasi kokain kronis menghasilkan peningkatan ΔFosB di ketiga kelompok umur (B). *p <0.05; **p <0.01 (Mahasiswa t uji; saline vs obat).
Kadar DAT dan DARPP-32 tidak berubah setelah kokain kronis atau amfetamin
Beberapa molekul kunci diekspresikan oleh neuron dopaminergik dan / atau dopaminoseptif, termasuk DARPP-32, D1 reseptor dopamin, dan DAT, berkontribusi terhadap respons akut dan kronis terhadap psikostimulan (Moratalla et al., 1996; Fienberg et al., 1998; Sora et al., 1998; Gainetdinov et al., 2001). Data dari DARPP-32, D1 reseptor, dan tikus DAT null dan DAT knock-down menunjukkan hubungan yang rumit di antara levelnya, regulasi aktivitas dopaminergik, dan respons terhadap psikostimulan. Faktanya, induksi osFosB tidak terjadi pada tikus DARPP-32 null yang menerima kokain kronis (Fienberg et al., 1998). Pada tikus dewasa, bagaimanapun, paparan 7 d pada 20 mg / kg kokain tidak mengubah tingkat total DARPP-32 (Fienberg et al., 1998). Regulasi protein DAT belum pernah dilaporkan sebelumnya pada tikus yang terpapar kronis dengan psikostimulan, meskipun perubahan ikatan radioligand pada transporter dopamin setelah paparan psikostimulan telah dilaporkan pada beberapa spesies (Letchworth et al., 2001). Di sini kami mengukur kadar protein DARPP-32 dan DAT untuk menentukan apakah ekspresi protein ini diubah setelah pemberian psikostimulan kronis pada salah satu dari tiga usia tikus. Temuan kami menunjukkan bahwa tidak ada perubahan signifikan dalam tingkat total DARPP-32 atau DAT di seluruh putamen kaudat atau nukleus accumbens setelah pemberian kronis kokain atau amfetamin pada salah satu dari tiga kelompok umur (Tabel 1).
Nilai densitometri relatif untuk DARPP-32 dan DAT dalam P24, P33, dan mencit yang diobati dengan amfetamin dan kokain relatif terhadap kontrol, nilai salin, ditetapkan secara acak pada 100%
Level dasar ΔFosB diatur secara perkembangan
Kami memeriksa ontogeni dari osFosB karena tikus dewasa dengan peningkatan ekspresi ΔFosB yang direkayasa secara genetik di striatum memiliki respon perilaku yang tinggi terhadap psikostimulan (Kelz et al., 1999). Kami menemukan bahwa tingkat baseline ΔFosB secara signifikan lebih rendah pada hewan yang lebih muda dibandingkan dengan orang dewasa di putamen kaudat dan nucleus accumbens (Gbr.3 A). Tingkat penanda fungsional sistem dopamin, termasuk DARPP-32 (Ehrlich et al., 1990), DAT (Perrone-Capano et al., 1996), dan reseptor dopamin (Teicher et al., 1993; Tarazi et al., 1999) juga diatur secara perkembangan. Laporan sebelumnya pada tikus CD-1 menunjukkan puncak pada DARPP-32 striatal pada hari postnatal 28 (P28) (Ehrlich et al., 1990). Pada tikus caudate putamen dan nucleus accumbens, D1level reseptor memuncak dari P28 ke P40 (Teicher et al., 1993; Tarazi et al., 1999), tetapi penelitian serupa belum dilakukan pada mouse. Sebaliknya, di sini kami menemukan bahwa kadar protein DAT dalam putamen caudate dan nucleus accumbens adalah konstan antara hari postnatal 24 dan dewasa (Gbr. 3 B). Dengan demikian, rasio relatif antara D1 reseptor, DAT, DARPP-32, dan Î "FosB berbeda antara kelompok umur, berpotensi menghasilkan perbedaan D1 aktivitas reseptor yang dapat mempengaruhi tingkat induksi B ”FosB.
Ekspresi perkembangan Î ”FosB dan DAT. A, Î ”Fosore (35 - 37 kDa) imunoreaktivitas dalam putamen kaudat dan nukleus accumbens dari tikus CD-1 naif sebagai fungsi dari usia. Immoboblot representatif ditunjukkan dalam panel atas.Panel bawah acara berarti  ± SEM dari tiga tikus per kelompok. *p <0.05, dewasa versus P24; #p <0.05, dewasa versus P36 (uji perbandingan berganda Tukey setelah ANOVA). B, Nilai densitometrik imunoreaktivitas DAT pada putamen kaudat dan nucleus accumbens untuk tikus CD-1 naif sebagai fungsi dari usia. Tingkat DAT tidak berbeda di antara ketiga kelompok umur.
PEMBAHASAN
Efek perilaku stimulan psikomotor tergantung pada usia. Kecenderungan adiktif yang tertinggi pada remaja, ketika penggunaan zat terlarang meningkat (Estroff et al., 1989; Myers dan Anderson, 1991). Faktanya, anak-anak yang lebih kecil sering menjadi dysphoric ketika terpapar psikostimulan, sedangkan remaja dan orang dewasa mengalami euforia (Rapoport et al., 1980). Dalam model hewan pengerat, beberapa penelitian menunjukkan bahwa hewan periadolescent memiliki tingkat aktivitas awal yang lebih tinggi (Tombak dan Rem, 1983) dan mengubah respons terhadap psikostimulan relatif terhadap hewan yang lebih muda dan lebih tua. Dengan demikian, mereka menunjukkan lebih sedikit stimulasi lokomotor dan pencarian kebaruan dalam menanggapi pemberian psikostimulan dosis rendah akut relatif terhadap hewan yang disapih dan dewasa tetapi meningkatkan hiperaktif setelah pengobatan dosis tinggi. Dengan pemberian kronis, kepekaan terhadap penggerak yang diinduksi kokain lebih besar pada tikus periadolescent dibandingkan dengan orang dewasa, sedangkan kepekaan terhadap stereotip lebih rendah. Juga, data mikrodialisis telah mengungkapkan perbedaan antara tikus periadolescent dan dewasa dalam hal sensitisasi terhadap pelepasan dopamin yang diinduksi amfetamin (Laviola et al., 1995; Adriani et al., 1998; Adriani dan Laviola, 2000;Laviola et al., 2001). Namun, ada studi yang bertentangan mengenai reaktivitas jangka panjang terhadap kokain setelah pemberian methylphenidate pada tikus remaja (Brandon et al., 2001; Andersen et al., 2002). Dua laporan terakhir ini menyoroti kesulitan dalam membandingkan studi ketika paradigma eksperimental yang berbeda digunakan. Upaya untuk membandingkan studi perilaku pada hewan muda lebih lanjut dikacaukan dengan menggunakan berbagai spesies dan strain.
Tikus menjadi model hewan yang semakin penting dalam studi penggunaan dan penyalahgunaan psikostimulan, dan ini adalah analisis sistematis pertama dari respons neuroadaptif molekuler dalam tiga usia perkembangan berbeda pada tikus atau spesies tunggal lainnya. Penelitian sebelumnya dari mana kami memperoleh paradigma pengobatan kami telah menunjukkan peningkatan Î ”FosB pada dorsal dan ventral striatum terisolasi dari tikus dewasa tipe liar setelah pemberian kokain kronis dan pemberian amfetamin (Hope et al., 1994; Nye et al., 1995; Turgeon et al., 1997) tetapi hanya pada kombinasi dorsal dan ventral striatum atau dorsal striatum terisolasi pada tikus dewasa tipe liar setelah kokain kronis (Fienberg et al., 1998; Zachariou et al., 2001).
Kami sekarang menunjukkan perbedaan spasial dan kuantitatif pada psikostimulan yang diinduksi Fos ”FosB pada tikus pascapanen, peranakan, dan dewasa. Pengamatan respon yang tinggi pada hewan periadolescent dibandingkan dengan orang dewasa dan pasca-weanling diperkuat oleh fakta bahwa responnya serupa pada tikus yang diobati dengan kokain dan amfetamin. Psikostimulan kokain dan amfetamin meningkatkan dopamin sinaptik, serta serotonin dan norepinefrin, tetapi dengan mekanisme yang berbeda. Kokain berikatan dengan transporter plasmalemma untuk dopamin, serotonin, dan norepinefrin dan menghambat reuptake mereka ke terminal presinaptik. Sebaliknya, amfetamin mendorong pelepasan pemancar ini. Induksi selektif Î ”FosB dalam nukleus accumbens hanya pada kelompok usia periadolescent setelah 7 d pemberian stimulan dan induksi yang relatif lebih tinggi dari Δ FosB dalam caudate putamen mungkin merupakan representasi neurobiologis atau penyebab peningkatan kecenderungan yang telah dicatat sebelumnya. penyalahgunaan psikostimulan dalam kelompok usia ini (Estroff et al., 1989; Myers dan Anderson, 1991) dan perubahan jangka panjang lainnya dalam ekspresi gen, yang berbeda antara kelompok umur (Andersen et al., 2002). Selain itu, perbedaan-perbedaan ini mungkin secara intrinsik diatur oleh perubahan perkembangan pada level molekul kunci, termasuk Î ”FosB itu sendiri. Implikasi potensial dari perbedaan tingkat baseline Î ”FosB antara kelompok umur adalah analog dengan yang diusulkan mengenai perbedaan antara strain tikus (Haile et al., 2001). Bahkan, kami mengantisipasi bahwa perbedaan strain yang sama akan ditemukan di antara tikus inbrida. Ada juga kemungkinan bahwa tikus-tikus dari berbagai usia akan menunjukkan adaptasi molekuler yang berbeda di area otak selain nukleus accumbens. Analisis tambahan menggunakan tikus periadolescent dengan perubahan rekayasa genetika pada level molekul kunci dan pengamatan perilaku bersamaan akan lebih jauh menguji hipotesis ini.
Catatan kaki
- menerima April 8, 2002.
- Revisi diterima Agustus 6, 2002.
- Diterima Agustus 8, 2002.
-
Pekerjaan ini didukung oleh Institut Kesehatan Nasional / National Institute of Neurological Disorders dan Stroke Grant NS41871 (MEE dan EMU) dan National Institute on Drug Abuse Grant P30-DA13429 (EMU).
-
Korespondensi harus ditujukan kepada Dr. Michelle E. Ehrlich, Universitas Thomas Jefferson, Curtis 310, 1025 Walnut Street, Philadelphia, PA 19107. E-mail: [email dilindungi].
- Hak Cipta © 2002 Society for Neuroscience