J Neurosci. 2006 May 10;26(19):5131-42.
Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ.
sumber
Departemen Psikiatri, Pusat Ilmu Saraf Dasar, Pusat Medis Universitas Texas Barat Daya, Dallas, Texas 75390-9070, AS.
Abstrak
Faktor transkripsi DeltaFosB (juga disebut sebagai FosB2 atau FosB [bentuk pendek]) adalah mediator penting dari plastisitas jangka panjang yang diinduksi di otak oleh paparan kronis terhadap beberapa jenis rangsangan psikoaktif, termasuk obat penyalahgunaan, stres, dan kejang elektrokonvulsif. . Ciri khas DeltaFosB adalah, setelah diinduksi, ia bertahan di otak untuk jangka waktu yang relatif lama tanpa adanya stimulasi lebih lanjut. Namun, mekanisme yang mendasari stabilitas yang tampak ini tetap tidak diketahui. Di sini, kami menunjukkan bahwa DeltaFosB adalah faktor transkripsi yang relatif stabil, dengan waktu paruh sekitar 10 jam dalam kultur sel. Lebih jauh, kami menunjukkan bahwa DeltaFosB adalah fosfoprotein di otak dan fosforilasi residu serin yang sangat terkonservasi (Ser27) di DeltaFosB melindunginya dari degradasi proteasomal. Kami menyediakan beberapa baris bukti yang menunjukkan bahwa fosforilasi ini dimediasi oleh casein kinase 2. Temuan ini merupakan bukti pertama bahwa DeltaFosB difosforilasi dan menunjukkan bahwa fosforilasi berkontribusi terhadap stabilitasnya, yang merupakan inti dari kemampuannya untuk memediasi adaptasi jangka panjang di otak.
Pengantar
Faktor transkripsi ΔFosB, juga disebut FosB2 atau FosB [bentuk pendek], adalah varian sambatan terputus C terminus dari gen awal langsung EBB (Dobrazanski et al., 1991; Nakabeppu dan Nathans, 1991; Yen et al., 1991). Seperti FosB panjang penuh, ΔFosB memiliki domain dasar pengikatan DNA dan ritsleting leusin yang melaluinya dengan protein Jun untuk membentuk protein aktivator-1 (AP-1) kompleks faktor transkripsi, yang mengatur ekspresi banyak gen (Morgan dan Curran, 1995; Rylski dan Kaczmarek, 2004). Meskipun kekurangan bagian dari domain transaktivasi yang ditemukan di terminal C FosB, ΔFos berfungsi sebagai aktivator transkripsional yang kuat dan penekan dalam sel yang dikultur dan di otak (Dobrazanski et al., 1991; Nakabeppu dan Nathans, 1991; Chen et al., 1997; McClung dan Nestler, 2003; Kumar et al., 2005).
ΔFosB diinduksi ke tingkat tinggi dengan cara spesifik wilayah di otak setelah paparan kronis, tetapi tidak akut, terhadap berbagai rangsangan psikoaktif, termasuk stres, lesi tertentu, obat antipsikotik dan antidepresan, obat pelecehan, dan penghargaan alami (Hope et al., 1994b; Hiroi dan Graybiel, 1996; Moratalla et al., 1996; Bing et al., 1997; Mandelzys et al., 1997; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002; Andersson et al., 2003; Colby et al., 2003; Peakman et al., 2003; Perrotti et al., 2004; Zachariou et al., 2006). Induksi osFosB telah dikaitkan langsung dengan efek fungsional dari beberapa rangsangan pada otak. Kegigihan ΔFosB bahkan tanpa adanya stimulasi tambahan membedakannya dari semua faktor transkripsi keluarga Fos lainnya, yang diinduksi dengan cepat sebagai respons terhadap rangsangan akut, pembusukan kembali ke tingkat basal dalam beberapa jam, dan umumnya menunjukkan desensitisasi setelah stimulasi kronis (Hope et al., 1992; Daunais et al., 1993; Persico et al., 1993; Hiroi dan Graybiel, 1996; Perrotti et al., 2004). Hal ini menjadikan ΔFosB kandidat yang menarik untuk memediasi beberapa perubahan jangka panjang dalam ekspresi gen yang mendasari adaptasi neuron yang stabil yang disebabkan oleh rangsangan kronis tertentu.
Karena kehadiran ΔFosB yang berkepanjangan terjadi tanpa adanya induksi mRNA lebih lanjut (Chen et al., 1995), kami berspekulasi bahwa, tidak seperti FosB full-length dan semua protein keluarga Fos lainnya, yang secara intrinsik tidak stabil, ΔFosB mungkin merupakan faktor transkripsi stabil luar biasa (Hope et al., 1994b; Chen et al., 1997; Nestler et al., 2001; McClung et al., 2004). Selain itu, analisis immunoblotting jaringan otak akut-versus-stimulasi menyarankan bahwa suggestedFosB bergeser jelas Mr (massa molekul) dari ∼33 kDa dalam kondisi akut hingga ∼35-37 kDa selama perawatan kronis (Hope et al., 1994a; Chen et al., 1995). Karena tidak ada bukti untuk keberadaan mRNA tambahan yang dapat mengkodekan berbagai isoform ini, kami lebih lanjut berspekulasi bahwa BFosB dimodifikasi secara posttranslobal dan mungkin ini berkontribusi pada stabilitas yang tidak biasa. Sampai saat ini, bagaimanapun, tidak ada analisis biokimia dari omset atau modifikasi posttranslational dari ΔFosB telah dilaporkan. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menentukan apakah osFosB adalah fosfoprotein dan apakah fosforilasi berperan dalam stabilitasnya.
Bagian sebelumnyaBagian selanjutnya
Bahan dan Metode
Garis sel mamalia dan konstruksi DNA.
Sel-sel PC12 (Clontech, Mountainview, CA) dikultur dalam DMEM glukosa tinggi yang mengandung l-glutamin (L-Gln) dan dilengkapi dengan 5% serum bovine fetal (FBS), 10% serum kuda (keduanya dari Invitrogen, Carlsbad, CA) , 100 U / ml penisilin, dan 100 μg / ml streptomisin (keduanya dari Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Sel HeLa (American Type Culture Collection, Manassas, VA) dikultur dalam DMEM glukosa tinggi yang mengandung L-Gln dan ditambah dengan 10% FBS, penisilin, dan streptomisin. Kedua garis sel dipertahankan pada 37 ° C dalam 5% CO yang lembab2 suasana.
Untuk transeksi sementara dengan DNA, sel PC12 atau HeLa diunggulkan ke piring enam sumur (dilapisi dengan kolagen I untuk sel PC12) sehingga untuk mencapai pertemuan 90-100% keesokan harinya dan kemudian ditransfeksi menggunakan Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Dalam beberapa percobaan (lihat Buah ara. 1⇓⇓⇓⇓⇓-7), OsFosB diekspresikan secara sementara dalam sel PC12 melalui infeksi dengan virus herpes simpleks rekombinan (HSV).
DFDOSB dan FosB cDNA diperoleh dari pTetop-constructs kami sendiri (Chen et al., 1997), dan subklon ke dalam vektor pcDNA3.1 (Invitrogen). Konstruksi pcDNA3.1-ΔFosB / FosB ini digunakan untuk ekspresi dalam sel mamalia dan sebagai templat untuk mutagenesis diarahkan-situs. Rekombinan HSV-ΔFosB disiapkan seperti yang dijelaskan sebelumnya (Neve et al., 1997), dan persiapan memiliki titer ∼1 × 108 pfu / ml.
Eksperimen pengejaran nadi.
Kira-kira 24 jam setelah infeksi / transfeksi, sel-sel (PC12 atau HeLa) dalam piring enam sumur dicuci dua sampai tiga kali dengan 2 ml PBS dan diinkubasi pada 37 ° C untuk ∼1 jam dalam 2 ml Cys / Met-free DMEM (Invitrogen) ditambah dengan 5% dialisis FBS (Hyclone, Logan, UT) untuk menguras kumpulan intraseluler Met dan Cys. Pada akhir periode "kelaparan" ini, obat-obatan (jika sel harus dirawat) ditambahkan, dan sel diberi label (pulsa) dengan 12 – 25 μCi dari 35Campuran Pelabelan S Protein (PerkinElmer, Wellesley, MA) untuk ∼1 jam di 37 ° C untuk memberi label semua protein yang baru disintesis. Radiolabel kemudian dihilangkan dengan mencuci sel dua sampai tiga kali dengan 2 ml PBS, dan 35Protein berlabel S diikuti (chase) dengan mengganti medium dengan medium "dingin" (nonradioaktif) yang dilengkapi dengan 5% FBS dan memanen sel pada berbagai titik waktu. Perawatan sel dipertahankan sepanjang pengejaran. Semua gambar percobaan ini menunjukkan jumlah awal yang sama dari berbagai protein untuk mengoptimalkan perbandingan tingkat turnover mereka.
Hewan dan pengobatan kejang elektrokonvulsif kronis.
Tikus jantan Sprague Dawley dewasa (200-300 g; Laboratorium Charles River, Kingston, RI) diperlakukan sekali sehari dengan kejang electroconvulsive (ECS) untuk 7-9 d. ECS dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya (Hope et al., 1994a) menggunakan Ugo Basile (Comerio VA, Italia) Unit ECS dengan pengaturan berikut: frekuensi, pulsa 100 / s; pulsa dengan, 0.5 ms; durasi kejut, 1.0 s; dan saat ini, 75 mA. Hewan kontrol palsu diperlakukan secara paralel dengan menerapkan elektroda klip telinga tanpa arus listrik.
32 Pelabelan metabolisme P.
Untuk pelabelan irisan otak, tikus dipenggal kepalanya, otaknya dibedah dengan cepat, dan irisan kortikal frontal 300 μm disiapkan dengan mikroserik DSK (Ted Pella, Redding, CA). Irisan diinkubasi di dalam tabung plastik dalam 2 ml CSF buatan defisiensi-fosfat (ACSF) dan dipertahankan pada 30 ° C di bawah gelembung lembut konstan dengan O2/BERSAMA2 campuran (Hemmings et al., 1989). Irisan (dua irisan per tabung) diberi label dengan 1.3 mCi untuk 8 – 10 h dengan ada atau tidak adanya asam okadaat (100 ng / ml). Pada akhir inkubasi ini, irisan dibilas setidaknya tiga kali dengan ACSF dingin dan kemudian dihomogenisasi oleh sonikasi dalam 250 μl penyangga radioimunopresipitasi dingin (RIPA) buffer [PBS, pH 7.4, 150 mm NaCl, 1% (v / v ) Igepal, 0.5% (b / v) natrium deoksikolat, 0.1% (b / v) SDS, 1 mm EDTA] ditambahkan sebelum digunakan dengan SDS hingga 0.6%, koktail protease inhibitor untuk sel mamalia (digunakan pada 5 μl / ml; Sigma-Aldrich), koktail penghambat fosfatase I dan II (digunakan di 1: 100; Sigma-Aldrich), 1 mm PMSF, dan 2% gliserol. Homogenat kemudian direbus selama 15 min dan dibersihkan dengan sentrifugasi pada 15,000 × g untuk 15 min. Konsentrasi protein dalam supernatan yang dihasilkan dinilai menggunakan uji protein BCA (Pierce, Holmdel, NJ).
Untuk 32Pelabelan P dari sel yang dikultur, ∼24 h setelah infeksi / transfeksi, sel dicuci dua sampai tiga kali dengan media bebas fosfat dan diinkubasi dalam media ini selama N1 h. Setelah periode kelaparan ini, 0.2 – 0.3 mCi dari 32PH3PO4 (PerkinElmer) ditambahkan ke masing-masing sumur, dan sel diberi label untuk 4 – 12 h tergantung pada jenis percobaan (lihat Gambar. 1 – 7 untuk spesifikasi). Sel-sel kemudian dicuci tiga kali dengan PBS dan dilisiskan di atas es selama 15 menit dengan 50 μl dari buffer RIPA yang ditambahkan. Lisat dikumpulkan dengan cara dikorek dan dilewatkan 10 kali melalui jarum 25 untuk mencukur DNA, direbus selama 10 min, dan disentrifugasi pada 15,000 rpm untuk 15-30 min pada 4 ° C. Lisis yang dibersihkan (supernatan) dipindahkan ke tabung baru dan uji protein BCA (Pierce) dilakukan. Semua gambar dari percobaan ini menunjukkan jumlah yang sama dari total tipe liar (WT) dan S27A proteinsFosB protein untuk mengoptimalkan perbandingan tingkat fosforilasi relatif mereka.
Perawatan bahan kimia dan kultur sel.
Asam Okadaat (OA; Sigma-Aldrich) dilarutkan dalam etanol dan digunakan pada konsentrasi akhir 100 ng / ml. 5,6-Dichloro-1-β-d-ribofuranosyl-benzimidazole (DRB; Biomol, Rapat Plymouth, PA) dilarutkan dalam dimetil sulfoksida (DMSO; Sigma-Aldrich) dan digunakan dalam kultur sel pada konsentrasi akhir 50 μm. Spermine (Sigma-Aldrich) dilarutkan dalam air dan digunakan pada konsentrasi akhir 200 μm. Calphostin-C (Biomol) dilarutkan dalam DMSO dan digunakan pada 0.2 μm, sedangkan phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA; Promega, Madison, WI) dilarutkan dalam DMSO dan digunakan pada 0.1 μm. myristoylated-autocamtide-2 terkait inhibitor peptida (m-AIP; Biomol) dilarutkan dalam air dan digunakan pada konsentrasi akhir 1 dan 10 μm. Inhibitor protein kinase spektrum luas H-7 dan H-8 (Biomol) dilarutkan dalam air dan digunakan pada konsentrasi akhir masing-masing 150 dan 200 μm. MG132 (Calbiochem, San Diego, CA) dan epoxomicin (Peptides International, Louisville, KY) keduanya dilarutkan dalam DMSO dan digunakan pada konsentrasi akhir masing-masing 12.5 dan 7.5 μm. Dalam semua percobaan, DMSO (kendaraan) ditambahkan ke sel yang diperlukan untuk mempertahankan jumlah DMSO yang konstan di seluruh perawatan. Untuk 32Eksperimen pelabelan P, obat ditambahkan segera sebelum label dan disimpan selama sisa periode pelabelan. Untuk percobaan pengejaran nadi, obat-obatan ditambahkan pada saat Cys / Met “kelaparan,” disimpan melalui periode pelabelan, dan kemudian ditambahkan kembali ke dalam media pengejaran. Inhibitor proteasome dibubuhi setiap 3-4 h sepanjang pengejaran untuk mengimbangi pergantian cepat peptida ini.
ΔFosB imunopresipitasi, imunobloting, dan autoradiografi.
Untuk imunopresipitasi, lisat diencerkan 1: 5 dengan RIPA polos untuk menurunkan konsentrasi SDS hingga 0.1% sebelum melanjutkan dengan imunopresipitasi (IP). Untuk membatasi pengikatan nonspesifik, lisat pertama-tama dibersihkan dengan immunoprecipitating dengan non-imun IgG dan protein G-Sepharose (Sigma-Aldrich) untuk setidaknya 4 h. OsFosB kemudian diimunisasi dari lisat yang telah dibersihkan menggunakan antibodi poliklonal kambing yang mengenali adanya epitop internal baik dalam FosB maupun ΔFosB (SC-48G; Santa Cruz Bioteknologi, Santa Cruz, CA) di 0.5-1 μg IgG per 10g (50 – 300 μg total protein) dalam volume total 0.5 ml. IPs secara lembut dicampur pada 4 ° C pada rotor selama setidaknya 8 jam dan kemudian 15 μl protein G-Sepharose ditambahkan dan IPs dicampur untuk setidaknya 4 lain h. IP dipelet dengan memutar pada 3000 × g untuk 3 – 5 min pada 4 ° C, dicuci tiga kali dengan 0.5 ml RIPA polos dingin dan dua kali dengan PBS dingin yang mengandung 0.1% Tween 20. IPs kemudian diresuspensi dalam 0.5 ml PBS dingin, dipindahkan, dipeletkan dalam tabung baru, dan protein imunopresipitasi kemudian dielusi dengan penambahan 15-25 μl 2 × mengurangi buffer sampel protein Laemmli. Protokol IP ini menghasilkan curah hujan spesifik dan efektif dari hampir semua ΔFosB di lisat. Protein immunoprecipitated menjadi sasaran SDS-PAGE dengan memuat seluruh IP pada gel Kriteria Kriteria 12.5% Tris-HCl (Bio-Rad, Hercules, CA), dan kemudian ditransfer ke PVDF atau nitroselulosa. Setelah transfer, membran dikeringkan dengan udara dan 32P- dan 35Pita protein S-radiolabeled diamati dengan autoradiografi menggunakan film autoradiografi Kodak (Rochester, NY), serta fosforimaging menggunakan Storm (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) PhosphorImager. Total (tidak terfosforilasi dan terfosforilasi) ΔFosB dalam lisat sel atau homogenat otak dideteksi dengan imunoblotting baik dari protein yang di immunoprecipitated (menggunakan membran yang sama yang digunakan untuk mendeteksi 32Protein berlabel P), atau dengan jumlah yang sama dari protein lisat / homogenat yang dikenai SDS-PAGE dan ditransfer ke PVDF atau nitroselulosa. Membran pertama kali diblokir dengan menginkubasi dengan 1% (b / v) susu kering tanpa lemak (Bio-Rad) dalam PBS yang dilengkapi dengan 0.1% (v / v) Tween 20 (Sigma) untuk 1 h pada 25 ° C. Membran kemudian diimunoblot semalaman pada 4 ° C dengan antibodi poliklonal kelinci kami sendiri yang dihasilkan melawan asam amino 1-16 dari FosB / ΔFosB (digunakan di 1: 10,000). Setelah inkubasi primer, membran dicuci empat kali untuk 5 min dengan buffer blocking, dan kemudian diinkubasi pada 25 ° C selama ∼1 h dengan IgG anti-kelinci kambing yang dikonjugasikan ke horseradish peroxidase (digunakan di 1: 5000 dalam buffer blocking, dari Vector) Laboratorium, Burlingame, CA). Membran kemudian dicuci tiga kali selama 10 min dengan blocking buffer dan satu kali untuk 5 min dengan PBS. Total pita protein ΔFosB divisualisasikan pada film MR Kodak dengan peningkatan chemiluminescence (Pierce) dan / atau dengan deteksi fluoresensi menggunakan reagen ECL-Plus (Amersham Biosciences) dan Storm PhosphorImager.
Ekspresi berlebih dan pemurnian ombinFosB rekombinan dari sel serangga.
ΔFosB diekspresikan secara berlebihan dalam sel serangga Sf9 sebagai protein N terminus hexa-His-tagged (N-His (6) ΔFosB) menggunakan sistem ekspresi Bac-to-Bac baculovirus (Invitrogen) dan mengikuti instruksi dari pabriknya. Secara singkat, ΔFosB cDNA (residu 2 – 237) didahului oleh tag N-terminal afinitas MGHHHHHHAG disubklonkan dalam vektor pFASTBacTM1, yang digunakan untuk menghasilkan baculovirus rekombinan. Sel Sf9 terinfeksi dengan virus rekombinan, dan N-His (6) ΔFosB dimurnikan dari lisat sel dengan beberapa langkah kromatografi termasuk kromatografi afinitas menggunakan kolom nikel (Qiagen, Valencia, CA), pertukaran anion menggunakan kolom mono-Q (Amersham) Biosains), dan eksklusi ukuran menggunakan kolom filtrasi gel (Amersham Biosains).
Secara in vitro studi fosforilasi.
Secara in vitro reaksi fosforilasi untuk perjalanan waktu dan analisis stoikiometri dilakukan dalam volume 30 μl yang mengandung substrat 10 μm (N-Nya (6) ΔFosB atau substrat kontrol positif), 250 μm ATP, dan 1 μC AT / μl [γ-32P] ATP, buffer yang disediakan oleh produsen kinase, dan salah satu kinase berikut: CK2 (20 ng / μl; Bagian Utara, Charlottesville, VA), CaMKII (10 ng / μl; Bagian Utara), PKC (1.6 ng / μl; Calbiochem) atau p70S6K (2.5 mU / μl; Bagian utara). Reaksi saja waktu dilakukan dengan menghilangkan 5 μl alikuot dari larutan reaksi pada titik waktu yang ditentukan dan menambahkan volume yang sama dari 4 × mengurangi buffer sampel protein Laemmli. Parameter kinetik Michaelis-Menten untuk reaksi CK2 ditentukan dalam kondisi tunak linier yang ditentukan secara empiris. Reaksi ini dilakukan selama 15 min dalam volume 10 μl yang mengandung 2 ng / μl enzim, 250 μm ATP, 1 μCi / μl [γ-32P] ATP, dan N-His (6) Δ Konsentrasi FOSB mulai dari 2.5 – 30 μm. Semua reaksi dilakukan pada 30 ° C dalam bak air. Setelah SDS-PAGE dan pewarnaan gel dengan Bio-Safe Coomassie (Bio-Rad), gel dikeringkan, dan 32Penggabungan P-fosfat dinilai dengan analisis phosphorimaging (lihat di bawah, kuantifikasi data, perhitungan, dan statistik).
Peta dua dimensi fosfopeptida dan analisis asam fosfoamino.
Kedua analisis ini dilakukan seperti yang dijelaskan oleh Ploegh dan Dunn (2000). Secara singkat, fragmen gel kering mengandung 32P-label ΔFosB (baik dari in vitro reaksi atau dari immunoprecipitates sel yang diberi label secara metabolik), dikeluarkan, direhidrasi, dicuci, dan mengalami pencernaan tryptic. Supernatan yang mengandung produk pencernaan tryptic diliofilisasi dan liofilat dicuci beberapa kali dan disuspensikan kembali dalam 10 μl buffer elektroforesis, pH 1.9. Sampel (3 μl) terlihat pada pelat kromatografi lapis tipis (TLC) selulosa (Analtech, Newark, DE) dan dipisahkan dalam satu dimensi dengan elektroforesis dan dimensi lainnya dengan menaikkan TLC. Peta fosfopeptida yang dihasilkan divisualisasikan dengan autoradiografi dan phosphorimaging. Untuk analisis asam fosfoamino, 2 μl dari pencernaan tryptic yang telah disuspensikan kembali dalam buffer elektroforesis selanjutnya dibelah dengan hidrolisis HCl pada 105 ° C selama 25 min dalam 3 m HCl di bawah N2 suasana. Reaksi dihentikan dengan pengenceran enam kali lipat dalam air, dan campuran diliofilisasi. Likuofilat diresuspensi dalam 5 μl buffer elektroforesis, pH 1.9, dan terlihat pada pelat TLC selulosa bersama dengan standar fosfo-Ser, -Thr, dan -Tyr. Elektroforesis dilakukan lebih dari setengah panjang pelat TLC menggunakan buffer elektroforesis, pH 1.9, dan kemudian plat dipindahkan ke buffer pH 3.5, dan elektroforesis dilakukan hingga selesai. Standar asam fosfoamino divisualisasikan dengan menyemprot pelat TLC dengan larutan 1% (v / v) ninhidrin dalam aseton, dan 32Sampel asam amino berlabel P divisualisasikan oleh autoradiografi dan phosphorimaging.
knock-down CK2α siRNA yang diinduksi.
Kami menggunakan metode interferensi RNA untuk secara selektif merobohkan level CK2 (Di Maira et al., 2005). Sel-sel PC12 diunggulkan ke piring enam-sumur berlapis kolagen I untuk mencapai conf70-80% pertemuan hari berikutnya, ketika mereka ditransfusikan secara transien dengan 20 nm (konsentrasi akhir) baik siRNA yang tidak menargetkan atau siRNA diarahkan ke mRNA dari katalitik. Subunit α dari Rat CK2, menggunakan 5 μl dari agen transfeksi SilentFectin (Bio-Rad) dan mengikuti instruksi dari pabriknya. Kira-kira 24 h kemudian, sel-sel ditransfusikan secara transien dengan asmFosB plasmid, sebagaimana dinyatakan di atas. Sekitar 24 jam kemudian (∼48 jam setelah transfeksi siRNA), sel-sel dikenai 32Pelabelan metabolik P atau analisis pengejaran nadi seperti dijelaskan di atas. Keempat CK2α siRNA berikut digunakan dengan hasil yang serupa: 5′P-CAAACUAUAAUCGUACAUCUU3 ′, 5′P-UCAAUCAU-GACAUUAUG-UAGUCAUAUJAUUJAU LUAR UGUUUUUUUUUUUUAKUUAKUUAKU jika UUSU dengan UGA Sebagai kontrol negatif, kami menggunakan Peredam kontrol negatif #3 siRNA dari Ambion (Austin, TX). Tingkat knock-down CK2 dimonitor oleh imunoblotting menggunakan antibodi poliklonal anti-CK2 (katalog # 06-873 dari Upstate) semalam di pengenceran 1: 1000. β-Tubulin digunakan sebagai kontrol pemuatan dan dideteksi dengan antibodi monoklonal (katalog # 05-661 dari Upstate) semalaman di pengenceran 1: 20,000.
Mutagenesis diarahkan-situs.
Mutasi Ser27 ke Ala atau Asp dilakukan dengan menggunakan kit Mutagenesis Langsung-Ubah Situs (Stratagene, La Jolla, CA) dan mengikuti instruksi dari pabriknya. Untuk memperkenalkan mutasi Ser27 pada protein ΔFosB tikus, primer mutagenesis berikut digunakan. Ser27 ke Ala: (reverse primer) 5′GCCGAAGGAGTCCACCGAAGCCAGGTACTGAGACTCGGCGGAGGG3 ′. Ser27 ke Asp (forward primer) 5′CCCTCCGCCGAGTCTCAGTACCTGGATTCGGTGGACTCCTTCGGC3 ′. Basis yang bermutasi dicetak tebal, dan kodon Ser27 dicetak miring.
Bioinformatika.
Situs fosforilasi potensial dan kinase untuk ΔFosB dicari dengan mengirimkan urutan protein tikus ke database khusus termasuk ProSite (http://www.expasy.org/prosite/), PredictProtein (Rost et al., 2004), dan NetPhosK (Blom et al., 2004).
Kuantifikasi data, perhitungan, dan statistik.
Jumlah protein yang ada dalam PVDF atau membran nitroselulosa dikuantifikasi menggunakan Storm PhosphorImager dan perangkat lunak ImageQuant yang menyertainya (Amersham Biosciences / Molecular Dynamics). Dalam kultur sel dan studi fosforilasi irisan otak, nilai yang diperoleh untuk 32Protein berlabel P kemudian dibagi dengan nilai yang diperoleh untuk total ΔFosB, dan dinyatakan sebagai rasio. Dalam in vitro studi fosforilasi, jumlah 32-FosB berlabel P per mol ΔFosB (stoikiometri) dihitung seperti yang dijelaskan sebelumnya (Sahin et al., 2004). Semua pengukuran dilakukan dalam rentang linearitas instrumen yang digunakan. Parameter kinetik dihitung menggunakan model Michaelis-Menten, dimana V = Vmax[S] / ([S]+KM) Dan Vmax = k2[ETotal] Paruh (t1/2) ΔFosB dan FosB diestimasi dari plot pulse-chase (menggunakan regresi nonlinear yang paling cocok dengan titik data) dan sesuai dengan waktu di mana jumlah protein yang tersisa adalah 50% dari aslinya. Dalam semua gambar, hasil yang ditampilkan mewakili setidaknya dua hingga tiga percobaan independen. Dalam semua grafik, data yang ditampilkan adalah rata-rata ± SEM (3 ≤ n ≤16). Signifikansi statistik perbedaan dinilai menggunakan tidak berpasangan t menguji, dikoreksi untuk beberapa perbandingan, dan tanda bintang menunjukkan p ≤ 0.05.
Bagian sebelumnyaBagian selanjutnya
Hasil
ΔFosB adalah faktor transkripsi yang luar biasa stabil
Meskipun kami telah berspekulasi sebelumnya bahwa ΔFosB adalah faktor transkripsi yang relatif stabil (Nestler et al., 2001), analisis langsung dari profil turnover protein belum dilakukan. Untuk menjawab pertanyaan ini, kami melakukan percobaan pengejaran nadi menggunakan sel PC12, yang telah banyak digunakan sebagai garis sel seperti neuron, di mana ΔFosB diekspresikan secara sementara melalui infeksi dengan virus herpes simplex rekombinan (HSV-ΔFosB). Protein yang baru disintesis secara metabolik diberi label 35S-Met / Cys, dan pola degradasi 35Berlabel S osFosB (35S-ΔFosB) dipantau dengan immunoprecipitating dari lisat sel yang diperoleh di berbagai titik waktu setelah penghapusan asam amino radiolabeled. Analisis imunopresipit oleh SDS-PAGE dan autoradiografi mengungkapkan bahwa waktu paruh osFosB dalam sel PC12 adalah ∼10 h (Ara. 1). Temuan ini menunjukkan bahwa paruh ΔFosB lebih tinggi daripada faktor transkripsi yang paling diinduksi (lihat Diskusi), termasuk FosB panjang penuh, yang paruh-nya dalam kultur sel telah dilaporkan ∼90 min (Dobrazanski et al., 1991; Carle et al. 2004). Selain itu, perlu dicatat bahwa degradasi ΔFosB tidak cocok dengan kurva peluruhan eksponensial tingkat pertama, melainkan bersifat bifasik, dimulai dengan laju degradasi yang lebih lambat. Ini menunjukkan keberadaan lebih dari satu spesies osFosB dan / atau lebih dari satu jalur degradasi.
Lihat versi yang lebih besar:
Gambar 1.
ΔFosB adalah faktor transkripsi yang luar biasa stabil. Waktu paruh ΔFosB adalah ∼10 h dalam kultur sel. ΔFosB diekspresikan dalam sel PC12 oleh infeksi HSV-ΔFosB atau transien transien dengan asmFosB yang mengandung plasmid, dan sel-sel dikenai percobaan pengejaran nadi seperti dijelaskan dalam Bahan dan Metode. Hasil yang setara diperoleh terlepas dari metode yang digunakan untuk mengekspresikan ΔFB secara berlebihan. Gambar tersebut menunjukkan arah waktu (dan autoradiogram yang representatif) dari degradasi osFosB. Data yang diplot adalah rata-rata ± SEM dari setidaknya 15 poin data individual yang diperoleh dari setidaknya lima percobaan independen. Sebagai perbandingan, waktu paruh FosB full-length yang dilaporkan ditunjukkan.
ΔFosB adalah fosfoprotein di otak
Kami telah berhipotesis bahwa modifikasi pasca-translasional dari osFosB dapat berkontribusi pada stabilitasnya. Karena fosforilasi telah terbukti memodulasi aktivitas faktor transkripsi dalam banyak cara, termasuk stabilitasnya (untuk ulasan, lihat Desterro et al., 2000; Whitmarsh dan Davis, 2000), kami menyelidiki apakah ΔFosB adalah fosfoprotein. Untuk tujuan ini, ekspresi osFosB diinduksi dalam otak tikus menggunakan ECS kronis, suatu pengobatan yang diketahui menginduksi tingkat tinggi ΔFosB, terutama di korteks frontal (Hope et al., 1994a). Satu hari setelah perawatan ECS terakhir, ketika ΔFosB tetap tinggi, irisan kortikal frontal tipis disiapkan dan secara metabolik diberi label dengan 32P-ortofosfat. Sepotong irisan paralel tidak diberi radiolabel, dan ini digunakan untuk mendeteksi kadar ΔFB total. Setelah imunopresipitasi dengan antibodi anti-FosB / osFosB spesifik dan pemisahan protein immunoprecipitated oleh SDS-PAGE, terfosforilasi 32-FosB berlabel P dideteksi dengan autoradiografi, sedangkan ΔFosB total terdeteksi oleh imunoblotting. Analisis ini mengungkapkan bahwa ΔFosB terfosforilasi di otak, sebagaimana dibuktikan oleh spesifik 32Pita berlabel P ∼35 kDa hadir dalam sampel otak yang dirawat secara kronis, tetapi secara virtual tidak terdeteksi dalam kontrol yang diperlakukan secara palsu (Ara. 2A). Ini konsisten dengan fakta bahwa, tanpa adanya stimulasi kronis, tingkat basal dari BFosB sangat rendah. Spesifisitas reaksi imunopresipitasi diilustrasikan oleh kurangnya sinyal pada endapan IgG non-imun.
Lihat versi yang lebih besar:
Gambar 2.
ΔFosB adalah fosfoprotein di otak. A, OsFosB difosforilasi di otak. OgenFosB endogen diinduksi dalam otak tikus dengan pengobatan ECS kronis seperti yang dijelaskan dalam Bahan dan Metode. Irisan kortikal frontal diberi label metabolik 32PH3PO4 selama beberapa jam. Setelah homogenisasi irisan, ΔFosB di imunopresipitasi, dan ΔFosB terfosforilasi (32P-ΔFosB) dideteksi oleh autoradiografi (panel atas). Total ΔFosB pada imunopresipit nonradioaktif dideteksi oleh imunobloting (panel bawah). Sebagai kontrol negatif, ditampilkan imunopresipitasi hewan yang dipalsukan dan IgG non-imun. B, Situs fosforilasi dan kinase Kandidat dengan skor prediksi yang sesuai untuk sekuens protein ΔFB tikus diperoleh dengan analisis bioinformatik. Situs kandidat dengan skor prediksi lebih tinggi disorot dalam urutan protein dan tercantum dalam tabel. Domain (dasar) pengikat DNA dan ritsleting leusin dicetak tebal dalam urutan protein. C, D, PhosphFosB fosforilasi ditingkatkan oleh Ser / Thr phosphatase inhibitor OA. C, 32Kadar P-osFosB dalam imunopresipit dari irisan kortikal frontal berlabel tidak adanya (RKT) atau adanya 100 ng / ml OA (grafik dan panel atas) dideteksi dengan autoradiografi. Panel bawah menunjukkan ΔFosB total yang terdeteksi dalam imunopresipitat dari irisan yang tidak berlabel dengan immunoblotting. D, Sel-sel PC12 terinfeksi dengan HSV-ΔFosB atau HSV-LacZ (vektor) dan secara metabolik diberi label dengan 32PH3PO4 dengan tidak adanya (RKT) atau adanya 100 ng / ml OA. 32Kadar P-osFosB pada imunopresipit terdeteksi oleh autoradiografi (grafik, panel atas). Panel bawah menunjukkan ΔFosB total yang terdeteksi dalam lisat sel dengan imunoblotting.
Sebagai langkah pertama untuk menjelaskan mana kinase dan situs yang terlibat dalam fosforilasi BFosB, kami melakukan serangkaian asam amino dengan beberapa analisis bioinformatika. Ini mengungkapkan bahwa, meskipun ΔFosB tidak mengandung situs kandidat fosforilasi Tyr, ΔFosB mengandung beberapa situs konsensus Ser / Thr kinase, termasuk tiga situs CaMKII, tiga situs CK2, dan dua situs PKC dengan skor prediksi fosforilasi sangat tinggi (Ara. 2B). Jika, seperti yang diprediksi melalui bioinformatika, ΔFosB hanya terfosforilasi pada residu Ser atau Thr, maka fosforasinya harus dimodulasi secara signifikan oleh aktivitas Ser / Thr fosfatase. Untuk menguji hipotesis ini, kami memberi label irisan kortikal frontal 32P-ortofosfat dengan ada atau tidak adanya OA, suatu penghambat protein fosfatase Ser / Thr. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2C, OA menyebabkan peningkatan besar (∼2.5-lipat) 32P-ΔFosB. Ini juga menyebabkan peningkatan kecil dalam total ΔFosB, yang konsisten dengan laporan sebelumnya yang menghubungkan efek karsinogenik OA dengan kemampuannya untuk menginduksi beberapa gen awal langsung termasuk protein Fos (Miller et al., 1998; Choe et al., 2004). Hasil bersihnya adalah peningkatan keseluruhan yang signifikan (N60%) dalam tingkat ΔFosB terfosforilasi.
Kami kemudian menyelidiki apakah, dalam sel PC12, yang lebih cocok untuk manipulasi eksperimental, osFosB menunjukkan pola fosforilasi yang mirip dengan yang terlihat di otak. Kami menyatakan ΔFosB dalam sel PC12 melalui infeksi dengan HSV-ΔFosB dan secara metabolik memberi label sel dengan 32P-ortofosfat dengan ada atau tidak adanya OA. Ekspresi yang sukses dan imunopresipitasi protein dari sel yang terinfeksi HSV-osFos ditunjukkan oleh kehadiran keduanya di immunoblot (Ara. 2D, panel bawah) dan autoradiograf (panel atas) dari pita ∼35 kDa, tidak ada dalam sel yang terinfeksi vektor. Seperti yang diamati di otak, OA menyebabkan peningkatan kecil total ΔFosB tetapi peningkatan yang lebih tinggi (sekitar dua kali lipat) pada 32P-ΔFosB, menghasilkan peningkatan bersih yang signifikan (N50%) dalam fosforilasi osFosB. Selain itu, konsisten dengan prediksi bioinformatik, pengobatan sel PC12 dengan inhibitor fosfatase Tyr tidak menghasilkan perubahan signifikan dalam 32P-ΔFosB level (data tidak ditampilkan). Bersama-sama, temuan ini mengungkapkan bahwa osFosB terfosforilasi pada residu Ser dan / atau di otak dan dalam sel PC12 dan mengonfirmasi yang terakhir menjadi sistem kultur sel yang baik untuk mempelajari lebih lanjut profil fosforilasi dan degradasi ΔFosB.
CK2 tetapi bukan PKC atau CaMKII phosphorylates ΔFosB in vitro
Seperti dijelaskan di atas, analisis acidFosB urutan asam amino mengungkapkan skor prediksi tinggi untuk situs fosforilasi CK2, PKC, dan CaMKII. Untuk menentukan kinase mana yang mungkin memfosforilasi ΔFosB, kami melakukan serangkaian in vitro reaksi fosforilasi menggunakan kinase yang dimurnikan dan ombinFosB rekombinan murni. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3A, dari tiga kandidat kinase, hanya CK2 yang terfosforilasi ΔFosB secara signifikan. Selain itu, beberapa kinase lain diuji (misalnya, GSK3 dan p70S6K) tetapi gagal untuk secara signifikan memfosforilasi ΔFosB (data tidak ditampilkan). Karakterisasi tambahan dari reaksi CK2 dengan analisis waktu saja mengungkapkan bahwa kinase ini dapat mengkatalisasi penggabungan ∼0.5 mol fosfat per mol ΔFosB (Ara. 3B). Fakta bahwa CK2 dapat memfosforilasi ΔFosB in vitro untuk stoikiometri yang cukup (∼50%) menunjukkan reaksi yang relevan secara fisiologis. Kami kemudian mempelajari kinetika reaksi ini dengan menginkubasi CK2 dengan adanya peningkatan jumlah ΔFosB yang dimurnikan, dan kami menentukan bahwa CK2 memfosforilasi ΔFosB dengan Vmax dari 5.8 pmol · mnt-1 · Μg-1 enzim, a KM dari 18.4 μm, dan a kkucing dari 0.2 / s (Ara. 3C). Nilai yang diperoleh untuk parameter kinetik ini lebih jauh mendukung relevansi fisiologis dari reaksi ini. Misalnya, KM CK2 untuk DARPP32, salah satu substrat yang paling dikenal, adalah 3.4 μm, dan kkucing adalah ∼0.3 / s (Girault et al., 1989); itu KM untuk rentang ATP dari ∼10 – 40 μm (Cochet et al., 1983; Silva-Neto et al., 2002), dan untuk kasein berkisar dari ∼10 – 50 μm (Meggio et al., 1977; Pyerin et al., 1987). Bersama-sama, data ini menunjukkan bahwa ΔFosB adalah media yang bonafid untuk CK2 in vitro.
Lihat versi yang lebih besar:
Gambar 3.
CK2 tetapi bukan PKC atau CaMKII phosphorylates ΔFosB in vitro. Autoradiograf (panel atas) menunjukkan produk terfosforilasi, dan gel bernoda Coomassie (panel bawah) menunjukkan total ΔFosB yang ada dalam reaksi. A, Rekombinan murni ΔFosB menjadi sasaran in vitro fosforilasi oleh berbagai kandidat kinase (tiga di antaranya diperlihatkan). B, Analisis waktu dan stoikiometri menunjukkan bahwa CK2 dapat memfosforilasi ΔFosB in vitro dengan stoikiometri ∼50%. C, Analisis kinetik dari reaksi CK2 mengungkapkan bahwa BFosB adalah bonafid in vitro substrat. Linearisasi reaksi ditunjukkan dalam plot resiprokal ganda (bawah), tetapi parameter kinetik diturunkan dari kurva Michaelis-Menten (atas).
CK2 memodulasi fosforilasi dan stabilitas ΔFosB dalam sel utuh
Untuk menilai relevansi fisiologis fosforilasi yang dimediasi oleh CK2 dari UMFosB, kami melakukan pemetaan perbandingan fosfopeptida menggunakan in vitro oryFosB terfosforilasi dan PC12-sel-terfosforilasi. Setelah SDS-PAGE dan gel elusi dari 32P-osFosB (dari in vitro reaksi atau dari immunoprecipitate dari 32Sel berlabel P), protein dicerna dengan trypsin, dan fosfopeptida yang dihasilkan menjadi sasaran pemisahan dua dimensi. Analisis ini mengungkapkan bahwa fosfopeptida utama dari reaksi CK2 digabungkan dengan salah satu dari dua fosfopeptida utama dari ΔFosB yang terfosforilasi dalam sel PC12 (Ara. 4A), sedangkan fosfopeptida yang dihasilkan dari reaksi PKC atau CaMKII (data tidak ditampilkan) tidak. Ada ΔFosB fosfopeptida kedua yang hadir di peta dari sel PC12, tetapi karena ketidakmampuan kinase apa pun yang telah kami uji untuk menghasilkan fosfopeptida serupa in vitro, kami saat ini tidak tahu apakah fosfopeptida kedua ini mengandung situs fosforilasi yang berbeda dari fosfopeptida lain atau apakah itu mewakili peptida tryptic yang berbeda yang mengandung situs fosforilasi yang sama.
Lihat versi yang lebih besar:
Gambar 4.
CK2 memodulasi fosforilasi dan stabilitas ΔFosB dalam sel utuh. A, CK2 tetapi tidak PKC tampaknya memfosforilasi ΔFosB dalam sel. Peta fosfopeptida dua dimensi ΔFosB difosforilasi oleh CK2 atau PKC in vitro atau dengan sel PC12 yang utuh. Panah menunjukkan comigrasi dari peptida CK2-terfosforilasi tetapi bukan yang PKC-terfosforilasi dengan salah satu ΔFosB fosfopeptida yang diperoleh dari sel PC12. B, PhosphFosB fosforilasi dalam sel PC12 meningkat dengan memperlakukan sel dengan CK2 aktivator spermine (SP) yang kuat dan menurun dengan pengobatan dengan penghambat CK2 DRB. Sebaliknya, fosforilasi osFosB dalam sel PC12 tidak dipengaruhi oleh pengobatan dengan aktivator PKC (PMA) atau inhibitor spesifik PKC, calphostin-C (Calph). Autoradiogram representatif (panel atas) dan immunoblot (panel bawah) ditunjukkan. C – F, Pengaruh aktivitas CK2 pada stabilitas ΔFosB. Angka-angka menunjukkan arah waktu (dan autoradiogram yang representatif) dari degradasi osFB. Sel-sel PC12 yang mengekspresikan secara sementara osFosB menjadi sasaran percobaan pengejaran nadi yang dilakukan tanpa atau ada penghambat CK2 DRB (C), sperma aktivator CK2 (D), atau inhibitor spektrum luas kinase H-8 (E), yang digunakan untuk mengontrol efek spesifik DRB. F, Pengaruh merobohkan subunit katalitik CK2 pada stabilitas ΔFosB. Sel-sel PC12 ditransfeksi dengan siRNA nontargeting (Ctr) atau siRNA yang menargetkan tikus CK2α dan 24 yang kemudian ditransfeksi dengan asmFosB plasmid. Panel atas menggambarkan imunoblot lisat sel utuh yang menunjukkan efek siRNA CK2 pada tingkat protein CK2 dan ΔFosB. Immunoblot yang sesuai untuk β-tubulin ditampilkan sebagai kontrol pemuatan.
Untuk membahas lebih lanjut relevansi fisiologis CK2 sebagai kinFosB kinase, kami memperlakukan PCFosB yang mengekspresikan sel PC12 dengan dua obat yang memodulasi aktivitas CK2. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4B, PhosphFosB fosforilasi berkurang dengan pengobatan sel PC12 dengan penghambat sel CK2 yang permeabel DRB (Meggio et al., 1990; Szyszka et al., 1995), dan meningkat dengan pengobatan dengan polyamine spermine, yang dikenal sebagai aktivator CK2 yang kuat (Cochet dan Chambaz, 1983; Meggio et al., 1983). Sebaliknya, pengobatan sel PC12 dengan inhibitor PKC calphostin-C (Kobayashi et al., 1989; Tamaoki et al., 1990) atau PMA aktivator PKC (Schmidt dan Hecker, 1975; Beh et al., 1989) tidak menghasilkan perubahan signifikan dalam fosforilasi BFosB. Dalam kasus PMA, sedikit (dan tidak signifikan) peningkatan 32P-ΔFosB dapat diperhitungkan dengan peningkatan total ΔFosB yang disebabkan oleh obat ini; pada kenyataannya, telah dilaporkan bahwa ester phorbol menginduksi ekspresi beberapa protein keluarga Fos, termasuk FosB (Yoza et al., 1992; Suh et al., 2004). Selanjutnya, pengobatan sel dengan inhibitor CaMKII permeabel sel spesifik m-AIP (Ishida dan Fujisawa, 1995; Stevens et al., 1999) juga tidak mengakibatkan penurunan fosforilasi osFosB (data tidak ditampilkan). Bersama-sama, hasil ini konsisten dengan hasil kami in vitro menemukan dan menunjukkan bahwa dalam sel utuh osFosB kemungkinan terfosforilasi oleh CK2 tetapi tidak pada PKC atau CaMKII. Fakta bahwa penghambatan CK2 tidak sepenuhnya mencegah phosphFosB fosforilasi menunjukkan adanya situs fosforilasi tambahan dalam protein.
Kami selanjutnya memeriksa apakah CK2 berperan dalam pergantian ΔFosB dan karenanya dalam stabilitasnya. Untuk tujuan ini, kami melakukan eksperimen pulse-chase menggunakan PCFosB-expressing PC12 cells yang diobati dengan inhibitor CK2 atau aktivator CK2 yang digunakan dalam studi fosforilasi. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4C, perawatan sel dengan inhibitor CK2 DRB memiliki efek signifikan pada tingkat turnover ΔFosB, dibuktikan dengan perubahan bentuk kurva degradasinya, dari bifasik menjadi kurva yang lebih dekat dengan peluruhan eksponensial. Sebaliknya, kehadiran aktivator CK2 sperma menyebabkan penurunan yang signifikan dalam tingkat degradasi ΔFosB, yang menyebabkan akumulasi protein selama jam-jam pertama pengejaran (Ara. 4D).
Seperti halnya dengan banyak aktivator dan inhibitor kinase, sperma dan DRB dapat memiliki efek metabolik di luar modulasi aktivitas CK2. Bahkan, DRB telah terbukti menghambat faktor transkripsi IIH (TFIIH) -terkait kinase (Yankulov et al., 1995), yang menghasilkan penghambatan transkripsi yang dimediasi RNA polimerase II. Karena efek ini dapat mempengaruhi stabilitas ΔFosB, kami menganalisis efek inhibitor spektrum luas H-8 (Hidaka dan Kobayashi, 1992) pada pergantian osFosB pada konsentrasi (200 μm) yang diketahui menghambat kinase terkait TFIIH tetapi tidak pada CK2 (Yankulov et al., 1995). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4E, pengobatan dengan H-8 tidak mempengaruhi tingkat turnover ΔFosB. Hasil yang sama diperoleh dengan H-7, penghambat kinase spektrum luas lainnya, digunakan pada konsentrasi yang menghambat kinase terkait TFIIH tetapi tidak dengan CK2 (data tidak ditampilkan). Data ini lebih lanjut mendukung interpretasi bahwa pengurangan stabilitas ΔFosB yang disebabkan oleh DRB kemungkinan besar disebabkan oleh penghambatan CK2.
Untuk lebih menetapkan peran CK2 dalam pergantian osFosB, kami menyelidiki konsekuensi dari merobohkan CK2 melalui siRNA. Kami melakukan percobaan ini menggunakan sel PC12 yang pertama ditransfusikan dengan siRNA kontrol (nontargeting) atau siRNA yang menargetkan mRNA dari subunit katalitik tikus CK2 (CK2α) dan 24 yang kemudian ditransfusikan dengan ΔFosB. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4F, transfeksi dengan CK2α siRNA secara efisien dan secara spesifik merobohkan level protein CK2α tanpa mempengaruhi level ΔFosB (panel atas). Analisis pengejaran pulsa mengungkapkan bahwa merobohkan CK2 menghasilkan peningkatan signifikan dalam tingkat turnover ΔFosB sebagaimana dibuktikan oleh degradasi protein yang lebih cepat. Fakta bahwa menghambat aktivitas CK2 (baik melalui pengobatan DRB atau siRNA) meningkatkan pergantian ΔFosB dan mengakibatkan hilangnya komponen laju lambat dari kurva bifasik, sedangkan aktivasi CK2 meningkatkan fase lambat kurva, memberikan dukungan kuat untuk gagasan bahwa CK2 berperan dalam mengatur stabilitas ΔFosB.
CK2 phosphorylates ΔFosB pada Ser27
Untuk mulai mengidentifikasi situs pada ΔFosB yang difosforilasi oleh CK2, kami melakukan analisis asam fosfat amino dari rekombinan ΔFosB yang difosforilasi oleh CK2 in vitro dan ΔFosB difosforilasi dalam sel PC12. Eksperimen ini mengungkapkan bahwa, dalam kedua kasus, satu-satunya asam fosfat amino yang terdeteksi adalah fosfat-Ser (Ara. 5A). Temuan ini, bersama-sama dengan stoikiometri yang diperoleh untuk CK2 in vitro reaksi fosforilasi (∼50%) (Ara. 3B) dan keberadaan hanya satu tempat signifikan pada peta fosfopeptida CK2 (Ara. 4A), menunjukkan bahwa fosforilasi CK2 dari ΔFosB mungkin terbatas pada residu serin tunggal. Kesimpulan ini konsisten dengan analisis situs konsensus fosforilasi (Ara. 2B), yang memperkirakan hanya satu kandidat serine, yaitu, Ser27, untuk CK2. Analisis taksonomi mengungkapkan bahwa Ser27 sangat dilestarikan melalui evolusi di antara anggota keluarga Fos (Ara. 5B), menunjukkan bahwa itu mungkin memiliki fungsi fisiologis yang penting.
Lihat versi yang lebih besar:
Gambar 5.
CK2 Phosphorylates ΔFosB pada Ser27. A, Analisis asam fosfoamino dari CK2-terfosforilasi (in vitro) dan PC12 sel-terfosforilasi ΔFosB menunjukkan bahwa, dalam kedua kasus, residu utama terfosforilasi adalah serin. B, Analisis lintas spesies dari urutan asam amino FosB / ΔFosB mengungkapkan konservasi tinggi Ser27 di antara anggota keluarga Fos dari manusia hingga ikan zebra (sorotan gelap). Namun, residu asam pada posisi + 3, yang diperlukan untuk situs konsensus CK2, tidak dikonservasi (sorotan cahaya). C, Sel HeLa ditransfusikan secara transien dengan tipe liar ΔFosB (WT) atau ΔFosB yang mengandung mutasi titik untuk menggantikan Ser27 dengan Ala (S27A). Sel diberi label secara metabolik 32PH3PO4 dan diobati dengan kendaraan atau dengan sperma (SP) untuk mengaktifkan CK2. Autoradiogram representatif (panel atas) dan immunoblot (panel bawah) dari ΔFosB immunoprecipitate yang diperoleh ditunjukkan. Imunopresipitat sel yang ditransfock mock (vektor) ditunjukkan.
Untuk menentukan apakah Ser27 difosforilasi dalam ΔFosB, kami memutasikan residu ini menjadi Ala, dan menganalisis konsekuensi pada status fosforilasi protein. Untuk tujuan ini, kami menggunakan sel HeLa (yang dapat ditransfusikan dengan efisiensi lebih tinggi) untuk secara sementara mengekspresikan WT atau S27A mutan ΔFosB. Kira-kira 24 jam setelah transfeksi, sel-sel diberi label secara metabolik 32P-ortofosfat, dan lisat seluruh sel disiapkan. Setelah imunopresipitasi dan SDS-PAGE, 32P-ΔFosB dideteksi oleh autoradiografi dan total ΔFosB dengan imunoblotting. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5C (panel bawah), ΔFosB tidak terdeteksi dalam sel yang ditransfeksi vektor, sedangkan sel yang ditransfeksi dengan mutan WT atau S27A ΔFosB berhasil mengekspresikan protein. Kami menemukan bahwa mutasi S27A menyebabkan pengurangan (∼30%) yang signifikan pada 32Tingkat P-ΔFosB (Ara. 5C, panel atas dan grafik), menunjukkan bahwa dalam sel hidup, osFosB terfosforilasi pada Ser27. Dalam upaya untuk menentukan apakah dalam sel Ser27 memang terfosforilasi oleh CK2, kami membandingkan kemampuan sperma aktivator CK2 untuk memodulasi fosforilasi WT dan S27A ΔFosB. Seperti yang telah kami amati sebelumnya dalam sel PC12 (Ara. 4B), pengobatan sel HeLa dengan sperma secara signifikan meningkatkan fosforilasi protein WT. Fakta bahwa efek ini berkurang secara signifikan oleh mutasi S27A (Ara. 5C) mendukung interpretasi bahwa Ser27 dalam ΔFosB adalah substrat fisiologis untuk CK2.
Fosforilasi Ser27 mengatur stabilitas ΔFosB
Setelah menetapkan bahwa stabilitas ΔFosB berkurang ketika CK2 dihambat dan ditingkatkan ketika CK2 diaktifkan (Ara. 4), dan CK2 memfosforilasi ΔFosB pada Ser27 (Ara. 5), kami memperkirakan bahwa mencegah fosforilasi situs ini akan membuat protein tidak stabil. Eksperimen pengejaran nadi yang dilakukan dengan sel HeLa secara sementara mengekspresikan mutan WT atau S27A ΔFosB mengungkapkan bahwa, seperti yang diperkirakan, mutasi S27A menghasilkan peningkatan yang signifikan dalam laju degradasi ΔFosB, dan penurunan yang bersamaan pada paruh protein. (Ara. 6A). Kami kemudian menyelidiki apakah mekanisme pengaturan ini juga terjadi pada garis sel PC12 yang lebih mirip neuron. Eksperimen ini mengungkapkan bahwa, seperti yang telah kami amati dalam sel HeLa, mutasi titik S27A menyebabkan penurunan dramatis dalam paruh halfFosB dalam sel PC12 (dari ∼11 ke ∼4 h) (Ara. 6B). Fakta bahwa destabilisasi ini mirip dengan yang disebabkan oleh penghambatan CK2 atau knock-down (Ara. 4) memberikan dukungan lebih lanjut untuk gagasan bahwa fosforilasi yang dimediasi CK2 dari Ser27 mengatur stabilitas ΔFosB. Bukti tambahan untuk peran pengaturan fosforilasi Ser27 pada pergantian protein osFosB diperoleh dengan menggunakan Ser27 fosfomimetik ke mutasi Asp (S27D). Mutasi S27D dianggap fosfomimetik, karena menempatkan kelompok besar (karboksil) bermuatan negatif pada asam amino 27 dan dengan demikian sebagian meniru fosforilasi Ser27. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 6C, mutasi S27D menyebabkan efek sebaliknya dari mutasi S27A dan menghasilkan protein yang secara signifikan lebih stabil daripada protein WT. Demikian pula dengan efek yang diperoleh setelah aktivasi CK2 (Ara. 4D), mutasi S27D menghasilkan akumulasi dan dengan demikian meningkatkan ΔFosB selama jam-jam pertama pengejaran.
Lihat versi yang lebih besar:
Gambar 6.
Fosforilasi Ser27 mengatur stabilitas ΔFosB. A, C, Analisis Pulse-chase menunjukkan efek fosforilasi Ser27 pada tingkat turnover ΔFosB. Profil degradasi dan perkiraan waktu paruh tipe liar ΔFosB (WT), Ser27 ke Ala mutan (S27A), dan Ser27 fosfomimetik ke mutan Asp (S27D) ditampilkan. Temuan yang sama diperoleh dalam sel HeLa (A) dan sel PC12 (B, C).
Ser27 fosforilasi menstabilkan osFosB dengan mencegah degradasi proteasomalnya
Untuk mulai menjelaskan mekanisme di mana fosforilasi Ser27 menstabilkan osFosB, kami memeriksa kemampuan proteasome inhibitor MG132 (Palombella et al., 1994; Tsubuki et al., 1996) dan epoxomicin (Hanada et al., 1992; Kim et al., 1999) untuk memodulasi laju degradasi antFosB mutan WT dan S27A. Eksperimen pengejaran nadi dilakukan menggunakan sel PC12 yang terinfeksi HSV rekombinan yang mengekspresikan WT atau S27A ΔFosB dan diobati dengan DMSO atau salah satu dari dua inhibitor proteasome. Eksperimen ini mengungkapkan bahwa meskipun tingkat degradasi protein WT relatif tidak sensitif terhadap kehadiran salah satu dari dua inhibitor proteasome (Ara. 7A), bahwa mutan S27A sensitif terhadap obat ini (Ara. 7B). Ini menunjukkan bahwa, tidak seperti protein WT, mutan S27A adalah target degradasi proteasomal. Memang, pengobatan sel dengan baik MG132 atau epoxomicin sepenuhnya membalikkan efek mutasi S27A pada tingkat degradasi ΔFosB, dibuktikan dengan peningkatan waktu paruh mutan S27A dari ∼4 ke ∼9 h untuk MG132 dan ke ∼ 12 h untuk epoxomicin (Ara. 7B). Bersama-sama, temuan ini menunjukkan bahwa fosforilasi ΔFosB pada Ser27 melindungi protein dari degradasi proteasom dan oleh karena itu penting untuk stabilitas yang tidak biasa.
Lihat versi yang lebih besar:
Gambar 7.
Fosforilasi Ser27 menstabilkan ΔFosB dengan mencegah degradasi proteasomalnya. A, B, Analisis pengejaran nadi dengan sel PC12 yang terinfeksi HSV menunjukkan profil degradasi dan perkiraan waktu paruh tipe liar ΔFosB (A) atau S27A ΔFosB (B) dengan tidak adanya atau adanya salah satu dari dua inhibitor proteasome [MG132 dan epoxomicin (Epoxo)]. Perhatikan fakta bahwa tidak ada obat yang memiliki efek signifikan terhadap turnover tipe liar ΔFosB, sedangkan pengobatan sel dengan proteasome inhibitor menghasilkan stabilisasi S27A ΔFosB. C, Sebuah model untuk peran fosforilasi Ser27 dalam kemampuan ΔFosB untuk menengahi plastisitas otak jangka panjang. Setelah diinduksi, sebagian ΔFosB distabilkan di otak oleh fosforilasi S2 yang dimediasi oleh CK27. Ini menghasilkan akumulasi, yang pada gilirannya menghasilkan perubahan ekspresi gen yang tahan lama. Perubahan stabil dalam ekspresi gen ini berkontribusi pada adaptasi perilaku yang stabil. Sebaliknya, defosforilasi S27 oleh Ser / Thr phosphatases PP1 dan / atau PP2A menghasilkan destabilisasi protein dan pemrosesannya oleh mesin proteasomal.
Bagian sebelumnyaBagian selanjutnya
Diskusi
Dalam penelitian ini, kami menunjukkan bahwa osFosB memiliki waktu paruh ∼10 dalam kultur sel, yang membuatnya stabil dibandingkan dengan FosB panjang penuh dan sebagian besar faktor transkripsi diinduksi lainnya, yang waktu paruh dalam kultur sel dapat sesingkat beberapa menit dan jarang melebihi 3 h (Hann dan Eisenman, 1984; Dobrazanski et al., 1991; Roberts dan Whitelaw, 1999; Ferrara et al., 2003; Hirata et al., 2004). Selain itu, kami menemukan bahwa osFosB difosforilasi di otak dan fosforilasi peka terhadap asam okadaat inhibitor PP1 / PP2A. Studi kultur sel kami menunjukkan bahwa stabilitas ΔFosB dimodulasi oleh CK2, dengan aktivitas CK2 yang lebih tinggi menstabilkan protein. Akhirnya, temuan kami menunjukkan bahwa CK2 memfosforilasi ΔFosB pada N terminus serine (S27) yang sangat terkonservasi dan menunjukkan bahwa fosforilasi S27 melindungi ΔFosB dari degradasi proteasom. Oleh karena itu kami mengusulkan model di mana fosforilasi ΔFosB pada S27 oleh CK2 adalah mekanisme pengaturan kritis pergantian ΔFosB (Ara. 7C). Stabilisasi yang dimediasi fosforilasi dari osFosB secara fungsional penting, karena peningkatan kadar ΔFosB di daerah otak tertentu telah terbukti secara langsung mengatur banyak gen neuronal in vivo dan untuk memberikan efek perilaku yang kuat dalam model hewan dari beberapa gangguan neuropsikiatri (lihat Pendahuluan).
Meskipun fosforilasi adalah cara cepat dan reversibel untuk mengatur aktivitas transkripsi faktor transkripsi tertentu, seperti CREB (cAMP response element binding protein) (Bohmann, 1990), memodulasi degradasi faktor transkripsi menyediakan bentuk regulasi yang bahkan lebih kuat (kurang mudah dibalik) (Desterro et al., 2000). Faktor transkripsi yang aktivitas fungsionalnya diatur pada tingkat degradasinya termasuk NFkB (Desterro et al., 2000), c-Myc (Sears et al., 1999), dan c-Fos (Ferrara et al., 2003), diantara yang lain. Dalam banyak kasus, fosforilasi adalah pengatur utama stabilitas faktor transkripsi, seperti yang telah ditunjukkan untuk c-Fos (Okazaki dan Sagata, 1995; Tsurumi et al., 1995), Antigen terkait-1 (Fra-1) (Vial dan Marshall, 2003), Fra-2 (Manabe et al., 2001), c-Jun (Fuchs et al., 1996), JunB (Fuchs et al., 1997), ATF2 (Fuchs et al., 2000), dan p53 (Buschmann et al., 2001). Studi kami dengan demikian menambahkan osFosB ke daftar faktor transkripsi ini yang aktivitas fungsionalnya diatur melalui stabilitas yang bergantung pada fosforilasi.
CK2 adalah Ser / Thr kinase yang ada di mana-mana dan aktif secara konstitutif yang memiliki> 300 substrat konon diidentifikasi sejauh ini dan terlibat dalam berbagai proses biologis, termasuk kematian sel dan kelangsungan hidup (Litchfield, 2003; Unger et al., 2004), respons stres seluler (Yanagawa et al., 1997; Kato et al., 2003), dan perbaikan DNA dan remodeling kromatin (Barz et al., 2003; Krohn et al., 2003). Lebih dari sepertiga substrat diduga CK2 adalah protein yang terlibat dalam regulasi ekspresi gen (Meggio dan Pinna, 2003). Bahkan, CK2 telah terbukti menjadi nuklir kinase yang menonjol (Krek et al., 1992) (untuk ulasan, lihat Yu et al., 2001) dan untuk berinteraksi dengan domain bZIP dari beberapa faktor transkripsi (Yamaguchi et al., 1998). Fosforilasi yang dimediasi CK2 juga telah terbukti memodulasi degradasi (baik meningkatkan atau menurunkannya) dari banyak protein, termasuk IkB (Schwarz et al., 1996), PTEN (Torres dan Pulido, 2001), lensa connexin (Yin et al., 2000), protein terkait kromatin HMG1 (Wisniewski et al., 1999), dan beberapa faktor transkripsi seperti HMGB (Stemmer et al., 2002), Myf-5 (Winter et al., 1997), dan c-Myc (Channavajhala dan Seldin, 2002). CK2 paling melimpah di otak (Alcazar et al., 1988; Girault et al., 1990), dan aktivitasnya telah terlibat dalam banyak aspek fungsi otak, termasuk kelangsungan hidup neuron (Boehning et al., 2003), diferensiasi (Nuthall et al., 2004), fungsi saluran ion (Jones dan Yakel, 2003; Bildl et al., 2004), dan potensiasi jangka panjang dan plastisitas neuron (Diaz-Nido et al., 1992; Lieberman dan Mody, 1999; Reikhardt et al., 2003).
Meskipun semakin banyak bukti untuk peran CK2 dalam pengaturan fungsi saraf, sedikit yang diketahui tentang apa yang mengontrol aktivitasnya. CK2 dianggap aktif secara konstitutif, dengan regulasi kemampuannya untuk memfosforilasi substrat spesifik sebagian besar bergantung pada perubahan lokalisasi intraselulernya (misalnya, sitosol vs nukleus) (Ahmed dan Tawfic, 1994; Yu et al., 1999). Informasi ini menimbulkan pertanyaan penting mengenai sinyal apa yang diperlukan untuk menginduksi ΔFosB akumulasi di otak setelah stimulasi kronis (Ara. 7C). Salah satu persyaratan adalah aktivasi berulang dari fosB gen dan induksi ΔFosB mRNA (Chen et al., 1995). Data kami menunjukkan bahwa fosforilasi CK2 dari ΔFosB sangat penting untuk stabilitasnya, menunjukkan bahwa sinyal kedua mungkin diperlukan untuk efek jangka panjang ΔFosB pada ekspresi gen, yaitu, sinyal yang merangsang fosforilasi protein oleh CK2. Ini dapat melibatkan aktivasi CK2 oleh beberapa mekanisme yang tidak diketahui atau translokasi ke inti. Sebagai alternatif, fosforilasi CK2 dari ΔFosB dapat bersifat konstitutif, sehingga ketika ΔFosB protein diterjemahkan sebagai respons terhadap setiap stimulus, sebagian darinya mengalami fosforilasi dan dengan demikian distabilkan, sehingga dengan stimulasi berulang-ulang ia terakumulasi ke level tinggi pada neuron yang terkena.
Temuan kami menunjukkan bahwa CK2 dan S27 mungkin bukan satu-satunya kinase dan situs yang bertanggung jawab atas fosforilasi BFosB, karena penghambatan CK2 maupun mutasi S27A tidak dapat sepenuhnya mencegah fosforilasi BFB. Dengan cara yang sama, fakta bahwa mutasi S27A menghasilkan pengurangan 30% dalam fosfo-ΔFosB berpendapat bahwa S27 adalah situs fosforilasi utama pada protein. Kami, bagaimanapun, menyelidiki kinase diduga lainnya dan situs fosforilasi di ΔFosB. Pada akhirnya, penting juga untuk menganalisis fosforilasi S27 dan situs fosforilasi lainnya di ΔFosB di otak in vivo setelah berbagai jenis stimulasi kronis, misalnya, melalui penggunaan spektrometri massa atau antibodi fosfospesifik.
Seperti disebutkan di atas, S27 dalam ΔFosB sangat dilestarikan sepanjang evolusi dan di antara protein keluarga Fos lainnya. Namun, situs konsensus untuk CK2 tidak: seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5B, hanya FosB / ΔFosB (dan xenolog Zebrafish), tetapi tidak c-Fos atau Fra-2, memiliki residu asam pada + 3, penentu utama fosforilasi CK2 (Marin et al., 1986; Meggio et al., 1994). Dengan demikian, kurangnya fosforilasi CK2 pada S27 dapat menjelaskan mengapa protein keluarga Fos lainnya tidak stabil seperti ΔFosB. Namun, ini tidak menjelaskan mengapa FosB full-length, yang memiliki situs konsensus CK2 yang sama dengan ΔFosB, tidak distabilkan dengan cara yang sama. Kita tidak tahu apakah FosB panjang-penuh difosforilasi oleh CK2 pada residu yang dilestarikan ini. Satu-satunya laporan FosB (Skinner et al., 1997) dan c-Fos (Okazaki dan Sagata, 1995; Chen et al., 1996) fosforilasi menggambarkan situs-situs di daerah terminal-C dari protein-protein ini, yang tidak ada dalam ΔFosB. Potensi fosforilasi full-length FosB dan protein keluarga Fos lainnya oleh CK2 membutuhkan investigasi langsung. Namun, bahkan jika mereka terfosforilasi, protein keluarga Fos lainnya diketahui mengandung motif pada termini C mereka yang menargetkan protein untuk degradasi cepat (Papavassiliou et al., 1992; Jariel-Encontre et al., 1997; Acquaviva et al., 2002). Sebagai contoh, telah ditunjukkan bahwa hamparan residu ∼21 hadir dalam terminal C dari semua protein keluarga Fos, tetapi tidak ada dalam ΔFosB, bertindak sebagai domain destabilisasi untuk c-Fos (Acquaviva et al., 2001). Kami menemukan bahwa meskipun urutan ini juga mengguncang FosB panjang penuh (Carle et al., 2004), tidak adanya domain ini di ΔFosB tidak sepenuhnya menjelaskan stabilisasinya. Sebaliknya, kombinasi dari ketiadaan domain terminus C ini dan fosforilasi Ser27 tampaknya sepenuhnya menjelaskan perbedaan sekitar lima kali lipat dalam stabilitas antara ΔFosB dan FosB.
Meskipun degradasi protein keluarga Fos kompleks dan tidak sepenuhnya dipahami, degradasi proteasom tampaknya menjadi jalur utama yang terlibat (Salvat et al., 1999; Acquaviva et al., 2002; Ferrara et al., 2003). Data yang disajikan di sini, di mana proteasomal inhibitor tidak secara signifikan mengubah tingkat degradasi ΔFosB, berpendapat bahwa, tidak seperti protein keluarga Fos lainnya, osFosB menghindari proteasome 26S, dan ini memainkan peran sentral dalam stabilisasi. Oleh karena itu kami mengusulkan skema dimana peningkatan stabilitas ΔFosB disebabkan oleh kombinasi dua faktor utama: (1) tidak adanya domain destabilisasi terminal-C dan (2) fosforilasi S27 oleh CK2.
Singkatnya, penelitian ini memberikan wawasan mekanistik mengapa ΔFosB, produk dari gen awal langsung fosB, Tidak seperti semua anggota keluarga Fos lainnya, protein yang relatif berumur panjang. Meskipun protein keluarga Fos lainnya dianggap memediasi kopling stimulus-transkripsi yang cepat tetapi sementara (Morgan dan Curran, 1995), stabilitas relatif ΔFosB memberikan kemampuan untuk memediasi perubahan transkripsional yang lebih lama yang disebabkan oleh stimulasi kronis. Ini mendukung pandangan bahwa osFosB berfungsi sebagai saklar molekuler yang berkelanjutan di otak, secara bertahap mengubah respons akut menjadi adaptasi kronis. Identifikasi fosforilasi Ser27 sebagai mekanisme sentral untuk stabilitas ΔFosB membuka jalan baru untuk pengembangan cara untuk mengatur fungsi ΔFosB dan dengan demikian memodulasi efek jangka panjangnya pada plastisitas saraf dan perilaku.
Bagian sebelumnyaBagian selanjutnya
Catatan kaki
- Menerima 21 November, 2005.
- Revisi diterima Februari 21, 2006.
- 2 April diterima, 2006.
- Pekerjaan ini didukung oleh Aliansi Nasional untuk Penelitian tentang Skizofrenia dan Depresi Young Investigator Award untuk PGU, Institut Nasional Penyalahgunaan Obat (NIDA), Penghargaan Layanan Riset Nasional untuk PGU, dan hibah dari Institut Nasional Kesehatan Mental dan NIDA kepada EJN. terima kasih Dr. James Bibb atas bantuannya dengan in vitro tes fosforilasi, Dr. Ming-Hu Han atas bantuannya dengan persiapan irisan otak yang digunakan untuk pelabelan metabolisme, dan Dr. Rachael Neve atas bantuannya dengan pengemasan HSV rekombinan.
- Alamat G. Rudenko saat ini: Institut Ilmu Hayati dan Departemen Farmakologi, Universitas Michigan, 210 Washtenaw Avenue # 3163A, Ann Arbor, MI 48109-2216.
- Korespondensi harus ditujukan kepada Eric J. Nestler, 5323 Harry Hines Boulevard, Dallas, TX 75390-9070. E-mail: [email dilindungi]
Referensi
Acquaviva C, F Brockly, Ferrara P, Bossis G, C Salvat, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2001) Identifikasi motif tripeptida terminal-C yang terlibat dalam kontrol degradasi proteasom cepat dari c-Fos proto-oncoprotein selama transisi fase G (0) ke S. Onkogen 20:7563–7572.
Acquaviva C, Bossis G, Ferrara P, F Brockly, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2002) Beberapa jalur degradasi untuk protein keluarga Fos. Ann NY Acad Sci 973:426–434.
Ahmed K, Tawfic S (1994) Mekanisme regulasi intraseluler protein kinase CK2: peran asosiasi subnuklear yang dimediasi stimulus. Cell Mol Biol Res 40:539–545.
Alcazar A, Martin E, Lopez-Fando J, Salinas M (1988) Prosedur pemurnian yang ditingkatkan dan sifat kasein kinase II dari otak. Neurochem Res 13:829–836.
Andersson M, Westin JE, Cenci MA (2003) Waktu perjalanan striatal DeltaFosB-like immunoreactivity dan tingkat mRNA prodynorphin setelah penghentian pengobatan dopaminomimetik kronis. Eur J Neurosci 17:661–666.
Barz T, Ackermann K, Dubois G, Eils R, Pyerin W (2003) Layar ekspresi genome menunjukkan peran global untuk protein kinase CK2 dalam remodeling kromatin. J Cell Sci 116:1563–1577.
Beh I, Schmidt R, Hecker E (1989) Dua isozim PKC yang ditemukan dalam sel HL-60 menunjukkan perbedaan aktivasi oleh TPA phorbol ester. FEBS Lett 249:264–266.
Bildl W, Strassmaier T, Thurm H, Andersen J, Eble S, Oliver D, Knipper M, Mann M, Schulte U, Adelman JP, Fakler B (2004) Protein kinase CK2 digabung dengan Ca konduktansi kecil (2 +) - saluran K + yang diaktifkan dan mengatur saluran gating. Neuron 43:847–858.
Bing G, Wang W, Qi Q, Feng Z, Hudson P, Jin L, Zhang W, Bing R, Hong JS (1997) Ekspresi jangka panjang dari antigen terkait-Fos dan ekspresi sementara dari delta FosB yang terkait dengan kejang pada tikus hippocampus dan striatum. J Neurochem 68:272–279.
Blom N, T Sicheritz-Ponten, Gupta R, Gammeltoft S, Brunak S (2004) Prediksi glikosilasi pasca-translasi dan fosforilasi protein dari sekuens asam amino. proteomik 4:1633–1649.
Boehning D, Bulan C, Sharma S, Hurt KJ, Hester LD, Ronnett GV, Shugar D, Snyder SH (2003) Transisi neurot karbon monoksida diaktivasi oleh CK2 fosforilasi heme oxygenase-2. Neuron 40:129–137.
Bohmann D (1990) Fosforilasi faktor transkripsi: hubungan antara transduksi sinyal dan regulasi ekspresi gen. Sel kanker 2:337–344.
Buschmann T, Potapova O, Bar-Shira A, Ivanov VN, Fuchs SY, Henderson S, Fried VA, Minamoto T, Alarcon-Vargas D, Pincus MR, Gaarde WA, NJ Holbrook, Shiloh Y, Ronai Z (2001) Jun NH2-terminal kinase fosforilasi p53 pada Thr-81 penting untuk stabilisasi p53 dan aktivitas transkripsi dalam menanggapi stres. Biol Sel Mol 21:2743–2754.
Carle TL, Ulery PG, Nestler EJ (2004) Tidak adanya domain C-terminal keluarga Fos yang dikonservasi berkontribusi pada stabilitas unik deltaFosB. Soc Neurosci Abstr 30: 692.2.
Channavajhala P, Seldin DC (2002) Interaksi fungsional protein kinase CK2 dan c-Myc dalam limfomagenesis. Onkogen 21:5280–5288.
Chen J, Nye HE, MB Kelz, Hiroi N, Nakabeppu Y, Hope BT, Nestler EJ (1995) Regulasi delta FosB dan protein mirip-FosB dengan kejang elektrokonvulsif dan perawatan kokain. Mol Pharmacol 48:880–889.
Chen J, MB Kelz, Hope BT, Nakabeppu Y, Nestler EJ (1997) Antigen terkait Fos kronis: varian stabil ΔFosB yang diinduksi di otak oleh perawatan kronis. J Neurosci 17:4933–4941.
Chen RH, Juo PC, Curran T, Blenis J (1996) Fosforilasi c-Fos di terminal-C meningkatkan aktivitas transformasi. Onkogen 12:1493–1502.
Choe ES, Parelkar NK, Kim JY, Cho HW, Kang HS, Mao L, Wang JQ (2004) Penghambat protein fosfatase 1 / 2A asam okadaat meningkatkan fosforilasi CREB dan Elk-1 dan ekspresi c-fos dalam striatum tikus in vivo. J Neurochem 89:383–390.
Cochet C, Chambaz EM (1983) Fosforilasi protein yang dimediasi poliamin: target yang mungkin untuk aksi poliamin intraseluler. Sel Mol Endokrin 30:247–266.
Cochet C, Feige JJ, Chambaz EM (1983) Sifat katalitik dan molekul dari kasein kinase tipe G yang sangat murni dari jaringan paru sapi. Biochim Biophys Acta 743:1–12.
Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, DW Sendiri (2003) Ekspresi DeltaFosB tipe spesifik sel striatal meningkatkan insentif untuk kokain. J Neurosci 23:2488–2493.
Daunais JB, Roberts DC, McGinty JF (1993) Pemberian sendiri kokain meningkatkan mRNA preprodinorfin, tetapi bukan c-fos, pada tikus striatum. NeuroReport 4:543–546.
Desterro JM, Rodriguez MS, Hay RT (2000) Regulasi faktor transkripsi oleh degradasi protein. Cell Mol Life Sci 57:1207–1219.
Diaz-Nido J, Armas-Portela R, Avila J (1992) Peningkatan aktivitas sitoplasmik kasein kinase tipe II menyertai pertumbuhan neurit setelah penghambatan sintesis DNA dalam sel neuroblastoma NIA-103. J Neurochem 58:1820–1828.
Di Maira G, Salvi M, Arrigoni G, Marin O, Sarno S, Brustolon F, Pinna LA, Ruzzene M (2005) Protein kinase CK2 memfosforilasi dan meningkatkan regulasi Akt / PKB. Kematian Sel Berbeda 12:668–677.
Dobrazanski P, Noguchi T, Kovary K, Rizzo CA, Lazo PS, Bravo R (1991) Kedua produk gen fosB, FosB dan bentuk pendeknya, FosB / SF, adalah aktivator transkripsi dalam fibroblast. Biol Sel Mol 11:5470–5478.
Ferrara P, Andermarcher E, Bossis G, Acquaviva C, F Brockly, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2003) Penentu struktural yang bertanggung jawab untuk degradasi protein protein c-Fos berbeda sesuai dengan kondisi ekspresi. Onkogen 22:1461–1474.
Fuchs SY, Dolan L, Davis RJ, Ronai Z (1996) Penargetan yang bergantung pada fosforilasi ubiquitination c-Jun oleh Jun N-kinase. Onkogen 13:1531–1535.
Fuchs SY, Xie B, Adler V, Fried VA, Davis RJ, Ronai Z (1997) c-Jun NH2-terminal kinases menargetkan di mana-mana faktor transkripsi yang terkait. J Biol Chem 272:32163–32168.
Fuchs SY, Tappin I, Ronai Z (2000) Stabilitas faktor transkripsi ATF2 diatur oleh fosforilasi dan defosforilasi. J Biol Chem 275:12560–12564.
Girault JA, Hemmings HC Jr, Williams KR, Nairn AC, Greengard P (1989) Fosforilasi DARPP-32, fosfoprotein yang diatur dopamin dan cAMP, oleh kasein kinase II. J Biol Chem 264:21748–21759.
Girault JA, Hemmings HC Jr, Zorn SH, Gustafson EL, Greengard P (1990) Karakterisasi dalam otak mamalia serin kinase DARPP-32 identik dengan kasein kinase II. J Neurochem 55:1772–1783.
Hanada M, Sugawara K, Kaneta K, Toda S, Nishiyama Y, Tomita K, Yamamoto H, Konishi M, Oki T (1992) Epoxomicin, agen antitumor baru yang berasal dari mikroba. J Antibiot (Tokyo) 45:1746–1752.
Hann SR, Eisenman RN (1984) Protein yang dikodekan oleh onkogen c-myc manusia: ekspresi diferensial dalam sel neoplastik. Biol Sel Mol 4:2486–2497.
Hemmings HC Jr, Girault JA, Williams KR, LoPresti MB, Greengard P (1989) ARPP-21, fosfoprotein yang diatur AMP-siklik (Mr = 21,000) yang diperkaya dalam daerah otak yang dipersarafi dopamin. Urutan asam amino dari situs difosforilasi oleh AMP siklik dalam sel utuh dan studi kinetik fosforilasi in vitro. J Biol Chem 264:7726–7733.
Hidaka H, Kobayashi R (1992) Farmakologi inhibitor protein kinase. Annu Rev Pharmacol Toxicol 32:377–397.
Hirata H, Bessho Y, Kokubu H, Masamizu Y, Yamada S, Lewis J, Kageyama R (2004) Ketidakstabilan protein Hes7 sangat penting untuk jam segmentasi somite. Nat Genet 36:750–754.
Hiroi N, Graybiel AM (1996) Perawatan neuroleptik atipikal dan khas menginduksi program yang berbeda dari ekspresi faktor transkripsi di striatum. J Comp Neurol 374:70–83.
Hope B, Kosofsky B, Hyman SE, Nestler EJ (1992) Regulasi ekspresi gen awal segera dan pengikatan AP-1 dalam nukleus tikus accumbens oleh kokain kronis. Proc Natl Acad Sci USA 89:5764–5768.
Hope BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ (1994a) Pengobatan kejang electroconvulsive (ECS) kronis menghasilkan ekspresi kompleks AP-1 yang tahan lama di otak dengan komposisi dan karakteristik yang berubah. J Neurosci 14:4318–4328.
Hope BT, Nye HE, MB Kelz, DW Sendiri, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ (1994b) Induksi kompleks AP-1 yang tahan lama terdiri dari perubahan protein mirip-Fos di otak oleh kokain kronis dan perawatan kronis lainnya. Neuron 13:1235–1244.
Ishida A, Fujisawa H (1995) Stabilisasi protein kinase II yang tergantung-tenangodulin melalui domain autoinhibitory. J Biol Chem 270:2163–2170.
Jariel-Encontre I, Salvat C, Steff AM, Pariat M, Acquaviva C, Furstoss O, Piechaczyk M (1997) Mekanisme kompleks untuk degradasi c-fos dan c-jun. Mol Biol Rep 24:51–56.
Jones S, Yakel JL (2003) Casein kinase ii (protein kinase ck2) mengatur serotonin 5-ht (3) fungsi saluran reseptor dalam sel ng108-15. Neuroscience 119:629–634.
Kato T Jr, Delhase M, Hoffmann A, Karin M (2003) CK2 adalah terminal-C IkappaB kinase yang bertanggung jawab untuk aktivasi NF-kappaB selama respon UV. Sel Mol 12:829–839.
MB Kelz, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, DW Diri, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ (1999) Ekspresi faktor transkripsi deltaFosB di otak mengontrol sensitivitas terhadap kokain. Alam 401:272–276.
Kim KB, Myung J, Sin N, Crews CM (1999) Penghambatan proteinase oleh produk alami epoxomicin dan dihydroeponemycin: wawasan tentang spesifisitas dan potensi. Bioorg Med Chem Lett 9:3335–3340.
Kobayashi E, Nakano H, Morimoto M, Tamaoki T (1989) Calphostin C (UCN-1028C), senyawa mikroba baru, adalah inhibitor protein kinase C. yang sangat kuat dan spesifik. Biochem Biophys Res Commun 159:548–553.
Krek W, Maridor G, Nigg EA (1992) Casein kinase II adalah enzim nuklir yang dominan. J Cell Biol 116:43–55.
Krohn NM, Stemmer C, Fojan P, Grimm R, Grasser KD (2003) Protein kinase CK2 memfosforilasi SSRP1 protein domain kelompok mobilitas tinggi, mendorong pengakuan DNA yang rusak UV. J Biol Chem 278:12710–12715.
Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, DEH Theobald, Truong HT, Russo SJ, LaPlant Q, Penyiul K, Neve RL, DW Sendiri, Nestler EJ (2005) Renovasi kromatin adalah mekanisme kunci yang mendasari plastisitas yang diinduksi kokain dalam striatum. Neuron 48:303–314.
Lieberman DN, Mody I (1999) Casein kinase-II mengatur fungsi saluran NMDA di neuron hippocampal. Nat Neurosci 2:125–132.
Litchfield DW (2003) Protein kinase CK2: struktur, regulasi dan peran dalam keputusan seluler hidup dan mati. Biochem J 369:1–15.
Manabe T, Kuramoto N, Nakamichi N, Aramachi K, Baba K, Hirai T, Yoneyama M, Yoneda Y (2001) Degradasi protein c-Fos diekspresikan oleh N-metildAsam -aspartik dalam fraksi nuklir murine hippocampus. Otak Res 905:34–43.
Mandelzys A, Gruda MA, Bravo R, Morgan JI (1997) Tidak adanya peningkatan antigen terkait-37 kDa yang terus-menerus meningkat dan aktivitas pengikatan DNA yang mirip AP-1 dalam otak tikus-tikus null-null yang diperlakukan asam-asam kainic. J Neurosci 17:5407–5415.
Marin O, Meggio F, Marchiori F, Borin G, Pinna LA (1986) Spesifisitas situs kasein kinase-2 (TS) dari sitosol hati tikus. Sebuah studi dengan substrat model peptida. Eur J Biochem 160:239–244.
McClung CA, Nestler EJ (2003) Regulasi ekspresi gen dan hadiah kokain oleh CREB dan DeltaFosB. Nat Neurosci 6:1208–1215.
McClung CA, PG Ulery, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ (2004) DeltaFosB: saklar molekuler untuk adaptasi jangka panjang di otak. Brain Res Mol Brain Res 132:146–154.
Meggio F, Pinna LA (2003) Seribu-dan-satu substrat protein kinase CK2? FASEB J 17:349–368.
Meggio F, Donella-Deana A, Pinna LA, Moret V (1977) Fosforilasi fraksi kasein oleh 'fosvitin kinase' hati tikus. FEBS Lett 75:192–196.
Meggio F, Brunati AM, Pinna LA (1983) Autofosforilasi tipe 2 casein kinase TS di kedua subunit alfa dan beta. Pengaruh berbagai efektor. FEBS Lett 160:203–208.
Meggio F, Shugar D, Pinna LA (1990) Turunan ribofuranosyl-benzimidazole sebagai inhibitor kasein kinase-2 dan kasein kinase-1. Eur J Biochem 187:89–94.
Meggio F, Marin O, Pinna LA (1994) Spesifisitas substrat protein kinase CK2. Cell Mol Biol Res 40:401–409.
Miller C, Zhang M, He Y, Zhao J, Pelletier JP, Martel-Pelletier J, Di Battista JA (1998) Induksi transkripsional gen siklooksigenase-2 oleh penghambatan asam okadaat dari aktivitas fosfatase dalam kondrosit manusia: ko-stimulasi protein pengikat nuklir AP-1 dan CRE. Biochem J Cell 69:392–413.
Moratalla R, Elibol B, Vallejo M, Graybiel AM (1996) Perubahan tingkat jaringan dalam ekspresi protein Fos-Jun yang dapat diinduksi dalam striatum selama perawatan dan penarikan kokain kronis. Neuron 17:147–156.
Morgan JI, Curran T (1995) Gen segera-awal: sepuluh tahun kemudian. Tren Neurosci 18:66–67.
Nakabeppu Y, Nathans D (1991) Suatu bentuk FosB terpotong yang terjadi secara alami yang menghambat aktivitas transkripsional Fos / Jun. Sel 64:751–759.
Nestler EJ, Barrot M, Self DW (2001) Delta FosB: saklar molekuler berkelanjutan untuk kecanduan. Proc Natl Acad Sci USA 98:11042–11046.
Neve RL, Howe JR, Hong S, Kalb RG (1997) Pengenalan subunit reseptor glutamat 1 ke dalam motor neuron in vitro dan in vivo menggunakan virus herpes simplex rekombinan. Neuroscience 79:435–447.
Nuthall HN, Joachim K, Stifani S (2004) Fosforilasi serin 239 dari Groucho / TLE1 oleh protein kinase CK2 penting untuk menghambat diferensiasi neuron. Biol Sel Mol 24:8395–8407.
Okazaki K, Sagata N (1995) Jalur Mos / MAP kinase menstabilkan c-Fos oleh fosforilasi dan menambah aktivitas transformasi dalam sel NIH 3T3. EMBO J 14:5048–5059.
Palombella VJ, Rando OJ, Goldberg AL, Maniatis T (1994) Jalur ubiquitin-proteasome diperlukan untuk memproses protein prekursor NF-kappa B1 dan aktivasi NF-kappa B. Sel 78:773–785.
Papavassiliou AG, Treier M, Chavrier C, Bohmann D (1992) Degradasi c-Fos yang ditargetkan, tetapi bukan v-Fos, oleh sinyal yang bergantung pada fosforilasi pada c-Jun. Ilmu 258:1941–1944.
Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, P Ulery, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E (2003) Ekspresi spesifik wilayah otak yang dapat diinduksi dari mutan negatif dominan c-Jun pada tikus transgenik menurunkan sensitivitas terhadap kokain. Otak Res 970:73–86.
Perrotti LI, Hadeishi Y, PG Ulery, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ (2004) Induksi DeltaFosB dalam struktur otak yang berhubungan dengan hadiah setelah stres kronis. J Neurosci 24:10594–10602.
Persico AM, Schindler CW, O'Hara BF, Brannock MT, Uhl GR (1993) Ekspresi faktor transkripsi otak: efek amfetamin akut dan kronis dan tekanan injeksi. Brain Res Mol Brain Res 20:91–100.
Ploegh HL, Dunn BM (2000) Modifikasi pasca-translasi: fosforilasi dan fosfatase. Dalam: Protokol terkini dalam ilmu protein (Dunn BM, ed.) Hlm. 13.01–13.02. New York: Wiley and Sons.
Pyerin W, Burow E, Michaely K, Kubler D, Kinzel V (1987) Sifat katalitik dan molekuler dari phosvitin / casein kinase tipe II yang sangat murni dari sel epitel manusia dalam kultur (HeLa) dan hubungannya dengan ekto protein kinase. Biol Chem Hoppe Seyler 368:215–227.
Reikhardt BA, Kulikova OG, Borisova GY, Aleksandrova IY, Sapronov NS (2003) Status sistem "protein kinase CK2-HMG14" pada amnesia terkait usia pada tikus. Neurosci Behav Physiol 33:799–804.
Roberts BJ, Whitelaw ML (1999) Degradasi reseptor domain dioksin helix-loop-helix / Per-ARNT-Sim dasar melalui jalur ubiquitin / proteasome. J Biol Chem 274:36351–36356.
Rost B, Yachdav G, Liu J (2004) Server PredictProtein. Asam Nukleat Res 32:W321–W326.
Rylski M, Kaczmarek L (2004) Ap-1 menargetkan di otak. Biosci depan 9:8–23.
Sahin B, Kansy JW, AC Nairn, Spychala J, Ealick SE, Fienberg AA, Greene RW, Bibb JA (2004) Karakterisasi molekuler adenosine kinase tikus rekombinan dan evaluasi sebagai target untuk fosforilasi protein. Eur J Biochem 271:3547–3555.
Salvat C, Aquaviva C, Jariel-Encontre I, Ferrara P, Pariat M, Steff AM, Carillo S, Piechaczyk M (1999) Apakah ada beberapa jalur proteolitik yang berkontribusi terhadap degradasi protein c-Fos, c-Jun dan p53 in vivo? Mol Biol Rep 26:45–51.
Schmidt R, Hecker E (1975) Autoksidasi ester phorbol dalam kondisi penyimpanan normal. Res kanker 35:1375–1377.
Schwarz EM, Van Antwerp D, Verma IM (1996) Fosforilasi IkappaBalpha oleh Casein kinase II terjadi secara istimewa pada serine 293: persyaratan untuk degradasi IkappaBalpha bebas. Biol Sel Mol 16:3554–3559.
Sears R, Leone G, DeGregori J, Nevins JR (1999) Ras meningkatkan stabilitas protein Myc. Sel Mol 3:169–179.
Silva-Neto MA, Fialho E, Paes MC, Oliveira PL, Masuda H (2002) Fosforilasi independen nukleotida-siklik dari vitelin oleh kasein kinase II yang dimurnikan dari Rhodnius prolixus oocytes. Serangga Biochem Mol Biol 32:847–857.
Skinner M, Qu S, Moore C, Kebijaksanaan R (1997) Aktivasi dan transformasi transkripsional oleh protein FosB memerlukan fosforilasi domain aktivasi terminal karboksil. Biol Sel Mol 17:2372–2380.
Stemmer C, Schwander A, Bauw G, Fojan P, Grasser KD (2002) Protein kinase CK2 secara berbeda memfosforilasi protein kromosom jagung kelompok B (HMGB) kromosom tinggi yang memodulasi stabilitas mereka dan interaksi DNA. J Biol Chem 277:1092–1098.
Stevens I, Derua R, Rondelez E, Waelkens E, Merlevede W, Goris J (1999) Identifikasi cyk, cyclin B2 kinase, sebagai protein kinase II yang tergantung kalsium / kalmodulin tergantung pada perannya selama pematangan oosit Xenopus laevis. Res Sel Exp 252:303–318.
Suh HW, Choi SS, Lee JK, Lee HK, Han EJ, Lee J (2004) Regulasi ekspresi gen c-fos dan c-jun oleh lipopolysaccharide dan sitokin dalam astrosit primer yang dikultur: efek jalur PKA dan PKC. Arch Pharm Res 27:396–401.
Szyszka R, Boguszewska A, Grankowski N, Ballesta JP (1995) Diferensial fosforilasi protein asam ribosom dari sel ragi oleh dua protein kinase endogen: kasein kinase-2 dan 60S kinase. Acta Biochim Pol 42:357–362.
Tamaoki T, Takahashi I, Kobayashi E, Nakano H, Akinaga S, Suzuki K (1990) Calphostin (UCN1028) dan senyawa yang terkait dengan calphostin, suatu kelas baru dari penghambat protein kinase spesifik dan potensial C. Adv Second Messenger Phosphoprotein Res 24:497–501.
Torres J, Pulido R (2001) Penekan tumor PTEN difosforilasi oleh protein kinase CK2 di terminal C-nya. Implikasi untuk stabilitas PTEN terhadap degradasi yang dimediasi proteasome. J Biol Chem 276:993–998.
Tsubuki S, Saito Y, Tomioka M, Ito H, Kawashima S (1996) Penghambatan diferensial aktivitas calpain dan proteasome oleh peptidyl aldehydes di-leusin dan tri-leusin. J Biochem (Tokyo) 119:572–576.
Tsurumi C, Ishida N, Tamura T, Kakizuka A, Nishida E, Okumura E, Kishimoto T, Inagaki M, Okazaki K, Sagata N (1995) Degradasi c-Fos oleh proteasome 26S dipercepat oleh c-Jun dan beberapa protein kinase. Biol Sel Mol 15:5682–5687.
Unger GM, Davis AT, Slaton JW, Ahmed K. (2004) Protein kinase CK2 sebagai pengatur kelangsungan hidup sel: implikasi untuk terapi kanker. Target Obat Kanker Curr 4:77–84.
Vial E, Marshall CJ (2003) Peningkatan aktivitas ERK-MAP kinase melindungi anggota keluarga FOS FRA-1 terhadap degradasi proteasomal dalam sel karsinoma usus besar. J Cell Sci 116:4957–4963.
Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S (2002) ΔFosB mengatur putaran roda. J Neurosci 22:8133–8138.
Whitmarsh AJ, Davis RJ (2000) Pengaturan fungsi faktor transkripsi oleh fosforilasi. Cell Mol Life Sci 57:1172–1183.
Musim Dingin B, Kautzner I, Issinger OG, Arnold HH (1997) Dua situs fosforilasi protein kinase CK2 diduga penting untuk aktivitas Myf-5. Biol Chem 378:1445–1456.
Wisniewski JR, Szewczuk Z, Petry I, Schwanbeck R, Renner U (1999) Fosforilasi konstitutif dari ekor asam dari protein 1 kelompok mobilitas tinggi oleh casein kinase II mengubah konformasi, stabilitas, dan spesifisitas pengikatan DNA. J Biol Chem 274:20116–20122.
Yamaguchi Y, T Wada, Suzuki F, T Takagi, Hasegawa J, Handa H (1998) Casein kinase II berinteraksi dengan domain bZIP dari beberapa faktor transkripsi. Asam Nukleat Res 26:3854–3861.
Yanagawa T, Yuki K, Yoshida H, Bannai S, Ishii T (1997) Fosforilasi protein stres A170 oleh aktivitas mirip kasein kinase II dalam makrofag. Biochem Biophys Res Commun 241:157–163.
Yankulov K, Yamashita K, Roy R, Egly JM, Bentley DL (1995) Inhibitor pemanjangan transkripsi 5,6-dichloro-1-beta-d-ribofuranosylbenzimidazole menghambat faktor transkripsi IIH terkait protein kinase. J Biol Chem 270:23922–23925.
Yen J, RM Kebijaksanaan, Tratner I, Verma IM (1991) Bentuk alternatif yang disambung FosB adalah regulator negatif aktivasi transkripsi dan transformasi oleh protein Fos. Proc Natl Acad Sci USA 88:5077–5081.
Yin X, PT Jedrzejewski, Jiang JX (2000) Casein kinase II memfosforilasi lensa connexin 45.6 dan terlibat dalam degradasinya. J Biol Chem 275:6850–6856.
Yoza BK, Brooks JW, Mizel SB (1992) Induksi komponen faktor transkripsi AP-1 selama aktivasi sel-T oleh interleukin 1 dan ester phorbol. Pertumbuhan Sel Berbeda 3:677–684.
Yu S, Wang H, Davis A, Ahmed K. (2001) Konsekuensi pensinyalan CK2 ke matriks nuklir. Biochem Sel Mol 227:67–71.
Yu S, Davis AT, Guo C, Green JE, Ahmed K. (1999) Penargetan diferensial protein kinase CK2 ke matriks nuklir pada saat overekspresi sementara dari subunitnya. Biochem J Cell 74:127–134.
Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ (2006) ΔFosB: peran penting untuk ΔFosB dalam nukleus accumbens dalam aksi morfin. Nat Neurosci 9:205–211.
Artikel yang mengutip artikel ini
- Respons Perilaku dan Struktural terhadap Kokain Kronis Membutuhkan Lingkaran Feedforward yang Melibatkan {Delta} FosB dan Protein / Calmodulin-Dependent Protein Kinase II dalam Nucleus Accumbens Shell Journal of Neuroscience, 6 Maret 2013, 33(10):4295-4307
- Striatal Overexpression dari {Delta} FosB mereproduksi gerakan-gerakan sukarela yang diinduksi Levodopa Kronis Journal of Neuroscience, 26 Mei 2010, 30(21):7335-7343
- Abstrak
- Teks Penuh
- Teks Lengkap (PDF)
- Abstrak
- Teks Penuh
- Teks Lengkap (PDF)
- Abstrak
- Teks Penuh
- Teks Lengkap (PDF)
- Abstrak
- Teks Penuh
- Teks Lengkap (PDF)
- Mekanisme transkripsi kecanduan: peran {Delta} FosB Transaksi filosofis dari Royal Society B: Biological Sciences, 12 2008 Oktober, 363(1507):3245-3255
- Kerentanan yang bertahan lama untuk mengembalikan perilaku mencari metamfetamin dalam sel neurotropik yang diturunkan dari sel glial yang diturunkan dari sel glial Jurnal FASEB, 1 Juli 2007, 21(9):1994-2004
- Faktor Transkripsi Activator Protein-1 dalam Karsinogenesis Epitel Pernafasan Penelitian Kanker Molekuler, 1 Februari 2007, 5(2):109-120
;