Cdk5 Phosphorylates Dopamine D2 Receptor dan Melemahkan pensinyalan Hilir (2013)

Komentar: Tampaknya menunjukkan bahwa Cdk5 menyebabkan turunnya regulasi reseptor D2 dopamin. Hebatnya, terjemahan faktor deltafosb menginduksi produksi Cdk5.

Jeong J, Taman YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, dkk. (2013) TUTUP SATU 8 (12): e84482. doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

Abstrak

Reseptor D2 dopamin (DRD2) adalah reseptor kunci yang memediasi fungsi otak terkait dopamin seperti suasana hati, penghargaan, dan emosi. Cyclin-dependent kinase 5 (Cdk5) adalah serine / threonine kinase yang diarahkan prolin yang fungsinya telah terlibat dalam sirkuit hadiah otak. Dalam penelitian ini, kami mengungkapkan bahwa serin 321 residu (S321) dalam loop intraseluler ketiga dari DRD2 (D2i3) adalah situs pengatur baru Cdk5. Fosforilasi S5 yang bergantung pada Gdk321 dalam D2i3 diamati pada in vitro dan sistem kultur sel.

Kami selanjutnya mengamati bahwa fosforilasi S321 merusak ekspresi permukaan yang dirangsang agonis dari DRD2 dan menurunkan penggandaan protein G ke DRD2. Selain itu, jalur cAMP hilir dipengaruhi dalam sistem heterolog dan dalam kultur neuron primer dari embrio KO p35 yang kemungkinan disebabkan oleh berkurangnya aktivitas penghambatan DRD2. Hasil ini menunjukkan bahwa fosforilasi S5 yang dimediasi Cdk321 menghambat fungsi DRD2, menyediakan mekanisme pengaturan baru untuk pensinyalan dopamin.

angka-angka

Kutipan: Jeong J, Taman YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, dkk. (2013) Cdk5 Phosphorylates Dopamine D2 Receptor dan Melemahkan pensinyalan Hilir. PLoS ONE 8 (12): e84482. doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

Editor: James Porter, Universitas Dakota Utara, Amerika Serikat

diterima: Mungkin 20, 2013; Diterima: November 14, 2013; Diterbitkan: Desember 31, 2013

Hak cipta: © 2013 Jeong et al. Ini adalah artikel akses terbuka yang didistribusikan di bawah ketentuan Lisensi Atribusi Creative Commons, yang mengizinkan penggunaan, distribusi, dan reproduksi tanpa batas dalam media apa pun, asalkan penulis dan sumber aslinya dikreditkan.

Pendanaan: Pekerjaan ini didukung oleh hibah (NRF-2012R1A2A2A01012923 dan NRF-2012R1A4A1028200) dari pemerintah Korea (MSIP) dan juga didukung oleh kerangka kerja program kerjasama internasional yang dikelola oleh NRF Korea (2012K2X1X Program Penelitian Dasar MSIP (2033117-2031). SKP adalah penerima Aliansi Nasional 415 dan 2004 untuk Penelitian Skizofrenia dan Depresi (NARSAD) Young Investigator Awards. Para penyandang dana tidak memiliki peran dalam desain studi, pengumpulan dan analisis data, keputusan untuk menerbitkan, atau persiapan naskah.

Kepentingan bersaing: Para penulis telah menyatakan bahwa tidak ada kepentingan yang bersaing.

Pengantar

Pensinyalan dopamin terlibat dalam berbagai fungsi otak termasuk koordinasi motorik, kontrol suasana hati dan mekanisme penghargaan [1]. Komponen utama pensinyalan dopamin pada vertebrata diberikan oleh neuron spriatal medium striatal (MSNs) yang secara selektif mengekspresikan subset reseptor dopamin dan menerima input dopaminergik terutama dari area ventral tegmental (VTA) dan substantia nigra (SN) [2]. Reseptor dopamin adalah reseptor berpasangan protein G (GPCR) dengan tujuh domain transmembran dan terdiri dari dua subtipe, Reseptor D1-like dan D2-like, yang memediasi aksi timbal balik dalam pensinyalan dopamin [1]. Misalnya, dopamin reseptor seperti D1 (D1, D5) mengaktifkan adenylyl cyclase melalui Gαs dan meningkatkan level intraseluler cAMP, tetapi reseptor dopamin seperti D2 (D2, D3, D4) menghambat adenylyl cyclase melalui Gαi dan mengurangi level cAMP intraseluler [1], [3].

Di antara reseptor dopamin, reseptor D2 (DRD2) terlibat dalam patofisiologi beberapa gangguan kejiwaan utama termasuk skizofrenia dan kecanduan obat. [4], sehingga banyak obat antipsikotik setidaknya menargetkan DRD2 sebagian. Juga diketahui bahwa aktivitas DRD2 berkorelasi baik dengan konsekuensi perilaku penyalahgunaan obat pada model hewan [5]. Antidepresan dan efikasi penstabil suasana hati juga telah dikaitkan dengan perubahan ekspresi permukaan sel DRD2 atau pensinyalan intraseluler hilir yang dimediasi oleh PKA, ERK dan GSK3 [1], [4], [6]. Terlepas dari peran penting ini untuk DRD2 di otak, mekanisme pengaturan terperinci yang memberikan heterogenitas dan kompleksitas pada properti DRD2 tidak sepenuhnya dipahami.

Garis konvergen bukti menunjukkan bahwa banyak modifikasi posttranslational terlibat dalam fine-tuning aktivitas DRD2. Glikosilasi luas dari DRD2 terungkap dalam studi pelabelan foto-afinitas awal [7], dan pembentukan ikatan disulfida dalam DRD2 juga diidentifikasi sebagai modifikasi penting untuk pengikatan ligan [8]. Selanjutnya, situs fosforilasi DRD2 awalnya diidentifikasi oleh in vitro uji dengan radioisotop, menyediakan rute untuk berbagai jalur pengaturan yang dimediasi oleh berbagai kinase [9]. Memang, protein kinase C (PKC) mengatur mobilisasi kalsium intraseluler yang dimediasi DRD2 dan memodulasi interaksi DRD2 dengan protein sitoskeletal. [10]. Fosforilasi oleh GPCR kinase 2 (GRK2) mengatur pola resensitisasi yang diinduksi oleh agonis dari DRD2 [11].

Cyclin-dependent kinase 5 (Cdk5) adalah serine / threonine kinase yang diarahkan prolin yang memiliki aktivitas preferensial karena ekspresi khusus otak dari aktivator-aktivator utamanya, p35 dan p39 [12]. Cdk5 terlibat dalam berbagai proses neuronal termasuk migrasi neuronal dan panduan akson, dan Cdk5 dan p35 null tikus menunjukkan cacat pada lapisan kortikal [13]. Baru-baru ini, ditunjukkan bahwa fosforilasi WAVE1 dan ephexin oleh Cdk5 mengatur morfogenesis tulang belakang dendritik [14]. Selain itu, Cdk5 juga mengatur level ekspresi permukaan reseptor NMDA, NR2B, dan arus NMDA yang dimediasi NR2A [15], [16]. Patut dicatat bahwa banyak bukti menunjukkan hubungan yang intim antara Cdk5 dan sistem dopamin. Cdk5 phosphorylates tyrosine hydroxylase (TH), mengatur stabilitasnya, dan dengan demikian mempertahankan homeostasis dopaminergik [17]. Dalam neuron pascasinaps, ketika residu T75 dari dopamin dan siklik-AMP yang diatur fosfoprotein-32kD (DARPP-32) difosforilasi oleh Cdk5, ia dapat menghambat aktivitas PKA dan dengan demikian memusuhi aktivitas PKA dan dengan demikian memusuhi tanda PKA yang dimediasi oleh PKD. [18]. Menariknya, ketika kokain, agonis tidak langsung dari reseptor dopamin, diberikan secara kronis pada tikus, mRNA dan kadar protein peningkatan Cdk5 dalam neuron berduri sedang [19]. Secara kolektif, Cdk5 tampaknya terlibat dalam adaptasi sinaptik yang diinduksi oleh obat. Dalam penelitian ini, kami menunjukkan interaksi fungsional DRD2 dan Cdk5 yang selanjutnya memperluas peran Cdk5 dalam pensinyalan dopamin.

Bahan dan Metode

Antibodi

Serum anti-kelinci diangkat terhadap peptida yang mengandung fosfom serin 321 (pS321) dari loop intraseluler ketiga DRD2 (D2i3). Phospho-peptide, CNPDpSPAKPEK (PEPTRON), digunakan untuk membuat kolom terkonjugasi peptida untuk pemurnian afinitas (20401, PIERCE). Antibodi anti-pS321 diperkaya oleh sistem pemurnian afinitas mengikuti instruksi pabrik. Antibodi fosfat murni disimpan dalam PBS dengan 0.1% sodium azide dan 0.1% gelatin. Antibodi anti-tikus-Cdk5 (sc-249) dan anti-kelinci anti-p35 (sc-820) digunakan untuk Western blotting dan immunocytochemistry Cdk5 / p35. Antibodi anti-tikus GFP (sc-9996) digunakan untuk imunopresipitasi dan pemblokiran Barat DRD2-GFP. Antibodi anti-kelinci FLAG (sc-807), antibodi anti-kelinci anti-HA (sc-805), antibodi anti-GST tikus (sc-138), dan antibodi anti-GAPDH anti-tikus (sc-32293) XNUMX) dibeli dari Santa Cruz Biotechnologies.

hewan

Tikus p35 knockout adalah hadiah dari Dr. Katsuhiko Mikoshiba di RIKEN Brain Science Institute di Jepang dan digunakan untuk kultur neuron primer. Set primer untuk genotipe adalah 5′-GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG, 5′-GCTCTGCTAGACACACACTACTGTAC dan 5′- TCCATCT GCACGAGACTAGT seperti yang dijelaskan sebelumnya [20]. Tikus ICR dan tikus Sprague Dawley digunakan untuk persiapan lisat otak. Semua prosedur hewan disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusi dan Sains Universitas Pohang.

Konstruksi Plasmid

Isoform panjang DRD2 manusia dalam vektor plasmid EGFP-N1 dan loop intraseluler ketiga DRD2 (212-373 residu asam amino termasuk 29 residu asam amino tambahan yang unik untuk DRD2 long isoform) dalam vektor pFLAG-CMV-XNUM yang digunakan. Human Cdk2 dimasukkan ke dalam vektor plasmid pCMV-HA dan p5 manusia dimasukkan ke dalam vektor plasmid pcDNA 35. Human Cdk3.1 dimasukkan di bawah promotor cytomegalovirus (CMV) bersama dengan p5 manusia dalam vektor pcDNA 35 untuk membuat konstruksi ekspresi ganda (Cdk3.1 / p5) untuk imunokytokimia, uji internalisasi reseptor, [35S] -GTPγAlat pengikat S, alat pengikat radioligand dan enzim cAMP immunoassay.

In Vitro Assay Kinase

Tautan-IP in vitro uji kinase dilakukan sebagai berikut. Satu otak tikus utuh di-lysed dalam 3 mL erythrocytes lysis buffer (ELB) (50 mM Tris (pH 8.0), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40) oleh 20 stroke dari homogenisasi Dounce dihomogenisasi untuk dihomogenisasi untuk homogenisasi . Lisat diinkubasi di atas es selama 30 min, disonikasi, dan disentrifugasi pada 16,000 × g untuk 10 min. Supernatan di imunopresipitasi dengan antibodi anti-kelinci anti-p35 untuk mendapatkan kompleks Cdk5 / p35 yang aktif. Protein fusi GST kompleks dan murni Gdk5 / p35 dicampur dengan adenosin 5′-triposfat, [γ-32P] (NEG-502H, PerkinElmer) dan diinkubasi dalam buffer kinase (30 mM HEPES (pH 7.2), 10 mM MgCl2, 0.2 mM DTT) untuk 1 h pada suhu kamar [18], [21]. Kompleks Cdk5 / p25 murni (14 – 516, Millipore) juga digunakan untuk in vitro uji kinase seperti dijelaskan di atas. Buffer pemuatan sampel 2 × ditambahkan ke campuran reaksi dan direbus pada 100 ° C. Sampel kemudian dikenakan SDS-PAGE dan gel kering dinilai dengan autoradiografi.

Liquid Chromatography (LC) -Mass Spectrometry (MS) / Analisis MS

Protein GST-D2i3 rekombinan dianalisis dengan LC-MS / MS setelah IP-linked in vitro uji kinase. Kami melakukan identifikasi peptida data LC-MS / MS menggunakan X !! Tandem (versi Dec-01-2008). Setiap file data RAW pertama kali dikonversi ke mzXML menggunakan pipa trans-proteomik (TPP; versi 4.3). Pemindaian MS / MS dalam mzXML yang dikonversi kemudian dilakukan pencarian terhadap basis data urutan protein tikus UniProt (lepaskan 2010_07) termasuk urutan GST-D2i3 menggunakan X !! Tandem. Toleransi diatur ke 3 Da untuk ion prekursor dan 2 Da untuk ion fragmen. Spesifisitas enzim untuk trypsin digunakan. Opsi modifikasi variabel digunakan untuk karbamidometilasi sistein (57.021 Da), oksidasi metionin (15.995 Da), hidrolisis asparagin (0.987 Da) dan fosforilasi serin (79.966 Da).

Imunopresipitasi

Imunopresipitasi dilakukan pada sel lisat dalam buffer lisis ELB. Antibodi anti-GFP ditambahkan ke lisat dan diinkubasi selama 3 jam pada 4 ° C. Imunokompleks dimurnikan menggunakan protein-A agarosa. Endapan diinkubasi dengan buffer pemuatan sampel SDS untuk 30 min pada 37 ° C, dan mengalami SDS-PAGE dan Western blots.

GST Pull-down Assay

10 µg GST dan GST-D2i3 yang dimurnikan diinkubasi dengan lisat otak tikus selama 1.5 h pada 4 ° C. 30 µL manik-manik Sepharose 4B glutathione (GSH) terkonjugasi (17-0756-01, GE Healthcare) yang diseimbangkan dengan buffer lisis ditambahkan dan diinkubasi untuk 1 tambahan h. Manik-manik dikumpulkan dengan sentrifugasi pada 2,000 ×g dan dibilas dengan buffer lisis 4 kali [22], [23]. Endapan dianalisis dengan Western blotting menggunakan antibodi anti-Cdk5 dan anti-p35.

Imunositokimia

Sel HN 293 yang ditransfusikan dan neuron striatal yang dikultur pada coverlips dicuci sekali dengan larutan salin fosfat (PBS) dan difiksasi dengan perendaman dalam 4% paraformaldehyde / PBS dingin untuk 30 min. Antibodi primer diencerkan dalam larutan pemblokiran (2% serum kuda dan 1% Triton X-100 dalam PBS). Antibodi anti-tikus terkonjugasi Alexafluor-647 (A20990, Invitrogen) dan antibodi anti-kelinci terkonjugasi Alexafluor-568 (A11011, Invitrogen) digunakan sebagai antibodi sekunder. Hoechst digunakan untuk pewarnaan nukleus. Gambar diperoleh dengan mikroskop confocal (Olympus, FluoView-1000).

Tes Internalisasi Reseptor

24 h setelah transfeksi, sel diperlakukan dengan 1 μM quinpirole (Q102, Sigma) untuk 30 min dan 90 min pada 37 ° C. Sel ditangguhkan kembali dalam 2 mL PBS dingin dan 200 µL aliquot digunakan untuk setiap reaksi. Perawatan obat dilakukan pada suhu kamar selama 3 jam pada konsentrasi berikut; 3 nM [3H] -spiperone (NET-565, PerkinElmer), 3 μM sulpiride (895, TOCRIS), 10 µM ​​haloperidol (H1512, Sigma). Hidrofobik [3H] -spiperone digunakan untuk melabeli reseptor total yang diekspresikan dan hidrofilik sulpiride digunakan untuk menggantikan membranous receptor-terikat [3H] - sinyal digital. Sinyal reseptor yang terkait dengan membran dihitung dengan mengurangi nilai reseptor intraseluler dari total nilai reseptor yang diekspresikan. Sel disaring pada filter GF / B (Millipore) dan dicuci 3 kali dengan pencuci pencuci (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Filter dikeringkan dan residu radioaktivitas diukur menggunakan penghitung kilau cair [24].

Persiapan Membran Sel

Sel-sel konfluen dalam piringan kultur 100 mm setelah transfeksi dicuci dengan PBS dingin dan dipanen dalam buffer 1 mL HME (25 mM HEPES (pH 7.5), 2 mM MgCl2, 1 mM EDTA). Lisat yang dihomogenisasi disentrifugasi dengan 500 × g selama 15 min dan supernatan kemudian disentrifugasi dengan 36,000 × g selama 30 min. Pelet yang ditangguhkan kembali dalam buffer HME digunakan untuk pengujian.

[35S] -GTPγS Binding Assay

Fraksi membran sel pra-inkubasi dengan 1 μM quinpirole (Q102, Sigma) dalam buffer pengujian (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA dan 0.01 mM GDP) untuk 10 mnt. [35S] -GTPγS (NET-030H, PerkinElmer) ditambahkan ke konsentrasi akhir 3 nM dalam 30 µL dan selanjutnya diinkubasi selama 90 min. 170 µL buffer es dingin (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, dan 0.1 mM GTP) ditambahkan untuk menghentikan reaksi. Membran disaring pada filter GF / B (Millipore) dan dicuci 3 kali dengan pencuci pencuci (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Filter dikeringkan dan radioaktivitas diukur menggunakan penghitung kilau [25], [26].

Binding Assay Radioligand

Membran sel yang disiapkan diinkubasi dengan 0.01 nM [3H] -spiperone (NET-565, PerkinElmer) dan peningkatan konsentrasi quinpirole (Q102, Sigma) untuk 30 min dalam buffer pengujian (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Membran disaring pada filter GF / B (Millipore) dan dicuci 3 kali dengan pencuci pencuci (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Reaksi dihentikan dengan penyaringan cepat melalui filter GF / C. Radioaktivitas residu diukur menggunakan penghitung kilau cair [27]-[29].

cAMP Enzim Immunoassay

Sel-sel HN 293 yang ditransfusikan sebelumnya diperlakukan dengan 10 µM ​​rolipram (R6520, Sigma) untuk 1 h, dan kemudian diobati dengan 0.1 µM ​​forskolin (F6886, Sigma) dan peningkatan konsentrasi quinpirole (Q102, Sigma) untuk min 30. Neuron striatal primer yang dikultur diperlakukan dengan 10 µM ​​rolipram untuk 1 h, dan kemudian 1 µM ​​dopamin untuk 1 h [22]. Lisis sel disiapkan dengan 0.1 M HCl dan kadar cAMP dideteksi oleh kit immunoassay enzim cAMP (Sapphire Bioscience) mengikuti instruksi pabrik.

Neuron Striatal Primer yang Dikultur

Area striatal diisolasi dari otak embrionik tikus (E15). Jaringan yang dibedah dipisahkan dalam media esensial minimal (MEM) (11095, Invitrogen) yang mengandung 0.25% trypsin (T4549-100, Sigma) dan 0.1% DNase I untuk 6 min pada 37 ° C. Sel ditangguhkan kembali dalam media pelapisan (MEM dengan 0.01 M HEPES (pH 7.4) dan serum kuda 10% (vol / vol) (16050-122, GIBCO)). Neuron dikultur selama 7 hari in vitro (DIV 7) dalam MEM dengan suplemen B27 (17504-044, Invitrogen) sebelum diterapkan pada immunoassays enzim cAMP.

Hasil

Cdk5 Phosphorylates Serine 321 dalam Loop Intraseluler Ketiga dari DRD2 in vitro

Untuk mengidentifikasi substrat Cdk5 novel, kami melakukan pencarian sistematis menggunakan (S / T) PX (K / H / R) sebagai urutan konsensus pengakuan Cdk5 [30] dan mengidentifikasi DRD2 sebagai kandidat media. Urutan konsensus, termasuk serine 321, terletak di loop intraseluler ketiga DRD2 (D2i3) di mana berbagai mekanisme pengaturan telah terlibat [3], [10], [11]. Urutan secara evolusioner dilestarikan dalam DRD2 dalam vertebrata, menyiratkan pentingnya fungsional residu (Fig. 1A).

kuku ibu jari

Gambar 1. Cdk5 phosphorylates serine 321 dalam loop intraseluler ketiga dari DRD2 secara in vitro

(A) Penjajaran urutan asam amino menunjukkan daerah DRD2 yang dilestarikan dari berbagai spesies (diarsir). Situs fosforilasi Cdk5 potensial ditandai dengan tanda bintang. (B) Tertaut IP in vitro uji kinase dengan rekombinan GST-D2i3 dan GST-D2i3 protein mutan. Kompleks Cdk5 / p35 yang diperkaya dari ekstrak otak tikus oleh imunopresipitasi anti-p35 digunakan untuk reaksi kinase. Autoradiograf protein terfosforilasi ditunjukkan bersama dengan pewarnaan Coomassie biru cemerlang dari gel yang sama. Panah menunjukkan sinyal radioaktif yang sesuai dengan GST-D2i3s dan panah terbuka menunjukkan sinyal radioaktif dari p35. (C) Spektrum MS / MS dari fragmen peptida terfosforilasi D2i3. Pola fragmentasi teoritis ditunjukkan di bawah spektrum. Di antara semua ion fragmen, ion y dan b yang terdeteksi dilambangkan dalam spektrum. Y6 dan y7 ion sangat menunjukkan fosforilasi serin 321. (D) Secara in vitro uji kinase dengan kompleks Cdk5 / GST-p25 murni menggunakan GST-D2i3 dan protein mutan GST-D2i3. Protein terfosforilasi ditunjukkan dalam autoradiograf, bersama dengan pewarnaan biru Coomassie yang cemerlang. Panah menunjukkan sinyal radioaktif yang sesuai dengan GST-D2i3 dan panah terbuka menunjukkan sinyal radioaktif dari GST-p25.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g001

Untuk menilai kapasitas Cdk5 untuk memfosforilasi D2i3, kami melakukan IP-linked in vitro pengujian kinase menggunakan kompleks Cdk5 / p35 aktif yang diperkaya dari lisat otak tikus dengan p35 imunopresipitasi dengan rekombinan GST-D2i3 (residu asam amino 212-373) sebagai substrat. Kami mengamati sinyal fosforilasi dalam protein GST-D2i3 dan GST-D2i3 S297A yang dimurnikan, tetapi sinyal berkurang secara signifikan menggunakan GST-D2i3 S321A (Fig. 1B). Untuk lebih memverifikasi fosforilasi serin 321 dalam GST-D2i3, kami melakukan analisis LC-MS / MS dari sampel dari IP-linked in vitro tes kinase menggunakan spektrometri massa LTQ XL. Secara konsisten, fosfon-peptida yang sesuai dengan massa fosfon-serin 321 peptida diperoleh kembali (Fig. 1C). Menimbang bahwa akuisisi yang bergantung pada data selama analisis LC-MS / MS cenderung mendeteksi protein yang berlimpah dalam sampel [31], data ini menunjukkan bahwa residu 321 serin adalah situs fosforilasi dominan Cdk5 di wilayah D2i3. Untuk membuktikan fosforilasi langsung serine 321 di GST-D2i3 oleh Cdk5, in vitro uji kinase menggunakan kompleks Cdk5 / GST-p25 murni dengan protein GST-D2i3 rekombinan murni telah dilakukan. Kami mengidentifikasi sinyal fosforilasi yang signifikan dalam GST-D2i3 yang tidak ada di GST-D2i3 S321A (Fig. 1D). Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa residu D2i3 S321 adalah target preferensi untuk fosforilasi yang dimediasi oleh Cdk5.

Cdk5 Phosphorylates Serine 321 dalam Loop Intraseluler Ketiga dari DRD2 dalam Sel

Untuk mengidentifikasi fosforilasi serin 321, kami mengangkat antibodi spesifik untuk phospho-serine 321 (pS321). Sampel dari IP-linked in vitro uji kinase dianalisis dengan Western blotting menggunakan antibodi anti-pS321. Blots menunjukkan pita berbeda dalam reaksi kinase yang bergantung pada GST-D2i3 (Fig. 2A). Untuk memverifikasi potensi fosforilasi serin 321 dalam DRD2 oleh Cdk5 dalam sel, imunopresipit anti-GFP dari sel-sel HEK 293 yang mengekspresikan DRD2-GFP dan DRD2 S321A-GFP dengan atau tanpa HA-CXXUMX dan pP yang dianalisa menggunakan Western antibodi anti-pS5. Sinyal-sinyal pita smear karakteristik dengan antibodi anti-GFP yang diketahui disebabkan oleh glikosilasi DRD35 yang berlebihan diamati hanya di hadapan antibodi DRD321-GFP, dan antibodi anti-pS2 mendeteksi sinyal DRD2 yang sama hanya dengan sinyal Cdk321 / p2 yang hanya diekspresikan.Fig. 2B) [7]. Untuk lebih memverifikasi fosforilasi serin 321 oleh Cdk5, D2i3 (FLAG-D2i3) dan bentuk mutan D2i3 (FLAG-D2i3 S321A) dihasilkan. FLAG-D2i3 dan FLAG-D2i3 S321A diekspresikan dengan atau tanpa HA-Cdk5 dan p35 dalam sel HEK 293 dianalisis dengan uji pergeseran mobilitas gel SDS-gel. Pergeseran mobilitas tergantung-Cdk5 yang signifikan diamati untuk FLAG-D2i3, tetapi tidak untuk FLAG-D2i3 S321A (Fig. 2C). Kami juga menilai tingkat fosforilasi DRD2 di Ser321 pada stimulasi agonis. Sel HEK 293 yang mengekspresikan kompleks DRD2-GFP dan Cdk5 / p35 distimulasi oleh quinpirole, dan imunopresipit anti-GFP dari lisat sel dianalisis dengan Western blotting menggunakan antibodi anti-GFP dan anti-pS321. Kami menemukan bahwa fosforilasi DRD5 yang dimediasi Cdk2 di Ser321 tidak dipengaruhi oleh stimulasi agonis, yang tampak berbeda dari fosforilasi yang dimediasi oleh GRK dan PKC (Fig. 2D) [32], [33]. Bersama-sama, hasil ini menunjukkan bahwa Cdk5 dapat memfosforilasi sisa serin 321 dari DRD2 di lingkungan seluler.

kuku ibu jari

Gambar 2. Cdk5 phosphorylates serine 321 dalam loop intraseluler ketiga dari DRD2 dalam sel.

Fosforilasi yang dimediasi oleh Cdk5 dari serin 321 dianalisis menggunakan antibodi anti-pS321. (A) Sampel dari IP-linked in vitro uji kinase menggunakan protein GST-D2i3 dianalisis dengan Western blotting (WB) dengan antibodi yang ditunjukkan. Tanda panah menunjukkan GST-D2i3s. (B) DRD2-GFP dan DRD2 S321A-GFP diekspresikan dengan atau tanpa HA-Cdk5 dan p35 dalam sel HEK 293. Imunopresipit anti-GFP dianalisis dengan Western blotting menggunakan antibodi anti-GFP dan anti-pS321. Braket menunjukkan sinyal DRD2 dan panah terbuka menunjukkan sinyal spesifik dari imunopresipif anti-GFP. '% input' adalah% volume total lisat untuk reaksi IP. Sinyal Cdk5 endogen yang lemah ditunjukkan oleh tanda bintang. (C) Uji pergeseran mobilitas gel. Sel HN 293 yang ditransfeksi sebagaimana ditunjukkan dianalisis dengan Western blotting. (D) Sel-sel HN 293 yang ditransfusikan diperlakukan dengan quinpirole dan imunopresipit anti-GFP dianalisis dengan Western blotting dengan antibodi anti-GFP dan anti-pS321. Buka panah menunjukkan sinyal spesifik dari imunopresipif anti-GFP.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g002

Kompleks Cdk5 / p35 dan DRD2 secara fisik terkait

Kami menyelidiki interaksi fisik potensial antara kompleks Cdk5 / p35 dan DRD2 karena banyak substrat Cdk5 diketahui secara fisik terkait dengan kompleks Cdk5 / p35 [23], [34], [35]. Pertama, percobaan pull-down GST dilakukan. Protein GST-D2i3 rekombinan murni diinkubasi dengan lisat otak tikus dan endapan pull-down GST dianalisis untuk Western blotting. Seperti yang ditunjukkan pada Fig. 3A, Cdk5 endogen dan p35 diidentifikasi dalam endapan pull-down, menunjukkan interaksi fisik antara DRD2 dan kompleks Cdk5 / p35 (Fig. 3A). Selain itu, HA-Cdk5 dan p35 terdeteksi dalam imunopresipit anti-GFP dari lisat sel HEK 293 yang mengekspresikan DRD2-GFP dan Cdk5 / p35 (Fig. 3B). Selain itu, kami melakukan analisis imunocytochemical dan mengamati bahwa DRD2-GFP, HA-Cdk5 dan p35 menunjukkan sinyal lokalisasi yang signifikan di area membran sel HN 293 (Fig. 3C, panel atas). Kami juga menyelidiki co-lokalisasi DRD2 dan Cdk5 / p35 dalam konteks neuronal. Secara konsisten, DRD2-GFP juga menunjukkan co-lokalisasi yang signifikan dengan Cdk5 endogen dan p35 dalam neuron striatal yang dikultur (DIV7), yang selanjutnya mendukung hubungan fungsional antara DRD2 dan Cdk5 / p35 (Fig. 3C, panel bawah). Hasil menunjukkan bahwa DRD2 dan Cdk5 / p35 dapat membentuk kompleks dan dengan demikian, mendukung gagasan bahwa DRD2 adalah substrat fisiologis Cdk5.

kuku ibu jari

Gambar 3. Cdk5 / p35 dapat membentuk kompleks dengan DRD2.

(A) GST pull-down assay menggunakan protein GST-D2i3 rekombinan murni dengan ekstrak otak tikus. Endapan pull-down GST menjadi sasaran analisis Western blotting. 'Manik' menunjukkan endapan pull-down tanpa protein GST. (B) Immunopresipitasi kompleks DRD2 dan Cdk5 / p35. IP Anti-GFP dari lisat dari sel yang ditransfeksi menjadi sasaran analisis Western blotting. Braket menunjukkan sinyal DRD2 dan panah terbuka menunjukkan sinyal spesifik dari imunopresipif anti-GFP. Blot yang terlalu terang untuk input juga ditampilkan di sebelah kanan. (C) Analisis imunokytokimia dari DRD2 dan Cdk5 / p35. Sel HEK 293 yang mengekspresikan DRD2-GFP dan Cdk5 / p35 diwarnai dengan antibodi anti-Cdk5 dan anti-p35 (panel atas). DRD2-GFP diekspresikan sendiri dalam neuron striatal yang dikultur dan diwarnai dengan antibodi anti-Cdk5 dan anti-p35 (panel bawah). Hoechst digunakan untuk pewarnaan nukleus. Bilah skala adalah 5 µm. Semua gambar diperoleh menggunakan confocal microscopy (Olympus, FluoView-1000).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g003

Fosforilasi yang dimediasi oleh Cdk5 dari DRD2 Melemahkan Aktivitas Reseptor

Telah dilaporkan bahwa fosforilasi memodulasi sifat kritis GPCRs seperti kopling protein G, internalisasi reseptor, lokalisasi intraseluler, dan hubungan dengan protein modulator [9], [11], [24]. Sebuahinternalisasi reseptor yang diinduksi gonist adalah proses pengaturan kritis transduksi sinyal. Kami menyelidiki modulasi internalisasi DRD5 yang dimediasi oleh Cdk2. Sel-sel HEK 293 yang mengekspresikan DRD2-GFP dan DRD2 S321A-GFP dengan atau tanpa Cdk5 / p35 diinkubasi dengan 1 μM kuinpirol untuk menginduksi agonis yang dipicu oleh internalisasi DRD2 (Fig. 4A). [3H] -sinyal spiperon dari DRD2-GFP mengekspresikan sel berkurang secara signifikan pada pengobatan 30 min quinpirole dan pulih pada 90 min. Menariknya, [3H] -syarat sinyal dari DRD2-GFP dan Cdk5 / p35 mengekspresikan sel juga berkurang pada 30 min quinpirol tetapi tidak pulih pada 90 min (Fig. 4A, bagian kedua). Di samping itu, [3H] -syarat sinyal dari DRD2 S321A-GFP mengekspresikan sel dikurangi pada 30 min dan pulih pada 90 min, terlepas dari koekspresi dengan Cdk5 / p35. Studi sebelumnya telah menunjukkan bahwa DRD2 yang diinternalisasi mendaur ulang kembali ke membran plasma setelah stimulasi agonis yang berkepanjangan [11]. TTampaknya, fosforilasi DRD5 yang dimediasi Cdk2 terlibat dalam proses resensitisasi setelah internalisasi DRD2 yang diinduksi oleh agonis.

kuku ibu jari

Gambar 4. Fosforilasi yang dimediasi-Cdk5 melemahkan ekspresi permukaan DRD2 dan pensinyalan hilir.

(A) Ekspresi permukaan DRD2 diukur dengan [3H] -pohon pengikat logam. Sel HEK293 yang ditransfusikan dirangsang dengan 1 μM quinpirole untuk waktu yang ditunjukkan dan dipanen, diikuti oleh 3 nM [3H] pengobatan -spiperone selama 3 jam. Radioaktivitas diukur dan sinyal permukaan dihitung. Error bar mewakili mean ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01; ANOVA satu arah dengan uji post hoc Dunnett: bandingkan semua kolom vs. kolom kontrol). (B) [35S] -GTPγS pengikatan uji. Selaput sel dibuat dari sel yang ditransfusikan seperti yang ditunjukkan. Preparat membran diinkubasi dengan 1 μM quinpirole diikuti oleh 3 nM [35S] -GTPγS selama 90 menit. Error bar merepresentasikan mean ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; One-way ANOVA dengan Bonferroni post hoc test: bandingkan semua pasang kolom). (C) Kompetisi Quinpirole [3H] -pohon pengikat logam. Persiapan membran dari sel transfected diinkubasi dengan 0.01 nM [3H] -spiperone dan meningkatkan konsentrasi quinpirole selama 30 menit. Regresi non-linier diperoleh dengan GraphPad. Bilah kesalahan menunjukkan mean ± SE (n = 3). (D) immunoassay enzim cAMP dalam sel HEK 293 yang ditransfeksi. Sel yang ditransfeksi diberi perlakuan awal dengan 10 µM rolipram selama 1 jam, dan selanjutnya diberi perlakuan bersama dengan 0.1 µM forskolin dan peningkatan konsentrasi quinpirole selama 30 menit. Regresi non-linier diperoleh dengan GraphPad. Batang kesalahan mewakili mean ± SE (n = 4; ** p <0.01; dua sisi t-test). (E) Neuron striatal yang dikultur dari tipe liar dan embrio knockout p35 (DIV 7) dirawat dengan rolipram 10 µM ​​untuk 1 h diikuti oleh 1 µM ​​dopamin untuk 1 h. Bilah galat mewakili mean ± SE (n = 4; **p<0.01; berekor dua t-test).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g004

Kami lebih lanjut mengevaluasi perubahan potensial dari coupling protein G yang distimulasi agonis menjadi DRD2 terkait dengan fosforilasi yang dimediasi oleh Cdk5 menggunakan [35S] -GTPγS pengikatan uji [25], [26]. DRD2-GFP dan DRD2 S321A-GFP dengan atau tanpa Cdk5 / p35 diekspresikan dalam sel HEK 293. Membran disiapkan dan distimulasi dengan 1 μM quinpirole dan selanjutnya diizinkan [35S] -GTPγPenggabungan. DRD2-GFP dan Cdk5 / p35 mengekspresikan membran sel menunjukkan gangguan signifikan [35S] -GTPγIkatan S dibandingkan dengan semua membran sel lainnya (Fig. 4B). Hasil ini menunjukkan bahwa fosforilasi yang dimediasi Cdk5 menurunkan pengikatan pengikatan protein G yang terstimulasi agonis di DRD2.

Selain itu, persaingan quinpirole [3Uji ikatan H-spiperone dilakukan untuk menginvestigasi setiap kemungkinan perubahan afinitas agonis di DRD2 oleh fosforilasi yang dimediasi oleh Cdk5. Pengikatan kompetitif [3H] -spiperone pada pengobatan peningkatan konsentrasi quinpirole terhadap persiapan membran dari ditransfeksi diukur. Pengikatan kompetitif quinpirole dan [3H] -spiperone di DRD2-GFP dan DRD2 S321A-GFP membuat logK serupai nilai (−9.789 untuk DRD2-GFP; −9.691 untuk DRD2 S321A-GFP), yang menunjukkan bahwa afinitas ligan terhadap DRD2 tidak dipengaruhi secara signifikan oleh fosforilasi yang dimediasi oleh Cdk5 di DRD2 (Fig. 4C).

Phdkorynated-mediated Cdk5 Down-mengatur DRD2-cAMP Signaling Pathway

Selanjutnya, kami menyelidiki apakah modifikasi DRD2 oleh Cdk5 memengaruhi jalur pensinyalan hilir. Kami memantau penghambatan yang dimediasi DRD2 dari produksi cAMP forskolin-stimulasi oleh adenylyl cyclase dalam sel yang mengekspresikan DRD2-GFP dan DRD2 S321A-GFP menggunakan enzim cAMP immunoassay Sel yang mengekspresikan DRD2 menunjukkan penurunan level cAMP sebagai respons terhadap quinpirol dengan cara yang tergantung pada dosis. Hebatnya, koekspresi Cdk5 / p35 secara signifikan mengurangi penghambatan maksimal pembentukan cAMP (Gbr. 4D, panel kiri). Di sisi lain, dalam sel pengekspres DRD2 S321A-GFP, formasi cAMP secara efektif dihambat dalam menanggapi pengobatan quinpirol terlepas dari ekspresi Cdk5 / p35 (Gbr. 4D, panel kanan). Hasil ini menunjukkan bahwa fosforilasi DRD5 yang dimediasi Cdk2 mengurangi aktivitas penghambatan DRD2 pada jalur pensinyalan cAMP downstream. Untuk lebih mengkonfirmasi fenomena dalam pengaturan yang lebih relevan secara fisiologis, kami menggunakan neuron kultur primer dari defisiensi embrio knockout di p35, aktivator penting Cdk5. Neuron striatal primer yang dikultur diperlakukan dengan dopamin 1 µM ​​dan dianalisis dengan immunoassay enzim cAMP. Neuron dari tikus KO p35 menunjukkan penurunan level cAMP dibandingkan dengan neuron tipe liar ketika distimulasi dengan dopamin (Fig. 4E). Tbersama-sama, kami menyimpulkan bahwa fosforilasi DRD5 yang dimediasi Cdk2 menghasilkan penurunan nada penghambatan pada jalur cAMP yang diberikan oleh DRD2.

Diskusi

Kami mengidentifikasi DRD2 sebagai substrat novel Cdk5. Fosforilasi nampaknya menurunkan regulasi ekspresi permukaan DRD2 dengan memengaruhi nasib DRD2 setelah internalisasi reseptor sehingga mengurangi DRD2 Gi-Coupling dan jalur cAMP hilir. Karena residu fosforilasi S321 ada baik dalam DRD2 panjang dan pendek isoform, mekanisme yang diusulkan dalam penelitian ini mungkin menjadi mode umum regulasi dalam DRD2-mediated pensinyalan.

DRD2 dalam neuron berduri sedang tidak hanya dianggap sebagai subtipe reseptor dopamin utama tetapi juga telah dikenal karena kerentanannya terhadap perubahan ketersediaan dalam menanggapi rangsangan lingkungan. Desensitisasi dan resensitisasi DRD2 yang diinduksi agonis telah dipelajari secara luas [11], [24]. Secara khusus, sejumlah penelitian telah menunjukkan bahwa efek pajanan psikostimulan kronis, seperti kokain dan amfetamin, yang meningkatkan level dopamin ekstraseluler dalam sinaps striatal, disertai dengan perubahan dinamis DRD2 pasca sinaptik. [36]. Memang, pengguna kokain kronis diketahui telah mengurangi tingkat DRD2 di daerah striatal, dan ketersediaan DRD2 di nucleus accumbens (NAcc) menunjukkan korelasi negatif dengan perilaku pencarian dan penguatan obat pada tikus dan primata. [37]-[39]. Temuan ini menunjukkan bahwa fungsi DRD2 sangat rentan terhadap regulasi adaptif atau kompensasi dalam menanggapi berbagai rangsangan termasuk paparan obat kronis. Hasil kami menunjukkan bahwa residu S321 dalam loop intraseluler ketiga DRD2 dapat difosforilasi oleh Cdk5, yang menghasilkan penurunan pengaruh penghambatan DRD2 pada jalur cAMP. Interaksi ini mengusulkan mekanisme pengaturan baru yang terkait dengan Cdk5 dalam neuron dopaminoseptif yang mungkin terkait dengan sifat dinamis ketersediaan permukaan DRD2.

Perlu dicatat bahwa Cdk5 dikenal sebagai komponen kunci dalam memediasi perubahan adaptif dari lingkungan neuron. Sebagai contoh, perubahan struktural dan fungsional duri dendritik pada neuron sirkuit limbik adalah salah satu konsekuensi dari paparan psikostimulan berulang. [40]. Perubahan-perubahan ini disertai dengan berbagai perubahan molekuler termasuk induksi protein pengikat elemen respons cAMP (CREB) dan ΔFosB, faktor transkripsi yang menunjukkan regulasi yang bertahan lama dalam menanggapi pemberian kokain kronis [41], [42]. Yang penting, Cdk5 adalah target dari ΔFosB [19], dan banyak komponen penting yang terlibat dalam dinamika tulang belakang dendritik, seperti PSD-95, kinase teraktivasi p21 (PAK), β-catenin, dan spinophilin, dilaporkan sebagai substrat Cdk5 [43]-[46]. Secara konsisten, manipulasi genetik atau farmakologis dari aktivitas Cdk5 mendatangkan perubahan morfologi tulang belakang dendritik dan respons perilaku terhadap kokain, menyiratkan peran penting untuk Cdk5 dalam perubahan molekuler dan morfologis dari sirkuit dopamin mesolimbik [47], [48]. Hasil kami menunjukkan bahwa DRD2 adalah target baru dari Cdk5 memberikan wawasan tambahan ke dalam perubahan adaptif sistem dopamin dalam menanggapi paparan obat kronis karena peraturan lanjutan yang dimediasi osFB dari Cdk5 dapat menginduksi peningkatan tonik dalam fosforilasi DRD2 . Selain itu, DRD2 diketahui mempengaruhi banyak proses seluler, termasuk regulasi jalur cAMP dan MAP kinase dan peristiwa transkripsi hilir [42], [49]. Dengan demikian, temuan dalam penelitian ini mungkin tidak hanya menggambarkan regulasi langsung DRD2 oleh Cdk5 tetapi juga memberikan wawasan baru tentang respon adaptif sistem dopamin terhadap paparan obat kronis.

Kontribusi Penulis

Bayangkan dan rancang percobaan: JJ YUP DH SKP. Melakukan percobaan: JJ YUP DKK YK. Menganalisis data: JJ YUP DKK SL YK SAL HL YSG DH SKP. Alat bantu reagen / bahan / analisis yang dikontribusikan: YHS. Menulis makalah: JJ SKP.

Referensi

  1. 1. Missale C, Nash SR, Robinson SW, Jaber M, Caron MG (1998) reseptor dopamin: dari struktur ke fungsi. Physiol Rev 78: 189 – 225.
  2. 2. Wise RA (2002) Sirkuit imbalan otak: wawasan dari insentif tanpa kompensasi. Neuron 36: 229 – 240. doi: 10.1016 / s0896-6273 (02) 00965-0
  3. Lihat Artikel
  4. PubMed / NCBI
  5. Google Scholar
  6. Lihat Artikel
  7. PubMed / NCBI
  8. Google Scholar
  9. Lihat Artikel
  10. PubMed / NCBI
  11. Google Scholar
  12. Lihat Artikel
  13. PubMed / NCBI
  14. Google Scholar
  15. Lihat Artikel
  16. PubMed / NCBI
  17. Google Scholar
  18. Lihat Artikel
  19. PubMed / NCBI
  20. Google Scholar
  21. Lihat Artikel
  22. PubMed / NCBI
  23. Google Scholar
  24. Lihat Artikel
  25. PubMed / NCBI
  26. Google Scholar
  27. Lihat Artikel
  28. PubMed / NCBI
  29. Google Scholar
  30. Lihat Artikel
  31. PubMed / NCBI
  32. Google Scholar
  33. Lihat Artikel
  34. PubMed / NCBI
  35. Google Scholar
  36. Lihat Artikel
  37. PubMed / NCBI
  38. Google Scholar
  39. Lihat Artikel
  40. PubMed / NCBI
  41. Google Scholar
  42. Lihat Artikel
  43. PubMed / NCBI
  44. Google Scholar
  45. Lihat Artikel
  46. PubMed / NCBI
  47. Google Scholar
  48. Lihat Artikel
  49. PubMed / NCBI
  50. Google Scholar
  51. Lihat Artikel
  52. PubMed / NCBI
  53. Google Scholar
  54. Lihat Artikel
  55. PubMed / NCBI
  56. Google Scholar
  57. Lihat Artikel
  58. PubMed / NCBI
  59. Google Scholar
  60. Lihat Artikel
  61. PubMed / NCBI
  62. Google Scholar
  63. Lihat Artikel
  64. PubMed / NCBI
  65. Google Scholar
  66. Lihat Artikel
  67. PubMed / NCBI
  68. Google Scholar
  69. Lihat Artikel
  70. PubMed / NCBI
  71. Google Scholar
  72. Lihat Artikel
  73. PubMed / NCBI
  74. Google Scholar
  75. Lihat Artikel
  76. PubMed / NCBI
  77. Google Scholar
  78. Lihat Artikel
  79. PubMed / NCBI
  80. Google Scholar
  81. Lihat Artikel
  82. PubMed / NCBI
  83. Google Scholar
  84. Lihat Artikel
  85. PubMed / NCBI
  86. Google Scholar
  87. Lihat Artikel
  88. PubMed / NCBI
  89. Google Scholar
  90. Lihat Artikel
  91. PubMed / NCBI
  92. Google Scholar
  93. Lihat Artikel
  94. PubMed / NCBI
  95. Google Scholar
  96. Lihat Artikel
  97. PubMed / NCBI
  98. Google Scholar
  99. Lihat Artikel
  100. PubMed / NCBI
  101. Google Scholar
  102. Lihat Artikel
  103. PubMed / NCBI
  104. Google Scholar
  105. Lihat Artikel
  106. PubMed / NCBI
  107. Google Scholar
  108. Lihat Artikel
  109. PubMed / NCBI
  110. Google Scholar
  111. Lihat Artikel
  112. PubMed / NCBI
  113. Google Scholar
  114. Lihat Artikel
  115. PubMed / NCBI
  116. Google Scholar
  117. Lihat Artikel
  118. PubMed / NCBI
  119. Google Scholar
  120. Lihat Artikel
  121. PubMed / NCBI
  122. Google Scholar
  123. Lihat Artikel
  124. PubMed / NCBI
  125. Google Scholar
  126. Lihat Artikel
  127. PubMed / NCBI
  128. Google Scholar
  129. Lihat Artikel
  130. PubMed / NCBI
  131. Google Scholar
  132. Lihat Artikel
  133. PubMed / NCBI
  134. Google Scholar
  135. Lihat Artikel
  136. PubMed / NCBI
  137. Google Scholar
  138. Lihat Artikel
  139. PubMed / NCBI
  140. Google Scholar
  141. Lihat Artikel
  142. PubMed / NCBI
  143. Google Scholar
  144. 3. Neve KA, Seamans JK, Trantham-Davidson H (2004) pensinyalan reseptor dopamin. J Recept Signal Transduct Res 24: 165 – 205. doi: 10.1081 / pertama-200029981
  145. 4. Amar S, Shaltiel G, Mann L, Shamir A, Dean B, dkk. (2008) Kemungkinan keterlibatan komponen pensinyalan reseptor D2 pasca-dopamin dalam patofisiologi skizofrenia. Int J Neuropsychopharmacol 11: 197 – 205. doi: 10.1017 / s1461145707007948
  146. 5. Caine SB, Negus SS, Mello NK, Patel S, Bristow L, dkk. (2002) Peran reseptor dopamin seperti D2 dalam pemberian sendiri kokain: penelitian dengan tikus mutan reseptor D2 dan antagonis reseptor D2 novel. J Neurosci 22: 2977 – 2988.
  147. 6. Lee S, Jeong J, Taman YU, Kwak Y, Lee SA, dkk. (2012) Valproate mengubah pensinyalan dopamin sehubungan dengan induksi ekspresi protein Par-4. PLoS One 7: e45618. doi: 10.1371 / journal.pone.0045618
  148. 7. Fishburn CS, Elazar Z, Fuchs S (1995) Glikosilasi diferensial dan perdagangan intraseluler untuk isoform panjang dan pendek dari reseptor dopamin D2. J Biol Chem 270: 29819 – 29824. doi: 10.1074 / jbc.270.50.29819
  149. 8. Pembaca TA, Molina-Holgado E, Lima L, Boulianne S, Dewar KM (1992) Spesifik [3H] yang mengikat raslopride pada reseptor D2 dopamin neostriatal: peran kelompok disulfida dan sulfhidril. Neurochem Res 17: 749 – 759. doi: 10.1007 / bf00969008
  150. 9. Ng GY, O'Dowd BF, Caron M, Dennis M, Brann MR, dkk. (1994) Fosforilasi dan palmitoylasi reseptor dopamin D2L manusia dalam sel Sf9. J Neurochem 63: 1589 – 1595. doi: 10.1046 / j.1471-4159.1994.63051589.x
  151. 10. Li M, Bermak JC, Wang ZW, Zhou QY (2000) Modulasi sinyal reseptor dopamin D (2) dengan protein pengikat aktin (ABP-280). Mol Pharmacol 57: 446 – 452.
  152. 11. Cho D, Zheng M, Min C, Ma L, Kurose H, dkk. (2010) Endositosis dan reseptor fosforilasi yang dimediasi agonis memediasi resensitisasi reseptor dopamin D (2). Mol Endocrinol 24: 574 – 586. doi: 10.1210 / me.2009-0369
  153. 12. Tsai LH, Delalle I, Caviness VS Jr, Chae T, Harlow E (1994) p35 adalah subunit regulator syaraf spesifik dari kinase yang bergantung pada cyclin 5. Alam 371: 419 – 423. doi: 10.1038 / 371419a0
  154. 13. Dhavan R, Tsai LH (2001) Satu dekade CDK5. Nat Rev Mol Cell Biol 2: 749 – 759. doi: 10.1038 / 35096019
  155. 14. Fu AK, Ip NY (2007) Cyclin-dependent kinase 5 menghubungkan isyarat ekstraseluler dengan aktin sitoskeleton selama perkembangan tulang belakang dendritik. Sel Adh Migr 1: 110 – 112. doi: 10.4161 / cam.1.2.4617
  156. 15. Wang J, Liu S, Fu Y, Wang JH, Lu Y (2003) Aktivasi Cdk5 menginduksi kematian sel CA1 hippocampal dengan secara langsung memfosforilasi reseptor NMDA. Nat Neurosci 6: 1039 – 1047. doi: 10.1038 / nn1119
  157. 16. Zhang S, Edelmann L, Liu J, Crandall JE, Morabito MA (2008) Cdk5 mengatur fosforilasi tirosin 1472 NR2B dan ekspresi permukaan reseptor NMDA. J Neurosci 28: 415 – 424. doi: 10.1523 / jneurosci.1900-07.2008
  158. 17. Moy LY, Tsai LH (2004) Cyclin-dependent kinase 5 phosphorylates serine 31 dari tirosin hidroksilase dan mengatur kestabilannya. J Biol Chem 279: 54487 – 54493. doi: 10.1074 / jbc.m406636200
  159. 18. Bibb JA, Snyder GL, Nishi A, Yan Z, Meijer L, dkk. (1999) Fosforilasi DARPP-32 oleh Cdk5 memodulasi pensinyalan dopamin dalam neuron. Alam 402: 669 – 671.
  160. 19. Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A, dkk. (2001) Efek pajanan kronis terhadap kokain diatur oleh protein neuronal Cdk5. Alam 410: 376 – 380.
  161. 20. Ohshima T, Ogawa M, Veeranna, Hirasawa M, Longenecker G, dkk. (2001) Kontribusi sinergistik cyclin-dependent kinase 5 / p35 dan Reelin / Dab1 pada posisi neuron kortikal di otak tikus yang sedang berkembang. Proc Natl Acad Sci USA 98: 2764 – 2769. doi: 10.1073 / pnas.051628498
  162. 21. Morabito MA, Sheng M, Tsai LH (2004) Cyclin-dependent kinase 5 memfosforilasi domain N-terminal dari protein densitas postsynaptic PSD-95 dalam neuron. J Neurosci 24: 865 – 876. doi: 10.1523 / jneurosci.4582-03.2004
  163. 22. Park SK, Nguyen MD, Fischer A, Luke MP, Affar el B, dkk. (2005) Par-4 mengaitkan pensinyalan dopamin dan depresi. Sel 122: 275 – 287. doi: 10.1016 / j.cell.2005.05.031
  164. 23. Niethammer M, Smith DS, Ayala R, Peng J, Ko J, dkk. (2000) NUDEL adalah substrat Cdk5 novel yang terkait dengan LIS1 dan dynein sitoplasma. Neuron 28: 697 – 711. doi: 10.1016 / s0896-6273 (00) 00147-1
  165. 24. Kim KM, Valenzano KJ, Robinson SR, Yao WD, Barak LS, dkk. (2001) Peraturan berbeda dari reseptor dopamin D2 dan D3 oleh reseptor kinase berpasangan protein G dan beta-arrestin. J Biol Chem 276: 37409 – 37414. doi: 10.1074 / jbc.m106728200
  166. 25. Waldhoer M, Bofill-Cardona E, Milligan G, Freissmuth M, Nanoff C (1998) Diferensial tanpa pisah dari A1 adenosin dan reseptor dopamin D2 oleh suramin dan didemetilasi suramin (NF037). Mol Pharmacol 53: 808 – 818.
  167. 26. Bofill-Cardona E, Kudlacek O, Yang Q, Ahorn H, Freissmuth M, dkk. (2000) Mengikat calmodulin ke reseptor D2-dopamin mengurangi pensinyalan reseptor dengan menahan saklar aktivasi protein G. J Biol Chem 275: 32672 – 32680. doi: 10.1074 / jbc.m002780200
  168. 27. Daftar SJ, Seeman P (1981) Resolusi komponen reseptor dopamin dan serotonin dari [3H] yang mengikat spiperone ke daerah otak tikus. Proc Natl Acad Sci USA 78: 2620 – 2624. doi: 10.1073 / pnas.78.4.2620
  169. 28. Gardner B, Strange PG (1998) Aksi agonis pada reseptor dopamin D2 (panjang): pengikatan ligan dan uji fungsional. Br J Pharmacol 124: 978 – 984. doi: 10.1038 / sj.bjp.0701926
  170. 29. Seeman P, Tallerico T, Ko F (2003) Dopamin menggeser [3H] domperidone dari situs afinitas tinggi dari reseptor D2 dopamin, tetapi bukan [3H] raclopride atau [3H] spiperone dalam media isotonik manusia: Implikasi untuk emisi positron manusia. Sinaps 49: 209 – 215. doi: 10.1002 / syn.10232
  171. 30. Obenauer JC, Cantley LC, Yaffe MB (2003) Scansite 2.0: Prediksi lebar protein dari interaksi pensinyalan sel menggunakan motif urutan pendek. Asam Nukleat Res 31: 3635 – 3641. doi: 10.1093 / nar / gkg584
  172. 31. Liu H, Sadygov RG, Yates JR 3rd (2004) Sebuah model untuk pengambilan sampel acak dan estimasi kelimpahan protein relatif dalam proteomik senapan. Anal Chem 76: 4193 – 4201. doi: 10.1021 / ac0498563
  173. 32. Ito K, Haga T, Lameh J, Sadee W (1999) Penyerapan reseptor D2 dopamin tergantung pada koekspresi reseptor kinase berpasangan G-protein 2 atau 5. Eur J Biochem 260: 112 – 119. doi: 10.1046 / j.1432-1327.1999.00125.x
  174. 33. Namkung Y, Sibley DR (2004) Protein kinase C memediasi fosforilasi, desensitisasi, dan perdagangan reseptor dopamin D2. J Biol Chem 279: 49533 – 49541. doi: 10.1074 / jbc.m408319200
  175. 34. Seperti AS, Lee RH, Cheung AY, Yeung PK, Chung SK, dkk. (2011) Fosforilasi endofilin yang dimediasi oleh Cdk5 yang diperlukan oleh B1 diperlukan untuk autophagy yang diinduksi pada model penyakit Parkinson. Nat Cell Biol 13: 568 – 579. doi: 10.1038 / ncb2217
  176. 35. Kesavapany S, Lau KF, McLoughlin DM, Brownlees J, Ackerley S, dkk. (2001) p35 / cdk5 mengikat dan memfosforilasi beta-catenin dan mengatur interaksi beta-catenin / presenilin-1. Eur J Neurosci 13: 241 – 247. doi: 10.1046 / j.1460-9568.2001.01376.x
  177. 36. Kuhar MJ, Ritz MC, Boja JW (1991) Hipotesis dopamin dari sifat penguat kokain. Tren Neurosci 14: 299 – 302. doi: 10.1016 / 0166-2236 (91) 90141-g
  178. 37. Volkow ND, Fowler JS, Wolf AP, Schlyer D, Shiue CY, dkk. (1990) Efek penyalahgunaan kokain kronis pada reseptor dopamin postinaptik. Am J Psychiatry 147: 719 – 724.
  179. 38. Dalley JW, TD Penggorengan, Brichard L, Robinson ES, Theobald DE, dkk. (2007) Nucleus accumbens reseptor D2 / 3 memprediksi sifat impulsif dan penguatan kokain. Sains 315: 1267 – 1270. doi: 10.1126 / science.1137073
  180. 39. Nader MA, Morgan D, HD Gage, Nader SH, Calhoun TL, dkk. (2006) Pencitraan PET dari reseptor D2 dopamin selama pemberian sendiri kokain kronis pada monyet. Nat Neurosci 9: 1050 – 1056. doi: 10.1038 / nn1737
  181. 40. Robinson TE, Kolb B (1997) Modifikasi struktural yang persisten pada nucleus accumbens dan neuron korteks prefrontal yang dihasilkan oleh pengalaman sebelumnya dengan amfetamin. J Neurosci 17: 8491 – 8497.
  182. 41. Robinson TE, Kolb B (1999) Perubahan dalam morfologi dendrit dan dendritik duri dalam nucleus accumbens dan prefrontal cortex setelah perawatan berulang dengan amphetamine atau kokain. Eur J Neurosci 11: 1598 – 1604. doi: 10.1046 / j.1460-9568.1999.00576.x
  183. 42. McClung CA, Nestler EJ (2003) Pengaturan ekspresi gen dan pemberian kokain oleh CREB dan DeltaFosB. Nat Neurosci 6: 1208 – 1215. doi: 10.1038 / nn1143
  184. 43. Feng J, Yan Z, Ferreira A, Tomizawa K, Liauw JA, dkk. (2000) Spinophilin mengatur pembentukan dan fungsi duri dendritik. Proc Natl Acad Sci USA 97: 9287 – 9292. doi: 10.1073 / pnas.97.16.9287
  185. 44. Prange O, Murphy TH (2001) Transport modular dari cluster postsynaptic-95 dan hubungannya dengan prekursor tulang belakang yang stabil selama perkembangan awal neuron kortikal. J Neurosci 21: 9325 – 9333.
  186. 45. Depolarisasi Murase S, Mosser E, Schuman EM (2002) mendorong beta-Catenin menjadi duri saraf yang mempromosikan perubahan struktur dan fungsi sinaptik. Neuron 35: 91 – 105. doi: 10.1016 / s0896-6273 (02) 00764-x
  187. 46. Hayashi ML, Choi SY, Rao BS, Jung HY, Lee HK, dkk. (2004) Mengubah morfologi sinaptik kortikal dan gangguan konsolidasi memori pada tikus transgenik PAK dominan dominan-negatif spesifik otak. Neuron 42: 773 – 787. doi: 10.1016 / j.neuron.2004.05.003
  188. 47. Benavides DR, Quinn JJ, Zhong P, AH Hawasli, DiLeone RJ, et al. (2007) Cdk5 memodulasi pemberian kokain, motivasi, dan rangsangan neuron striatal. J Neurosci 27: 12967 – 12976. doi: 10.1523 / jneurosci.4061-07.2007
  189. 48. Meyer DA, Richer E, Benkovic SA, Hayashi K, Kansy JW, dkk. (2008) Disregulasi striatal Cdk5 mengubah respons alat gerak terhadap kokain, pembelajaran motorik, dan morfologi dendritik. Proc Natl Acad Sci USA 105: 18561 – 18566. doi: 10.1073 / pnas.0806078105
  190. 49. Impey S, Obrietan K, Storm DR (1999) Membuat koneksi baru: peran pensinyalan ERK / MAP kinase dalam plastisitas neuron. Neuron 23: 11 – 14. doi: 10.1016 / s0896-6273 (00) 80747-3