Decoding Sirkuit Saraf Tiruan yang Mengontrol Pencarian Sukrosa Kompulsif (2015) (BINGE MECHANISM)

Untuk mengidentifikasi neuron LH yang memberikan masukan monosinaptik ke VTA in vivo dan mengamati aktivitasnya selama perilaku bergerak bebas, kami menggunakan strategi virus ganda untuk mengekspresikan channelrhodopsin-2 (ChR2) secara selektif di neuron LH yang memberikan masukan monosinaptik ke VTA (Angka 1A dan S1). Kami menyuntikkan vektor virus terkait adeno (AAV₅) membawa ChR2-eYFP dalam konstruksi kerangka baca terbuka terbalik (DIO) yang bergantung pada Cre-rekombinase ke dalam LH untuk menginfeksi somata lokal dan menyuntikkan virus herpes simpleks perjalanan retrogradely (HSV) yang membawa Cre-rekombinase ke dalam VTA. Rekombinasi selanjutnya memungkinkan ekspresi opsin dan fluorofor secara selektif di neuron LH yang memberikan masukan monosinaptik ke VTA. Untuk mengkonfirmasi pendekatan kami, kami melakukan rekaman penjepit patch seluruh sel ex vivo di irisan otak horizontal yang mengandung LH dan direkam dari neuron yang mengekspresikan ChR2-eYFP, serta neuron LH tetangga yang ChR2-eYFP negatif (Gambar 1B). Latensi lonjakan cahaya, diukur dari awal denyut cahaya hingga puncak potensial aksi, berkisar antara 3–8 ms (Gambar 1C). Kami juga menemukan bahwa tidak ada sel non-ekspresif (ChR2-negatif) yang direkam menunjukkan respon rangsang terhadap fotostimulasi (n = 14; Gambar 1C), meskipun dekat dengan sel pengekspres ChR2.

Untuk melakukan identifikasi foto yang dimediasi secara optogenetik secara in vivo, sebuah optrode ditanamkan ke dalam LH untuk merekam aktivitas neuron selama tugas pencarian sukrosa. Dalam sesi perekaman yang sama, kami menyediakan beberapa pola fotostimulasi untuk mengidentifikasi neuron LH-VTA yang mengekspresikan ChR2 (Angka 1D dan S1). Kami memeriksa distribusi latensi photoresponse rangsang di semua neuron LH yang menunjukkan perubahan waktu-terkunci dalam laju penembakan sebagai respons terhadap iluminasi dan mengamati distribusi bimodal (Gambar 1E). Kami mengamati populasi neuron selama perekaman in vivo dengan latensi dalam kisaran 3–8 ms. Ini identik dengan kisaran latensi yang ditemukan di neuron LH-VTA yang mengekspresikan ChR2 saat kami merekam ex vivo. Kami menamakan unit ini unit "Tipe 1" (Angka 1C, 1E, dan 1F). Selain itu, terdapat populasi sel yang berbeda dengan latensi respons fotorik ∼100 ms (Angka 1E dan 1G), dan kami menyebutnya unit "Type 2". Kami juga mengamati neuron yang dihambat dalam menanggapi fotostimulasi neuron LH-VTA (Gambar S2), dan kami menyebut unit-unit "Type 3" ini. Kami membandingkan durasi potensial aksi (yang diukur dari puncak ke palung) dan rata-rata laju penembakan unit Tipe 1 dan Tipe 2 serta yang tidak menunjukkan respons photor (Gambar 1H). Distribusi durasi potensial aksi Tipe 1 (Gambar 1I) dan Ketik 2 (Gambar 1J) unit menunjukkan bahwa mayoritas unit Tipe 1 memiliki durasi potensial aksi kurang dari 500 μs (84%; n = 16/19, distribusi binomial, p = 0.002).

Meskipun unit Tipe 1 memenuhi kriteria standar untuk diklasifikasikan sebagai pengekspresian ChR2 (Cohen et al., 2012, Zhang et al., 2013), tidak jelas apakah respons fotorespon yang lebih lama dari unit Tipe 2 merupakan indikasi neuron pengekspres ChR2 yang merespons. lebih lambat pada fotostimulasi, atau apakah efek ini disebabkan oleh aktivitas jaringan. Mengingat bahwa neuron LH yang mengekspresikan ChR2 (Tipe 1) memproyeksikan langsung ke VTA, satu kemungkinan adalah bahwa neuron Tipe 2 menerima umpan balik dari VTA (Gambar 1K). Kemungkinan lain adalah bahwa neuron Tipe 2 diaktifkan oleh agunan akson dari neuron Tipe 1 (Gambar 1L). Untuk membedakan antara dua model rangkaian yang mungkin ini, kami menghambat VTA bersamaan dengan fotoidentifikasi di LH.

Berdasarkan model rangkaian kami, kami berharap penghambatan distal tidak memiliki efek pada respon fotores dari neuron LH yang mengekspresikan ChR2. Namun, jika photoresponsive, tetapi tidak mengekspresikan, LH neuron mengandalkan umpan balik dari VTA untuk memperoleh respons yang terkunci waktu terhadap pencahayaan (Gambar 1K), kami mengharapkan atenuasi respons fotores dalam neuron ini pada penghambatan VTA. Kami menyatakan ChR2 dalam sel LH-VTA seperti di atas, tetapi kali ini juga menyatakan peningkatan halorhodopsin 3.0 (NpHR) di VTA dan menanamkan serat optik dalam VTA di samping optroda di LH (Gambar 2SEBUAH). Kami memberikan pola iluminasi cahaya biru yang sama di LH untuk ketiga zaman, tetapi juga memotret VTA dengan cahaya kuning pada zaman kedua (Gambar 2SEBUAH).

Respons fotor dari unit Tipe 1 terhadap pencahayaan cahaya biru di LH tidak terpengaruh oleh fotoinhibisi VTA, yang konsisten dengan ekspresi ChR2 dalam neuron Tipe 1 LH-VTA (Gambar 2B). Sebaliknya, sebagian besar unit Tipe 2 (87%; n = 13/15, distribusi binomial, p = 0.004) menunjukkan redaman yang signifikan dari respons fotorik terhadap sinyal cahaya biru yang dikirimkan di LH pada fotoinhibisi neuron VTA. Respon unit Tipe 1 dan Tipe 2 selama fotoinhibisi VTA berbeda secara signifikan (chi-square = 7.64, p = 0.0057; Angka 2B dan 2C). Perbedaan-perbedaan ini juga dapat dilihat dalam skor maks Z selama masing-masing zaman (Gambar 2D) dan dengan zaman kuning-ON dinormalisasi ke zaman kuning-OFF (Gambar 2E). Data ini menunjukkan bahwa neuron Tipe 2 LH menerima input (baik secara langsung maupun tidak langsung) dari VTA (Gambar 1K) daripada melalui agunan akson lokal (Gambar 1L).

Setelah mengidentifikasi dua jenis neuron LH yang berbeda ini dalam loop LH-VTA, kami ingin memeriksa aktivitas saraf yang terjadi secara alami selama tugas administrasi mandiri sukrosa (Gambar 3SEBUAH). Tikus dilatih untuk melakukan respon nosepoke sebagai isyarat untuk memprediksi pengiriman sukrosa di pelabuhan yang berdekatan (seperti dalam Tye et al., 2008). Untuk memungkinkan kita membedakan respon saraf terhadap nosepoke dan isyarat, isyarat dan sukrosa diberikan dengan jadwal penguatan parsial, dimana 50% dari nosepoke dipasangkan dengan pengiriman isyarat dan sukrosa.

Unit Tipe 1 menunjukkan respons fasik terhadap entri port sukrosa, seperti yang terlihat dalam unit Tipe 1 yang representatif (Gambar 3B), serta data populasi untuk semua unit Tipe 1 (Gambar 3C). Respons phasic unit Tipe 2, bagaimanapun, terutama mencerminkan tanggapan terhadap isyarat prediktif-hadiah (Angka 3D dan 3E). Pola penembakan yang dinormalisasi dari semua neuron yang terekam (n = 198, dibagi menjadi Tipe 1, 2, 3, dan unit non-responsif) ditampilkan untuk setiap komponen tugas: nosepokes dipasangkan dengan isyarat, nosepoke jika tidak ada isyarat, dan entri sukrosa port (Gambar 3F). Semua unit Tipe 1 yang menunjukkan perubahan fase aktivitas yang relevan dengan tugas (74%; n = 14/19) baik secara fase bersemangat atau dihambat oleh entri port sukrosa, dengan sejumlah kecil juga menunjukkan penghambatan fase ke isyarat prediksi-penghargaan (Angka 3B, 3C, dan 3G). Sebaliknya, unit Tipe 2 lebih heterogen, dengan neuron responsif tugas mengkode isyarat secara selektif (35%), entri port sukrosa secara selektif (26%), atau kedua isyarat dan entri port (12%; Angka 3D, 3E, dan 3H). Untuk mengilustrasikan kekuatan respons unit Tipe 1 dan Tipe 2 terhadap peristiwa terkait tugas, kami memplot setiap sel pada plot tiga dimensi berdasarkan skor Z (Gambar 3SAYA). Untuk menunjukkan distribusi perubahan phasic dalam penembakan ke beberapa peristiwa yang berhubungan dengan tugas pada tingkat kualitatif, kami merencanakan jumlah sel dari masing-masing jenis respons fotores yang masuk dalam kategori tertentu (Gambar 3J).

Mengingat peran VTA yang terdefinisi dengan baik dalam kesalahan prediksi ganjaran (misalnya, pengurangan phasic dari neuron DA sebagai respons terhadap kelalaian tak terduga dari hadiah dan eksitasi fase dalam menanggapi pengiriman hadiah yang tidak terduga) (Schultz et al., 1997), kami menyelidiki apakah neuron LH akan mengkodekan kelalaian tak terduga dari hadiah sukrosa. Untuk melakukan ini, kami mencatat aktivitas saraf dari neuron fotoresponif selama tugas pemberian isyarat yang sama pada hewan terlatih tetapi secara acak menghilangkan 30% pengiriman sukrosa setelah isyarat (Gambar 4SEBUAH).

Mayoritas unit Tipe 1 (88%; n = 15/17, distribusi binomial, p = 0.001) tidak sensitif terhadap kelalaian penghargaan (Angka 4B dan 4D), sedangkan sebagian besar unit Tipe 2 (67%; n = 12/18) menunjukkan respons yang berbeda secara signifikan terhadap uji coba yang diberikan reward dan reward-dihilangkan (Angka 4C dan 4D). Kami menyimpulkan bahwa neuron LH-VTA (Tipe 1) menyandikan aksi memasuki port, karena respons port-entry ini tetap ada bahkan saat penghilangan hadiah (Gambar 4D), berbeda dengan unit Tipe 2 (chi-square = 10.9804, p = 0.0009).

Untuk menentukan apakah tipe 1 respons terhadap entri port benar-benar mengkodekan respon terkondisi (CR), sebagai lawan dari pencarian umum atau perilaku eksplorasi, kami mencatat pada tikus yang tidak terlatih yang belum mendapatkan tugas. Pada tikus tugas-naif, kami mengirimkan sukrosa ke port dengan tidak adanya isyarat prediktif (pengiriman hadiah yang tidak dapat diprediksi) dan menemukan bahwa unit Tipe 1 tidak menunjukkan respons phasic terhadap entri port (Angka 4E, 4F, dan 4I), konsisten dengan model yang menyandi neuron Tipe 1 CR (Gambar 4J).

Selanjutnya, untuk menentukan apakah aktivitas unit Tipe 2 konsisten dengan profil respons yang mirip dengan kesalahan prediksi, kami juga mencatat neuron ini pada hewan yang terlatih selama pemberian hadiah yang tidak terduga (Gambar 4G). Kami menemukan bahwa subset dari unit Tipe 2 menanggapi pengiriman sukrosa yang tidak terduga (50%; Angka 4G – 4I). Secara keseluruhan, himpunan bagian dari unit Tipe 2 sensitif terhadap penghilangan hadiah yang tidak terduga (Angka 4C dan 4D) dan pengiriman hadiah yang tidak terduga (Angka 4G – 4I), konsisten dengan profil respons yang mirip dengan kesalahan prediksi.

Seperti yang telah kami tunjukkan di atas, unit Tipe 1 mewakili korelasi neural CR. Yang penting, peningkatan laju pembakaran dimulai sebelum CR, meningkat hingga CR telah selesai (Angka 3B, 3C, dan 4B). Untuk menentukan apakah aktivasi jalur LH-VTA dapat mempromosikan CR, kami ingin menguji kemampuan aktivasi LH-VTA dalam menggerakkan CR dalam menghadapi konsekuensi negatif. Pada tikus tipe liar, kami mengekspresikan ChR2-eYFP atau eYFP sendirian di badan sel LH ​​dan menanamkan serat optik di atas VTA (Angka 5A dan S4). Sebaliknya, untuk menguji peran jalur LH-VTA dalam memediasi CR atau perilaku yang berhubungan dengan makan, kami secara bilateral mengekspresikan NpHR-eYFP atau eYFP saja dalam sel LH ​​dan menanamkan serat optik di atas VTA (Angka 5A dan S4).

Kami merancang tugas pengkondisian Pavlovian di mana tikus yang kekurangan makanan harus melintasi kotak kejutan untuk mengambil hadiah sukrosa (Gambar 5B). Pada periode "baseline" pertama (dengan grid shock dimatikan), kami memverifikasi bahwa setiap tikus telah memperoleh tugas pendekatan yang dikondisikan Pavlov. Dalam periode kedua ("Shock"), shock grid menghasilkan kejutan kaki ringan setiap detik. Terakhir, di epoch ketiga ("Shock + Light"), kami terus memberikan guncangan kaki tetapi juga menerangi terminal LH di VTA dengan cahaya biru (10 Hz) pada mouse yang mengekspresikan ChR2 dan kontrol eYFP yang cocok serta lampu kuning (konstan) untuk tikus mengekspresikan NpHR dan kontrol eYFP mereka (Gambar 5B).

Kami mengamati jumlah entri port yang jauh lebih tinggi per isyarat selama zaman Shock + Light dan skor perbedaan yang jauh lebih tinggi (Kejutan + zaman Cahaya - zaman Shock-only) di tikus ChR2 relatif terhadap tikus eYFP (Gambar 5C dan Film S1). Sebaliknya, photoinhibition dari jalur LH-VTA menghasilkan penurunan yang signifikan dalam entri port per isyarat dan skor perbedaan pada tikus NpHR relatif terhadap tikus eYFP (Gambar 5D dan Film S2). Eksperimen percobaan dalam sesi selama isyarat presentasi tidak diikuti oleh pengiriman sukrosa menunjukkan tren yang sama berlaku (Gambar S4).

Yang penting, kami ingin menentukan apakah perubahan dalam pencarian sukrosa yang kami peroleh disebabkan oleh perubahan perilaku terkait makan atau sensitivitas terhadap rasa sakit. Kami mengamati bahwa fotoaktivasi proyeksi LH-VTA secara signifikan meningkatkan waktu yang dihabiskan untuk memberi makan pada tikus yang diberi makan dalam kelompok ChR2 (Gambar 5E). Namun, photoinhibition dari jalur LH-VTA tidak secara signifikan mengurangi pemberian makan (Gambar 5F), meskipun hewan-hewan ini kekurangan makanan untuk meningkatkan kemampuan kita untuk mendeteksi pengurangan relatif terhadap zaman awal (dibandingkan dengan hewan yang dipelihara di Gambar 5E). Dalam kedua ChR2 (Gambar 5G) atau grup NpHR (Gambar 5H) apakah kami mengamati perbedaan dalam latensi untuk penarikan ekor dari air panas (Ben-Bassat et al., 1959, Grotto dan Sulman, 1967), menunjukkan bahwa memanipulasi proyeksi LH-VTA tidak mengubah analgesia.

Untuk mempelajari komposisi komponen transmisi cepat input LH ke VTA yang memunculkan efek ini, kami melakukan rekaman patch-clamp seluruh sel dari neuron VTA dalam preparasi irisan akut sambil mengaktifkan input LH secara optik yang mengekspresikan ChR2-eYFP (Angka 6A dan S5). Mengingat bahwa terdapat heterogenitas yang mapan dalam VTA, termasuk ∼65% neuron DA, ∼30% neuron GABA, dan ∼5% neuron glutamat (Margolis dkk., 2006, Nair-Roberts dkk., 2008, Yamaguchi dkk. al., 2007), kami mengisi sel dengan biosit saat merekam untuk memungkinkan identifikasi jenis sel menggunakan imunohistokimia post-hoc untuk tirosin hidroksilase (TH; Gambar 6B), selain merekam arus kation teraktivasi hiperpolarisasi (I_h) dan memetakan lokasi sel (Angka 6Pita S5).

Pertama, kami mencatat dalam klem saat ini selama fotostimulasi input LH yang mengekspresikan ChR2 dan mengamati bahwa 23 dari neuron 27 menunjukkan respons yang terkunci waktu terhadap fotostimulasi input LH (Gambar 6C). Mayoritas neuron DA sampel dalam VTA menerima input rangsang bersih dari LH (56%), sedangkan subset lain menunjukkan penghambatan bersih (30%; Gambar 6C). Distribusi spasial neuron DA ini dipetakan ke atlas untuk irisan horizontal yang mengandung VTA (Gambar 6D).

Untuk menetapkan kontribusi monosinaptik input LH ke neuron VTA DA, kami menggunakan pemetaan sirkuit berbantuan ChR2, di mana perekaman penjepit tegangan dilakukan dengan adanya tetrodotoxin (TTX) dan 4-aminopyridine (4AP; Petreanu et al., 2007) . Konsisten dengan pengamatan kami dari rekaman penjepit saat ini, kami mengamati bahwa sebagian besar neuron VTA DA yang tercatat secara eksklusif menerima masukan monosinaptik rangsang dari LH (67%), dibandingkan dengan neuron VTA DA yang secara eksklusif menerima masukan monosinaptik penghambat (11%), atau keduanya (22%; Angka 6E dan S6).

Kami mengidentifikasi neuron VTA GABA dengan menyuntikkan fluorofor yang bergantung pada Cre (AAV₅-DIO-mCherry) ke dalam VTA tikus VGAT :: Cre dan menggunakan ekspresi mCherry untuk mengarahkan perekaman neuron VTA GABA (n = 24; Gambar 6F). Empat puluh enam persen dari neuron VTA GABA merespons dengan eksitasi bersih, sedangkan 54% merespons dengan penghambatan bersih, terhadap fotostimulasi input LH yang mengekspresikan ChR2 (Gambar 6G). Distribusi spasial sel-sel ini ditunjukkan pada Gambar 6H. Setelah memeriksa input monosinaptik dari LH (seperti dijelaskan di atas), kami menemukan bahwa 18% dari neuron GABA sampel menerima input eksitasi ekslusif dan 9% menerima input inhibisi eksklusif (Gambar 6SAYA). Namun, relatif terhadap neuron VTA DA, kami menemukan bahwa lebih banyak neuron VTA GABA menerima GABA yang dimediasi AMPAR dan penghambat._AInput monosinaptik bermediasi-R dari LH (73%; chi-square = 5.0505, p = 0.0246; Angka 6saya dan S6).

Mengingat bahwa rekaman ex vivo kami memberikan bukti yang mendukung masukan yang kuat dari proyeksi GABAergic dan glutamatergic LH ke VTA, kami selanjutnya menyelidiki peran masing-masing komponen secara independen. Untuk melakukan ini, kami menggunakan garis tikus transgenik yang mengekspresikan Cre-rekombinase dalam neuron yang mengekspresikan transporter glutamat vesikuler 2 (VGLUT2) atau transporter GABA vesikuler (VGAT). Kami menyuntikkan AAV₅-DIO-ChR2-eYFP atau AAV₅-DIO-eYFP ke LH dari VGLUT2 :: Cre dan VGAT :: Cre tikus dan menanamkan serat optik di atas VTA (Gambar S7). Hewan-hewan ini kemudian dijalankan pada masing-masing tes perilaku yang ditunjukkan pada Gambar 5.

Kami tidak mengamati adanya perbedaan yang terdeteksi dalam jumlah entri port yang dibuat per isyarat antara tikus yang mengekspresikan ChR2 atau eYFP di LH^kekenyangan-VTA proyeksi (Gambar 7A) atau di LH^GABA-VTA proyeksi (Gambar 7B). Namun berdasarkan analisis video, kami memperhatikan perilaku menyimpang yang menyimpang di LH^GABA-VTA: Grup ChR2 setelah penerangan cahaya biru (lihat Film S3 dan S4). Di LH^kekenyangan-VTA tikus, meskipun ada kecenderungan penurunan pemberian makan setelah fotostimulasi pada kelompok ChR2 dibandingkan dengan kelompok eYFP, ini tidak signifikan secara statistik (Gambar 7C). Sebaliknya, kami mengamati peningkatan yang kuat dalam waktu yang dihabiskan untuk memberi makan tikus yang kenyang setelah pencahayaan di LH^GABA-VTA: Grup ChR2 relatif terhadap kontrol (Gambar 7D dan Film S3). Pada kedua kelompok hewan tidak ada efek stimulasi cahaya dalam uji penarikan ekor (Angka 7E dan 7F).

Selama tugas makan, seperti yang kami lakukan selama tugas pencarian sukrosa, kami kembali memperhatikan urutan motorik terkait penyuapan yang tidak diarahkan pada makanan. Kami merekam tikus representatif di LH^GABA-VTA: Kelompok ChR2 dalam ruang transparan kosong, dan pada fotostimulasi 20 Hz, kami mengamati urutan motorik nafsu makan yang tidak biasa seperti menjilati dan menggerogoti lantai atau ruang kosong (Film S4). Kami menghitung perilaku "menggerogoti" ini selama tugas makan di tipe liar LH-VTA (Gambar 7G), LH^kekenyangan-VTA (Gambar 7H), dan LH^GABA-VTA (Gambar 7I) mengelompokkan dan menunjukkan LH itu^GABA-VTA: Tikus ChR2 mengunyah lebih dari tipe liar atau LH^kekenyangan-VTA: Tikus ChR2 saat fotostimulasi, dibandingkan dengan masing-masing kelompok eYFP masing-masing (Gambar 7J). Kami mempertimbangkan apakah perilaku terkait pemberian makan yang menyimpang mungkin dipisahkan dari pemberian makanan yang diarahkan dengan tepat pada frekuensi yang lebih rendah. Namun, ketika kami menguji LH^GABA-VTA: Kelompok ChR2 dengan rangkaian cahaya biru 5 Hz dan 10 Hz, kami mengamati hubungan proporsional antara frekuensi stimulasi dan makan dan menggerogoti (Gambar 7K).

Proyeksi LH untuk VTA telah dieksplorasi dengan studi tabrakan stimulasi listrik (Bielajew dan Shizgal, 1986) dan telah lama dihipotesiskan untuk memainkan peran dalam pemrosesan hadiah (Hoebel dan Teitelbaum, 1962, Margules dan Olds, 1962), namun menunjukkan dengan tepat hal ini peran telah menjadi tantangan. Di sini, kami menyediakan pembedahan terperinci tentang bagaimana masing-masing komponen proses loop LH-VTA aspek yang berbeda dari tugas yang berhubungan dengan hadiah.

Melalui penggunaan fototagging yang dimediasi optogenetik (Gambar 1), kami telah mengidentifikasi dua populasi neuron LH yang terpisah: sel yang mengirim proyeksi ke VTA (Tipe 1) dan sel yang menerima umpan balik dari VTA (Tipe 2; Gambar 2) - walaupun populasi ini tidak harus saling eksklusif, karena ada kemungkinan bahwa neuron LH dapat mengirim dan menerima input ke dan dari VTA. Menariknya, kami menemukan bahwa relatif sedikit neuron fotoresponsif berada di luar distribusi bimodal yang merangkum kedua populasi ini (Angka S2Pita 1E). Mengingat hal ini, dalam kombinasi dengan penundaan latensi yang lama pada respons fotorik Tipe 2 (100 ms), kami berspekulasi bahwa mungkin ada satu jalur dominan yang berkontribusi pada aktivitas neuron Tipe 2. Selain itu, karena DA mengikat reseptor berpasangan protein G, kinetiknya lebih lambat daripada kebanyakan sinapsis glutamatergik (Girault dan Greengard, 2004) dan dapat menjelaskan gugus unit fotoresponif latensi 100 ms ini. Mungkin juga bahwa VTA dapat memberikan umpan balik tidak langsung melalui daerah distal lainnya, melalui daerah perantara eksitatori seperti amigdala, atau dengan disinhibisi melalui nukleus accumbens (NAc) atau inti bed dari stria terminalis (BNST).

Menariknya, sementara fotostimulasi unit Tipe 1 membangkitkan respons rangsang dalam unit Tipe 2, unit Tipe 1 dan 2 menunjukkan sifat pengkodean perilaku yang berbeda. Misalnya, jumlah unit Tipe 1 dan Tipe 2 yang secara selektif menyandikan isyarat prediksi-penghargaan berbeda secara signifikan (n = 0/19 Tipe 1 versus n = 12/34 Tipe 2, chi-square = 8.67, p = 0.003) . Pola respons paradoks ini dapat disebabkan oleh proses komputasi pada elemen sirkuit perantara, seperti VTA, yang mungkin memainkan peran aktif selama tugas perilaku tetapi tidak aktif selama penandaan foto. Selain itu, status perilaku hewan dapat memengaruhi cara pemrosesan data ini.

Eksperimen penghilangan penghargaan kami memungkinkan kami untuk membedakan antara pengkodean saraf LH dari CR dan konsumsi stimulus tanpa syarat (AS). Dalam eksperimen ini, subset dari unit Tipe 2 menanggapi isyarat prediktif-pahala (CS) dan AS dan juga menunjukkan penurunan tingkat pembakaran ketika hadiah yang diharapkan dihilangkan. Selain itu, subset unit Tipe 2 juga menunjukkan eksitasi phasic pada pengiriman hadiah yang tidak terduga (Angka 4G dan 4H). Data ini mengingatkan cara neuron DA di VTA menyandikan kesalahan prediksi penghargaan (Cohen et al., 2012, Schultz et al., 1997). Kami berspekulasi bahwa neuron VTA dapat mengirimkan sinyal kesalahan prediksi penghargaan ke subset neuron LH, yang memiliki posisi yang baik untuk mengintegrasikan sinyal-sinyal ini untuk penentuan keluaran perilaku yang sesuai. Secara khusus, LH sangat erat berhubungan dengan banyak area otak lainnya (Berthoud dan Münzberg, 2011) dan secara kausal dikaitkan dengan keadaan homeostatis seperti tidur / gairah dan kelaparan / kenyang (Carter et al., 2009, Jennings et al. , 2013).

Perilaku mencari penghargaan kompulsif terutama telah dibahas dalam konteks kecanduan narkoba, di mana paradigma klasik untuk pencarian obat kompulsif telah memeriksa sejauh mana perilaku mencari obat tetap ada dalam menghadapi konsekuensi negatif, seperti syok kaki. (Belin et al., 2008, Pelloux et al., 2007, Vanderschuren dan Everitt, 2004). Kami menyesuaikan tugas ini untuk sukrosa yang berusaha memungkinkan kami untuk menyelidiki apakah aktivasi jalur LH-VTA cukup untuk mempromosikan pencarian sukrosa kompulsif. Mengingat bahwa perbedaan yang berbeda antara obat dan hadiah alami adalah bahwa penghargaan obat tidak diperlukan untuk bertahan hidup, ada kontroversi mengenai perilaku apa yang merupakan perilaku mencari sukrosa atau makanan kompulsif. Interpretasi alternatif dari data kami adalah bahwa aktivasi jalur LH-VTA hanya meningkatkan dorongan motivasi atau dorongan untuk mencari penguat nafsu makan. Karena tingkat obesitas telah meningkat dalam beberapa dekade terakhir (Mietus-Snyder dan Lustig, 2008), makan berlebihan kompulsif dan kecanduan gula adalah kondisi umum yang merupakan ancaman utama bagi kesehatan manusia (Avena, 2007). Perilaku makan pada tikus yang kenyang (kenyang) setelah aktivasi jalur LH-VTA mengingatkan pada perilaku makan yang terlihat pada manusia yang didiagnosis dengan gangguan makan berlebihan kompulsif (atau gangguan makan berlebihan) (DSM-V).

Telah diusulkan bahwa tindakan yang berulang-ulang mengarah pada pembentukan kebiasaan, yang dengan sendirinya mengarah pada pencarian penghargaan kompulsif yang menjadi ciri kecanduan (Everitt and Robbins, 2005). Temuan kami bahwa neuron LH-VTA hanya mengkodekan entri port setelah pengkondisian menunjukkan bahwa jalur ini secara selektif mengkode respons terkondisi, bukan hanya tindakan termotivasi. Ini konsisten dengan pengamatan kami bahwa pengaktifan proyeksi ini secara optik dapat mempromosikan pencarian imbalan kompulsif dalam menghadapi konsekuensi negatif (Gambar 5C), serta tidak adanya kebutuhan (seperti yang terlihat pada tikus yang puas, Gambar 5E). Interpretasi ini lebih jauh dibuktikan dengan temuan kami bahwa photoinhibition dari jalur LH-VTA secara selektif mengurangi pencarian sukrosa kompulsif (Gambar 5D) tetapi tidak mengurangi pemberian makan pada tikus yang dibatasi makanan (Gambar 5F). Salah satu tantangan terbesar dalam mengobati gangguan makan berlebihan atau makan berlebihan adalah risiko gangguan perilaku makan secara umum. Dari perspektif translasi, kami mungkin telah mengidentifikasi sirkuit saraf spesifik sebagai target potensial untuk pengembangan intervensi terapeutik untuk makan berlebihan kompulsif atau kecanduan gula tanpa mengorbankan perilaku makan alami.

Kami menunjukkan bahwa selain komponen LH-VTA glutamatergik (Kempadoo et al., 2013), ada juga komponen GABAergic yang signifikan dalam proyeksi (Leinninger et al., 2009), dan bahwa neuron LH bersinaps langsung ke DA dan Neuron GABA di VTA (Gambar 6). Namun, ada perbedaan dalam keseimbangan input rangsang / penghambatan ke neuron VTA DA dan GABA.

Sementara kami menggunakan pemrosesan imunohistokimia untuk memverifikasi identitas neuron VTA, kami juga mengukur I_h, arus kation non-spesifik yang diaktivasi hiperpolarisasi ke dalam (Lacey et al., 1989, Ungless and Grace, 2012). Kehadiran arus ini telah banyak digunakan dalam studi elektrofisiologi untuk mengidentifikasi neuron DA, tetapi telah terbukti hanya ada di subpopulasi neuron DA, digambarkan oleh target proyeksi (Lammel et al., 2011). Meskipun sebelumnya telah diusulkan dalam tinjauan oleh Fields dan rekannya bahwa "neuron LH bersinaps dengan proyeksi VTA ke PFC, tetapi bukan yang memproyeksikan ke NAc" (Fields et al., 2007), data kami menunjukkan bahwa kontroversi ini dibuka kembali untuk penyelidikan lebih lanjut. Meskipun kami mengamati subset neuron DA yang menerima eksitasi bersih dari LH dan memiliki I_h (konsisten dengan mPFC- atau NAc medial shell-memproyeksikan neuron DA), kami juga mengamati subset neuron DA yang menerima input eksitasi bersih dan menunjukkan I yang besar_h (konsisten dengan karakteristik neuron DA yang memproyeksikan ke cangkang lateral NAc; Gambar S5; Lammel et al., 2011). Sebaliknya, neuron VTA DA yang menerima masukan penghambatan bersih menunjukkan I yang sangat kecil_h atau kekurangan arus ini, yang konsisten dengan gagasan bahwa LH mengirimkan input penghambatan yang dominan ke neuron VTA DA yang memproyeksikan ke mPFC atau cangkang medial NAc. Kami juga menunjukkan bahwa input LH dapat diamati baik di VTA medial dan lateral, menunjukkan bahwa LH memberikan input ke neuron VTA dengan target proyeksi yang beragam, karena diketahui bahwa target proyeksi VTA agak sesuai dengan lokasi spasial di sepanjang sumbu medial-lateral ( Lammel et al., 2008).

Peran jalur LH-VTA dalam mempromosikan penghargaan sebelumnya telah dianggap berasal dari transmisi glutamatergic di VTA (Kempadoo et al., 2013), karena promotor CaMKIIα sering dianggap selektif untuk neuron proyeksi rangsang. Namun, data kami dengan jelas menunjukkan bahwa mengekspresikan ChR2 di bawah kendali promotor CaMKIIα juga menargetkan neuron proyeksi GABAergic di LH (Gambar 6).

Perilaku yang ditimbulkan oleh fotostimulasi LH^GABA-VTA jalur hiruk pikuk, salah arah, dan maladaptif (Film S4). Salah satu interpretasi adalah bahwa aktivasi LH^GABAJalur -VTA mengirimkan sinyal ke mouse yang menyebabkan pengakuan penguat selera. Interpretasi alternatif adalah bahwa LH^GABA-VTA jalur mungkin mendorong arti-penting insentif atau "keinginan," yang konsisten dengan sinyal yang mendasari pendekatan terkondisi, tetapi pada tingkat non-fisiologis yang menghasilkan perilaku terkait makan yang menyimpang ini (Berridge dan Robinson, 2003). Konsisten dengan ini, ada kemungkinan bahwa aktivasi LH^GABAProyeksi -VTA benar-benar menghasilkan sensasi keinginan yang kuat, atau dorongan untuk memberi makan. Namun, percobaan kami menunjukkan bahwa aktivasi LH^GABA-VTA tidak menghasilkan peningkatan dalam pencarian sukrosa kompulsif, tetapi ini kemungkinan karena menggerogoti berlebihan dan perilaku nafsu makan yang menyimpang yang berfokus pada objek non-makanan di ruang pengujian. Meskipun sulit untuk menentukan pengalaman mouse selama manipulasi ini, jelas bahwa perilaku yang berhubungan dengan pemberian makan yang diarahkan dengan tepat membutuhkan aktivasi terkoordinasi baik komponen GABAergik dan glutamatergik dari jalur LH-VTA.

Manipulasi optogenetik dan farmakogenetik adalah alat yang kuat untuk membangun hubungan kausal, namun mereka tidak mengungkapkan sifat fisiologis endogen dari elemen sirkuit saraf. Studi kami menyatukan informasi tentang konektivitas sinaptik, fungsi endogen yang terjadi secara alami, dan peran kausal dari jalur LH-VTA, memberikan tingkat wawasan baru tentang bagaimana informasi diintegrasikan dalam sirkuit ini. Hasil ini menyoroti pentingnya menguji peran fungsional neuron dengan konektivitas, selain penanda genetik. Neuron LH-VTA secara selektif mengkodekan aksi pencarian hadiah tetapi tidak mengkodekan rangsangan lingkungan, sedangkan rangsangan yang memberi penghargaan dan isyarat prediksi-hadiah dikodekan oleh populasi terpisah dari neuron LH di hilir VTA. Selain itu, kami telah mengidentifikasi proyeksi spesifik yang secara kausal terkait dengan perilaku mencari makan dan sukrosa kompulsif. Heterogenitas dalam proyeksi LH-VTA diperlukan untuk memberikan keseimbangan adaptif antara motivasi mengemudi dan mengatur perilaku nafsu makan yang diarahkan dengan tepat. Temuan ini memberikan wawasan yang relevan dengan kondisi patologis seperti gangguan makan berlebihan kompulsif, kecanduan gula, dan obesitas