Dampak brown-oryzanol spesifik beras merah pada modulasi epigenetik reseptor D2 dopamin di striatum otak pada obesitas yang diinduksi diet tinggi lemak pada tikus (2017)

. 2017; 60 (8): 1502 – 1511.

Diterbitkan secara online, 2017, Mei 20. doi:  10.1007/s00125-017-4305-4

PMCID: PMC5491592

Abstrak

Tujuan / hipotesis

Terlalu banyak makan lemak menyebabkan kegemukan pada manusia dan tikus. Studi terbaru pada manusia dan tikus menunjukkan bahwa kecanduan lemak memiliki mekanisme yang sama dengan kecanduan alkohol, nikotin, dan narkotika dalam hal disfungsi sistem penghargaan otak. Telah disorot bahwa diet tinggi lemak (HFD) melemahkan reseptor dopamin D2 (D2R) yang memberi sinyal pada striatum, pengatur penting dari sistem hadiah otak, yang menyebabkan makan berlebihan hedonis. Kami sebelumnya melaporkan bahwa konstituen bioaktif spesifik beras merah γ-oryzanol melemahkan preferensi untuk HFD melalui kontrol hipotalamus. Karena itu kami menjelajahi kemungkinan bahwa γ-oryzanol akan memodulasi fungsi sistem penghargaan otak pada tikus.

metode

Tikus C57BL / 6J jantan yang diberi makan HFD secara oral diobati dengan γ-oryzanol, dan tingkat striatal molekul yang terlibat dalam pensinyalan D2R dievaluasi. Dampak γ-oryzanol pada metilasi DNA promotor D2R dan perubahan selanjutnya dalam preferensi untuk lemak makanan diperiksa. Selain itu, efek 5-aza-2′-deoxycytidine, inhibitor poten dari DNA methyltransferases (DNMTs), pada preferensi makanan, pensinyalan D2R dan kadar DNMTs di striatum diselidiki. Efek penghambatan γ-oryzanol pada aktivitas DNMT secara enzimatis dievaluasi secara in vitro.

Hasil

Dalam striatum dari tikus yang diberi makan HFD, produksi D2R menurun melalui peningkatan metilasi DNA dari daerah promotor D2R. Pemberian oral γ-oryzanol menurunkan ekspresi dan aktivitas DNMT, sehingga mengembalikan tingkat D2Rs di striatum. Penghambatan farmakologis dari DNMT oleh 5-aza-2′-deoxycytidine juga memperbaiki preferensi untuk lemak makanan. Konsisten dengan temuan ini, uji in vitro enzimatik menunjukkan bahwa γ-oryzanol menghambat aktivitas DNMT.

Kesimpulan / interpretasi

Kami menunjukkan bahwa γ-oryzanol memperbaiki hipermetilasi DNA yang diinduksi HFD dari daerah promotor D2R di striatum tikus. Paradigma eksperimental kami menyoroti γ-oryzanol sebagai zat antiobesitas yang menjanjikan dengan sifat berbeda sebagai modulator epigenetik novel.

Bahan pelengkap elektronik

Versi online dari artikel ini (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) berisi materi pelengkap yang ditinjau sejawat tetapi belum diedit, yang tersedia untuk pengguna yang berwenang.

Kata kunci: Metilasi DNA, Dopamin, Epigenetik, Perilaku makan, Nutrisi, Obesitas, Penghargaan, Striatum, Diabetes tipe 2

Pengantar

Makan berlebihan pada individu yang kelebihan berat badan, setidaknya sebagian, mekanisme umum dengan kecanduan alkohol, nikotin, dan narkotika [] Seperti halnya pengaturan nafsu makan hipotalamus dan hormonal, sistem penghargaan otak, khususnya pensinyalan reseptor dopamin, terkait erat dengan perilaku makan adiktif atau hedonis [] Sebuah studi sebelumnya pada tikus menunjukkan bahwa knockdown dari reseptor D2 dopamin striatal oleh D2R striatal oleh hairpin pendek yang dimediasi lentivirus mengganggu RNA dengan cepat menginduksi defisit hadiah seperti kecanduan dan pencarian makanan seperti paksaan [] Karena kepadatan D2R berkurang, striatum dorsal kurang responsif terhadap hadiah makanan dibandingkan dengan kelompok kontrol lean pada manusia gemuk dan tikus [-] Sesuai dengan gagasan ini, the TaqAlel IA dari ANKK1 lokus gen (pengkodean DRD2 / ankyrin repeat dan domain kinase yang mengandung 1), yang menurunkan produksi D2R striatal, dikaitkan dengan fenotip obesitas pada manusia [], sementara efek penurunan berat badan setelah operasi bariatric dikaitkan dengan peningkatan kepadatan D2R striatal [] Data ini sangat menyarankan pentingnya D2R striatal sebagai target terapi baru untuk pengobatan obesitas. Namun, beberapa obat yang dikembangkan yang bekerja pada sistem penghargaan otak menyebabkan efek samping yang cukup besar, termasuk masalah kejiwaan yang serius, yang mengakibatkan mereka akhirnya menarik diri dari klinik [].

Modifikasi epigenetik sangat penting tidak hanya untuk pengembangan dan diferensiasi, tetapi juga karena mereka muncul sebagai akibat dari perubahan lingkungan, termasuk dalam diet dan gaya hidup [] Metilasi DNA adalah peristiwa epigenetik utama untuk stabilitas ekspresi gen [] Pada tikus, paparan ibu terhadap diet tinggi lemak (HFD) antar generasi mengubah metilasi DNA dalam sistem imbalan pusat pada keturunannya, yang mengarah ke konsumsi HFD berlebihan oleh anak-anak [] Secara khusus, DNA methyltransferases (DNMTs) memainkan peran penting dalam pengaturan perilaku makan dan aktivitas fisik [, ], menunjukkan bahwa DNMT dapat menjadi target terapi yang menjanjikan untuk terapi sindrom obesitas-diabetes. Yang penting, beberapa zat yang berasal dari makanan alami, termasuk asam caffeic dan epigallocatechin, diketahui bertindak sebagai inhibitor DNMT [, ].

Kami baru-baru ini menunjukkan bahwa komponen bioaktif, komponen spesifik beras merah γ-oryzanol, campuran ester asam ferulat dan beberapa fitosterol, melemahkan preferensi untuk lemak makanan melalui penurunan tekanan retikulum endoplasma hipotalamus (ER) hipotalamus [ER].] Pada tikus dan kelinci, γ-oryzanol yang diberikan secara oral dengan cepat diserap dari usus dan didistribusikan terutama ke otak [, ] Mengambil temuan ini bersama-sama, produk turunan makanan alami yang bekerja pada sistem saraf pusat bisa menjadi alternatif untuk memperbaiki perilaku makan yang terganggu pada obesitas secara aman. Dalam konteks ini, kami menguji hipotesis bahwa γ-oryzanol akan mengubah status metilasi DNA dalam sistem penghargaan otak, yang menghasilkan pelemahan preferensi untuk HFD pada tikus.

metode

hewan

Tikus C57BL / 6J jantan berumur tujuh minggu yang diperoleh dari Charles River Laboratories Jepang (Kanagawa, Jepang) ditempatkan (3–4 per kandang) dalam kondisi bebas patogen spesifik pada suhu 24 ° C di bawah cahaya 12 jam / 12 jam / siklus gelap. Setelah satu minggu aklimatisasi, mencit berusia 8 minggu dicocokkan bobotnya dan dibagi menjadi dua atau tiga kelompok untuk menjalani setiap percobaan. Tikus diberi akses gratis ke makanan dan air. Semua hewan percobaan telah disetujui oleh Komite Etika Percobaan Hewan dari Universitas Ryukyus (No. 5352, 5718 dan 5943).

Pemberian γ-oryzanol dan 5-aza-2′-deoxycytidine

Untuk mengevaluasi preferensi untuk HFD, γ-oryzanol (Industri Kimia Murni Wako, Osaka, Jepang) diberikan pada tikus 8 yang berumur satu minggu dengan pembelahan selama uji pilihan makanan seperti yang dijelaskan sebelumnya [, ] Untuk percobaan lain, HFD (D12079B; Diet Diets, New Brunswick, NJ, USA) yang mengandung 0.4% γ-oryzanol diproduksi sebagai pelet. Komponen diet ditunjukkan dalam Tabel bahan pelengkap elektronik (ESM) 1. Setelah 12 minggu makan, jaringan diambil dari striatum dan hipotalamus. Asupan harian γ-oryzanol, diperkirakan dari rata-rata asupan makanan mencit, sekitar 320 μg / g berat badan. Dosis γ-oryzanol ditentukan seperti yang dijelaskan sebelumnya []. 5-aza-2′-deoxycytidine (5-aza-dC; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) disuntikkan secara intraperitoneal (0.25 μg / g berat badan) tiga kali seminggu selama 12 minggu [].

Perkiraan preferensi untuk lemak makanan

Untuk mengevaluasi preferensi untuk lemak makanan, tes makanan memberikan pilihan antara chow dan HFD (D12450B dan D12451; Diet Penelitian) seperti yang dijelaskan sebelumnya [] Komponen makanan ditunjukkan pada Tabel ESM 1. Singkatnya, tikus diberi akses gratis untuk makan dan HFD. Asupan makanan dan HFD diukur setiap minggu dan dianalisis untuk perubahan preferensi lemak makanan. Preferensi HFD dihitung menurut rumus: Preferensi HFD = [(Asupan HFD / total asupan makanan) × 100].

Pengurutan bisulfit untuk metilasi DNA

DNA dimurnikan menggunakan DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Tokyo, Japan). Larutan DNA dicampur dengan 3 mol / l NaOH yang baru disiapkan, diinkubasi pada 37 ° C selama 15 menit dan ditambahkan ke 5.3 mol / l urea, 1.7 mol / l natrium bisulfit dan 4.9 mmol / l hidrokuinon. Solusinya dikenakan 15 siklus denaturasi pada 95 ° C selama 30 detik dan inkubasi pada 50 ° C selama 15 menit [] DNA yang diobati dengan bisulphite dimurnikan menggunakan Kit Pemurnian MinElute PCR (QIAGEN) dan diamplifikasi oleh PCR menggunakan KAPA HiFi HotStart Uracil + ReadyMix Kit PCR (KAPA Biosystems, Woburn, MA, USA) dan primer di sekitar situs CpG di wilayah promotor D2R . Urutan primer adalah sebagai berikut: forward primer, 5′-GTAAGAATTGGTTGGTTGGAGTTAAAA-3 ′; membalikkan primer, 5′-ACCCTACCCTCTAAACCACAACTAC-3 ′. Selanjutnya, urutan adaptor ditambahkan dan dibersihkan menggunakan Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, CA, USA). Sampel kemudian dikumpulkan dan dimuat ke GS Junior (Roche Diagnostics, Tokyo, Jepang) untuk diurutkan berdasarkan protokol pabrikan. Tingkat metilasi dinyatakan sebagai persentase sitosin teretilasi dalam semua residu sitosin.

Uji aktivitas DNMT

Uji aktivitas enzim DNMT dilakukan menggunakan EpiQuik DNA Methyltransferase Activity / Inhibition Assay Kit (Grup Epigentek, Brooklyn, NY, USA) dan kit Uji Methyltransferase EPIgeneous (Cisbio Jepang, Chiba, Jepang) sesuai dengan protokol pabrikan.

Untuk menilai aktivitas penghambatan setiap senyawa pada metilasi DNA, pembentukan S-adenosyl-l-homocysteine ​​(SAH) diukur dengan adanya setiap senyawa (20 μmol / l untuk uji skrining), S-adenosyl methionine (SAM; 10 μmol / l) dan substrat DNMT (4 ng / μl) pada 37 ° C selama 90 menit. Untuk mengevaluasi kinetika Michaelis-Menten, DNMT1 (20 μmol / l) diinkubasi dengan γ-oryzanol, SAM (5 μmol / l) dan konsentrasi poli dI-dC yang ditunjukkan pada 37 ° C selama 90 menit. DNMT3a (100 μmol / l) dan DNMT3b (100 μmol / l) diinkubasi dengan γ-oryzanol, SAM (5 μmol / l) dan konsentrasi poli dG · dC yang ditunjukkan pada 37 ° C selama 120 menit. Pengujian dilakukan dalam rangkap empat. Protein yang diekstraksi (0.75 mg / ml) diinkubasi dengan SAM (5 μmol / l), poli dI-dC (5 μg / ml), dan poli dG · dC (5 μg / ml) pada 40 ° C selama 120 menit, dan Pembentukan SAH diukur.

Uji aktivitas reseptor-γ terkait estrogen

Aktivitas antagonis potensial γ-oryzanol pada reseptor terkait estrogen-γ (ERRγ) dinilai menggunakan Sistem Uji Reporter Gamma Reseptor Terkait Estrogen Manusia (INDIGO Bioscience, State College, PA, USA) sesuai dengan protokol pabrikan. Singkatnya, sel reporter mamalia non-manusia yang secara konstitutif mengekspresikan ERR active aktif diekspos ke konsentrasi yang ditunjukkan dari setiap senyawa selama 24 jam dalam rangkap tiga.

Western blotting

Ini dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [] dengan antibodi terhadap D2R (1: 500, kelinci), transporter dopamin (DAT; 1: 500, kelinci), tirosin hidroksilase (TH; 1: 1000, kelinci) (AB5084P, AB1591P dan AB152, Merck Millipore, Billerica, MA, USA), transduser sinyal dan aktivator transkripsi 3α (STAT3α; 1: 1000, kelinci), DNMT1 (1: 1000, kelinci), DNMT3a (1: 1000, kelinci) (no. 8768, 5032 dan 3598; Teknologi Sinyal Sel, Tokyo, Jepang), DNMT3b (1 μg / ml, kelinci), ERRγ (1: 1000, kelinci) dan β-aktin (1: 10,000, tikus) (ab16049, ab128930 dan ab6276; Abcam, Cambridge, MA, USA).

PCR waktu-nyata kuantitatif

Ekspresi gen diperiksa seperti yang dijelaskan sebelumnya [] Tingkat mRNA dinormalisasi menjadi Rn18s (18S rRNA). Set primer yang digunakan untuk analisis PCR kuantitatif waktu-nyata dirangkum dalam Tabel ESM 2.

Analisis statistik

Data dinyatakan sebagai mean ± SEM. ANOVA satu arah dan pengukuran ulang ANOVA diikuti dengan beberapa tes perbandingan (metode Bonferroni-Dunn) digunakan jika memungkinkan. Mahasiswa t Tes digunakan untuk menganalisis perbedaan antara dua kelompok. Perbedaan dianggap signifikan pada p <0.05.

Hasil

Penghambatan farmakologis dari DNMT oleh 5-aza-dC melemahkan preferensi untuk lemak makanan pada tikus

Pada tikus yang diberi makan HFD, metilasi DNA di daerah promotor D2R di striatum secara signifikan diperbesar dibandingkan dengan tikus yang diberi diet chow (Gbr. (Gbr. 1a) .1Sebuah). Di sisi lain, metilasi DNA hipotalamus di daerah promotor D2R tampaknya lebih tinggi daripada di striatum di bawah diet chow (p <0.01) (Gbr. (Gbr. 1a, 1a, f) dan tidak diubah oleh HFD (Gbr. (Gbr. 1f) .1f). Pada tikus yang diberi makan HFD, metilasi DNA yang diperbesar di daerah promotor D2R di striatum dinormalisasi dengan pengobatan dengan 5-aza-dC, inhibitor DNMT yang kuat (Gbr. (Gbr. 1a) .1Sebuah). Sebaliknya, metilasi DNA di daerah promotor D2R di hipotalamus tidak berubah secara signifikan oleh pengobatan dengan 5-aza-dC (Gbr. (Gbr. 1f) .1f). Dalam striatum mencit jantan berusia 20 minggu yang diberi HFD selama 12 minggu, tingkat mRNA dan protein D2R menurun secara signifikan (Gbr. (Gbr. 1b, 1b, k, l). Sebaliknya, tingkat reseptor D1 dopamin (D1Rs, disandikan oleh Drd1), yang bertindak berlawanan dengan D2R pada adenylyl cyclase dan pensinyalan intraseluler yang dimediasi-cAMP, tidak berubah (Gbr. (Gbr. 1c) .1c). Selain itu, tidak ada perubahan dalam tingkat molekul lain yang terkait dengan pensinyalan D2R, seperti TH dan DAT pada mRNA dan / atau tingkat protein (Gbr. (Gbr. 1d, 1d, e, k, m). Di sisi lain, tidak ada perubahan nyata yang diamati pada hipotalamus, termasuk untuk D2R (Gbr. (Gbr. 1g – m) .1g – m). Khususnya, kadar protein D2R dan TH dalam hipotalamus jauh lebih rendah daripada yang ada di striatum (Gbr. (Gbr. 1l, 1aku m), mungkin mencerminkan kepentingan relatif pensinyalan reseptor dopamin dalam sistem penghargaan otak dibandingkan dengan hipotalamus.

Ara. 1 

Penghambatan DNMT oleh 5-aza-dC melemahkan preferensi untuk HFD melalui augmentasi D2Rs di striatum tikus yang diberi makan HFD. Tingkat metilasi DNA di daerah promotor D2R di striatum (n = 3) (a) dan hipotalamus (n = 3) ...

Untuk memeriksa apakah metilasi DNA di daerah promotor D2R akan mengubah preferensi untuk lemak makanan, perilaku makan tikus yang diobati dengan 5-aza-dC dianalisis. Seperti yang diharapkan, 5-aza-dC secara signifikan meningkatkan kadar mRNA dan protein untuk D2R di striatum tikus yang diberi makan HFD (Gbr. (Gbr. 1b, 1b, k, l). Di sisi lain, tidak ada efek pada level Drd1, Th dan Slc6a3 (Pengkodean DAT) di striatum, atau pada level Drd2, Drd1, Th dan Slc6a3 di hipotalamus (Gbr. (Gbr. 1c – e, 1c – e, g – m). Sedangkan tikus yang dirawat kendaraan lebih menyukai HFD, preferensi untuk HFD secara signifikan menurun pada tikus yang diobati 5-aza-dC (88% dari nilai untuk tikus yang dirawat kendaraan) (Gbr. (Gbr. 1n) .1n). Akibatnya, pengobatan dengan 5-aza-dC mengurangi kenaikan berat badan (Gbr. (Gbr. 11Hai).

γ-oryzanol menurunkan kadar DNMT di striatum tikus yang diberi makan HFD

Seperti yang kami laporkan sebelumnya [], pemberian oral γ-oryzanol ke tikus jantan oleh gavage secara signifikan melemahkan preferensi untuk HFD (93% dari nilai-nilai untuk tikus yang dirawat dengan kendaraan) (Gbr. (Gbr. 2a), 2a), menghasilkan pelemahan nyata kenaikan berat badan (Gbr. (Gbr. 2b) .2b). Karena itu kami mengeksplorasi dampak potensial dari γ-oryzanol pada modulasi epigenetik D2Rs di striatum.

Ara. 2 

Efek penghambatan γ-oryzanol pada DNMT pada tikus yang diberi makan HFD. Preferensi HFD (a) dan berat badan (b) pada tikus yang diobati or-oryzanol selama tes pilihan makanan chow vs HFD (n = 4 kandang; tiga tikus per kandang). Tingkat mRNA untuk ...

Dalam mamalia, ada tiga DNMT utama — DNMT1, 3a dan 3b. DNMT1 berfungsi untuk mempertahankan metilasi DNA, sementara DNMT3a dan 3b berperan dalam memfasilitasi metilasi DNA de novo [] Untuk mengeksplorasi dampak potensial γ-oryzanol pada DNMTs in vivo, kami mengevaluasi level DNMTs di otak tikus yang diberi makan HFD. Meskipun HFD per se tidak berpengaruh pada mRNA dan kadar protein DNMTs baik di striatum atau hipotalamus, suplementasi dengan γ-oryzanol secara signifikan menurunkan kadar DNMTs di striatum tetapi tidak dalam hipotalamus (Gbr. (Gbr. 2c – e, 2c – e, g – i, k – n). Data ini meningkatkan kemungkinan bahwa γ-oryzanol dapat mengatur kadar DNMT dengan cara spesifik striatum. Dengan cara yang serupa, 5-aza-dC secara signifikan menurunkan level mRNA dari DNMT3a dan 3b secara istimewa dalam striatum (Gambar ESM. 1iklan).

Atas dasar penelitian sebelumnya yang menunjukkan bahwa level mRNA DNMT1 diatur secara positif, setidaknya sebagian, oleh reseptor nuklir ERRγ [], kami menguji efek potensial γ-oryzanol pada aktivitas ERRγ. Dalam sel mamalia non-manusia yang secara konstitutif mengekspresikan ERRγ aktif, 4-hydroxy tamoxifen, agonis invers kuat ERRγ, secara nyata menurunkan aktivitas ERRγ. Dari catatan, γ-oryzanol sebagian mengurangi aktivitas ERR ((pengurangan sekitar 40% dari nilai bawaan) (Gbr. (Gbr. 3a) .3Sebuah). Yang penting, ERRγ sangat diekspresikan dalam striatum tetapi tidak dalam hipotalamus (Gbr. (Gbr. 3b – d) .3b – d). Bertentangan dengan situasi untuk striatum, γ-oryzanol secara signifikan meningkatkan kadar protein DNMT1 hanya di hipotalamus (Gbr. (Gbr. 2k, 2k, l). Hasil ini dapat dijelaskan, setidaknya sebagian, dengan temuan kami bahwa STAT3α, regulator positif tingkat DNMT1 [], banyak diekspresikan dalam hipotalamus tetapi tidak dalam striatum (Gbr. (Gbr. 33misalnya).

Ara. 3 

Dampak γ-oryzanol pada aktivitas ERRγ dan STAT3α. (a) Efek penghambatan γ-oryzanol pada ERRγ in vitro. Kurva dosis-respons dari aktivitas ERRγ dengan γ-oryzanol (lingkaran hitam), asam ferulic ...

Untuk menilai lebih lanjut dampak or-oryzanol pada aktivitas DNMTs in vivo, pembentukan SAH, produk sampingan dari metilasi DNA dan juga penghambat potensial dari DNMT, dievaluasi pada tikus yang diobati dengan γ-oryzanol yang diberi makan HFD. Tidak ada perubahan signifikan dalam pembentukan SAH di striatum atau hipotalamus antara tikus yang diberi makan HFD dan tikus yang diberi makan chow (Gbr. (Gbr. 2f, 2f, j). Terlihat, γ-oryzanol secara signifikan menurunkan pembentukan SAH di striatum (Gbr. (Gbr. 2f) 2f) tetapi tidak dalam hipotalamus (Gbr. (Gbr. 2j), 2j), menunjukkan bahwa γ-oryzanol dapat menekan aktivitas DNMT dengan cara khusus striatum pada tikus yang diberi makan HFD.

Analisis enzimatik pada sifat penghambatan γ-oryzanol untuk DNMTs in vitro

Kami selanjutnya menilai dampak γ-oryzanol pada aktivitas DNMT secara in vitro. Potensi penghambatan γ-oryzanol, asam ferulic, 5-aza-dC, haloperidol (antagonis D2R yang representatif), quinpirole (agonis D2R yang representatif) dan SAH terhadap DNMT dievaluasi. Sebagai kontrol positif, SAH sangat melemahkan aktivitas DNMT dengan cara yang tergantung dosis (Gbr. (Gbr. 4a – f) .4a – f). Seperti yang diharapkan, haloperidol dan quinpirol tidak menunjukkan efek pada aktivitas DNMT (ESM Gambar. 2). Terlihat, γ-oryzanol secara signifikan menghambat aktivitas DNMT1 (IC50 = 3.2 μmol / l), 3a (IC50 = 22.3 μmol / l) dan 3b (penghambatan maksimum 57%) (Gbr. (Gbr. 4d – f) .4d – f). Sebaliknya, aktivitas penghambatan asam ferulic, metabolit γ-oryzanol, jauh lebih rendah daripada γ-oryzanol (Gbr. (Gbr. 44d – f).

Ara. 4 

Efek penghambatan γ-oryzanol pada DNMTs in vitro. Tes penyaringan throughput tinggi untuk inhibitor potensial dari DNMT1 (a), DNMT3a (b) dan DNMT3b (c). Potensi penghambatan terhadap DNMT untuk γ-oryzanol, asam ferulic (metabolit γ-oryzanol), ...

Kami selanjutnya menyelidiki sifat penghambatan γ-oryzanol pada DNMT. Pembentukan SAH diukur untuk menilai aktivitas penghambatan γ-oryzanol pada DNMT secara in vitro. Data tentang pembentukan SAH selama metilasi DNA yang diperantarai DNMT menunjukkan pola saturasi kinetika Michaelis-Menten untuk kedua keberadaan dan tidak adanya γ-oryzanol (Gbr. (Gbr. 4g – i) .4g – i). Dalam metilasi DNA yang dimediasi oleh DNMT1, analisis Eadie-Hofstee menunjukkan bahwa γ-oryzanol tidak menunjukkan efek pada V max pembentukan SAH (kendaraan, 597 pmol / menit; γ-oryzanol 2 μmol / l, 619 pmol / menit; γ-oryzanol 20 μmol / l, 608 pmol / menit), sedangkan γ-oryzanol tampaknya meningkatkan K m (kendaraan, 0.47 μg / ml; γ-oryzanol 2 μmol / l, 0.67 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.89 μg / ml) (Gbr. (Gbr. 4j) .4j). Hasil ini menunjukkan bahwa γ-oryzanol menghambat DNMT1 setidaknya sebagian dengan cara yang kompetitif. Di sisi lain, untuk metilasi DNA yang dimediasi oleh DNMT3a- dan 3b, γ-oryzanol menurunkan V max pembentukan SAH (DNMT3a: kendaraan, 85.3 pmol / menit; γ-oryzanol 2 μmol / l, 63.1 pmol / menit; γ-oryzanol 20 μmol / l, 42.5 pmol / menit; DNMT3b: kendaraan, 42.3 pmol / menit; γ -oryzanol 2 μmol / l; 28.0 pmol / menit, γ-oryzanol 20 μmol / l, 15.0 pmol / menit) dan, demikian pula, K m untuk reaksi ini (DNMT3a: kendaraan, 0.0086 μg / ml; γ-oryzanol 2 μmol / l, 0.0080 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.0058 μg / ml; DNMT3b: kendaraan, 0.0122 μg / ml; γ- oryzanol 2 μmol / l, 0.0097 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.0060 μg / ml) (Gbr. (Gbr. 4k, 4k, l). Hasil ini menunjukkan bahwa γ-oryzanol menghambat DNMT3a dan 3b setidaknya sebagian dengan cara yang tidak kompetitif.

γ-oryzanol meningkatkan kadar D2R di striatum tikus yang diberi makan HFD

Kami selanjutnya menguji kemungkinan bahwa γ-oryzanol akan meningkatkan konten D2R striatal melalui penghambatan DNMT. Pada tikus yang diberi makan HFD, pemberian oral γ-oryzanol secara signifikan menurunkan metilasi DNA striatal di daerah promotor D2Rs (Gbr. (Gbr. 5a), 5a), sedangkan itu tidak melakukan ini di hipotalamus (Gbr. (Gbr. 5f) .5f). Sesuai dengan temuan ini, tingkat mRNA dan protein D2R meningkat secara timbal balik (Gbr. (Gbr. 5b, 5b, g, k, l). Mirip dengan data pada pengobatan dengan 5-aza-dC (Gbr. (Gbr. 1), 1), tidak ada efek nyata pada RNA dan kadar protein Drd1, Th dan Slc6a3 (DAT) di striatum, dan tidak ada efek pada kadar Drd1, Th dan Slc6a3 di hipotalamus (Gbr. (Gbr. 5c – e, 5c – e, h – k, m).

Ara. 5 

Penghambatan DNMT oleh γ-oryzanol melemahkan preferensi untuk HFD melalui augmentasi D2Rs dalam striatum tikus yang diberi makan HFD. Tingkat metilasi DNA dari daerah promotor D2R di striatum (n = 3) (a) dan hipotalamus ...

Studi sebelumnya telah menunjukkan bahwa kadar D2R dan DNMT1 diatur oleh tekanan ER dan peradangan setidaknya sebagian melalui NF-κB [, , ] Oleh karena itu kami memeriksa kadar gen yang berhubungan dengan stres ER dan terkait peradangan. Seperti yang ditunjukkan sebelumnya [], HFD meningkatkan ekspresi gen yang mengkode TNF-α (Tnfa), protein kemoattractan monosit - 1 (MCP-1) (Ccl2), Protein homolog C / EBP (Memotong), DnaJ 4 yang dilokalisasikan ER (ERdj4) (Dnajb9) dan bentuk disambung dari X-box binding protein 1 (Xbp1s) di hipotalamus tetapi tidak di striatum (Gbr. (Gbr. 6) .6). Khususnya, suplementasi HFD dengan γ-oryzanol secara signifikan menurunkan ekspresi augmented Ccl2, Memotong, Dnajb9 dan Xbp1s secara eksklusif di hipotalamus tetapi tidak di striatum (Gbr. (Gbr. 66).

Ara. 6 

Ekspresi gen proinflamasi dan ER terkait stres di striatum dan hipotalamus. Tingkat mRNA untuk Tnfa (a, f), Ccl2 (b, g), Memotong (c, h), Dnajb9 (d, i), dan bentuk sambungan aktif dari Xbp1 (Xbp1s) (e, j) di striatum (n = 8) ...

Diskusi

Temuan utama dalam penelitian ini adalah bahwa γ-oryzanol bertindak sebagai inhibitor DNMT yang kuat dalam striatum tikus, dengan demikian melemahkan, setidaknya sebagian, preferensi untuk HFD melalui modulasi epigenetik D2R striatal. Dalam striatum dari tikus yang diberi makan HFD, kadar D2R menurun secara signifikan, sedangkan yang D1R, TH dan DAT tidak berubah (Gbr. (Gbr. 1b – e, 1b – e, k – m). Data ini konsisten dengan gagasan bahwa disregulasi D2R striatal memainkan peran penting dalam persepsi hadiah makanan ketika menggunakan HFD, yang mengarah pada konsumsi berlebihan HFD hFD pada hewan gemuk [] Dalam penelitian ini, pengobatan tikus yang diberi makan HFD dengan 5-aza-dC secara signifikan meningkatkan kadar D2R striatal (Gbr. (Gbr. 1b, 1b, k, l) mungkin melalui pengurangan tingkat metilasi DNA di daerah promotor D2R (Gbr. (Gbr. 1a), 1a), dan akibatnya melemahkan preferensi untuk lemak makanan (Gbr. (Gbr. 1n) .1n). Temuan ini juga mendukung peran penting D2R striatal dalam persepsi hadiah makanan saat menggunakan HFD.

Uji in vitro kami menunjukkan bahwa aktivitas penghambatan γ-oryzanol terhadap DNMT tampaknya lebih kuat daripada asam ferulat metabolitnya (Gbr. (Gbr. 4d – f), 4d – f), menunjukkan pentingnya struktur lengkap γ-oryzanol untuk tindakan penghambatannya pada DNMT. Pada tikus yang diberi makan HFD, penelitian kami menunjukkan bahwa, setelah pemberian oral, γ-oryzanol mencapai otak sebagai struktur yang lengkap dan menurunkan kadar dan aktivitas DNMT secara istimewa di striatum, dengan konsekuensi penurunan metilasi DNA di wilayah promotor dari D2R di striatum. Selain itu, penelitian in vitro kami telah menunjukkan bahwa γ-oryzanol bertindak sebagai antagonis parsial terhadap ERRγ, yang terutama berfungsi sebagai regulator positif untuk produksi DNMT1 [], dan akibatnya menurunkan aktivitas DNMT1 (Gbr. (Gbr. 3a) .3Sebuah). Dari catatan, ERRγ sangat diekspresikan dalam striatum tetapi tidak pada hipotalamus pada tikus (Gbr. (Gbr. 3b) .3b). Data ini menunjukkan bahwa γ-oryzanol memiliki potensi untuk menurunkan tingkat mRNA dari DNMT1, setidaknya sebagian, melalui penghambatan ERRγ. Berbeda dengan striatum, γ-oryzanol tidak menunjukkan efek pada tingkat D2R dalam hipotalamus dari tikus yang diberi makan HFD (Gbr. (Gbr. 5g, 5g, k, l).

Di sisi lain, kami menunjukkan bahwa γ-oryzanol secara signifikan meningkatkan kadar DNMT1 di hipotalamus tetapi tidak di striatum (Gbr. (Gbr. 2k, 2k, l). Telah terbukti bahwa STAT3 meningkatkan kandungan DNMT1 dalam sel T-limfoma ganas [] Khususnya, kami sebelumnya menunjukkan bahwa γ-oryzanol secara signifikan meningkatkan fosforilasi STAT3 yang diinduksi leptin dalam hipotalamus dari tikus yang diberi makan HFD [] Juga harus dicatat bahwa STAT3α secara substansial diekspresikan dalam hipotalamus tetapi tidak pada striatum pada tikus (Gbr. (Gbr. 3e –g) .3misalnya). Data ini menggoda kita untuk berspekulasi bahwa perbedaan yang jelas dalam efek γ-oryzanol pada tingkat DNMT1 antara hipotalamus dan striatum dapat dikaitkan, setidaknya sebagian, dengan konten spesifik STAT3α dan ERRγ di otak tikus ( Ara. (Gbr. 3b –g) .3b – g). Secara kolektif, tampaknya ada pola timbal balik dari ekspresi ERRγ dan STAT3α antara striatum dan hipotalamus pada tikus. Atas dasar hasil kami, oleh karena itu masuk akal untuk berspekulasi bahwa dalam striatum, di mana produksi ERRγ berlimpah, γ-oryzanol lebih disukai dapat mengurangi tingkat mRNA dan aktivitas enzim dari DNMT1 sebagai regulator negatif ERRγ. Sebaliknya, di hipotalamus, di mana produksi STAT3α dominan, γ-oryzanol dapat secara istimewa meningkatkan kadar DNMT1.

Sebuah studi baru-baru ini menunjukkan bahwa pelemahan pensinyalan D2R striatal yang disebabkan oleh HFD mengatur perilaku makan], menunjukkan pentingnya penghambatan DNMT striatal untuk pengobatan obesitas. Di sisi lain, penelitian sebelumnya menunjukkan kemungkinan bahwa status metilasi DNA gen 4 reseptor melanokortin yang diekspresikan dalam nukleus hipotalamus spesifik dapat memodulasi bentuk transgenerasi obesitas pada tikus kuning yang hidup [] Meskipun penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menjelaskan mekanisme yang mendasarinya, penelitian ini menunjukkan pentingnya metilasi DNA spesifik jaringan, gen dan urutan dalam patofisiologi obesitas yang disebabkan oleh HFD.

Kami baru-baru ini melaporkan bahwa HFD meningkatkan level D2R di pulau pankreas tikus [, ] Sangat mungkin bahwa augmentasi tersebut dimediasi, setidaknya sebagian, oleh tekanan ER dan peradangan melalui NF-κB, karena ada beberapa elemen responsif NF-κB di daerah promotor D2R [, ] Lebih lanjut, sebuah penelitian terbaru menunjukkan bahwa TNF-α dan IL-1β meningkatkan level dan aktivitas DNMT1 dalam jaringan adiposa dari tikus yang diberi makan HFD [] Yang penting, penelitian ini menunjukkan bahwa HFD menginduksi stres ER dan peradangan secara istimewa di hipotalamus tetapi tidak di striatum (Gambar. (Gbr. 6) .6). Mekanisme mendalam untuk metilasi dan demetilasi DNA spesifik jaringan, wilayah, dan lokasi dalam paradigma eksperimental kami harus menunggu penyelidikan lebih lanjut.

Bersama dengan laporan kami sebelumnya menunjukkan bahwa that-oryzanol melemahkan preferensi untuk HFD melalui regulasi hipotalamus stres ER pada tikus [], γ-oryzanol juga mewakili sifat unik untuk memperbaiki baik disregulasi hedonis dan metabolik perilaku makan. Karena beberapa obat antiobesitas yang telah dikembangkan diketahui menyebabkan efek samping kritis [], pendekatan berbasis makanan alami terhadap sistem penghargaan otak diantisipasi untuk mengobati sindrom obesitas-diabetes dengan aman [] Dalam paradigma ini, γ-oryzanol adalah kandidat antiobesitas yang menjanjikan dengan sifat berbeda sebagai modulator epigenetik.

 

Bahan pelengkap elektronik

 

ESM(256K, pdf) 

(PDF 256 kb)

Ucapan Terima Kasih

Kami berterima kasih kepada S. Okamoto (Universitas Ryukyus, Jepang) yang telah meninjau ulang naskah tersebut. Kami berterima kasih kepada M. Hirata, H. Kaneshiro, I. Asato dan C. Noguchi (Universitas Ryukyus, Jepang) atas bantuan kesekretariatan.

Singkatan

5-aza-dC5-aza-2′-deoxycytidine
D1RReseptor D1 dopamin
D2RReseptor D2 dopamin
DATTransporter dopamin
DNMTDNA methyltransferase
ERRetikulum endoplasma
ERRReseptor terkait estrogen
HFDDiet tinggi lemak
SAHS-Adenosyl-l-homocysteine
SAMS-Adenosyl metionin
STAT3αTransduser sinyal dan aktivator transkripsi 3α
THTirosin hidroksilase
 

Catatan

Ketersediaan data

Kumpulan data yang dihasilkan dan / atau dianalisis selama penelitian ini tersedia dari penulis terkait berdasarkan permintaan yang masuk akal.

Pendanaan

Pekerjaan ini didukung sebagian oleh Bantuan Hibah dari Masyarakat Jepang untuk Promosi Ilmu Pengetahuan (JSPS; KAKENHI Grant Numbers 15K19520 dan 24591338), Dewan Sains, Teknologi dan Inovasi (CSTI), Program Promosi Inovasi Strategis Lintas Kementerian (SIP) 'Teknologi untuk menciptakan pertanian, kehutanan dan perikanan generasi baru', Lotte Foundation, Yayasan Jepang untuk Enzimologi Terapan, Energi Baru dan Organisasi Pengembangan Teknologi Industri (NEDO), Proyek Pembentukan Jejaring Ilmu Kehidupan (Bidang Farmasi) ) (Prefektur Okinawa, Jepang) dan Proyek Promosi Pengelompokan Medis di Prefektur Okinawa, Jepang, bersama dengan hibah dari Prefektur Okinawa untuk promosi obat canggih (Prefektur Okinawa, Jepang).

Dualitas yang menarik

Para penulis menyatakan bahwa tidak ada dualitas yang menarik terkait dengan naskah ini.

Pernyataan kontribusi

CK dan HM merancang penelitian. CK dan TK melakukan percobaan dan menganalisis data. TK, CS-O, CT, MT, MM dan KA berkontribusi pada interpretasi data. CK dan HM menulis naskah itu. Semua penulis berkontribusi pada interpretasi data. Semua penulis bergabung dalam merevisi naskah dan menyetujui versi akhirnya. HM adalah penjamin pekerjaan ini, memiliki akses penuh ke semua data dan bertanggung jawab penuh atas integritas data dan keakuratan analisis data.

Catatan kaki

 

Bahan pelengkap elektronik

Versi online dari artikel ini (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) berisi materi pelengkap yang ditinjau sejawat tetapi belum diedit, yang tersedia untuk pengguna yang berwenang.

 

Referensi

1. DiLeone RJ, Taylor JR, Picciotto MR. Dorongan untuk makan: perbandingan dan perbedaan antara mekanisme imbalan makanan dan kecanduan narkoba. Nat Neurosci. 2012; 15: 1330 – 1335. doi: 10.1038 / nn.3202. [Artikel gratis PMC] [PubMed] [Cross Ref]
2. Kenny PJ. Mekanisme seluler dan molekuler yang umum dalam obesitas dan kecanduan obat. Nat Rev Neurosci. 2011; 12: 638 – 651. doi: 10.1038 / nrn3105. [PubMed] [Cross Ref]
3. Johnson PM, Kenny PJ. Reseptor D2 dopamin dalam disfungsi hadiah seperti kecanduan dan makan kompulsif pada tikus gemuk. Nat Neurosci. 2010; 13: 635 – 641. doi: 10.1038 / nn.2519. [Artikel gratis PMC] [PubMed] [Cross Ref]
4. Stice E, Spoor S, Bohon C, DM Kecil. Hubungan antara obesitas dan respons striatal tumpul terhadap makanan dimoderatori oleh alel TaqIA A1. Ilmu. 2008; 322: 449 – 452. doi: 10.1126 / science.1161550. [Artikel gratis PMC] [PubMed] [Cross Ref]
5. Geiger BM, Haburcak M, Avena NM, MC Moyer, Hoebel BG, Pothos EN. Defisit neurotransmisi dopamin mesolimbik pada obesitas diet tikus. Ilmu saraf. 2009; 159: 1193 – 1199. doi: 10.1016 / j.neuroscience.2009.02.007. [Artikel gratis PMC] [PubMed] [Cross Ref]
6. EP mulia. Kecanduan dan proses penghargaannya melalui polimorfisme gen reseptor dopamin D2: ulasan. Psikiatri Eur 2000; 15: 79 – 89. doi: 10.1016 / S0924-9338 (00) 00208-X. [PubMed] [Cross Ref]
7. Wang GJ, Tomasi D, Backus W, dkk. Distensi lambung mengaktifkan sirkuit kenyang di otak manusia. NeuroImage. 2008; 39: 1824 – 1831. doi: 10.1016 / j.neuroimage.2007.11.008. [PubMed] [Cross Ref]
8. Janero DR, antagonis reseptor Makriyannis A. Cannabinoid: peluang farmakologis, pengalaman klinis, dan prognosis translasi. Ahli Opin Obat Terlarang. 2009; 14: 43 – 65. doi: 10.1517 / 14728210902736568. [PubMed] [Cross Ref]
9. Jaenisch R, Bird A. Peraturan epigenetik dari ekspresi gen: bagaimana genom mengintegrasikan sinyal intrinsik dan lingkungan. Nat Genet. 2003; 33 (Suppl): 245 – 254. doi: 10.1038 / ng1089. [PubMed] [Cross Ref]
10. Ong ZY, Muhlhausler BS. Memberi makan "junk-food" ibu dari bendungan tikus mengubah pilihan makanan dan pengembangan jalur hadiah mesolimbik pada keturunannya. FASEB J. 2011; 25: 2167 – 2179. doi: 10.1096 / fj.10-178392. [Artikel gratis PMC] [PubMed] [Cross Ref]
11. Barres R, Osler ME, Yan J, et al. Metilasi non-CpG dari promotor PGC-1alpha melalui DNMT3B mengontrol kepadatan mitokondria. Metab sel. 2009; 10: 189 – 198. doi: 10.1016 / j.cmet.2009.07.011. [PubMed] [Cross Ref]
12. Lee WJ, Zhu BT. Penghambatan metilasi DNA oleh asam caffeic dan asam chlorogenic, dua polifenol kopi yang mengandung katekol. Karsinogenesis. 2006; 27: 269 – 277. doi: 10.1093 / carcin / bgi206. [PubMed] [Cross Ref]
13. Fang MZ, Wang Y, Ai N, dkk. Teh polifenol (-) - epigallocatechin-3-gallate menghambat DNA methyltransferase dan mengaktifkan kembali gen yang dibungkam metilasi dalam garis sel kanker. Res Kanker 2003; 63: 7563 – 7570. [PubMed]
14. Kozuka C, Yabiku K, Sunagawa S, dkk. Nasi merah dan komponennya, gamma-oryzanol, melemahkan preferensi untuk diet tinggi lemak dengan mengurangi tekanan retikulum endoplasma hipotalamus pada tikus. Diabetes. 2012; 61: 3084 – 3093. doi: 10.2337 / db11-1767. [Artikel gratis PMC] [PubMed] [Cross Ref]
15. Kozuka C, Sunagawa S, Ueda R, dkk. Gamma-Oryzanol melindungi sel beta pankreas terhadap stres retikulum endoplasma pada tikus jantan. Endokrinologi. 2015; 156: 1242 – 1250. doi: 10.1210 / en.2014-1748. [PubMed] [Cross Ref]
16. Kozuka C, Yabiku K, Takayama C, Matsushita M, Shimabukuro M, Masuzaki H. Pendekatan novel sains berbasis pangan alami terhadap pencegahan dan pengobatan obesitas dan diabetes tipe 2: penelitian terbaru tentang beras merah dan γ-oryzanol. Obes Res Clin Pract. 2013; 7: e165 – e172. doi: 10.1016 / j.orcp.2013.02.003. [PubMed] [Cross Ref]
17. Kozuka C, Sunagawa S, Ueda R, dkk. Mekanisme insulinotropik novel gamma-oryzanol yang berasal dari biji-bijian utuh melalui penindasan pensinyalan reseptor dopamin D lokal di pulau tikus. Br J Pharmacol. 2015; 172: 4519 – 4534. doi: 10.1111 / bph.13236. [Artikel gratis PMC] [PubMed] [Cross Ref]
18. Karahoca M, Momparler RL. Analisis farmakokinetik dan farmakodinamik dari 5-aza-2′-deoxycytidine (decitabine) dalam desain jadwal dosis untuk terapi kanker. Epigenetika Klinik. 2013; 5: 3. doi: 10.1186 / 1868-7083-5-3. [Artikel gratis PMC] [PubMed] [Cross Ref]
19. Rein T, Zorbas H, DePamphilis ML. Asal replikasi mamalia aktif dikaitkan dengan sekelompok kepadatan tinggi mCpG dinukleotida. Biol Sel Mol. 1997; 17: 416 – 426. doi: 10.1128 / MCB.17.1.416. [Artikel gratis PMC] [PubMed] [Cross Ref]
20. Tanaka T, Masuzaki H, Yasue S, et al. Pensinyalan melanocortin sentral mengembalikan otot rangka protein fosfat kinase teraktivasi-AMP otot pada tikus yang diberi diet tinggi lemak. Metab sel. 2007; 5: 395 – 402. doi: 10.1016 / j.cmet.2007.04.004. [PubMed] [Cross Ref]
21. Okano M, Bell DW, Haber DA, Li E. DNA methyltransferases Dnmt3a dan Dnmt3b sangat penting untuk metilasi de novo dan pengembangan mamalia. Sel. 1999; 99: 247 – 257. doi: 10.1016 / S0092-8674 (00) 81656-6. [PubMed] [Cross Ref]
22. Zhang Y, Wang L. Penghambat reseptor nuklir SHP ekspresi Dnmt1 melalui ERRγ FEBS Lett. 2011; 585: 1269 – 1275. doi: 10.1016 / j.febslet.2011.03.059. [Artikel gratis PMC] [PubMed] [Cross Ref]
23. Zhang Q, Wang HY, Woetmann A, Raghunath PN, Odum N, Wasik MA. STAT3 menginduksi transkripsi gen 1 DNA methyltransferase (DNMT1) dalam limfosit T ganas. Darah. 2006; 108: 1058 – 1064. doi: 10.1182 / darah-2005-08-007377. [Artikel gratis PMC] [PubMed] [Cross Ref]
24. Bontempi S, Fiorentini C, Busi C, Guerra N, Spano P, Missale C. Identifikasi dan karakterisasi dua situs faktor-kappaB nuklir di wilayah pengaturan reseptor D2 dopamin. Endokrinologi. 2007; 148: 2563 – 2570. doi: 10.1210 / en.2006-1618. [PubMed] [Cross Ref]
25. Kim AY, Park YJ, Pan X, dkk. Hypermethylation DNA yang diinduksi obesitas dari gen adiponectin memediasi resistensi insulin. Nat Commun. 2015; 6: 7585. doi: 10.1038 / ncomms8585. [Artikel gratis PMC] [PubMed] [Cross Ref]
26. Ozcan L, Ergin AS, Lu A, dkk. Stres retikulum endoplasma memainkan peran sentral dalam pengembangan resistensi leptin. Metab sel. 2009; 9: 35 – 51. doi: 10.1016 / j.cmet.2008.12.004. [PubMed] [Cross Ref]
27. Waterland RA, Travisano M, Tahiliani KG, Rached MT, Suplementasi donor Mirza S. Meth mencegah penguatan transgenerasional obesitas. Int J Obes. 2008; 32: 1373 – 1379. doi: 10.1038 / ijo.2008.100. [Artikel gratis PMC] [PubMed] [Cross Ref]