Insulin mengaktifkan reseptor insulin (InsRs) di hipotalamus untuk memberi sinyal rasa kenyang setelah makan. Namun, meningkatnya insiden obesitas, yang mengakibatkan peningkatan level insulin secara kronis, menyiratkan bahwa insulin juga dapat bertindak di pusat-pusat otak yang mengatur motivasi dan penghargaan. Kami melaporkan di sini bahwa insulin dapat memperkuat aksi pelepasan dopamin (DA) potensial bergantung pada nucleus accumbens (NAc) dan caudate-putamen melalui mekanisme tidak langsung yang melibatkan interneuron kolinergik striatal yang mengekspresikan InsRs. Selain itu, dua manipulasi diet kronis yang berbeda pada tikus, pembatasan makanan (FR) dan diet obesogenik (OB), sebaliknya mengubah sensitivitas pelepasan DA striatal terhadap insulin, dengan peningkatan responsif pada FR, tetapi hilangnya responsif pada OB. Studi perilaku menunjukkan bahwa kadar insulin utuh dalam cangkang NAc diperlukan untuk memperoleh preferensi untuk rasa larutan glukosa berpasangan. Bersama-sama, data ini menyiratkan bahwa pensinyalan insulin striatal meningkatkan pelepasan DA untuk memengaruhi pilihan makanan.

Telah diketahui bahwa peningkatan berkelanjutan dalam insulin plasma selama dan setelah makan mengaktifkan reseptor insulin (InsRs) di hipotalamus, yang memberikan umpan balik negatif ke sirkuit nafsu makan yang mengurangi makan lebih lanjut^{1, 2, 3}. Insulin otak terutama berasal dari sel β pankreas, dengan transpor aktif dari plasma ke otak pada sawar darah-otak^{4, 5, 6, 7, 8}, meskipun ada semakin banyak bukti untuk sintesis dan pelepasan insulin neuron, juga^{1, 9}. Khususnya, ekspresi InsRs tidak terbatas pada hipotalamus, meskipun fungsi InsRs ekstra-hipotalamus masih belum terselesaikan.^{1, 2, 3}. Mengingat meningkatnya insiden obesitas dan diabetes tipe II, di mana kadar insulin yang bersirkulasi terus meningkat dan transportasi insulin otak dan sensitivitas reseptor menurun^{3, 8, 10, 11}Sangat penting untuk memahami fungsi insulin di daerah otak yang mengatur motivasi dan penghargaan. Wilayah otak yang sangat menarik termasuk nucleus accumbens (NAc), yang memediasi efek baik makanan dan obat-obatan^{12, 13}, dan caudate-putamen (CPu), yang berperan dalam perilaku dan keinginan berbasis kebiasaan¹³. InsR diekspresikan di seluruh wilayah ini, dengan kepadatan tertinggi terjadi di NAc^{3, 14}; InsRs juga diekspresikan oleh neuron dopamin (DA) di otak tengah, termasuk yang di area ventral tegmental (VTA) dan substantia nigra pars compacta (SNc)¹⁵. Tingkat insulin otak sebanding dengan konsentrasi insulin plasma dan adipositas tubuh^{6, 7, 8}, yang mengarah ke hipotesis bahwa insulin mungkin bertindak di InsRs di wilayah otak ini untuk mempengaruhi hadiah makanan^{3, 16, 17}.

Penelitian sebelumnya pada sinaptosom striatal, sel heterolog, irisan otak dan in vivo telah menunjukkan bahwa aktivasi insulin InsR mengarah pada peningkatan penyerapan DA oleh transporter DA (DAT)^{18, 19, 20, 21, 22, 23}. Proses ini melibatkan jalur pensinyalan PI3 kinase^{19, 20}, dan menghasilkan penyisipan DAT dalam membran plasma¹⁹. Tingkat insulin yang bersirkulasi secara dinamis memodulasi aktivitas DAT striatal, dengan penurunan serapan DA dan ekspresi permukaan DAT terlihat pada model hewan diabetes dan setelah pembatasan makanan (FR)^{20, 21}. Peningkatan ketergantungan insulin dalam aktivitas DAT telah terbukti mengurangi konsentrasi DA ekstraseluler yang ditimbulkan ([DA]_o) di VTA²³, mencerminkan pergeseran keseimbangan antara rilis dan serapan DA. Konsisten dengan peran insulin yang mapan dalam rasa kenyang, injeksi mikro akut insulin dalam VTA dapat menurunkan imbalan makanan^{23, 24}, sedangkan tikus yang kekurangan InsRs dalam neuron VTA dan SNc DA menunjukkan peningkatan asupan makanan dan menjadi gemuk²⁵. Meskipun insulin dapat menginduksi depresi jangka panjang dari input rangsang ke neuron VTA DA²⁴, lagi-lagi konsisten dengan peran dalam kenyang, paparan insulin juga dapat meningkatkan laju penembakan neuron DA, mungkin dengan mengurangi pelepasan DA dan penghambatan yang dimediasi oleh autoreseptor²⁵. Efek bersih insulin pada pelepasan DA striatal sulit diprediksi. Memang, hasil dari studi pengaruh insulin pada rilis DA striatal di ex vivo iris¹⁹ dan efek injeksi mikro lokal insulin di NAc pada hadiah makanan²⁶ tampaknya bertentangan. Untuk mengatasi ini, kami mengevaluasi pelepasan DA aksonal dan serapan di lingkungan mikro utuh dari NAc dan CPu di ex vivo irisan striatal menggunakan fast-scan cyclic voltammetry (FCV), dan menentukan efek pensinyalan insulin dalam NAc pada perilaku penghargaan in vivo.

Studi kami menunjukkan bahwa efek utama insulin dalam NAc dan CPu adalah untuk meningkatkan pelepasan DA, meskipun peningkatan serentak pada DA. Regulasi pelepasan DA yang dinamis ini melibatkan peningkatan ketergantungan insulin pada rangsangan striatal cholinergic interneurons (ChIs), yang mengarah pada pelepasan DA yang ditingkatkan melalui aktivasi reseptor nicotinic acetylcholine (ACh) (nAChRs). Pengaruh insulin pada CHI dan pada rilis DA dimediasi oleh InsRs. Khususnya, efek insulin pada rilis DA diamplifikasi dalam irisan dari tikus FR, tetapi tumpul pada tikus pada diet obesogenic (OB). Data ini menunjukkan amplifikasi rilis DA di ex vivo irisan oleh insulin mengarah pada prediksi bahwa insulin dapat bertindak sebagai sinyal hadiah in vivo. Memang, studi perilaku paralel menunjukkan peran insulin dalam cangkang NAc dalam pengkondisian preferensi rasa. Bersama-sama, temuan ini menunjukkan peran baru untuk insulin sebagai sinyal hadiah yang dapat memengaruhi pilihan makanan

Insulin yang bekerja di InsRs meningkatkan pelepasan DA striatal

Pemeriksaan awal [DA] yang ditimbulkan secara lokal_o dipantau dengan FCV in ex vivo irisan striatal dari tikus dengan ad libitum (AL) akses ke makanan dan air mengungkapkan temuan tak terduga bahwa aplikasi akut insulin di berbagai konsentrasi yang relevan secara fisiologis^{1, 4} peningkatan single-pulse-evoked [DA]_o (Fig. 1a – c), dengan EC insulin₅₀ nilai (konsentrasi di mana efeknya setengah maksimal) dari 2 – 12 nM (Fig. 1b). Peningkatan yang ditimbulkan [DA]_o terutama mengejutkan, mengingat bahwa ini disertai dengan peningkatan signifikan dalam tingkat maksimal (V_max) untuk serapan yang dimediasi DAT di setiap subregion (Tabel 1), yang akan menyebabkan penurunan bersaing dalam membangkitkan [DA]_o, seperti yang dilaporkan sebelumnya^{22, 23}. Sebaliknya, kami menemukan bahwa membangkitkan [DA]_o diamplifikasi secara maksimal 20 – 55% oleh 30 nM insulin; wilayah dengan efek proporsional terbesar adalah shell NAc, yang merupakan subregional striatal dengan ekspresi InsR tertinggi^{1, 14}. Irisan yang terpapar 30 nM insulin dalam kondisi yang sama tidak menunjukkan perubahan pada konten DA striatal (Gambar Tambahan 1a), menyiratkan bahwa insulin mengubah regulasi pelepasan dinamis, bukan hanya mengatur sintesis DA. Khususnya, efek insulin pada [DA] yang ditimbulkan_o hilang pada konsentrasi suprafisiologis ≥100 nM (Fig. 1b). Ini bukan hasil dari peningkatan rilis menyalip aktivitas DAT, sebagai efek dari insulin pada V_max juga hilang pada konsentrasi ini (Tabel 1). Secara keseluruhan, data ini menunjukkan bahwa dalam lingkungan mikro striatal yang utuh, efek dominan insulin pada yang ditimbulkan [DA]_o adalah untuk meningkatkan rilis, meskipun peningkatan serapan DA bersamaan.

  

  

(a) Rata-rata membangkitkan pulsa tunggal [DA]_o dalam cangkang NAc, inti NAc dan CPu sebelum dan sesudah insulin (Ins) diilustrasikan untuk 30 nM; bar kesalahan dihilangkan, tetapi lihat (b); panah menunjukkan waktu stimulus. Insulin meningkat membangkitkan [DA]_o dalam shell (oleh 55 ± 10%), inti (oleh 37 ± 5%) dan CPu (oleh 20 ± 4%) (***P<0.001). (b) Pengaruh insulin tergantung konsentrasi pada rentang fisiologis (1-30 nM) dalam cangkang (n= 22 – 24, F_5,133= 14.471, P<0.001), inti (n= 36 – 76, F_5,308= 16.318, P<0.001) dan CPu (n= 30 – 62, F_5,253= 13.763, P<0.001), tetapi hilang pada ≥100 nM. (c) Rekaman representatif dari peak-evoked [DA]_o versus waktu di satu situs di inti NAc dengan tidak adanya aplikasi obat (Con), selama penerapan insulin (30 nM) atau ketika insulin diterapkan di hadapan penghambat InsR HNMPA (5 μM). (d) Average peak-evoked [DA]_o data yang menunjukkan pencegahan efek insulin (30 nM) oleh HNMPA, Insagon antagonis S961 (1 μM) dan penghambat PI3K LY294002 (1 μM), tetapi tidak oleh penghambat IGF-1R PPP (1 μM) (n= 29 – 76; P> 0.9 versus insulin saja). Untuk Gbr. 1a – d, n= jumlah tempat per subregion dari tikus 3 – 6 untuk setiap obat atau konsentrasi insulin; ANOVA satu arah, uji signifikansi jujur ​​Tukey (HSD). Lihat Gambar Tambahan 1b, c untuk data NAc shell dan CPu.

• Gambar ukuran penuh (98 KB)

 

 

Karena insulin juga dapat bertindak pada reseptor 1 faktor pertumbuhan seperti insulin (IGF-1Rs), walaupun pada konsentrasi melebihi 100 nM (ref. 1), kami berusaha untuk mengkonfirmasi bahwa peningkatan efek insulin pada yang ditimbulkan [DA]_o tergantung InsR. Ini terbukti sebagai kasus, karena efeknya dicegah oleh penghambat InsR intraseluler, asam hidroksi-2-naphthalenylmethylphosphonic (HNMPA), dan oleh antagonis InsR, S961, tetapi tidak oleh inhibitor selektif IGF-1Rs, pikropodilin²⁴ (PPP; Gbr. 1c, d dan Gambar Tambahan 1b, c). Kami kemudian memeriksa keterlibatan PI3 kinase, yang memulai jalur pensinyalan yang bertanggung jawab untuk regulasi DAT yang tergantung insulin¹⁹. Pada konsentrasi 1 μM, inhibitor P13K LY249002 saja tidak memiliki efek pada [DA] yang dipicu oleh puncaknya._o or V_max (n= 29 – situs 76 (inti NAc) per obat, P> 0.05, analisis varian satu arah (ANOVA); data tidak ditampilkan), namun mencegah efek insulin pada membangkitkan [DA]_o di semua sub regional striatal (Fig. 1d dan Gambar Tambahan 1b, c).

Lokalisasi InsR pada akson DA dan CHI

Peningkatan yang diamati dalam V_max untuk pengambilan DA dengan tingkat fisiologis insulin menyiratkan adanya InsRs pada akson DA, seperti halnya hasil sebelumnya dalam berbagai persiapan striatal^{18, 19, 20, 21, 22}. Meskipun ekspresi fungsional InsR pada neuron DA otak tengah telah dibuktikan^{15, 23, 24, 25}, Ekspresi InsR pada akson DA striatal belum dilaporkan. Kami membahas ini menggunakan imunohistokimia. Imunoreaktivitas padat InsR di seluruh striatum penilaian kuantitatif terbatas lokalisasi InsR pada akson DA, yang diidentifikasi oleh immunoreactivity untuk enzim mensintesis DA, tyrosine hydroxylase (TH). Karena itu kami mengadopsi protokol yang dilaporkan sebelumnya²⁷, yang melibatkan penghitungan puncta InsR yang tumpang tindih dengan profil TH + dalam tampilan gambar normal dan menghitung lagi setelah gambar InsR hanya diputar oleh 90 °. Jika tumpang tindih nyata profil InsR dan TH + tidak spesifik, prosedur ini harus memberikan jumlah yang sama secara statistik apakah normal atau 90 ° keluar dari fase. Namun, analisis ini menunjukkan penurunan tumpang tindih puncta InsR dengan profil TH + dari 14 ± 9% (n= Bidang 42, P<0.01, dipasangkan dengan dua sisi t-uji; data tidak ditampilkan), mengonfirmasi kehadiran InsR pada akson DA. Lebih menariknya, bagaimanapun, Insol immunolabelling striatum mengungkapkan ekspresi InsR yang berbeda pada badan sel besar yang diidentifikasi sebagai ChI striatal oleh co-immunolabelling untuk choline acetyltransferase (ChAT), enzim utama yang diperlukan untuk sintesis ACh. Menggunakan kriteria elektrofisiologi²⁸ untuk mengidentifikasi CHI dalam studi awal perekaman seluruh sel, beberapa neuron dipenuhi dengan biocytin dan kemudian diproses untuk imunohistokimia; semua ini (4 / 4) adalah imunopositif untuk InsR dan ChAT (Fig. 2a). Evaluasi selanjutnya dari co-lokalisasi InsR dan ChAT di NAc menegaskan bahwa hampir semua neuron ChAT + menyatakan InsR (96%; n= 27 / 28 neuron dalam empat bagian dari dua tikus).

  

  

(a) ChI diisi dengan biocytin, kemudian immunolabelled untuk ChAT, dan InsR (perwakilan dari ChI yang diisi biocytin 4 / 4); gambar gabungan menunjukkan co-localization; bilah skala, 10 μm. (b-e) Respons CHI striatal terhadap serangkaian pulsa saat ini mendepolarisasi (durasi 3; 200, 300 dan 400 pA; Interval 120) sebelum dan sesudah insulin (30 nM). (b) Adaptasi frekuensi lonjakan dalam CHI (atas) terlihat pada kehilangan potensial aksi (AP) selama injeksi saat ini, sedangkan spike bertahan sepanjang pulsa saat ini dalam insulin (lebih rendah); set data lengkap ditunjukkan pada d. (c) Perwakilan waktu program peningkatan jumlah AP yang diinduksi insulin dengan setiap langkah saat ini untuk CHI di b. (d) Ringkasan nomor AP selama pulsa saat ini disampaikan sebelum dan pada efek puncak paparan insulin (n= Stimulasi berpasangan 21, neuron 7, tikus 5) (e) Respon rata-rata yang menunjukkan efek insulin (+ Ins) dalam kondisi kontrol (Con; n= Stimulasi berpasangan 21, neuron 7, ***P<0.001, dipasangkan dengan dua sisi t-test), di hadapan HNMPA (5 μM) (n= Stimulasi berpasangan 12, neuron 4, tikus 4, P>0.05, berpasangan dua sisi t-test), dan di hadapan PPP (1 μM) (n= Stimulasi berpasangan 18, neuron 6, tikus 6, **P<0.01, Wilcoxon pasangan berpasangan menandatangani tes peringkat). (f) Rata-rata membangkitkan pulsa tunggal [DA]_o dalam inti NAc sebelum dan sesudah insulin (30 nM) dalam mecamylamine (Mec; 5 μM) atau DHβE (1 μM) dinormalisasi menjadi 100% kontrol puncak (n= 20 – 40 situs per subkawasan per kondisi dari tikus 3 – 4, P> 0.05 versus kontrol, tidak berpasangan t-uji). (g) Rata-rata membangkitkan pulsa tunggal [DA]_o dalam irisan otak depan dari kontrol heterozigot (Het) dan Obrolan Tikus KO sebelum dan sesudah insulin (30 nM), dinormalisasi menjadi 100% kontrol puncak. Insulin meningkat membangkitkan [DA]_o dalam tikus heterozigot oleh 190 ± 23% dalam shell NAc, 140 ± 8% dalam inti NAc dan 137 ± 12% dalam CPu (n= 15 – 25 situs per subkawasan dari 3 – 4 tikus per genotipe, **P<0.01, ***P<0.001 versus kontrol tidak berpasangan t-test), tetapi tidak berpengaruh pada membangkitkan [DA]_o dalam setiap sub regional striatal dari Obrolan Tikus KO (P> 0.1).

• Gambar ukuran penuh (167 KB)

 

 

Insulin meningkatkan rangsangan CHI

Untuk menguji fungsionalitas InsRs pada CHI striatal, kami memeriksa efek insulin pada rangsangan CHI menggunakan seluruh rekaman sel-saat-penjepit. Rangsangan CHI dinilai dengan menggunakan serangkaian pulsa arus depolarisasi 3 untuk memperoleh rangkaian aksi potensial yang secara andal menunjukkan adaptasi frekuensi lonjakan (Fig. 2b), seringkali dengan hilangnya spiking pada akhir denyut nadi saat ini. Yang mengejutkan, insulin (30 nM) melemahkan adaptasi frekuensi lonjakan, menghasilkan peningkatan progresif dalam jumlah potensial aksi dari waktu ke waktu (Fig. 2c), dengan peningkatan maksimum (Gbr. 2d, e) biasanya terlihat antara 20 dan 50 min paparan insulin. Dengan tidak adanya insulin, kontrol CHI tidak menunjukkan perubahan dalam jumlah potensi aksi yang ditimbulkan (P> 0.05, berpasangan dengan dua sisi t-uji; data tidak ditampilkan); bila dibandingkan dengan neuron kontrol yang dipantau dalam interval waktu yang sama, neuron yang terpapar insulin menunjukkan perubahan signifikan yang lebih besar dalam jumlah potensi aksi yang ditimbulkan (kontrol). n= Pasangan stimulus 12 dari empat neuron, insulin n= Pasangan stimulus 21 dari tujuh neuron, F_1,25= 5.63, P<0.05, ANOVA dua arah ukuran campuran; data tidak ditampilkan). Efek insulin pada peningkatan jumlah potensial aksi dicegah oleh HNMPA tetapi tidak oleh PPP inhibitor selektif IGF-1R (Fig. 2e), menunjukkan bahwa peningkatan rangsangan CHI oleh insulin dimediasi InsR.

Peningkatan insulin yang ditimbulkan [DA]_o membutuhkan nAChRs dan ACh

Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa CHI dan ACh berpotensi mengatur pelepasan DA striatal melalui nAChR pada akson DA^{29, 30, 31, 32, 33, 34}. Ekspresi InsR yang melimpah pada CHI dan peningkatan rangsangan CHI terlihat dengan paparan insulin akut menunjukkan bahwa neuron ini mungkin menjadi target baru untuk insulin yang dapat menyebabkan peningkatan pelepasan DA. Untuk menguji ini, kami menguji efek insulin dengan adanya mekamilamin, antagonis nAChR non-selektif, atau dihydro-β-erythroidine (DHβE), antagonis selektif untuk mengandung β2 yang mengandung subunit (β2 *) nAChR yang diperkaya dengan Akson DA³⁵. Evoked [DA]_o mudah terdeteksi di hadapan antagonis ini, meskipun kedua obat menurunkan amplitudo [DA]_o (misalnya, oleh 13 – 26% dalam inti NAc), seperti yang dilaporkan sebelumnya^{29, 30, 31, 32}. Untuk mendukung peran ACh dan nAChR, efek insulin pada [DA] yang ditimbulkan_o dicegah dengan mecamylamine atau DHβE (Fig. 2f). Untuk mengkonfirmasi keterlibatan pensinyalan ACH striatal dalam pelepasan DA yang ditingkatkan insulin, kami memeriksa efek insulin dalam ex vivo irisan striatal dari tikus di mana ekspresi ChAT secara genetik diablasi dalam struktur otak depan (otak depan) Obrolan KO tikus), termasuk striatum³². Meskipun CHIs utuh pada tikus-tikus ini, sintesis ACh dihapuskan, yang mengarah pada penurunan, tetapi masih dapat dideteksi dengan single-pulse-evoked [DA]_o, seperti yang dijelaskan sebelumnya³². Dalam kontrol littermates heterozigot, insulin (30 nM) meningkat membangkitkan [DA]_o dalam shell dan inti NAc dan di CPu oleh 37 – 90% (Fig. 2g), melebihi amplifikasi yang terlihat pada tikus striatum (misalnya, Ara. 1). Namun, efek insulin pada [DA] yang ditimbulkan_o tidak ada di seluruh kompleks striatal di otak depan Obrolan Tikus KO, menunjukkan bahwa peningkatan pelepasan DA yang dimediasi insulin membutuhkan AC striatal, tetapi bukan pemancar yang dikeluarkan bersama dari CHI, seperti glutamat³⁶.

Pengaruh insulin pada yang ditimbulkan [DA]_o tergantung diet

Konsentrasi plasma dan insulin otak sebanding dengan adipositas tubuh^{6, 7, 8}, dan dapat menyebabkan perubahan kompensasi pada sensitivitas otak terhadap insulin. Oleh karena itu kami menguji hipotesis bahwa diet mempengaruhi kemampuan insulin untuk mempromosikan pelepasan DA, menggunakan irisan striatal dari tikus yang dipelihara baik dengan diet FR atau OB kronis dibandingkan dengan kontrol AL. Seperti yang diharapkan, kadar insulin plasma berkorelasi dengan berat badan, dengan insulin lebih rendah pada FR daripada pada tikus AL atau OB (Fig. 3a dan Tabel 2). Meskipun terdapat perbedaan dalam sirkulasi insulin ini, [DA] yang dipicu oleh puncaknya_o di shell dan inti NAc, dan CPu secara signifikan lebih rendah di ex vivo irisan striatal dari kedua kelompok diet dibandingkan dengan AL (Fig. 3b dan Gambar Tambahan. 2 a, b), menyiratkan bahwa faktor-faktor selain insulin mengatur absolut membangkitkan [DA]_o. Konten DA striatal tidak berbeda di antara kelompok diet, menunjukkan perubahan dalam peraturan rilis daripada dalam sintesis DA (Gambar Tambahan. 2c). Konsisten dengan perubahan regulasi dinamis, sensitivitas pelepasan DA striatal terhadap insulin sangat tergantung pada diet. Pada tikus FR, konsentrasi insulin ≤1 nM, yang tidak memiliki efek pada AL (Fig. 1b), meningkat membangkitkan [DA]_o (Fig. 3c), mencerminkan peningkatan sensitivitas insulin, dengan EC₅₀ nilai dalam FR striatum (0.4 – 0.6 nM) yang kira-kira urutan besarnya lebih rendah dari pada AL (bandingkan Gambar 1b dan 3c). Sebaliknya, efek insulin hilang pada striatum OB; bahkan 30 nM insulin, yang memiliki efek maksimal pada AL striatum (Fig. 1b), tidak berpengaruh pada OB (Fig. 3c).

  

  

(a) Konsentrasi insulin plasma berkorelasi positif dengan berat badan pada kelompok makan (R= 0.76). (b) Rata-rata membangkitkan pulsa tunggal [DA]_o dalam inti NAc (lihat Gambar Tambahan 2a, b untuk NAc shell dan CPu) lebih rendah di FR (38 ± 4%) dan OB (25 ± 4%) dibandingkan AL (n= 50 – 60 situs dari 5 – 6 tikus per kelompok diet, F_2,156= 23.337, ANOVA satu arah, Tukey HSD; ***P<0.001); OB versus FR (P<0.08). (c) Sensitivitas yang ditimbulkan [DA]_o untuk insulin ditingkatkan pada FR, tetapi hilang pada OB (n= Situs 21 – 49 per subkawasan per konsentrasi dari tikus 2 – 4 per kelompok diet, ANOVA satu arah, Tukey HSD), dengan sensitivitas yang lebih besar pada FR dibandingkan tikus AL di semua subregional (P<0.001 untuk setiap wilayah; ANOVA dua arah; CPu: F_{(conc × diet; 3,286)}= 10.253; inti: F_{(conc × diet; 3,353)}= 6.166; kulit: F_{(conc × diet; 3,195)}= 10.735).

• Gambar ukuran penuh (124 KB)

 

 

Data ini menyiratkan hubungan terbalik antara sensitivitas InsR striatal dan adipositas tubuh. Sebagai alternatif, bagaimanapun, perbedaan-perbedaan yang tergantung pada diet ini mungkin mencerminkan sensitivitas nAChR yang berubah. Oleh karena itu kami menentukan respons konsentrasi terhadap nikotin dalam inti NAc dari masing-masing kelompok diet. Nikotin menyebabkan desensitisasi nAChR, yang dapat dikuantifikasi dengan membandingkan rasio [DA]_o ditimbulkan oleh kereta singkat lima pulsa di 100 Hz ke single-pulse-evoked [DA]_o (5 p: 1 p rasio) sebagai indeks aktivasi / desensitisasi nAChR^{30, 31}. Dengan menggunakan pendekatan ini, kami tidak menemukan perbedaan di antara kelompok diet dalam sensitivitas nAChR di inti NAc (Gambar Tambahan 3a – c). Lebih lanjut, kontrol 5 p: 1 p rasio tidak berbeda di antara kelompok diet dalam inti NAc (Gambar Tambahan. 3d) atau CPu (tidak diilustrasikan), menyiratkan bahwa diet tidak mengubah regulasi pelepasan DA yang bergantung pada nAChR. Dengan demikian, sensitivitas InsR striatal tampaknya ditingkatkan pada tikus FR dibandingkan AL, tetapi tidak ada pada tikus OB, dengan hilangnya regulasi pelepasan DA striatal pada konsentrasi fisiologis insulin.

Insulin shell NAc memodulasi preferensi rasa terkondisi

Preferensi makanan dihasilkan oleh faktor sebelum dan sesudah konsumsi; mekanisme untuk masing-masing tidak sepenuhnya diselesaikan, tetapi bukti saat ini melibatkan pensinyalan DA NAc di keduanya^{37, 38}. Mengingat bahwa kadar insulin plasma dan cairan serebrospinal (CSF) meningkat dengan cepat setelah peningkatan glukosa perifer⁶, dan bahwa peningkatan insulin dalam striatum dapat dideteksi dalam 5 menit peningkatan insulin plasma⁷, logis untuk berhipotesis bahwa pelepasan insulin perifer selama makan dapat meningkatkan pelepasan NAc DA dan berkontribusi pada mekanisme imbalan pasca-konsumsi. Kami mengadaptasi protokol preferensi rasa yang dijelaskan sebelumnya³⁷ dengan larutan glukosa manis-sakarin pada tikus untuk menguji hipotesis yang menghalangi efek insulin endogen melalui aplikasi lokal antibodi insulin (InsAb) dalam NAc akan menurunkan preferensi untuk rasa berpasangan. Kemanjuran InsAb dalam memblokir efek insulin diuji dalam in vitro uji DA serapan menjadi striatal sinaptosom. Insulin (30 nM) menyebabkan peningkatan yang signifikan pada V_max dalam sinaptosom dari NAc atau CPu (Gambar Tambahan. 4), konsisten dengan V_max data dari irisan striatal (Tabel 1) dan dengan studi sebelumnya^{18, 19, 20, 21, 22, 23}. Dengan tidak adanya insulin, baik InsAb maupun kontrol antibodi imunoglobulin G (IgG) tidak mengubah V_max untuk pengambilan DA versus kontrol. Dengan adanya IgG, insulin masih menyebabkan peningkatan yang signifikan V_max; Namun, efek insulin pada V_max hilang di hadapan InsAb (Gambar Tambahan. 4).

Untuk meminimalkan kerusakan jaringan dan menjaga sensitivitas target jaringan, dua kelompok subjek diuji di mana kami bergantian microinjection intra-NAc dengan prosedur microinjection mock, daripada menggunakan satu kelompok subjek dan memasangkan satu solusi rasa dengan InsAb dan yang lain dengan kendaraan. Akibatnya, selama sesi pengkondisian satu botol, kelompok eksperimen menerima insulasi mikro InsAb dipasangkan dengan salah satu dari dua rasa, dan pada sesi bergantian, injeksi mikro tiruan dipasangkan dengan rasa lainnya (Fig. 4a, kiri). Kelompok kontrol menerima microinjections tiruan bergantian dengan microinjections baik phosphate-buffered saline (PBS) atau IgG. Kedua larutan rasa mengandung glukosa selama pengkondisian. Tidak ada preferensi diferensial antara rasa yang diharapkan pada kelompok yang disuntik-kontrol, sedangkan preferensi diharapkan untuk bergeser ke arah rasa berpasangan mikroinjeksi tiruan dalam kelompok yang disuntikkan InsAb-mikro.

  

  

(a) Diagram menggambarkan pengkondisian satu botol (kiri) dan tes dua botol (kanan). (b) Volume yang dikonsumsi (ml) selama sesi pengkondisian satu botol. Ada interaksi yang signifikan antara sesi pengkondisian infus dan perawatan injeksi mikro (n= 19 – 20 tikus per grup, F_(3,111)= 3.088, P<0.05, 2 × 4 campuran ANOVA dengan tindakan berulang pada sesi pengkondisian infus). Injeksi mikro InsAb secara signifikan menurunkan konsumsi dibandingkan dengan kontrol selama injeksi ketiga (t(40) = 3.026, **P<0.01) dan keempat (t(40) = 3.052, **P<0.01, dilindungi satu sisi t-test) infus. Suntikan mock tidak berpengaruh pada konsumsi di kedua kelompok (F_3,111= 1.110, 2 × 4 mencampur ANOVA dengan tindakan berulang pada sesi pengkondisian tiruan). (c) Volume yang dikonsumsi selama uji preferensi rasa dua botol. Ada interaksi yang signifikan antara rasa dan perawatan microinjection selama pengkondisian (F_1,37= 5.36, P<0.05, ANOVA campuran dua arah dengan tindakan berulang pada rasa). Grup InsAb mengonsumsi lebih sedikit rasa berpasangan InsAb dibandingkan dengan rasa berpasangan tiruan (t(18) = 2.82, ** P<0.01, dilindungi satu sisi t-uji); kelompok kontrol tidak menunjukkan preferensi rasa (t(19) = 0.803, P> 0.05, terlindungi t-uji). Membandingkan kelompok, tikus InsAb minum secara signifikan lebih sedikit dari rasa yang dipasangkan infus (t(40) = 1.96, *P<0.05) dan secara signifikan lebih banyak rasa berpasangan tiruan (t(40) = 1.77, *P<0.05, dilindungi satu sisi t-test) daripada kontrol.

• Gambar ukuran penuh (161 KB)

 

 

Selama sesi pengkondisian satu botol, injeksi mikro InsAb secara signifikan menurunkan konsumsi dibandingkan dengan kendaraan selama infus ketiga dan keempat (Fig. 4b). Sebaliknya, kedua kelompok mengkonsumsi volume larutan yang sama selama keempat sesi injeksi tiruan (F_3,111= 0.127, P>0.05, ANOVA dua arah campuran) (Fig. 4b). Setelah total delapan sesi pengkondisian, preferensi rasa dinilai dalam uji dua botol di mana tikus memiliki akses ke kedua solusi rasa secara bersamaan (Fig. 4a). Analisis statistik mengungkapkan interaksi yang signifikan antara rasa dan perawatan injeksi mikro yang diterima selama pengkondisian (Fig. 4c). Kelompok InsAb mengkonsumsi secara signifikan lebih sedikit dari rasa berpasangan InsAb dibandingkan dengan rasa berpasangan tiruan (Fig. 4c), sedangkan kelompok kendaraan tidak menunjukkan preferensi rasa (Fig. 4c), menyiratkan bahwa pensinyalan insulin utuh berkontribusi pada pemilihan larutan kalori yang manis. Dibandingkan dengan kendaraan, tikus yang diinfeksi dengan InsAb minum lebih sedikit dari rasa pasangan-infus dan secara signifikan lebih dari rasa pasangan-injeksi-mock (Fig. 4c). Mikroinjeksi IgG (t(9) = 0.792. P>0.05, dilindungi t-tests) atau PBS (t(9) = 0.442. P>0.05, dilindungi t-tests) tidak berpengaruh pada preferensi rasa (data tidak ditampilkan), dengan alasan kemungkinan efek spesifik dari injeksi mikro InsAb menurunkan konsumsi atau preferensi rasa. Juga harus dicatat bahwa preferensi kelompok InsAb pada tes bukan preferensi untuk rasa yang kurang baru, karena tidak ada interaksi antara sesi dan jenis sesi (infus aktual versus infus tiruan) untuk kelompok InsAb (F_3,54= 1.584, P> 0.05, ANOVA dua arah). Artinya, grup InsAb tidak mengonsumsi lebih banyak rasa berpasangan infus tiruan dibandingkan dengan rasa berpasangan infus InsAb; sebaliknya, perbedaan antara kelompok perlakuan hanya muncul selama sesi pengkondisian infus. Secara keseluruhan, data ini menunjukkan bahwa insulin dalam NAc berperan dalam memperkuat preferensi rasa yang menandakan beban glikemik.

Kami melaporkan di sini bahwa insulin memperkuat pelepasan DA striatal dalam cara yang tergantung nAChR dengan memodulasi rangsangan CHI melalui InsRs. Hasil kami menyiratkan bahwa insulin dapat berfungsi sebagai sinyal hadiah, di samping perannya yang mapan dalam memberi sinyal rasa kenyang. Khususnya, efek insulin pada rilis DA dimodulasi oleh diet, dengan peningkatan sensitivitas terhadap insulin setelah FR, tetapi hilangnya regulasi peningkatan insulin pada diet OB. Perubahan-perubahan ini tampaknya mencerminkan perubahan dalam sensitivitas InsR yang berbanding terbalik dengan sirkulasi tingkat insulin, mengingat bahwa kadar insulin plasma ditemukan tergantung pada diet, tetapi sensitivitas nAChR tidak. Akhirnya, studi preferensi rasa kami dalam berperilaku hewan menyiratkan bahwa pensinyalan insulin dalam cangkang NAc memengaruhi preferensi makanan, yang tidak hanya berimplikasi pada insulin dalam pembelajaran terkait makanan tetapi juga menegaskan perannya sebagai sinyal hadiah.

Net [DA]_o mencerminkan keseimbangan antara rilis DA dan serapan DA melalui DAT. Bukti sebelumnya menunjukkan bahwa insulin dapat mengatur aktivitas DAT^{18, 19, 20, 21, 22, 23} menyebabkan prediksi bahwa peningkatan insulin harus menyebabkan penurunan bersih dalam membangkitkan [DA]_o melalui peningkatan serapan DA. Namun, kami menemukan bahwa di striatum, efek insulin lebih kompleks daripada ini. Meskipun paparan insulin memang meningkat V_max untuk DAT, efek utama insulin adalah pada rilis DA, bukan pada serapan DA, dengan peningkatan yang konsisten dalam membangkitkan [DA]_o melintasi rentang fisiologis konsentrasi insulin dalam cangkang dan inti NAc dan pada CPu. Meskipun peningkatan membangkitkan [DA]_o tidak kembali ke tingkat kontrol pada konsentrasi suprafisiologis 100 nM, V_max juga tidak berubah dari kontrol, menghilangkan efek dominan pada DAT sebagai penjelasan. Sebaliknya, kehilangan efek pada serapan serta pelepasan berimplikasi desensitisasi InsRs atau downregulation jalur pensinyalan hilir pada konsentrasi insulin yang tinggi. Memang, InsRs mengalami endositosis dan degradasi yang cepat setelah pengikatan insulin dalam jaringan perifer¹, dengan bukti yang muncul untuk hilangnya sensitivitas InsR neuronal setelah paparan jangka pendek pada level tinggi insulin atau diet tinggi kalori^{10, 11, 39}.

Efek dominan insulin untuk meningkatkan pelepasan DA striatal yang dilaporkan di sini berbeda dengan hasil dua lainnya baru-baru ini ex vivo studi irisan. Pada yang pertama, insulin menyebabkan penurunan limpahan [³H] DA dari irisan striatal, meskipun meningkat [³H] Kelimpahan DA terdeteksi ketika DAT dihambat²². Mengingat bahwa dirilis [³H] DA harus menghindari serapan yang dimediasi DAT di seluruh jaringan untuk dideteksi dalam solusi superfusi, protokol ini sangat sensitif terhadap regulasi DAT. Hasil kami menunjukkan bahwa insulin meningkatkan pelepasan DA melalui CHI dan aktivasi nAChR, di samping meningkatkan serapan yang dimediasi DAT, akan menjelaskan peningkatan yang tampaknya paradoksal dalam peningkatan insulin [³H] Overflow DA terlihat ketika efek yang bersaing pada DAT diblokir²². Studi kedua menggunakan FCV untuk deteksi langsung pelepasan DA somatodendritic di VTA, tetapi juga menemukan efek dominan insulin pada serapan DA, tercermin dalam penurunan yang ditimbulkan [DA]_o (ref. 23). Perbedaan dalam sejumlah faktor, dari microcircuitry lokal ke mekanisme pelepasan DA somatodendritic versus axonal⁴⁰, dapat berkontribusi pada perbedaan regional ini. Akan tetapi, sebagaimana dibahas lebih lanjut di bawah ini, peran insulin yang tergantung secara regional cenderung bersifat komplementer, bukan bertentangan.

Sebelumnya, setiap peran regulasi insulin yang bergantung pada pensinyalan DA telah diasumsikan dimediasi oleh aktivasi langsung InsR pada neuron DA. Kami menunjukkan di sini bahwa InsRs juga diekspresikan pada CHI striatal, dan bahwa insulin memodulasi rangsangan CHI untuk memperkuat pelepasan DA striatal, yang mungkin memainkan peran penting dalam pengaruh insulin pada diet. Chri Striatal menerima proyeksi dari neuron dari inti intralaminar thalamus, yang menunjukkan penembakan meledak sebagai respons terhadap rangsangan sensorik yang menonjol dan membantu mendorong pola lonjakan jeda ledakan pada ChI yang penting dalam mengarahkan perhatian, penguatan, dan pembelajaran asosiatif.⁴¹. Oleh karena itu, aksi insulin di InsRs pada CHI striatal dapat meningkatkan efek isyarat makanan sensorik pada respons striatal terhadap penembakan thalamic, berkontribusi terhadap peningkatan persepsi nilai hadiah dari makanan yang dikonsumsi. Promosi langsung pelepasan DA striatal oleh aktivasi CHI telah menghasilkan saran bahwa faktor-faktor yang merangsang CHI akan memiliki peran istimewa sebagai pemicu pelepasan DA³³. Data kami memberikan bukti pendukung pertama untuk ini, dengan rangsangan CHI yang ditingkatkan insulin dan pensinyalan ACh yang mendorong peningkatan dinamis dalam rilis DA.

Pelepasan DA yang meningkat di hadapan insulin juga menentang peningkatan sinyal ACh yang menyebabkan desensitisasi nAChR atau aktivasi reseptor ACh muskarinik (mAChR), yang keduanya dapat menekan [DA] yang dipicu oleh pulsa tunggal._o (ref 29, 30, 31, 42). Dengan demikian, mekanisme yang dilaporkan di sini berbeda dari aktivasi ACh dari mAChRs, yang telah dikaitkan dengan keengganan dan rasa kenyang.⁴³.

Single-pulse-evoked [DA]_o lebih rendah pada tikus FR dan OB dibandingkan pada tikus AL; meskipun hasil ini sesuai dengan laporan sebelumnya^{44, 45, 46}, penelitian kami memberikan perbandingan sistematis pertama dari tiga subregional striatal dalam dua kelompok diet selama jangka waktu yang konstan. Mekanisme yang mendasari perubahan yang bergantung pada diet pada pelepasan DA belum dijelaskan, dan berada di luar ruang lingkup penelitian ini. Namun, mengingat bahwa kadar insulin plasma secara berlawanan diubah oleh diet FR dan OB, tidak mungkin penurunan yang ditimbulkan [DA]_o pada kedua kelompok merupakan konsekuensi dari kadar insulin yang bergantung pada diet.

Di sisi lain, perubahan sensitivitas InsR dengan diet dan akibatnya kadar insulin plasma yang bergantung pada diet memberikan penjelasan yang paling mungkin untuk peningkatan sensitivitas terhadap insulin dalam FR dan hilangnya respons terhadap insulin dalam OB. Tidak ada bukti untuk penjelasan alternatif dari sensitivitas nAChR yang berubah pada tikus FR atau OB dibandingkan AL. Meskipun temuan kami adalah yang pertama menunjukkan peningkatan sensitivitas InsR striatal dengan FR¹⁸, penurunan berat badan dapat disertai dengan penurunan kadar insulin dalam CSF⁷, yang akan berkontribusi pada peningkatan sensitivitas pelepasan DA terhadap insulin pada FR. Sebaliknya, kehilangan respon insulin pada tikus OB konsisten dengan bukti sebelumnya untuk penurunan sensitivitas InsR otak yang disebabkan oleh penambahan berat badan atau diet OB.^{3, 10, 11}.

Kami ex vivo data irisan mendukung hipotesis bahwa insulin dapat menandakan imbalan serta rasa kenyang. Kami menguji hipotesis ini dengan memblokir efek insulin endogen dengan mikroinjeksi InsAb bilateral dalam cangkang NAc selama pengkondisian preferensi rasa. Konsisten dengan peran dalam penghargaan, menghalangi efek insulin menurunkan preferensi rasa dari larutan yang mengandung glukosa berpasangan versus rasa yang terkait dengan pensinyalan insulin yang utuh. Memblokir insulin dalam cangkang NAc juga menurunkan konsumsi larutan berpasangan selama pengkondisian satu botol, sedangkan tiruan atau kontrol mikro-injeksi tidak berpengaruh pada konsumsi. Data ini menunjukkan bahwa insulin dalam cangkang NAc berperan dalam preferensi makanan. Studi sebelumnya telah menunjukkan bahwa pensinyalan DA yang utuh dalam NAc diperlukan untuk memperoleh pengkondisian rasa^{37, 38}, mengkonfirmasikan peran NAc DA dalam memediasi efek penguatan dari solusi nutrisi. Dalam hal ini, preferensi untuk larutan glukosa yang dipasangkan dengan ketersediaan insulin yang utuh berpendapat terhadap efek utama insulin pada serapan DA yang dimediasi DAT dalam cangkang NAc, karena hal ini diharapkan akan menurun [DA]_o dan karenanya mengurangi konsumsi rasa yang dipasangkan dengan kontrol. Hasil kami juga konsisten dengan yang dari penelitian sebelumnya di mana microinjection insulin dalam cangkang NAc meningkat saat hewan terlibat dalam pemberian sukrosa oral secara mandiri, dengan peningkatan konsumsi sukrosa di ambang batas.²⁶, yang berlawanan dengan konsekuensi yang diharapkan dari peningkatan penyerapan DA. Secara keseluruhan, data perilaku ini konsisten dengan pengaruh insulin yang diprediksi pada CHI striatal dan peningkatan pelepasan DA. Namun, hasil ini tidak mengecualikan keterlibatan elemen mikrosirkuitri striatal lainnya dalam perilaku yang dipantau, mengingat ekspresi InsR luas di seluruh striatum.^{1, 14}.

Studi yang dilaporkan di sini memberikan bukti pertama bahwa insulin berperan dalam mengkomunikasikan nilai kalori, dan oleh karena itu efek hadiah makan, yang memiliki implikasi penting untuk pengaruh insulin pada subjek kurus dan obesitas. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa efek pasca makan dari makanan, terlepas dari apakah jalur transduksi rasa masih utuh⁴⁷, meningkatkan pelepasan NAc DA dan penguatan perilaku yang positif^{37, 47}. Dengan demikian, respons insulin pasca-absorpsi dapat mengkodekan hasil glikemik makanan dan berkontribusi pada penguatan preferensi makanan dan perilaku yang memungkinkan konsumsi. Namun, perubahan ekstrem dalam sirkulasi kadar insulin dan sensitivitas InsR sentral dapat berperan dalam perilaku abnormal, serta adaptif. Sebagai contoh, hipoinsulinaemia dan upregulasi kompensasi sensitivitas InsR pada subjek FR bisa menjadi faktor dalam kecenderungan mereka untuk pesta minuman keras.⁴⁸. Sebaliknya, ketidakpekaan insulin sentral pada diabetes tipe II atau obesitas, tercermin di sini pada tikus OB, dapat berkontribusi pada berkurangnya rasa penghargaan setelah konsumsi, mendorong asupan makanan dengan indeks glikemik tinggi sebagai kompensasi.^{49, 50}. Oleh karena itu, baik peningkatan atau penurunan sensitivitas insulin striatal dapat berkontribusi pada makan patologis, sehingga makan pesta dan / atau obesitas.

Secara keseluruhan, temuan kami mengungkapkan peran baru untuk insulin sebagai sinyal hadiah. Peran seperti itu kontras dengan fungsinya yang dikenal sebagai sinyal kenyang, termasuk temuan baru-baru ini bahwa insulin yang disuntikkan ke dalam VTA dapat mengurangi pemberian makanan hedonis dan preferensi untuk isyarat yang terkait dengan hadiah makanan^{23, 24}. Hal ini menimbulkan pertanyaan tentang bagaimana peran insulin yang tampaknya berlawanan dalam fungsi-fungsi yang bergantung pada DA ini dapat direkonsiliasi. Jawabannya mungkin bahwa efek-efek ini bersifat komplementer, bukan kontradiktif. Hasil ini menunjukkan bahwa insulin dalam striatum mengkomunikasikan nilai hadiah dari makanan yang dikonsumsi. Peran ganda dalam menandakan rasa kenyang mungkin hanya memungkinkan insulin untuk melayani tujuan penting dari mengakhiri makan, sementara secara bersamaan membangun memori tentang gizi dan kualitasnya, sehingga memperkuat pengulangan perilaku menelan.

Penanganan hewan

Prosedur hewan sesuai dengan pedoman NIH dan disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Fakultas Kedokteran NYU. Semua hewan menggunakan 12 h cahaya: siklus gelap, dengan lampu menyala dari 06: 00 hingga 18: 00; ex vivo irisan disiapkan antara 08: 00 dan 12: 00. Studi mekanis pada tikus dan tikus AL dilakukan di ex vivo irisan dari hewan disimpan berpasangan, sedangkan tikus ditempatkan sendiri untuk semua perbandingan kelompok diet dan untuk studi perilaku.

Rejimen diet tikus

Tikus Sprague-Dawley jantan dewasa (Taconic) jantan berumur 8 – 10 pada awal rejimen diet yang berlangsung selama 21 – 30 hari. Tikus secara semi-acak ditugaskan ke kelompok diet: subyek diberi peringkat berdasarkan berat awal, kemudian masing-masing trio tikus berturut-turut didistribusikan secara acak di antara kelompok diet. Tikus AL memiliki akses gratis ke tikus chow untuk periode yang sama dengan tikus berpasangan pada diet FR atau OB. Semua tikus memiliki akses gratis ke air. Pembatasan makanan dilaksanakan seperti sebelumnya⁵¹; secara singkat, tikus menerima 40-50% dari asupan AL standar tikus chow setiap hari sampai berat badan berkurang sebesar 20%, setelah itu makanan dititrasi untuk mempertahankan berat badan ini. Tikus OB memiliki akses gratis ke tikus chow dan cokelat Pastikan, cairan yang sangat enak dengan lemak dan gula yang cukup tinggi⁵².

Otak depan Obrolan tikus KO

Tikus dengan alel flox yang kondisional Obrolan (Obrolan^flox) disilangkan dengan Nkx2.1^Cre garis transgenik untuk menghasilkan tikus di mana ablasi sintesis ACh terbatas pada otak depan³². Littermate transgenik non-mutan adalah kontrol; genotipe mereka Cre⁺;Obrolan^{flox / +} dan Cre^-;Obrolan^{flox / flox} disebut sebagai 'heterozigot'. Tikus jantan dewasa digunakan untuk penelitian irisan ad libitum akses ke chow dan air.

Ex vivo persiapan irisan dan solusi fisiologis

Tikus atau tikus dibius secara mendalam dengan 50 mg kg^-1 pentobarbital (intraperitoneal (ip)) dan dipenggal. Untuk voltammetri, irisan otak depan koronal (ketebalan 300-400-μm) dipotong pada mikrotom pisau bergetar Leica VT1200S (Leica Microsystems; Bannockburn, IL) dalam es dingin HEPES-buffered CSF buatan (aCSF) yang mengandung (dalam mM): NaCl (120); NaHCO₃ (20); glukosa (10); Asam HEPES (6.7); KCl (5); Garam natrium HEPES (3.3); CaCl₂ (2); dan MgSO₄ (2), diseimbangkan dengan 95% O₂/ 5% CO₂. Irisan kemudian dipertahankan dalam larutan ini pada suhu kamar selama 1 jam sebelum eksperimen^{30, 32, 53}. Untuk elektrofisiologi, setelah anestesi, tikus diperfusi secara transcardial dengan larutan dingin yang mengandung (dalam mM): sukrosa (225); KCl (2.5); CaCl₂ (0.5); MgCl₂ (7); NaHCO₃ (28); NaH₂PO₄ (1.25); glukosa (7); askorbat (1); dan piruvat (3), dan diseimbangkan dengan 95% O₂/ 5% CO₂. Irisan dipotong dalam solusi ini, kemudian dipindahkan ke ruang pemulihan di mengandung aCSF yang dimodifikasi (dalam mM): NaCl (125); KCl (2.5); NaH₂PO₄ (1.25); NaHCO₃ (25); MgCl₂(1); CaCl₂ (2); glukosa (25); askorbat (1); piruvat (3); dan myo-inositol (4), diseimbangkan dengan 95% O₂/ 5% CO₂; solusi ini awalnya pada 34 ° C, kemudian dibiarkan dingin secara bertahap hingga suhu kamar⁵⁴. Semua percobaan voltametri dan fisiologi dilakukan di ruang perekaman submersi pada 32 ° C yang superfusi pada 1.5 ml min^-1 dengan aCSF yang berisi (dalam mM): NaCl (124); KCl (3.7); NaHCO₃ (26); CaCl₂ (2.4); MgSO₄ (1.3); KH₂PO₄ (1.3); dan glukosa (10), dan albumin serum bovine (BSA, 0.05 – 0.1 mg ml^-1) disetimbangkan dengan 95% O₂/ 5% CO₂; irisan diizinkan untuk menyeimbangkan di lingkungan ini selama 30 menit sebelum eksperimen.

Voltammetri siklik cepat-scan

Studi rilis DA yang dilakukan dilakukan menggunakan FCV pada irisan otak^{32, 53} dibuat dari tikus jantan atau Obrolan tikus knockout otak depan dan kontrol heterozigot (5 – 8 minggu). Belajar di Obrolan tikus knockout dibutakan, tetapi kelompok diet tikus memiliki fenotipe yang jelas yang menghalangi menyilaukan. Pengukuran voltammetrik dilakukan dengan Millar Voltammeter (tersedia atas permintaan khusus untuk Dr Julian Miller di St Bartholomew's dan Fakultas Kedokteran dan Kedokteran Gigi Kerajaan London, University of London). Bentuk gelombang segitiga konvensional digunakan untuk FCV, dengan rentang pindaian −0.7 hingga + 1.3 V (dibandingkan Ag / AgCl), kecepatan pindai 800 V s^-1, dan interval pengambilan sampel 100 ms^{30, 32, 53}. Data diperoleh dengan menggunakan papan A / D DigiData 1200B yang dikendalikan oleh perangkat lunak Clampex 7.0 (Perangkat Molekuler). Pelepasan DA dibangkitkan menggunakan elektroda stimulasi konsentris; amplitudo pulsa stimulus adalah 0.4-0.6 mA dan durasinya adalah 100 μs^{30, 32, 53}. Stimulasi nadi tunggal lokal digunakan pada inti NAc dan CPu; namun, kereta pulsa frekuensi tinggi yang singkat (lima pulsa pada 100 Hz) digunakan untuk memperkuat [DA] yang ditimbulkan_o di shell NAc. Kedua paradigma stimulus membangkitkan rilis DA yang berpotensi aksi dan Ca²⁺ tergantung, tidak terpengaruh oleh glutamat dan GABA yang dirilis bersamaan^{42, 55}, dan difasilitasi oleh ACh yang dirilis bersamaan^{29, 30, 31, 32, 33, 34}. Untuk mengukur membangkitkan [DA]_o, elektroda dikalibrasi dengan konsentrasi DA yang diketahui pada 32 ° C setelah setiap percobaan dalam aCSF dan dengan adanya masing-masing obat yang digunakan selama percobaan yang diberikan⁵³.

Eksperimen voltametri untuk menilai efek insulin pada yang ditimbulkan [DA]_o diperoleh menggunakan salah satu dari dua protokol. Eksperimen awal untuk menentukan arah waktu efek insulin (Sigma, I5523) dilakukan dengan memantau [DA] yang ditimbulkan._o setiap 5 menit dalam satu situs. Insulin diaplikasikan setelah konsisten membangkitkan [DA]_o diperoleh (biasanya pengukuran 4 – 5); efek insulin maksimal setelah 50-60 min, dan kemudian membangkitkan [DA]_o tetap pada tingkat ini selama durasi percobaan (biasanya 90 min total paparan insulin; Fig. 1c). Selanjutnya, efek insulin dinilai dengan rekaman yang ditimbulkan [DA]_o di 4 – 5 situs terpisah dalam irisan (+ 1.5 mm dari bregma) di masing-masing dari tiga sub regional striatal di bawah kondisi kontrol (aCSF atau aCSF ditambah obat) dan lagi pada saat efek insulin maksimal (pengambilan sampel melalui 60-80 min), kemudian sampel-sampel ini dirata-rata untuk setiap sub regional. Efek insulin berkurang dengan waktu setelah persiapan irisan; untuk meminimalkan waktu ex vivo dan untuk mengoptimalkan penggunaan hewan, biasanya, dua irisan dari hewan yang diberikan diuji di ruang rekaman pada saat yang sama. Obat yang digunakan untuk menantang efek insulin diterapkan 15 min sebelum insulin melalui superfusi aCSF, termasuk HNMPA trisacetoxymethyl ester (HNMPA-AM_3; Enzo Life Sciences), S961 (Novo Nordisk), LY294002 (Sigma), picropodophyllotoxin (PPP; Tocris), mecamylamine (Tocris) dan DHβE (Tocris). Seperti yang dijelaskan dalam Hasil, kemungkinan sensitivitas yang berubah dari reseptor nikotinik ACh di antara kelompok diet diuji dengan membandingkan rasio puncak [DA]_o dibangkitkan oleh 5 p (100 Hz) dengan yang ditimbulkan oleh 1 p yang ditimbulkan (5 p: 1 p rasio)^{30, 31} dalam inti NAc di hadapan nikotin 0 – 500 nM (Sigma).

Penentuan V _max dari membangkitkan [DA]_o transien dalam irisan striatal

Untuk mengevaluasi perubahan yang diinduksi insulin pada serapan DA yang dimediasi DAT, bagian awal dari fase penurunan [DA] yang ditimbulkan_o kurva dipasang ke persamaan Michaelis-Menten untuk mengekstrak V_max (konstanta laju serapan maksimal)⁵⁶. K_m (yang berbanding terbalik dengan afinitas DAT untuk DA) ditetapkan pada 0.2 μM dan diketahui serupa di seluruh subregional striatal.⁵⁷ dan tidak terpengaruh oleh insulin (lihat Gambar Tambahan. 4 keterangan).

Rekaman sel utuh

Irisan otak dibuat dari tikus jantan berumur 29- hingga 35; kondisi rekaman identik dengan yang digunakan dalam studi rilis DA. Rekaman penjepit arus sel utuh menggunakan metode konvensional⁵⁴. Chri Striatal divisualisasikan menggunakan mikroskop Olympus BX51WI (Olympus America, Center Valley, PA) dengan optik kontras-gangguan-diferensial inframerah dan tujuan perendaman air × 40. Solusi pipet yang terkandung (dalam mM): K-gluconate (129); KCl (11); HEPES (10); MgCl₂ (2); EGTA (1); Na₂-ATP (2); Na₃-GTP (0.3); dan disesuaikan dengan pH 7.2 – 7.3 dengan KOH. Untuk neuron yang direkam akan dinilai untuk imunoreaktivitas ChAT, 0.3% biocytin dimasukkan dalam larutan pipet dan neuron yang direkam secara singkat (~ 5 min) untuk meminimalkan pengenceran isi intraseluler. Resistensi pipet adalah ~ 3 – 5 MΩ. Rekaman diperoleh dengan menggunakan penguat Axopatch 200B (Perangkat Molekul, Sunnyvale CA) dan low-pass filtered pada 2 kHz. ChI diidentifikasi dengan kriteria elektrofisiologi yang telah ditetapkan²⁸; sebagian besar aktif secara tonik, tetapi aktivitas berkurang secara bervariasi setelah ditambal. Namun, responsif terhadap injeksi saat ini umumnya kuat dan konsisten dari waktu ke waktu, dan karena itu digunakan untuk menyelidiki efek insulin pada rangsangan CHI (lihat Hasil). Dalam percobaan untuk menguji peran InsRs dan IGF-1Rs dalam respon ini, baik HNMPA atau PPP diterapkan untuk setidaknya 20 min sebelum ChI ditambal. Efek maksimal insulin saja diamati setelah ~ 16 min paparan, meskipun dalam beberapa sel, peningkatan tidak maksimal sampai 50 min atau lebih lama. Selain itu, dalam empat dari enam neuron yang dicatat dalam PPP, insulin menyebabkan penurunan awal jumlah lonjakan sebelum pulih ke dan melebihi jumlah lonjakan awal. Akibatnya, dalam semua percobaan, efek insulin dikuantifikasi dengan membandingkan efek maksimum pada jumlah lonjakan dengan jumlah lonjakan yang ditimbulkan segera sebelum aplikasi insulin. Perbedaan yang jelas dalam waktu untuk mencapai efek puncak dapat mencerminkan sejumlah faktor, termasuk kedalaman sel yang terekam dalam irisan. Potensi aksi yang timbul juga dicatat dalam CHI dengan tidak adanya insulin pada titik waktu yang sebanding.

Kromatografi cair kinerja tinggi

Kandungan DA dari irisan striatal tikus (ketebalan 400-μm) ditentukan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi dengan deteksi elektrokimia⁵⁸. Pasangan slice diseimbangkan untuk 30 min pada 32 ° C dalam aCSF, dan kemudian satu irisan per pasangan diinkubasi untuk 60 min tambahan di 32 ° C dalam aCSF sementara yang lain diinkubasi dalam aCSF dengan 10 atau 30 nM insulin. Untuk perbandingan kelompok diet, jaringan striatal dikumpulkan antara 30-60 min pasca pemulihan. Setelah inkubasi, kelebihan aCSF dihilangkan dengan hati-hati dari irisan, sampel jaringan striatal (7-10 mg) ditimbang, dibekukan di atas es kering dan kemudian disimpan pada saat kemudian disimpan di −80 ° C. Pada hari analisis, sampel disonikasi dalam es dingin, eluen, dideoksigenasi dengan argon⁵⁸, diputar dalam microcentrifuge selama 2 min, dan supernatan disuntikkan langsung ke kolom HPLC (BAS, West Lafayette, IN); detektor adalah elektroda karbon kaca di 0.7 V versus Ag / AgCl.

Imunohistokimia

Untuk pelabelan imunohistokimia, tikus dibius dengan natrium pentobarbital (50 mg kg^-1, ip), kemudian diperfusi secara transcardially dengan PBS (154 mM NaCl dalam buffer 10 mM fosfat, pH 7.2) diikuti oleh 4% paraformaldehyde dalam PBS ini; Otak dihilangkan dan bagian koronal (20 μm) dipotong dan diproses secara konvensional^{27, 59}. Gambar imunofluoresensi diperoleh dengan mikroskop confocal Nikon PM 800 yang dilengkapi dengan kamera digital yang dikendalikan oleh perangkat lunak Spot (Diagnostic Instruments Inc.) dan menggunakan tujuan × 100 (aperture numerik = 1.4) atau dengan mikroskop confocal Zeiss LSM 510 menggunakan mikroskop × 63 obyektif (bukaan numerik = 1.2). Laser adalah Argon (488 nm), He / Ne (543 nm) dan He / Ne (633 nm). Filter yang sesuai untuk setiap laser dipilih oleh perangkat lunak mikroskop confocal. Ukuran lubang jarum bervariasi dengan tujuan yang digunakan dan ketebalan bagian dipilih zgenerasi-tumpukan; kami memilih nilai lubang jarum optimal yang ditunjukkan oleh perangkat lunak (biasanya 30 μm). File digital dianalisis dengan perangkat lunak dekonvolusi (AutoQuant Imaging), dengan gambar akhir diproses menggunakan Adobe Photoshop 7.0. Semua gambar disesuaikan untuk kecerahan dan kontras; penyesuaian seperti itu dilakukan secara seragam ke semua bagian gambar. Akson DA striatal diidentifikasi menggunakan dua antibodi TH: poliklonal AB152 kelinci anti-TH (1: 800) dan monoklonal MAB318 mouse anti-TH (1: 500) (keduanya dari Chemicon). Tiga antibodi InsR digunakan: sc-57342 dan sc-09 (1: 100; Santa Cruz), dan PP5 (hadiah dari Pfizer). Kekhasan masing-masing telah ditunjukkan sebelumnya^{60, 61}, dan dikonfirmasi dalam penelitian ini dengan tidak adanya immunolabelling dengan antibodi sc-57342 atau PP5 di hadapan peptida pemblokiran yang sesuai. Antibodi ChAT adalah AB144 (1: 200; Millipore), dan biotin berasal dari Vector (1: 200). Antibodi sekunder yang digunakan adalah keledai anti-kelinci Alexa 488 (Invitrogen), atau keledai anti-kelinci Cy2 (Laboratorium Jackson, Bar Harbor, ME), keledai anti-kambing Cy3 (Jackson) dan keledai anti-tikus Cy5 (Jackson).

Untuk mengevaluasi co-lokalisasi InsRs di TH + akson, kami menggunakan metode yang dijelaskan sebelumnya untuk mengidentifikasi keberadaan Kir6.2, subunit pembentuk pori dari ATP-sensitif K⁺ saluran dalam akson DA²⁷. Puncta mewakili InsRs didistribusikan di seluruh gambar yang disesuaikan, menunjukkan bahwa superimposisi dengan imunoreaktivitas TH mungkin terjadi pada tingkat tertentu secara kebetulan. Untuk menguji asumsi ini, kami menghitung superimposisi InsR / TH di bidang independen 42 di tiga bagian immunolabelled NAc dari dua tikus. File-file digital InsR kemudian diputar 90 ° searah jarum jam dan penghitungan diulang; rotasi menurunkan jumlah puncta InsR yang co-localized dengan TH di sebagian besar bidang (lihat Hasil). Penurunan jumlah penambahan dengan rotasi²⁷ menunjukkan proporsi puncta InsR di setiap bidang striatal yang terkait dengan akson DA.

Glukosa darah dan insulin ELISA

Darah batang dikumpulkan pada saat pemenggalan kepala untuk studi irisan. Glukosa darah segera ditentukan dengan monitor glukosa darah standar. Untuk insulin, darah tambahan dikumpulkan dalam tabung yang mengandung EDTA dan disentrifugasi pada 1,500g untuk min 15; supernatan (plasma) dikumpulkan dan disimpan pada suhu −80 ° C hingga diproses dengan kit ELISA Rat Insulin ELPC.

Penempatan kanula dan verifikasi histologis

Empat puluh satu tikus jantan Sprague-Dawley (Taconic dan Charles River) jantan dewasa dengan berat 350 – 425 g dibius dengan ketamin (100 mg kg^-1, ip) dan xylazine (10 mg kg^-1, ip) dan diimplantasikan secara stereotoksik dengan dua kanula pemandu yang berada secara kronis (pengukur 26) yang ditempatkan secara bilateral 2.0 mm dorsal ke tempat infus di cangkang medial NAc⁶² (1.6 mm anterior ke bregma; 2.1 mm lateral dari sutura sagital, ujung miring 8 ° menuju garis tengah, 5.8 mm ventral ke permukaan tengkorak). Tikus diberi banamine (2.0 mg kg^-1, subkutan) sebagai analgesik pasca bedah setelah pemulihan dari anestesi dan keesokan paginya. Satu minggu setelah operasi, tikus ditempatkan pada FR (dijelaskan di atas) dan dipertahankan pada 80% dari berat pemulihan pasca-bedah selama sisa penelitian. Penempatan kanula ditentukan secara histologis setelah menyelesaikan pengujian perilaku. Setiap tikus dibunuh dengan CO₂, dipenggal dan otak diangkat dan difiksasi dalam 10% buffer formalin selama> 48 jam. Potongan koronal beku (ketebalan 40 μm) dipotong pada Reichert-Jung Cryostat, dicairkan dipasang pada slide kaca berlapis gelatin, dan diwarnai dengan cresyl violet. Data dari tikus tertentu digunakan hanya jika kedua kanula berada di dalam cangkang NAc medial⁶² (termasuk shell / core atau shell / olfactory tubercle border) (Gambar Tambahan. 5); berdasarkan kriteria ini, dua tikus dikeluarkan dari analisis akhir.

Pendinginan preferensi rasa

Tikus menerima satu malam (dalam kandang) dan enam sesi 30-min-per-hari pra-paparan (di ruang pengujian) untuk 0.2% sodium sakarin (Sigma) dalam air dengan interval 48-h antara sesi. Tikus kemudian menerima dua sesi paparan 5-min-per-hari untuk 0.2% natrium sakarin dalam 0.05% anggur tanpa pemanis atau cherry Kool-Aid (Kraft Foods) dalam air. Untuk sesi pra-paparan Kool-Aid pertama, setengah dari tikus menerima larutan rasa ceri, dan setengah lainnya menerima larutan rasa anggur. Rasa dibalik pada sesi pra-paparan Kool-Aid kedua untuk memastikan bahwa semua tikus mencicipi setiap rasa. Asupan diukur untuk semua sesi pra-paparan. Ruang pengujian adalah kandang plastik bening dengan tempat tidur segar. Untuk semua sesi pra-paparan, tikus memiliki akses ke solusi yang sama di kedua sisi ruangan. Kecuali untuk sesi pra-paparan semalam, semua sesi dilakukan di ruang prosedur perilaku, dengan periode pembiasaan 30-min sebelum pelatihan atau pengujian.

Pengondisian satu botol

Studi sebelumnya telah menunjukkan bahwa injeksi mikro InsAb ke dalam hipotalamus ventromedial dapat memblokir efek insulin pada perilaku makan dan sekresi glukagon.^{63, 64}. Di sini kami menggunakan pendekatan ini untuk menilai kemungkinan peran insulin dalam memperkuat pilihan makanan. Tikus secara semi-acak didasarkan pada volume asupan pra-paparan rata-rata menjadi dua kelompok, kontrol atau eksperimental (InsAb). Pada kelompok kontrol, tikus menerima kendaraan (microinjection PBS; 137 mM NaCl dan 2.7 mM KCl dalam buffer fosfat 10 mM) atau IgG (Abcam ab81032; 0.5 μg μl^-1 di PBS, seperti yang diterima) microinjection dalam cangkang NAc sebelum mengkonsumsi salah satu dari dua larutan rasa, dan microinjection tiruan sebelum mengonsumsi larutan rasa lainnya. Pada kelompok eksperimen, tikus menerima microinjection shell NAc dari InsAb (Abcam ab46707; 0.5 μl dari 1 μg μl^-1 di PBS, seperti yang diterima) sebelum terpapar ke satu larutan rasa, dan tiru microinjection paparan sebelumnya dengan yang lain. Dua set subjek dengan pergantian antara injeksi mikro cairan dan injeksi mikro tiruan digunakan, sehingga jumlah total injeksi mikro dibatasi hingga empat, sehingga meminimalkan kemungkinan kerusakan jaringan dan hilangnya sensitivitas di lokasi injeksi mikro.⁶⁵. Untuk injeksi mikro cairan, larutan kontrol atau InsAb dimasukkan ke dalam dua panjang 30-cm tabung PE-50 yang terpasang di satu ujung ke 5 μl Jarum suntik Hamilton diisi dengan air suling dan di ujung lainnya ke kanula jarum pengukur injektor 31, yang diperpanjang 2.0 mm di luar panduan yang ditanamkan. Volume infus 0.5 μl dikirim melalui 90 pada laju 0.005 μl s^-1; injektor dibiarkan di tempat untuk ~ 60 untuk memberikan waktu untuk difusi, kemudian injektor diganti dengan stylet.

Tikus dipindahkan langsung ke ruang perilaku dalam 2 menit penyelesaian mikroinjeksi atau tiruan mikroinjeksi. Solusi pengkondisian mengandung 0.2% natrium sakarin, 0.05% anggur tanpa pemanis atau cherry Kool-Aid, dan 0.8% glukosa. Akses solusi dibatasi hingga 30 menit per sesi. Rasa berpasangan dan sisi ruangan dengan akses minum secara semi-acak ditugaskan dan diimbangi pada masing-masing kelompok. Interval antara injeksi mikro setidaknya 72 jam, bergantian antara sesi infus dan tiruan untuk total delapan sesi pengkondisian.

Tes preferensi dua botol

Empat puluh delapan jam setelah sesi pengkondisian terakhir, tikus ditempatkan di ruang pengujian dengan akses simultan untuk kedua rasa pengkondisian; solusi adalah 0.2% natrium sakarin dalam 0.05% anggur atau cherry Kool-Aid, tanpa glukosa. Pengujian terjadi selama 2 hari (60 min per hari). Posisi tabung minum yang mengandung pasangan berpasangan atau berpasangan infus berganti-ganti untuk memastikan bahwa masing-masing tikus diuji untuk konsumsi masing-masing larutan di kedua sisi kandang. Asupan setiap larutan rasa rata-rata selama dua hari uji untuk menentukan preferensi.

[³H] Pengambilan DA pada sinaptosom striatal untuk menilai efikasi InsAb

Sinaptosom striatal^{21, 66} dibuat dari tikus AL (jantan, 350-400 g), dengan NAc (cangkang dan inti) dan CPu dibedah dan disiapkan secara terpisah. Jaringan dari masing-masing daerah dihomogenisasi dalam volume 15 dari larutan sukrosa 0.32 M sedingin es dalam homogenizer gelas dengan alu Teflon yang digerakkan oleh motor; setelah dibilas dan disentrifugasi, pelet akhir ditangguhkan kembali dalam sukrosa 0.32 M yang dingin^{21, 66}. Sebelum memulai [³H] uji serapan DA⁶⁶, alikuot sinaptosomal dalam volume total 180 μl dari serapan penyangga diinkubasi dalam pengocok selama 15 min pada 30 ° C di hadapan atau tidak adanya 30 nM insulin, di dalam kendaraan (PBS) atau di InsAb (pengenceran akhir 1: 500) , dalam IgG (pengenceran akhir 1: 500) atau dalam kendaraan. Penyerapan penyangga terkandung (dalam mM): NaCl (122); Na₂HPO₄ (3); NaH₂PO₄ (15); KCl (5); MgSO₄ (1.2); glukosa (10), CaCl₂ (1); nialamide (0.01); tropolone (0.1); dan asam askorbat (0.001), pH 7.4. Serapan [³H] DA dimulai dengan mengeluarkan 20 μl cepat dari setiap suspensi sinaptosomal ke dalam pelat sumur 96 dengan berbagai konsentrasi DA (0.003-1.0 μM) dan [³H] DA (5 nM); setelah 5 menit dalam plat-shaker pada 25 ° C, pengambilan dihentikan dengan dingin, filtrasi vakum cepat⁶⁶. Hitungan per sumur dikonversi menjadi pmol, kemudian dikoreksi menjadi mg total protein per menit. Semua tes dilakukan dalam rangkap tiga dan diulang setidaknya empat kali; V_max dan K_m dihitung menggunakan perangkat lunak Biosoft Kell Radlig (Cambridge, UK).

Analisis statistik

Data diberikan sebagai sarana ± sem; signifikansi dinilai menggunakan Siswa berpasangan atau tidak berpasangan t-tests atau ANOVA, kecuali dinyatakan sebaliknya. Untuk data voltametri, n adalah jumlah lokasi rekaman, mengingat bahwa variabilitas situs-ke-situs dalam subregional striatal lebih besar daripada variabilitas antar hewan atau antar-slice^{30, 32, 55, 56}; nomor hewan dicatat untuk setiap set data. Komisi Eropa₅₀ untuk efek insulin dan nikotin pada peak-evoked [DA]_o dihitung menggunakan Prism 6.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Untuk data elektrofisiologis, signifikansi statistik dinilai menggunakan pasangan tuji atau tes Wilcoxon di Prism 6.0, atau campuran dua arah ANOVA di SAS 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC). Untuk evaluasi keterlibatan insulin dalam pengkondisian preferensi rasa, dua studi lengkap diselesaikan dengan menggunakan protokol yang identik dengan pengecualian dari perawatan kendaraan yang digunakan. Dalam studi pertama, tikus 10 menerima infus kendaraan PBS dan 9 menerima infus InsAB. Dalam studi kedua, tikus 10 menerima infus kendaraan IgG dan 10 menerima infus InsAb. Tidak ada perbedaan yang signifikan antara kedua kelompok kendaraan (PBS atau IgG) selama sesi pengkondisian infus (F₁₉= 0.619, ANOVA dua arah campuran) dengan tindakan berulang pada sesi pengkondisian infus) atau saat pengujian (F₁₉= 0.012, ANOVA campuran dua arah dengan ukuran berulang-ulang untuk rasa). Akibatnya, dua percobaan digabungkan untuk analisis. Untuk analisis ini, campuran ANOVA 2 × 4 dicampur (dengan tindakan berulang pada hari pengkondisian infus) digunakan untuk menentukan efek dari perawatan injeksi mikro selama pengkondisian, diikuti oleh perlindungan t-menguji (satu ekor untuk menentukan di mana sesi pengkondisian pengobatan injeksi mikro menurunkan volume asupan). Analisis yang sama diselesaikan untuk sesi pengkondisian tiruan. Untuk menentukan efek perawatan pengkondisian selama tes preferensi rasa dua botol, data dianalisis menggunakan ANOVA dua arah campuran (dengan langkah-langkah berulang pada rasa), diikuti oleh perlindungan t-tests (satu ekor untuk menguji hipotesis bahwa InsAb akan mengurangi preferensi).

Cara mengutip artikel ini: Stouffer, MA et al. Insulin meningkatkan pelepasan dopamin striatal dengan mengaktifkan interneuron kolinergik dan dengan demikian menandakan penghargaan. Nat. Komunal. 6: 8543 doi: 10.1038 / ncomms9543 (2015).

1. Schulingkamp, ​​RJ, Pagano, TC, Hung, D. & Raffa, RB Reseptor insulin dan tindakan insulin di otak: tinjauan dan implikasi klinis. Neurosci. Biobehav. Wahyu 24, 855–872 (2000).
   • CAS
   • ISI
   • PubMed
   • Artikel
   • Tampilkan konteks
2. Gerozissis, K. Insulin otak, energi dan homeostasis glukosa; gen, lingkungan dan patologi metabolisme. Eur. J. Pharmacol. 585, 38 – 49 (2008).
3. CAS
4. PubMed
5. Artikel
6. Tampilkan konteks
7. CAS
8. PubMed
9. Artikel
10. Tampilkan konteks
11. CAS
12. PubMed
13. Artikel
14. Tampilkan konteks
15. CAS
16. PubMed
17. Artikel
18. Tampilkan konteks
19. CAS
20. ISI
21. PubMed
22. Artikel
23. Tampilkan konteks
24. ISI
25. PubMed
26. Artikel
27. Tampilkan konteks
28. CAS
29. PubMed
30. Artikel
31. Tampilkan konteks
32. Tampilkan konteks
33. CAS
34. ISI
35. PubMed
36. Artikel
37. Tampilkan konteks
38. CAS
39. ISI
40. PubMed
41. Artikel
42. Tampilkan konteks
43. CAS
44. ISI
45. PubMed
46. Tampilkan konteks
47. ISI
48. PubMed
49. Artikel
50. Tampilkan konteks
51. CAS
52. ISI
53. PubMed
54. Artikel
55. Tampilkan konteks
56. CAS
57. ISI
58. PubMed
59. Artikel
60. Tampilkan konteks
61. Tampilkan konteks
62. CAS
63. ISI
64. PubMed
65. Artikel
66. Tampilkan konteks
67. CAS
68. ISI
69. PubMed
70. Artikel
71. Tampilkan konteks
72. CAS
73. ISI
74. PubMed
75. Artikel
76. Tampilkan konteks
77. PubMed
78. Artikel
79. Tampilkan konteks
80. Tampilkan konteks
81. CAS
82. PubMed
83. Artikel
84. Tampilkan konteks
85. ISI
86. PubMed
87. Artikel
88. Tampilkan konteks
89. CAS
90. ISI
91. PubMed
92. Artikel
93. Tampilkan konteks
94. CAS
95. ISI
96. PubMed
97. Artikel
98. Tampilkan konteks
99. CAS
100. PubMed
101. Artikel
102. Tampilkan konteks
103. Tampilkan konteks
104. CAS
105. ISI
106. PubMed
107. Artikel
108. Tampilkan konteks
109. CAS
110. ISI
111. PubMed
112. Artikel
113. Tampilkan konteks
114. CAS
115. ISI
116. PubMed
117. Artikel
118. Tampilkan konteks
119. CAS
120. ISI
121. PubMed
122. Artikel
123. Tampilkan konteks
124. PubMed
125. Artikel
126. Tampilkan konteks
127. CAS
128. ISI
129. PubMed
130. Artikel
131. Tampilkan konteks
132. CAS
133. PubMed
134. Artikel
135. Tampilkan konteks
136. CAS
137. ISI
138. PubMed
139. Artikel
140. Tampilkan konteks
141. CAS
142. PubMed
143. Artikel
144. Tampilkan konteks
145. ISI
146. PubMed
147. Artikel
148. Tampilkan konteks
149. Tampilkan konteks
150. Tampilkan konteks
151. CAS
152. ISI
153. PubMed
154. Artikel
155. Tampilkan konteks
156. CAS
157. ISI
158. PubMed
159. Artikel
160. Tampilkan konteks
161. CAS
162. ISI
163. PubMed
164. Artikel
165. Tampilkan konteks
166. CAS
167. ISI
168. PubMed
169. Artikel
170. Tampilkan konteks
171. CAS
172. ISI
173. PubMed
174. Tampilkan konteks
175. CAS
176. ISI
177. PubMed
178. Artikel
179. Tampilkan konteks
180. PubMed
181. Artikel
182. Tampilkan konteks
183. CAS
184. ISI
185. PubMed
186. Artikel
187. Tampilkan konteks
188. CAS
189. ISI
190. PubMed
191. Artikel
192. Tampilkan konteks
193. CAS
194. ISI
195. PubMed
196. Artikel
197. Tampilkan konteks
198. CAS
199. ISI
200. PubMed
201. Artikel
202. Tampilkan konteks
203. Tampilkan konteks
204. CAS
205. ISI
206. PubMed
207. Tampilkan konteks
208. Tampilkan konteks
209. Tampilkan konteks
210. Tampilkan konteks
211. CAS
212. ISI
213. PubMed
214. Artikel
215. Tampilkan konteks
216. CAS
217. PubMed
218. Artikel
219. Tampilkan konteks
220. CAS
221. ISI
222. PubMed
223. Tampilkan konteks
224. Tampilkan konteks
225. CAS
226. PubMed
227. Artikel
228. Tampilkan konteks
229. ISI
230. PubMed
231. Artikel
232. Tampilkan konteks
233. Tampilkan konteks
234. ISI
235. PubMed
236. Artikel
237. Tampilkan konteks
238. Tampilkan konteks
239. CAS
240. ISI
241. PubMed
242. Artikel
243. Tampilkan konteks
244. Tampilkan konteks
245. Vogt, MC & Bruning, sinyal insulin JC CNS dalam kendali homeostasis energi dan metabolisme glukosa — dari embrio hingga usia tua. Tren Endocrinol. Metab. 24, 76–84 (2013).
246. Havrankova, J., Schmechel, D., Roth, J. & Brownstein, M. Identifikasi insulin di otak tikus. Proc. Natl Acad. Sci. USA 75, 5737–5741 (1978).
247. King, GL & Johnson, S. Transpor insulin yang dimediasi reseptor melintasi sel endotel. Sains 227, 1583–1586 (1985).
248. Strubbe, JH, Porte, D. Jr & Woods, SC Respon insulin dan kadar glukosa dalam plasma dan cairan serebrospinal selama puasa dan makan ulang pada tikus. Physiol. Berperilaku. 44, 205–208 (1988).
249. Banks, WA & Kastin, AJ Permeabilitas diferensial dari sawar darah-otak ke dua peptida pankreas: insulin dan amylin. Peptida 19, 883–889 (1998).
250. Banks, WA Sumber insulin otak. Eur. J. Pharmacol. 490, 5 – 12 (2004).
251. Nemoto, T. et al. Wawasan baru tentang sintesis insulin dan sekresi hippocampus dan korteks serebral tikus: amyloid-β1-42-menginduksi penurunan tingkat proinsulin melalui glikogen sintase kinase-3β. Sinyal Sel. 26, 253 – 259 (2014).
252. De Souza, CT et al. Konsumsi makanan kaya lemak mengaktifkan respons proinflamasi dan menginduksi resistensi insulin di hipotalamus. Endokrinologi 146, 4192 – 4199 (2005).
253. Anthony, K. et al. Atenuasi respon yang ditimbulkan insulin dalam jaringan otak yang mengendalikan nafsu makan dan penghargaan pada resistensi insulin: dasar otak untuk gangguan kontrol asupan makanan pada sindrom metabolik? Diabetes 55, 2986 – 2992 (2006).
254. Kelley, AE & Berridge, KC Ilmu saraf penghargaan alami: relevansi dengan obat-obatan adiktif. J. Neurosci. 22, 3306–3311 (2002).
255. Koob, GF & Volkow, ND Neurocircuitry dari kecanduan. Neuropsikofarmakologi 35, 217–238 (2010).
256. Werther, GA et al. Lokalisasi dan karakterisasi reseptor insulin di otak tikus dan kelenjar hipofisis menggunakan in vitro autoradiografi dan densitometri terkomputerisasi. Endokrinologi 121, 1562 – 1570 (1987).
257. Figlewicz, DP, Evans, SB, Murphy, J., Hoen, M. & Baskin, DG Ekspresi reseptor untuk insulin dan leptin di daerah tegmental ventral / substantia nigra (VTA / SN) tikus. Res otak. 964, 107–115 (2003).
258. Daws, LC et al. Pensinyalan dan kecanduan insulin. Neurofarmakologi 61, 1123 – 1128 (2011).
259. Figlewicz, DP & Sipols, sinyal regulasi Energi AJ dan hadiah makanan. Pharmacol. Biochem. Berperilaku. 97, 15–24 (2010).
260. Patterson, TA et al. Kurang makanan mengurangi mRNA dan aktivitas transporter tikus dopamin. Neuroendokrinologi 68, 11 – 20 (1998).
261. Carvelli, L. et al. PI 3-kinase regulasi penyerapan dopamin. J. Neurochem. 81, 859 – 869 (2002).
262. Williams, JM et al. Hipoinsulinemia mengatur transpor dopamin terbalik yang diinduksi amfetamin. PLoS Biol. 5, e274 (2007).
263. Zhen, J., Reith, MEA & Carr, KD Pembatasan makanan kronis dan fungsi transporter dopamin di striatum tikus. Res otak. 1082, 98–101 (2006).
264. Schoffelmeer, AN et al. Insulin memodulasi fungsi transporter monoamine peka-kokain dan perilaku impulsif. J. Neurosci. 31, 1284 – 1291 (2011).
265. Mebel, DM, Wong, JC, Dong, YJ & Borgland, SL Insulin di area ventral tegmental mengurangi pemberian makan hedonik dan menekan konsentrasi dopamin melalui peningkatan pengambilan kembali. Eur. J. Neurosci. 36, 2336–2346 (2012).
266. Labouebe, G. et al. Insulin menginduksi depresi jangka panjang neuron dopamin area ventral tegmental melalui endocannabinoid. Nat. Neurosci. 16, 300 – 308 (2013).
267. Konner, AC et al. Peran pensinyalan insulin dalam neuron katekolaminergik dalam mengendalikan homeostasis energi. Metab sel. 13, 720 – 728 (2011).
268. Figlewicz, DP, Bennett, JL, Aliakbari, S., Zavosh, A. & Sipols, AJ Insulin bekerja di situs CNS yang berbeda untuk mengurangi asupan sukrosa akut dan pemberian sukrosa sendiri pada tikus. Saya. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 295, R388 – R394 (2008).
269. Patel, JC, Witkovsky, P., Coetzee, WA & Rice, ME Regulasi sub-detik pelepasan dopamin striatal oleh K pra-sinaptik_ATP saluran. J. Neurochem. 118, 721 – 736 (2011).
270. Tepper, JM & Bolam, JP Keragaman fungsional dan spesifisitas interneuron neostriatal. Curr. Opin. Neurobiol. 14, 685–692 (2004).
271. Zhou, FM, Liang, Y. & Dani, JA Aktivitas kolinergik nikotinik endogen mengatur pelepasan dopamin di striatum. Nat. Neurosci. 4, 1224–1229 (2001).
272. Rice, ME & Cragg, SJ Nicotine memperkuat sinyal dopamin yang berhubungan dengan penghargaan di striatum. Nat. Neurosci. 7, 583–584 (2004).
273. Zhang, H. & Sulzer, D. Modulasi pelepasan dopamin yang bergantung pada frekuensi oleh nikotin. Nat. Neurosci. 7, 581–582 (2004).
274. Patel, JC, Rossignol, E., Rice, ME & Machold, RP Menentang regulasi pelepasan dopamin striatal dan perilaku motorik eksplorasi oleh input kolinergik otak depan dan batang otak. Nat. Komun. 3, 1172 (2012).
275. Threlfell, S. et al. Pelepasan dopamin striatal dipicu oleh aktivitas sinkron dalam interneuron kolinergik. Neuron 75, 58 – 64 (2012).
276. Cachope, R. et al. Aktivasi selektif dari interneuron kolinergik meningkatkan pelepasan dopamin fasik akumbal: mengatur nada untuk pemrosesan hadiah. Rep. 2, 1 – 9 (2012).
277. Jones, IW, Bolam, JP & Wonnacott, S. Lokalisasi presinaptik dari reseptor asetilkolin nikotinat reseptor beta2 subunit imunoreaktivitas dalam neuron dopaminergik nigrostriatal tikus. J. Comp. Neurol. 439, 235–247 (2001).
278. Higley, MJ et al. Interneuron kolinergik memediasi transmisi glutamatergik yang bergantung pada VGluT3 dalam striatum. PLoS ONE 6, e19155 (2011).
279. Touzani, K., Bodnar, R. & Sclafani, A. Aktivasi reseptor seperti dopamin D1 dalam nukleus accumbens sangat penting untuk perolehan, tetapi bukan ekspresi, preferensi rasa yang dikondisikan nutrisi pada tikus. Eur. J. Neurosci. 27, 1525–1533 (2008).
280. Sclafani, A., Touzani, K. & Bodnar, RJ Dopamine dan mempelajari preferensi makanan. Physiol. Berperilaku. 104, 64–68 (2011).
281. Mayer, CM & Belsham, DD Sinyal insulin sentral dilemahkan oleh paparan insulin jangka panjang melalui fosforilasi serine substrat reseptor insulin-1, degradasi proteasomal, dan degradasi reseptor insulin lisosom. Endokrinologi 151, 75–84 (2010).
282. Beras, ME, Patel, JC & Cragg, SJ Dopamin rilis di basal ganglia. Neuroscience 198, 112–137 (2011).
283. Smith, Y., Surmeier, DJ, Redgrave, P. & Kimura, kontribusi M. Thalamic untuk peralihan perilaku dan penguatan terkait ganglia basal. J. Neurosci. 31, 16102–16106 (2011).
284. Threlfell, S. et al. Reseptor muskarinik striatal meningkatkan ketergantungan aktivitas penularan dopamin melalui subtipe reseptor yang berbeda pada interneuron kolinergik dalam ventri dibandingkan striatum punggung. J. Neurosci. 30, 3398 – 3408 (2010).
285. Hoebel, BG, Avena, NM & Rada, P. Accumbens keseimbangan dopamin-asetilkolin dalam pendekatan dan penghindaran. Curr. Opin. Pharmacol. 7, 617–627 (2007).
286. Pothos, EN, Creese, I. & Hoebel, BG Makan yang dibatasi dengan penurunan berat badan secara selektif menurunkan dopamin ekstraseluler di nukleus accumbens dan mengubah respons dopamin terhadap amfetamin, morfin, dan asupan makanan. J. Neurosci. 15, 6640–6650 (1995).
287. Geiger, BM et al. Defisit neurotransmisi dopamin mesolimbik pada obesitas diet tikus. Neuroscience 159, 1193 – 1199 (2009).
288. Morris, JK et al. Resistensi insulin merusak fungsi dopamin nigrostriatal. Exp. Neurol. 231, 171 – 180 (2011).
289. De Araujo, IE et al. Hadiah makanan tanpa adanya sinyal reseptor rasa. Neuron 57, 930 – 941 (2008).
290. Stice, E., Spoor, S., Bohon, C. & Small, DM Hubungan antara obesitas dan respon striatal tumpul terhadap makanan dimoderasi oleh alel TaqIA A1. Sains 322, 449–452 (2008).
291. Wang, GJ et al. Dopamin otak dan obesitas. Lancet 357, 354 – 357 (2001).
292. Johnson, PM & Kenny, PJ Dopamine D2 reseptor di disfungsi hadiah seperti kecanduan dan makan kompulsif pada tikus gemuk. Nat. Neurosci. 13, 635–641 (2010).
293. Carr, KD, Kim, G.-Y. & Cabeza de Vaca, S. Efek pengaktifan dan pengaktifan lokomotor dari agonis reseptor dopamin langsung ditambah dengan pembatasan makanan kronis pada tikus. Psikofarmakologi (Berl.) 154, 420–428 (2001).
294. Levin, BE & Keesey, RE Pertahanan terhadap titik setel berat badan yang berbeda pada tikus yang obesitas dan resisten yang diinduksi diet. Saya. J. Physiol. 274, R412 – R419 (1998).
295. Patel, JC & Rice, ME Memantau pelepasan dopamin aksonal dan somatodendritik menggunakan voltametri siklik pemindaian cepat pada irisan otak. Metode Mol. Biol. 96, 243–273 (2013).
296. Lee, CR, Witkovsky, P. & Rice, ME Peraturan aktivitas neuron substansia nigra pars reticulata GABAergic oleh H₂O₂ melalui saluran sensitif asam flufenamat dan K_ATP saluran. Depan. Syst. Neurosci. 5, 14 (2011).
297. Chen, BT, Moran, KA, Avshalumov, MV & Rice, ME Peraturan terbatas pelepasan dopamin somatodendritik oleh Ca yang sensitif terhadap tegangan²⁺ saluran kontras dengan regulasi kuat pelepasan dopamin aksonal. J. Neurochem. 96, 645 – 655 (2006).
298. Li, X. et al. Peningkatan transmisi dopamin striatal dan kinerja motorik dengan overekspresi LRRK2 pada tikus dieliminasi oleh mutasi penyakit famili Parkinson G2019S. J. Neurosci. 30, 1788 – 1797 (2010).
299. Wu, Q., Reith, MEA, Wightman, RM, Kawagoe, KT & Garris, PA Penentuan parameter pelepasan dan serapan dari dinamika dopamin yang dibangkitkan secara elektrik yang diukur dengan voltametri waktu-nyata. J. Neurosci. Metode 112, 119–133 (2001).
300. Chen, BT, Avshalumov, MV & Rice, ME H₂O₂ adalah novel, modulator endogen dari pelepasan dopamin sinaptik. J. Neurophysiol. 85, 2468 – 2476 (2001).
301. Witkovsky, P., Patel, JC, Lee, CR & Rice, ME Identifikasi imunositokimia protein yang terlibat dalam pelepasan dopamin dari kompartemen somatodendritik neuron dopaminergik nigral. Neuroscience 164, 488-496 (2009).
302. Sugimoto, K. et al. Reseptor insulin pada saraf tepi tikus: lokasinya dan alternatifnya adalah isoform. Diabetes Metab. Res. Pdt. 16, 354 – 363 (2000).
303. Sanchez-Alavez, M. et al. Insulin menyebabkan hipertermia melalui penghambatan langsung neuron sensitif-hangat. Diabetes 59, 43 – 50 (2010).
304. Paxinos, G. & Watson, C. Otak Tikus di Koordinat Stereotaxic 6th edn Academic (2007).
305. Strubbe, JH & Mein, CG Peningkatan makan sebagai respons terhadap injeksi bilateral antibodi insulin di VMH. Physiol Behav. 19, 309–313 (1977).
306. Paranjape, SA et al. Pengaruh insulin dalam hipotalamus ventromedial pada sekresi glukagon pankreas in vivo. Diabetes 59, 1521 – 1527 (2010).
307. Wise, RA & Hoffman, DC Lokalisasi mekanisme penghargaan obat dengan suntikan intrakranial. Sinaps 10, 247-263 (1992).
308. Zhen, J., Maiti, S., Chen, N., Dutta, AK & Reith, MEA Interaksi antara analog hidroksipiperidin 4- (2-benzhydryloxy-ethyl) -1- (4-fluorobenzyl) piperidine dan aspartate 68 in pengangkut dopamin manusia. Eur. J. Pharmacol. 506, 17–26 (2004).

Unduh referensi

Studi-studi ini didukung oleh hibah NIH DA033811 (MER, KDC dan MEAR), NS036362 (MER), DA03956 (KDC) dan NARSAD Independent Investigator Award (KDC). S961 adalah hadiah murah hati dari Dr Lauge Schaffer, Novo Nordisk. Antibodi PP5 adalah hadiah murah hati dari Pfizer. Kami berterima kasih kepada Dr Charles Nicholson, NYU School of Medicine untuk mengekstrak perangkat lunak V_max nilai dari data FCV.