Front Endocrinol (Lausanne). 2017; 8: 216.
Diterbitkan secara online 2017 Agustus 29. doi: 10.3389 / fendo.2017.00216
PMCID: PMC5581815
Julie Paradis,1 Pierre Boureau,1 Thomas Moyon,1 Sophie Nicklaus,2 Patricia Parnet,1,*† dan Vincent Paillé1,*†
Abstrak
Konsumsi makanan padat energi ibu perinatal meningkatkan risiko obesitas pada anak-anak. Hal ini terkait dengan konsumsi makanan enak yang dikonsumsi berlebihan untuk properti hedonisnya. Mekanisme yang mendasari yang menghubungkan diet ibu perinatal dan preferensi keturunan untuk lemak masih kurang dipahami. Dalam penelitian ini, kami bertujuan untuk mempelajari pengaruh pemberian makan ibu tinggi lemak / tinggi gula [diet barat (WD)] selama kehamilan dan menyusui pada jalur hadiah yang mengendalikan pemberian makan pada tikus mulai dari kelahiran hingga kematangan seksual. Kami melakukan tindak lanjut longitudinal WD dan Kontrol keturunan pada tiga periode waktu kritis (masa kanak-kanak, remaja, dan dewasa) dan fokus pada penyelidikan pengaruh paparan perinatal terhadap diet yang enak pada (i) preferensi lemak, (ii) profil ekspresi gen , dan (iii) perubahan neuroanatomis / arsitektur dari jaringan dopaminergik mesolimbik. Kami menunjukkan bahwa pemberian makan WD terbatas pada periode perinatal memiliki pengaruh jangka panjang yang jelas pada organisasi sirkuit otak homeostatik dan hedonis tetapi tidak pada preferensi lemak. Kami menunjukkan periode tertentu evolusi preferensi untuk lemak yang kami berkorelasi dengan tanda tangan molekul otak tertentu. Dalam keturunan dari WD yang memberi makan bendungan, kami mengamati selama masa kanak-kanak keberadaan preferensi lemak yang terkait dengan ekspresi gen kunci yang lebih tinggi yang terlibat dalam sistem dopamin (DA); pada masa remaja, preferensi berlemak tinggi untuk kedua kelompok, semakin berkurang selama tes hari 3 untuk kelompok WD dan terkait dengan berkurangnya ekspresi gen kunci yang terlibat dalam sistem DA untuk kelompok WD yang dapat menyarankan mekanisme kompensasi untuk melindungi mereka dari paparan lemak tinggi lebih lanjut; dan akhirnya pada usia dewasa, preferensi untuk lemak yang identik dengan mengendalikan tikus tetapi terkait dengan modifikasi mendalam pada gen kunci yang terlibat dalam jaringan asam am-aminobutyric, reseptor serotonin, dan remodeling asam polisialat-NCAM yang bergantung pada hipotalamus. Secara keseluruhan, data ini mengungkapkan bahwa WD ibu, terbatas pada periode perinatal, tidak memiliki dampak berkelanjutan pada homeostasis energi dan preferensi lemak di kemudian hari meskipun remodeling yang kuat dari jalur homeostatis hipotalamus dan jalur hadiah yang terlibat dalam perilaku makan terjadi. Eksperimen fungsional lebih lanjut diperlukan untuk memahami relevansi remodeling sirkuit ini.
Pengantar
Lingkungan dan peristiwa kehidupan awal sekarang dikenal dengan baik untuk berkontribusi pada kesehatan dan kecenderungan penyakit di kemudian hari (1-3). Konsep pencetakan metabolik telah diusulkan untuk menggambarkan bagaimana perubahan dalam lingkungan nutrisi dan hormonal selama periode perinatal dapat mempengaruhi anak untuk obesitas dan patologi terkaitnya di kemudian hari. Masalah signifikan dari cara hidup barat kita adalah kelebihan gizi sebagai konsekuensi dari konsumsi makanan padat energi. Memang, individu yang terpapar asupan makanan jenis ini pada ibu memiliki risiko lebih tinggi untuk mengalami obesitas dan sindrom metabolik (4, 5). Banyak penelitian telah menunjukkan bahwa diet tinggi lemak ibu (HFD) melalui kehamilan dan menyusui memiliki efek jangka panjang pada metabolisme keturunan (6-8). Selain jalur yang terlibat dalam regulasi metabolisme, sistem penghargaan otak juga memainkan peran penting dalam perilaku makan (9, 10). Neurotransmisi mesolimbik dopamin (DA), dipelajari secara intensif dalam konteks hadiah dan kecanduan, diubah dalam obesitas yang disebabkan oleh diet pada kedua manusia (11-13) dan binatang (14-16). Proyeksi DA berkembang, sebagian besar, pascakelahiran (17), dan karena itu perkembangannya mungkin dipengaruhi oleh diet awal. Selama beberapa tahun terakhir, percobaan pada tikus membuktikan bahwa asupan HFD ibu meningkatkan pemberian makan hedonis pada anak (18, 19). Meskipun pengamatan ini melibatkan beberapa perubahan dalam fungsi sistem DA (20-22), data terbatas tersedia mengenai ontogeni dan remodeling jalur hadiah selama awal kehidupan (21). Terlebih lagi apakah dan bagaimana bagian pensinyalan non-DA dari sistem penghargaan seperti sistem GABA (asam am-aminobutirat) dapat dipengaruhi oleh tekanan nutrisi perinatal tidak didokumentasikan. Memang, neuron GABA tampaknya memainkan peran kunci dalam penghargaan dan keengganan. Ventral tegmental area (VTA) Neuron GABA menerima pola input yang serupa dari area otak yang berbeda (23), dan studi perilaku berbasis optogenetik baru-baru ini menyoroti peran utama VTA GABA dalam penolakan tempat terkondisi (24) dan dalam perilaku penyempurnaan hadiah (25). Nucleus accumbens (NAc) terutama didasari oleh proyeksi neuron berduri medium GABAergic dan bertindak sebagai antarmuka limbik-motor yang mengintegrasikan sinyal yang timbul dari sistem limbik dan mengubahnya menjadi aksi melalui output ke ventral pallidum (VP) dan efektor motor lain (26). Dan akhirnya, hipotalamus yang didasari oleh banyak koneksi GABA di LH (27) dan nukleus nukleus, mengintegrasikan sinyal rasa lapar dan kenyang (10).
Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi pengaruh asupan makanan ibu barat (WD) pada anak tikus dari lahir hingga kematangan seksual (i) pada preferensi lemak (ii) pada profil ekspresi gen dari sistem DA, sistem GABAergik dan plastisitas hipotalamus , dan (iii) pada perubahan neuroanatomis / arsitektur dari jaringan dopaminergik mesolimbik untuk periode yang sama. Oleh karena itu kami menilai, pada studi longitudinal (dari menyapih, P25, hingga kematangan seksual, P45 dan dewasa, P95), efek WD ibu pada pertumbuhan berat badan dan perkembangan jaringan adiposa dari keturunan disimpan di bawah chow biasa setelah penyapihan. Bersamaan dengan itu, kami melakukan tes preferensi lemak diikuti oleh analisis transkriptomik khusus dan analisis komponen utama berikutnya (PCA) dari seleksi penanda untuk asupan makanan, pilihan dan sistem regulasi motivasi. Hasil kami secara signifikan memperkaya hasil terbaru yang berfokus pada pemrograman nutrisi dari sistem DA.
Bahan dan Metode
Pernyataan etika
Semua percobaan dilakukan sesuai dengan pedoman komite kesejahteraan hewan lokal, UE (arahan 2010 / 63 / EU), Institut National de la Recherche Agronomique (Paris, Prancis), dan Departemen Kedokteran Hewan Prancis (A44276). Protokol eksperimental telah disetujui oleh komite etik kelembagaan dan terdaftar di bawah referensi APAFIS 8666. Setiap tindakan pencegahan dilakukan untuk meminimalkan stres dan jumlah hewan yang digunakan dalam setiap rangkaian percobaan.
Hewan dan Diet
Hewan dipelihara dalam siklus 12 h / 12 h terang / gelap dalam 22 ± 2 ° C dengan makanan dan air ad libitum. Tiga puluh dua betina tikus Sprague-Dawley (berat badan: 240 – 290 g) pada hari kehamilan 1 (G1) dibeli langsung dari Janvier (Le Genest Saint Isle, Prancis). Mereka ditempatkan secara individual dan diberi makan diet kontrol (CD) (5% lemak sapi dan 0% sukrosa) untuk 16 mereka atau WD (21% lemak sapi dan 30% sukrosa) untuk 16 dari mereka selama masa kehamilan dan menyusui. (lihat Tabel Tabel1: 1: komposisi diet dalam persen kkal dari ABdiet Woerden, Belanda). Saat lahir, ukuran litter disesuaikan menjadi delapan anak anjing per litter dengan rasio 1: 1 jantan dan betina. Kami menjauhkan 12 dari bendungan 16 dengan sampah yang terdiri dari pejantan 4 dan betina 4 untuk masing-masing kelompok. Pada penyapihan (P21), keturunan yang lahir dari CD dan WD dam disimpan di chow standar sampai akhir percobaan (Gambar (Angka 1A, B) .1A, B). Berat badan pup dicatat saat lahir dan sesudahnya setiap hari di 10: 00 pagi sampai P21 (menyapih). Setelah menyapih dan sampai akhir percobaan, tikus diberi bobot setiap 3 hari. Kami menyajikan data hanya untuk anak laki-laki. Tikus betina digunakan untuk penelitian lain (Gambar (Gambar 11).
Behavior (Tes Pilihan Dua Botol)
Tiga periode perkembangan kritis dipelajari (P21 ke P25: remaja, P41 ke P45: remaja dan P91 ke P95: dewasa muda). 24 anak anjing jantan (n = 12 per kelompok) dipilih secara acak dan ditempatkan di kandang individu untuk melakukan tes bebas pilihan dua botol (Gambar (Angka 1A, B) 1A, B) (28-30). Tes ini digunakan untuk secara khusus mempelajari daya tarik terhadap rasa lemak dengan memisahkannya dari rasa manis dan sebanyak mungkin dari efek metabolisme dari asupan kalori. Memang, 1% konsumsi larutan minyak jagung dikaitkan dengan asupan 0.09 kkal / ml saja. Setelah satu hari pembiasaan dengan kehadiran dua botol, tes dilakukan selama 2 hari di P25 dan lebih dari 4 hari di P41 dan P91 (Gambar (Figure1A) .1SEBUAH). Secara rinci, saat menyapih (P21), 24 pups ditempatkan secara individual selama 2 hari (Gambar (Figure1A): 1A): hari 1, fase pembiasaan, hari 2, tikus diberi pilihan dua botol gratis antara emulsi 1% minyak jagung dalam 0.3% karet xanthan (Sigma Aldrich, St. Quentin Fallavier, Prancis) dan larutan getah xanthan ( 0.3%). Di P41 dan P91, 24 pups digunakan dan pilihan bebas dua botol diusulkan selama tiga hari berturut-turut. Konsumsi larutan xanthan gum dan larutan rasa (minyak jagung 1%) dicatat setiap hari di 11: 00 pagi selama 3 hari (P45 dan P95). Posisi kedua botol itu dibalik setiap hari untuk mencegah bias preferensi posisi. Skor preferensi lemak dihitung sebagai rasio volume "solusi lemak" yang dikonsumsi dengan total volume yang dikonsumsi dalam 24 h. Semua tikus dipelihara dengan diet chow standar selama tes perilaku.
Pengumpulan Jaringan dan Pengambilan Sampel Darah
Sehari setelah hari terakhir dari tes pilihan bebas dua botol, setengah dari tikus (n = 6 per kelompok) dengan cepat disuntik mati antara pukul 09:00 dan 12:00 oleh CO2 inhalasi. Darah dikumpulkan dalam tabung dengan EDTA (Laboratoires Léo SA, St Quentin en Yvelines, Prancis) dan disentrifugasi pada 2,500 g untuk 15 min pada 4 ° C. Plasma dibekukan pada −20 ° C. Organ-organ dan depot lemak individu retroperitoneal dibedah dan ditimbang. Otak dengan cepat diangkat dan ditempatkan dalam matriks otak (WPI, Sarasota, FL, USA tikus 300-600 g). Pertama hipotalamus dibedah [menurut koordinat atlas Paxinos: −1.0 ke −4.5 mm dari Bregma (31)] kemudian, untuk masing-masing tikus, dua irisan koron dengan ketebalan 2 mm pada tingkat NAc dan yang lain pada tingkat VTA diperoleh. Sampel dari kanan dan kiri NAc dan kanan dan kiri VTA (total empat sampel per hewan) dengan cepat diperoleh dengan menggunakan dua pukulan biopsi yang berbeda (Laboratorium Stiefel, Nanterre, Prancis) (diameter 4 mm untuk NAc dan 3 mm) untuk otak tengah ventral). Sampel diambil beku dalam nitrogen cair dan disimpan pada −80 ° C untuk penentuan ekspresi gen selanjutnya oleh TaqMan low-density array (TLDA).
Tikus lainnya (n = 6 per kelompok) dibius dalam dengan pentobarbital (150 mg / kg ip) dan perfusi dengan perfusi saline fisiologis transkardial diikuti dengan paraformaldehida 4% dingin dalam buffer fosfat (PB), pH 7.4. Otak dibuang dengan cepat, direndam dalam fiksatif yang sama selama 1 jam pada suhu 4 ° C, dan akhirnya disimpan dalam sukrosa PB 25% selama 24-48 jam. Otak kemudian dibekukan dalam isopentan pada suhu -60 ° C, dan akhirnya disimpan pada suhu -80 ° C sampai digunakan. NAc, hipotalamus dan VTA dipotong menjadi 20 µm bagian koronal serial dengan cryostat (Microm, Microtech, Francheville, Prancis). Dua atau tiga rangkaian 10 slide kaca yang berisi 4-6 bagian dilakukan untuk setiap area otak. Untuk setiap kaca geser, bagian serial diberi jarak 200 µm (Gambar (Gambar 66).
Analisis Plasma Biokimia
Plasma EDTA yang dikumpulkan pada tikus P25, P45, dan P95 digunakan untuk mengukur glukosa plasma, NEFA (asam lemak non-esterifikasi), insulin, dan leptin. Glukosa dan NEFA diukur menggunakan reaksi enzimatik kolorimetri dengan kit spesifik (kit glukosa dan NEFA PAP 150, BioMérieux, Marcy-l'Etoile, Prancis). Hormon diuji dengan kit ELISA spesifik mengikuti instruksi pabrik untuk insulin dan leptin (kit ELISA insulin tikus / tikus, kit ELISA leptin tikus, Linco Research, St. Charles, MO, USA).
Imunohistokimia
Kaca slide yang mengandung bagian serial VTA dan NAc pertama kali diblokir untuk 3-4 jam dan kemudian diinkubasi semalaman di 4 ° C dengan campuran antibodi berikut: anti-NeuN tikus (1: 500; IgM; Millipore Bioscience Research Reagents, Merk, AS) dan kelinci anti-TH (1: 1,000; Reagen Penelitian Millipore Bioscience, Merk, USA). Setelah inkubasi dengan antibodi primer dan pencucian berikutnya dengan PB, bagian diinkubasi dalam campuran antibodi sekunder: Alexa 488 konjugasi keledai anti-tikus IgM dan IgG konjugasi keledai anti-kelinci IgG 568 terkonjugasi (1: 500; Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham , MA, USA) untuk 2 h. Bagian dipasang di superfrost plus slide emas (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA), dikeringkan dengan udara, dan ditutup dengan reagen antifade Emas ProLong ™ Emas (Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA).
Neuron TH Menghitung dalam VTA
Untuk setiap tikus, sel TH-positif dihitung seperti yang dijelaskan sebelumnya (32) pada tiga tingkat rostrocaudal yang berbeda dari VTA: pada tingkat keluarnya saraf ketiga (jarak relatif terhadap Bregma: −5.3 mm), 200 µm rostral dan 200 µm caudal ke level ini (Gambar (Angka 6A) .6SEBUAH). Untuk sisi kiri dan kanan, gambar digital yang terdiri dari seluruh VTA dari saluran terminal aksesori secara medial ke batas lateral mesencephalon diperoleh dengan menggunakan pembesaran × 40 dari pemindai slide Digital-XR NanoZoomer-XR C12000 (Hamamatsu, Jepang). Garis ditarik di sekeliling VTA untuk setiap bagian. Batas dipilih dengan memeriksa bentuk sel dan mengacu pada atlas Paxinos dan Watson. Neuron dopaminergik didefinisikan sebagai tubuh sel imunoreaktif NeuN (+) / TH (+) dengan nukleus yang terlihat jelas. Menggunakan perangkat lunak NIH Image J (plugin penghitung sel), sel-sel NeuN (+) / TH (+) dihitung oleh dua orang yang berbeda tanpa pengetahuan kelompok hewan. Kesalahan penghitungan sel terpisah dikoreksi menggunakan rumus Abercrombie (32), dimana N = n[t/(t + d)] (N = jumlah total sel; n = jumlah sel yang dihitung; t = ketebalan bagian; dan d = diameter sel), dan faktor koreksi ini adalah 0.65. Data dinyatakan sebagai mean [NeuN (+) / TH (+) di kiri dan kanan VTA] ± SEM.
TH Fiber Density dalam NAc
Kandungan protein TH dalam terminal saraf dopaminergik NAc diperkirakan dengan analisis densitometrik anatomi dari bagian imunolabel TH. Densitas serat TH dikuantifikasi pada tiga level acak sepanjang sumbu rostrocaudal dari NAc (Bregma 2.20, 1.70, dan 1.20 mm) (Gambar (Figure6B) .6B). Secara singkat, gambar digital yang terdiri dari seluruh striatum dan NAc yang diperoleh menggunakan pembesaran × 40 dari pemindai slide NanoZoomer-XR Digital C12000 (Hamamatsu, Jepang) diperoleh. Untuk NAc yang diberikan, sebuah garis digambar di sekitar seluruh nukleus untuk menentukan area pengukuran kepadatan optik (OD) (Gambar (Figure6B) .6B). Nilai yang diperoleh dinormalisasi dengan nilai OD diukur dari zona melingkar yang diambil pada corpus callosum (wilayah yang tidak diwarnai untuk imunokimia TH) dari bagian yang sama menggunakan perangkat lunak NIH Image J. Data dinyatakan sebagai rata-rata rasio OD (nilai OD dalam nilai NAc / OD dalam corpus callosum dari tiga bagian) ± SEM.
Ekspresi Gen oleh TLDA dan TaqMan
RNA diisolasi dari snap-beku NAc, sampel yang diperkaya VTA, dan hipotalamus, menggunakan NucleoSpin RNA / protein kit (Macherey-Nagel, Hoerdt, Prancis). Total RNA diserahkan ke pencernaan DNase mengikuti instruksi pabrik, kuantitasnya diperkirakan dengan 260 / 280 nm UV absorbance, dan kualitasnya dinilai menggunakan Agilent 2100 Bioanalyzer System, nomor integritas RNA (RIN) kemudian dihitung. Sampel dengan RIN di bawah 8 dibuang. Satu mikrogram total RNA ditranskripsi terbalik menjadi cDNA menggunakan RT kit berkapasitas tinggi (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) dalam volume total 10 µl.
Seperti yang dijelaskan sebelumnya (33), TLDA adalah kartu micro-fluidic 384-well di mana 384 PCR waktu-waktu simultan dapat dilakukan (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Kami menggunakan TLDA yang dirancang khusus yang dibuat untuk mencakup berbagai keluarga gen yang relevan dengan plastisitas dan pengaturan asupan makanan. Setiap kartu khusus dikonfigurasikan sebagai jalur pemuatan sampel 2 × 4 yang berisi ruang reaksi 2 × 48 (referensi: 96a). Satu set gen 92 (Tabel S1 dalam Bahan Tambahan) dan empat gen rumah tangga (18S, Gapdh, Polr2a, dan Ppia) dipelajari. PCR waktu nyata dilakukan menggunakan reagen TaqMan Life Technologies dan dijalankan pada sistem deteksi sekuens ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Data fluoresensi mentah dikumpulkan melalui PCR menggunakan perangkat lunak SDS 2.3 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), yang selanjutnya menghasilkan siklus ambang Ct dengan penentuan otomatis garis dasar dan ambang batas. Setelah memfilter menggunakan ThermoFisher cloud App (ThermoFisher, USA) untuk membedakan PCR yang menyimpang, pengujian per sampel dilakukan. n = 6 (n = 5 untuk kelompok WD di P25). Data tersebut kemudian dianalisis dengan Aplikasi Cloud ThermoFisher (ThermoFisher, USA) untuk kuantisasi relatif. Kuantitasi relatif ekspresi gen (RQ) didasarkan pada metode komparatif Ct menggunakan persamaan RQ = 2−ΔΔCt, di mana ΔΔCt untuk satu target gen adalah variasi Ct-nya sendiri dikurangi dari sampel kalibrator dan dinormalisasi dengan kontrol endogen. Tepatnya, kami menentukan gen housekeeping paling stabil menggunakan algoritma geNorm (ThermoFisher Cloud App RQ, ThermoFisher, USA). Di antara empat gen rumah tangga, Gapdh didefinisikan sebagai kontrol endogen untuk NAc dan hipotalamus, dan Ppia untuk VTA dan ini berlaku untuk semua sampel dari tiga periode waktu yang dianalisis. Representasi grafis dari ekspresi gen secara manual dirancang untuk menetapkan satu warna untuk peningkatan 10% ekspresi gen relatif terhadap kelompok CD. Variasi yang signifikan, menggunakan uji tanda-peringkat Wilcoxon non-parametrik, dicatat dengan tanda bintang.
Analisis Statistik
Hasil dinyatakan sebagai rata-rata ± SEM dalam tabel dan gambar. Uji non-parametrik Mann-Whitney digunakan untuk analisis berat badan pada titik waktu yang berbeda, preferensi lemak, dan rasio OD yang diperoleh dari imunohistokimia.
Untuk menilai pentingnya preferensi lemak 3 hari, kami melakukan analisis statistik kolom untuk setiap hari. Untuk setiap kelompok, konsumsi solusi lemak dan solusi kontrol diuji menggunakan uji Wilcoxon non-parametrik. Kami membandingkan nilai rata-rata preferensi dengan nilai hipotetis 50% (garis merah putus-putus). Variasi yang signifikan dicatat dengan tanda bintang merah. Kami menggunakan tes yang sama untuk analisis nilai qPCR RQ; kami membandingkan nilai RQ rata-rata dengan nilai hipotesis 1. Variasi yang signifikan dicatat dengan tanda bintang (Gambar (Gambar 44).
Untuk analisis sampel plasma, kami melakukan uji Mann dan Whitney non-parametrik. Jumlah sel TH-positif dianalisis dengan ANOVA dua arah dan p nilai dihitung. Karena banyaknya tes yang diterapkan, Bonferroni post hoc koreksi diterapkan hanya mengikuti tes ini. Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak Prism 6.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).
PCA tanpa pengawasan pertama kali dilakukan pada parameter 130 (TLDA, perilaku, dan data plasma) pada titik waktu yang berbeda untuk setiap pukulan biopsi otak (VTA, NAc, dan hipotalamus) untuk memvisualisasikan struktur umum dari kumpulan data (yaitu, tiga PCA global per titik waktu). PCA dapat didefinisikan sebagai proyeksi ortogonal data ke ruang linear dimensi yang lebih rendah, sehingga varians dari data yang diproyeksikan dimaksimalkan dalam subruang. Kami pertama kali memfilter gen yang tidak diekspresikan atau sedikit diekspresikan (Gambar (Figure5) .5). Nilai-nilai untuk keturunan dari bendungan pengumpahan CD dan dari bendungan pengumpan WD muncul dalam warna berbeda dalam plot PCA individu untuk memvisualisasikan jika kedua kelompok eksperimental ini dipisahkan dengan baik oleh komponen PCA yang tidak diawasi. Analisis ini memisahkan kelompok gen yang diekspresikan secara berbeda antara kedua kelompok keturunan. Selanjutnya, PCA terfokus dilakukan pada kelompok penanda mRNA yang berbeda: plastisitas (adhesi sel, sitoskeleton, faktor neurotropik, sinaptogenesis, dan regulasi transkripsi), jalur DA, jalur GAB, jalur modulator epigenetik (histone deacetylase dan histone acetyl transferase). PCA terfokus ini memungkinkan seseorang untuk memvisualisasikan secara bersamaan korelasi antara diet ibu dan beberapa penanda dan korelasi antara gen keluarga tertentu. Skala kualitatif digunakan untuk analisis PCA dan PCA terfokus: +++: pemisahan yang sangat baik; ++: pemisahan yang baik dengan satu tikus di sisi yang salah dari pemisahan PCA; +: pemisahan yang cukup baik dengan dua tikus (satu dari setiap kelompok) di sisi yang salah, -: tidak ada pemisahan yang jelas.
Hasil
Berat dan Pertumbuhan Tubuh
Asupan WD ibu selama kehamilan (dari G1 ke G21) tidak mempengaruhi berat badan anak anjing saat lahir (Gambar (Figure2) 2) (CD: 6.55 ± 0.07 g vs WD: 6.54 ± 0.05 g p = 0.9232) (Angka (Angka 2A, B) .2A, B). Kenaikan berat badan sejak lahir sampai disapih adalah 21% lebih tinggi pada keturunan yang lahir dari WD dam daripada keturunan dari CD bendungan dengan berat badan secara signifikan lebih tinggi pada penyapihan pada keturunan yang lahir dari WD dam (36.19 ± 0.90 g vs 47.32 ± 1.48 g p <0.001) (Gambar (Figure2C) .2C). Dari penyapihan sampai akhir percobaan (P95), tikus diberi makan dengan diet chow standar dan berat badan tetap lebih tinggi untuk keturunan dari WD dam daripada keturunan CD bendungan. Secara detail: selama masa remaja (P39) (Angka (Angka 2A, D), 2A, D), CD: 176.8 ± 3.3 g vs WD: 192.2 ± 3.3 g p = 0.0016 dan pada P93 (dewasa muda) (Gambar (Angka 2A, E) 2A, E) CD: 478 ± 9.9 g vs WD: 508.6 ± 10.3 g p = 0.0452.
Hormon dan Penanda Metabolik pada Periode Waktu yang Berbeda
Konsentrasi leptin, insulin, glukosa, dan NEFA plasma diukur pada P25, P45, dan P95. Pada semua umur, kadar glukosa plasma, NEFA dan leptin keturunan WD tidak berbeda secara statistik dari keturunan CD (Tabel (Tabel2,2, n = 6 per kelompok). Kami mengamati peningkatan yang signifikan dalam penumpukan lemak (rasio massa lemak retroperitoneal) pada keturunan dari bendungan yang diberi makan WD hanya pada P25 (p = 0.0327, uji Mann dan Whitney).
Dampak WD Perinatal pada Preferensi Fat dari Penyapihan hingga Dewasa
Untuk mengeksplorasi dampak WD pada preferensi lemak, kami menggunakan paradigma pilihan dua botol pada tiga titik waktu yang berbeda selama pertumbuhan. Tes ini digunakan untuk mempelajari secara khusus preferensi untuk rasa lemak dengan menghindari sebanyak mungkin efek metabolik dari penelanannya. Kami menunjukkan bahwa perbedaan dalam asupan kalori "ekstra" dari botol (di P25, P45, dan P95) tidak signifikan secara statistik. antar kelompok (Gambar S1A – C dalam Bahan Tambahan). Selain itu perbedaan dalam konsumsi 1% larutan minyak jagung menghasilkan peningkatan kalori sebesar 1% untuk tikus WD di P25 (WD: 4.9% vs CD: 3.9% dari kalori yang dicerna) dan 0.5% untuk tikus CD di P45 (WD: 2% vs CD: 2.5% dari kalori yang dicerna) (Gambar S1D – F dalam Bahan Tambahan). Di P25, anak anjing dari bendungan CD tidak memiliki preferensi untuk lemak (44.87 ± 9.8%, p = 0.339); sebaliknya, tikus WD menunjukkan preferensi untuk lemak (75.12 ± 8.04%, p = 0.039 mengikuti tes peringkat bertanda Wilcoxon, tanda bintang merah). Selain itu terdapat perbedaan statistik antara kedua kelompok dengan p = 0.0347 (uji Mann dan Whitney, tag hash hitam) (Gambar (Gambar 33SEBUAH).
Di P45 dan P95, kedua kelompok memiliki preferensi yang signifikan untuk lemak, yaitu berbeda secara signifikan dari nilai teoritis 50% (di P45, CD: 80.68 ± 2.2% p = 0.0005 dan WD: 78.07 ± 3.25% p = 0.0005; di P95, CD: 74.84 ± 8.4% p = 0.0425 dan WD: 69.42 ± 8.9% p = 0.109 mengikuti uji peringkat bertanda Wilcoxon, tanda bintang merah) (Gambar (Figure3A) .3SEBUAH). Nilai-nilai untuk kedua kelompok tidak dapat dibedakan setelah satu hari presentasi rasa (di P45 p = 0.7857 dan pada P95 p = 0.9171 uji Mann – Whitney) (Gambar (Gambar 33SEBUAH).
Untuk mengetahui bagaimana tikus mengatur konsumsi lemak mereka dari waktu ke waktu, kami mengulangi presentasi lemak selama tiga hari berturut-turut di P45 dan P95 (Angka (Angka 3B, C) .3B, C). Menariknya di P45, hanya pria dari bendungan WD yang semakin kehilangan pilihan untuk solusi lemak (Gambar (Figure3B) 3B) (hari ketiga: 53.12 ± 8.36% p = 0.851 setelah uji peringkat bertanda Wilcoxon). Namun, pada P95 (usia dewasa) semua hewan lebih menyukai lemak tanpa evolusi selama pengujian 3 hari (Gambar (Gambar 33C).
Singkatnya, dalam model ini, kami mengamati, pada tahap awal (masa kanak-kanak), preferensi untuk lemak pada tikus yang diberi makan oleh bendungan WD dengan ketertarikan progresif dari waktu ke waktu selama masa remaja. Kami mengamati tidak ada perbedaan antara kedua kelompok tikus di masa dewasa.
Tanda Tangan Molekuler Plastisitas Otak dan Sirkuit GABA Renovasi di Jalur Hipotalamus dan Hadiah
Untuk menentukan apakah asupan WD ibu selama kehamilan dan menyusui memiliki dampak pada jalur hipotalamus dan hadiah anak, kami mengukur ekspresi relatif dari beberapa faktor kunci plastisitas otak, pemodelan otak, dan penanda sirkuit neuron yang terlibat dalam asupan makanan dan epigenetik. regulator. Kami menggunakan TLDA untuk menganalisis kelimpahan mereka di area otak yang berbeda (yaitu, hipotalamus, VTA, dan NAc) (Tabel S1 dalam Bahan Tambahan) pada tiga periode waktu. Penapisan dilakukan setelah tes pilihan dua botol di P25, P45, dan P95 (Gambar (Figure1) 1) pada enam laki-laki yang lahir dari WD memberi makan bendungan dan enam laki-laki yang lahir dari CD makan bendungan.
Di P25 dalam hipotalamus, lima gen dari tiga belas kategori berbeda menunjukkan tingkat ekspresi mRNA yang jauh lebih rendah terutama pada penanda plastisitas dan penanda GABA berkisar antara −20% (Gfap) dan −40% (Gabra5) pada anak anjing dari WD yang makan bendungan dibandingkan dengan tikus dari WD yang makan dari bendungan dari WD CD memberi makan bendungan. Dalam biopsi jalur hadiah (VTA dan NAc), dua gen menampilkan tingkat ekspresi mRNA yang lebih tinggi secara statistik (D2R dan Gabra1), yaitu, pensinyalan DA dan reseptor GABA dan satu gen ekspresi lebih rendah (Hcrtr2) (yaitu, reseptor 2 orexin) di NAc , sedangkan empat gen menunjukkan tingkat ekspresi mRNA yang secara signifikan lebih tinggi (Map2, Gabara1, Hcrtr1, dan Hcrtr2) (yaitu, penanda plastisitas, reseptor GABA dan reseptor serotoninergik) di VTA (Gambar (Gambar 44).
Di P45 dalam hipotalamus, lima gen dari tiga belas kategori berbeda menampilkan tingkat ekspresi mRNA yang lebih rendah berkisar antara −20% (Fos) dan −50% (FosB) pada anak anjing dari WD yang makan bendungan dibandingkan dengan tikus dari CD yang diberi makan bendungan. Di P45 dalam biopsi jalur hadiah, empat gen menampilkan tingkat ekspresi mRNA yang lebih tinggi (Gfap, Dat, Cck2r, dan Kat5) dan dua gen ekspresi yang lebih rendah (Fos dan FosB) di NAc sedangkan tiga gen menampilkan tingkat ekspresi mRNA yang lebih rendah (Arc, FosB, dan Th) dan satu gen tingkat yang lebih tinggi (Gabrg2) di VTA.
Pada P95 dalam hipotalamus, gen 20 dari tiga belas kategori berbeda menampilkan tingkat ekspresi mRNA yang lebih tinggi, berkisar antara + 20 dan + 40% (Syt4 hingga Gjd2) dan gen 3 menampilkan ekspresi mRNA yang lebih rendah (FosB, D1r, dan XBXX). makan bendungan dibandingkan dengan tikus dari bendungan makan CD. Pada P1 dalam biopsi jalur hadiah, gen 95 menampilkan tingkat ekspresi mRNA yang lebih tinggi berkisar antara + 12 dan + 20% (Syn40 hingga Hcrt1) dan gen 1 ekspresi lebih rendah (Th) dalam NAc, gen 1 menampilkan tingkat ekspresi mRNA yang lebih tinggi (NXX6 , Gja1, Gjd1, Gabra2, Htr5a, dan Htr1b), dan gen 1 menampilkan tingkat ekspresi mRNA yang lebih rendah (Cntf, Igf6, Fos, Socs1, Gabrb3, dan HdacX di VTA).
Kami kemudian melakukan tiga PCA tanpa pengawasan yang sesuai dengan tiga biopsi otak menggunakan semua parameter terkuantifikasi (yaitu, dosis plasma, data perilaku dan variasi ekspresi mRNA). Pemisahan yang jelas dari kedua kelompok diperoleh hanya di P95 untuk NAc dan VTA (Tabel (Tabel33).
Menurut lingkaran korelasi PCA dan data TLDA (mewakili mayoritas variabel yang termasuk dalam PCA ini), kami mendefinisikan keluarga gen yang dapat bertanggung jawab atas segregasi dan melakukan PCA terfokus (Gambar 5). (Angka 5A, B, 5A, B, misalnya). PCA terfokus mengungkapkan bahwa pada penanda P25 DA dalam NAc dan penanda plastisitas pada hipotalamus dapat memisahkan kedua kelompok keturunan (Tabel (Tabel33 untuk ringkasan). Tidak ada diskriminasi seperti itu yang diperoleh di P45. Namun, analisis yang sama di P95 mengungkapkan bahwa penanda yang berbeda dari sistem GABA di NAc dan hipotalamus, ditambah penanda plastisitas (dalam hipotalamus, NAc dan VTA) dan regulator epigenetik (hanya dalam NAc) berkontribusi untuk memisahkan dua kelompok hewan ( Angka (Gambar 5; 5; Meja Tabel33).
Analisis ini mengungkapkan pengaruh jangka panjang dari diet perinatal pada penanda GABAergik serta penanda plastisitas dan epigenetik baik pada jalur homeostatis maupun pahala yang terlibat dalam perilaku makan.
Imunohistokimia Analisis Transkrip Sel Terkonfirmasi
Karena kami mengamati beberapa variasi dalam THNA pada NAc dan VTA pada berbagai periode perkembangan, kami bertujuan untuk mengkorelasikan hasil ini dengan imunostaining TH. Jumlah sel positif TH / NeuN dianalisis dalam VTA di mana badan sel dopaminergik berada dan OD dari imunolabeling TH dikuantifikasi di ujung saraf yang terletak di NAc. Sel TH (+) kurang berlimpah dalam VTA WD dibandingkan dengan tikus CD di P45 saja (Gambar (Angka 6A, C, E; 6KARTU AS; Angka S2A dalam Bahan Tambahan). Tidak ada interaksi yang signifikan antara tingkat bagian dan kuantifikasi TH / NeuN pada tiga periode (P25 p = 0.9991, P45 p = 0.9026, dan P95 p = 0.9170). Hanya pada P45, perbedaan statistik diperoleh antara dua kelompok keturunan (p = 0.0002) (Gambar (Figure6E) .6E). Selain itu, kami mengamati tidak ada perbedaan OD dari imunostaining TH di NAc di P25 dan P45 antara kedua kelompok (nilai rasio OD di P25: 1.314 ± 0.022 dalam CD vs 1.351 ± 0.026 di WD, p = 0.2681; Nilai rasio OD pada P45: 1.589 ± 0.033 di CD vs 1.651 ± 0.027 di WD, p = 0.1542). Namun, penurunan yang signifikan dari OD ujung saraf TH ditemukan pada NAc dari kelompok WD pada P95 (nilai rasio OD pada p95: 1.752 ± 0.041 pada CD vs 1.550 ± 0.046 pada WD, p = 0.0037) (Angka (Angka 6B, D, F; 6B, D, F; Angka S2B dalam Bahan Tambahan).
Diskusi
Dalam penelitian ini, kami berhipotesis bahwa kelebihan gizi perinatal ibu akan mempengaruhi program pengembangan jalur hadiah yang terlibat dalam homeostasis energi, pilihan makanan, dan asupan makanan keturunan. Kami secara ekstensif memeriksa dampak asupan WD ibu sejak lahir hingga disapih pada jalur GABA, serotonin, dan DA pada area otak tertentu (VTA, NAc, dan hipotalamus) pada keturunannya, mulai dari masa kanak-kanak hingga dewasa. Hasil kami menunjukkan bahwa penggunaan diet, kaya lemak dan manis, terbatas pada periode perinatal berdampak pada preferensi lemak awal (masa kanak-kanak) pada keturunan yang berkorelasi dengan perubahan dalam profil ekspresi gen dan perubahan neuroanatomis / arsitektur mesolimbik. jaringan dopaminergik. Namun, ketika keturunannya disimpan di bawah chow diet, kami mengamati pada remaja WD memberi makan tikus kehilangan progresif terhadap lemak yang berkorelasi dengan berkurangnya ekspresi gen dari sistem DA dan sedikit penurunan neuron TH-positif di VTA . Kemudian dalam preferensi hidup lemak tidak berbeda antara kelompok meskipun plastisitas penting dari jaringan GABAergik dan jaringan homeostasis energi dari hipotalamus diidentifikasi pada tikus dari WD makan bendungan (Gambar (Gambar 77).
Dampak pertama asupan perinatal-WD yang kami amati dalam penelitian ini adalah peningkatan berat badan anak saat disapih tetapi tidak ada perbedaan saat lahir. Memang, hewan dari kelompok WD mendapatkan berat 21% lebih dari CD pada akhir periode mengisap. Studi sebelumnya telah memberikan hasil yang bertentangan mengenai perubahan berat lahir untuk anak dari bendungan WD fed: berat badan lebih tinggi (19, 34), berat badan lebih rendah (18, 21, 35) atau tidak ada perbedaan (6, 22). Data kami sejalan dengan analisis meta-regresi terbaru (36) dilakukan pada publikasi eksperimental 171 yang menyimpulkan bahwa paparan HFD ibu tidak mempengaruhi berat lahir anak tetapi menginduksi peningkatan berat badan pada akhir periode laktasi. Berat badan yang lebih tinggi dari keturunan WD mungkin mencerminkan perubahan dalam komposisi susu dan / atau produksi susu yang telah diilustrasikan dalam publikasi sebelumnya (37, 38). Sesuai dengan berat badan mereka yang lebih tinggi, rasio lemak retroperitoneal dari keturunan WD secara signifikan lebih tinggi dibandingkan dengan keturunan CD pada akhir periode menyusui (P25, Tabel Table2), 2), yang juga konsisten dengan penelitian sebelumnya (18, 21). Namun, adipositas yang lebih tinggi tidak bertahan pada P45 dan P95, dan parameter metabolisme lainnya seperti insulin, NEFA, dan plasma glukosa tidak berbeda antara kelompok. Hasil kami menunjukkan bahwa tanpa obesitas ibu yang jelas selama kehamilan dan menyusui, diet dengan sendirinya tidak cukup untuk menginduksi efek metabolisme yang bertahan lama pada keturunannya (22, 39, 40).
Telah dilaporkan bahwa asupan HFD perinatal berkorelasi positif dengan preferensi keturunan untuk makanan yang enak (41). Dalam penelitian kami, kami melakukan penelitian longitudinal yang bertujuan menguji preferensi lemak pada keturunan yang disapih pada chow biasa.
Dampak WD Perinatal pada Anak (setelah Menyapih)
Anak anjing pengerat makan makanan padat 19 – 20 hari setelah lahir (42) ketika jalur hadiah otak mereka belum matang (17). Oleh karena itu sangat menarik untuk mempelajari preferensi awal mereka untuk lemak dan menghubungkan preferensi awal ini dengan analisis transkrip otak. Tepat setelah disapih, kami mengamati preferensi untuk lemak pada keturunan WD yang tidak terbukti pada tikus CD. Hal ini sejalan dengan laporan lain yang menunjukkan hubungan antara malnutrisi perinatal dan preferensi makanan yang enak dan preferensi rendah untuk lemak pada usia dini untuk tikus kontrol (43).
PCA global tidak memungkinkan membedakan kelompok anak anjing sehubungan dengan diet ibu pada usia itu. Namun, ketika PCA yang ditargetkan, terbatas pada penanda DA, dilakukan, kami memperoleh pemisahan kelompok yang baik. Memang, ada peningkatan nyata dalam ekspresi mRNA reseptor D2 di NAc pada WD pups. Ekspresi D2 post-sinaptik ini dalam NAc sebagian dapat terlibat dalam motivasi yang lebih tinggi untuk lemak (44). Beberapa transkrip lainnya dimodifikasi dalam WD pups dibandingkan dengan CD pups, seperti peningkatan subunit alfa 1 GABAA dalam NAc dan VTA dan penurunan subunit alfa 5 GABAA di hipotalamus yang menunjukkan reorganisasi reseptor GABAA dalam nuklei ini.
Dampak WD Perinatal pada Remaja
Di P45, kami mengamati preferensi lemak tinggi yang serupa untuk kedua kelompok pada hari pertama presentasi tetapi, yang menarik, tikus WD semakin kehilangan minat terhadap lemak setelah presentasi berulang. Masa remaja adalah periode kritis reorganisasi neurobehavioral yang diperlukan untuk pemrosesan kognitif seumur hidup (45), dan berbagai penelitian menunjukkan kerentanan yang nyata terhadap efek kognitif yang merugikan dari diet lemak (46-48). Hasil ini bertentangan dengan pekerjaan sebelumnya dari kelompok Muhlhausler (21, 35) di mana tikus muda (6 minggu) menunjukkan preferensi yang jelas untuk junk food. Namun, dalam publikasi mereka, paradigma eksperimental berbeda karena tikus memiliki akses gratis ke chow dan junk food standar dari penyapihan hingga pengorbanan (6 minggu).
Secara bersamaan, kami mengukur peningkatan Dat mRNA dalam NAc dan penurunan Th mRNA dalam VTA yang dikonfirmasi oleh imunohistokimia yang menunjukkan pengurangan jumlah sel TH (+) dalam VTA tikus WD. Setelah peningkatan aktivitas transkriptomik untuk sistem DA saat disapih, aktivitas yang berkurang di P45 dapat menjelaskan rendahnya minat terhadap makanan enak yang diamati pada tikus WD kami. Juga harus dicatat bahwa penurunan sistematis ekspresi mRNA Fos dan FosB di berbagai nuklei yang kami analisis bisa menjadi tanda berkurangnya aktivitas otak setelah paparan WD ibu.
Tikus WD remaja menunjukkan ketertarikan yang lebih cepat terhadap lemak yang berlawanan dengan perilaku mereka sebelumnya. Penggunaan diet "normal" selama masa kanak-kanak tampaknya "melindungi" mereka terhadap preferensi lemak berlebihan pada masa remaja. Sebaliknya ketika tikus memiliki akses gratis ke junk food setelah disapih, seperti dalam Ref. (21, 35), mereka menunjukkan pada remaja preferensi yang kuat untuk lemak. Hasil ini menunjukkan bahwa minggu 3 chow diet setelah menyapih bisa memprogram ulang sirkuit dan membuat anak remaja kurang sensitif terhadap tantangan lemak akut.
Dampak WD Perinatal pada Orang Dewasa
Tikus dewasa tidak lagi menampilkan perbedaan preferensi untuk lemak, bahkan setelah presentasi lemak berulang seperti yang telah dijelaskan (22, 35). Secara bersamaan, kami mengamati penurunan mRNA Th dan protein dalam NAc, dan kecenderungan berkurangnya ekspresi Dat mRNA dalam VTA. Naef dan rekan kerja (20) sudah melaporkan aktivitas rendah sistem DA pada tikus dewasa yang diberi makan dalam periode perinatal dengan HFD, dengan respons DA tumpul terhadap amfetamin yang diukur dengan mikrodialisis dan peningkatan motivasi untuk imbalan lemak (lihat tabel yang merangkum data qPCR terbaru pada model ini, Meja S2 dalam Bahan Tambahan). Salah satu batasan kuantifikasi TH (mRNA dan imunohistokimia) dalam NAc berasal dari fakta bahwa sel-sel NAc juga bisa mengekspresikan mRNA dan protein Th dan kemudian dapat membiaskan kuantifikasi serat DA (49, 50). Namun, penggunaan imunostaining TH pada NAc terutama mengungkapkan terminal akson padat yang berasal dari neuron DA otak tengah (VTA dan SNc). Biasanya, TH yang mengekspresikan neuron di striatum dan NAc hanya dapat dilihat pada hewan yang memiliki DA sangat tinggi (51) dan karenanya hampir tidak dapat terdeteksi di bagian immuno kami. Dalam penelitian ini, kami juga mengamati peningkatan yang kuat dalam reseptor opioid mu di NAc ketika kelompok lain, dengan model yang berbeda, menunjukkan penurunan ekspresi dalam ventral striatum tikus yang terpapar HFD (selama menyusui dan kehamilan) (19, 21) atau tidak ada perubahan (35). Modifikasi ini, diukur pada tingkat mRNA saja, dapat mencerminkan sedikit aktivitas hypo dari sirkuit DA yang terkait dengan sensitivitas opioid yang lebih tinggi (52) yang mungkin tidak cukup untuk berdampak pada tes perilaku yang kami lakukan. Asumsi ini perlu dikonfirmasi menggunakan pendekatan fungsional. Dalam sebuah makalah baru-baru ini, dengan model yang serupa, Romani-Perez et al., Tidak dapat mengamati peningkatan motivasi yang signifikan dalam kotak pengkondisian operan untuk keturunan HFD tetapi mengamati latensi yang lebih pendek untuk mencapai kotak tujuan dalam paradigma uji runway (22). Meskipun tidak ada preferensi lemak jangka panjang dalam kondisi eksperimental kami, kami menemukan bahwa asupan WD ibu perinatal memiliki efek jangka panjang pada sirkuit serebral lainnya yang sebagian besar dimediasi oleh remodeling GABA dalam NAc dan Hypothalamus. NAc dianggap sebagai "sentrael sensorik" untuk perilaku penyempurnaan (52). Studi terbaru menunjukkan bahwa asupan makanan ditekan oleh penghambatan neuron LH yang melepaskan GABA (53). O'Connor et al. menunjukkan bahwa neuron D1R NAc (neuron proyeksi GAB) secara selektif menghambat neuron LH VGAT untuk menghentikan asupan makanan (54). Eksperimen ini mengungkap sirkuit GABA (NAc / Hypothalamus) yang mungkin bertanggung jawab untuk mengendalikan respons perilaku. Sistem ventrium striatum-hipotalamus ini melengkapi rangkaian lain yang melibatkan inti nukleus stria terminalis yang melepaskan GABA yang memproyeksikan neuron ke glutamat yang melepaskan neuron Vglut LH dan penghambatan langsung pemberian LH vglut2.55). Komponen penting lain dari sirkuit pengatur nafsu makan yang melibatkan kulit NAc adalah proyeksi penghambatan pelepasan GABA ke VP (56). Data ini menyoroti peran penting pensinyalan GABA dalam interaksi antara hipotalamus dan NAc untuk mempromosikan pemberian makan. Dalam penelitian kami, kami tidak dapat membedakan populasi neuron yang terlibat dalam remodeling GABA dan bagaimana modifikasi ini dapat mengubah jaringan. Namun, peran sentral dari sirkuit GABA pantas lebih menarik. Secara khusus, akan sangat menarik untuk melakukan eksperimen fungsional lebih lanjut dari sirkuit GABA ini menggunakan pendekatan elektrofisiologis (57). Kami juga mengamati peningkatan global transkrip mRNA untuk reseptor 5HT1a dan 5HT1b di tiga inti yang diteliti. Sebagian besar serat serotonin yang diproyeksikan berasal dari nukleus raphe dorsal (DRN) dan nukleus raphe median (MRN). Data terbaru dari in vivo rekaman dan studi pencitraan menunjukkan peran positif 5HT dalam hadiah (58). Serat 5HT dari DRN terlibat dalam kontrol impulsif (59). Meningkatkan 5HT1a di VTA dan NAc bisa menjadi mekanisme kompensasi yang bisa mengendalikan impulsif. Dalam hipotalamus, studi farmakologis menunjukkan bahwa subtipe reseptor 5HT1a dapat menekan perilaku makan yang disebabkan oleh stimulasi serotonin (60, 61). Peningkatan reseptor 5HT1a dan b di hipotalamus dapat mempotensiasi aksi penekan makan serotonin dan karenanya dapat membentuk mekanisme kompensasi. Asumsi ini perlu diverifikasi dengan melakukan percobaan fungsional yang tepat.
Perubahan jaringan ini terkait dengan modifikasi penanda plastisitas sebagai Ncam mRNA. Dalam hipotalamus tikus dewasa, kami mengamati peningkatan transkrip Ncam1 dan St8sia4 yang menunjukkan dan meningkatkan pensinyalan asam polsialat (PSA). PSA adalah glycan permukaan sel yang memodulasi interaksi sel-ke-sel. Polisialilasi protein adhesi sel terlibat dalam berbagai proses plastisitas yang bergantung pada sinaptik dalam sistem saraf pusat dan telah dilaporkan diperlukan untuk plastisitas sinaptik adaptif dari sirkuit makan selama keseimbangan energi positif akut (33, 62). Selain itu regulator lain dari interaksi sel dan sinaptogenesis mungkin terlibat dalam plastisitas hipotalamus ini.
Kesimpulannya (Gambar (Figure7), 7), asupan WD ibu memiliki pengaruh jangka panjang pada pengaturan sirkuit homeostatik dan hedonis yang mengatur perilaku makan pada anak. Dengan analisis tiga periode waktu kritis, kami dapat menunjukkan evolusi yang jelas untuk preferensi lemak berkorelasi dengan tanda tangan molekul otak tertentu. Selama masa kanak-kanak, preferensi untuk lemak mungkin berkorelasi dengan aktivitas yang lebih tinggi dari sistem DA. Masa remaja, ditandai dengan inversi preferensi lemak, dikaitkan dengan ekspresi yang lebih rendah dari penanda sistem DA yang menyarankan mekanisme kompensasi. Hal yang sangat menarik untuk diberitahukan adalah bahwa, dalam model ini, diet seimbang setelah penyapihan dapat melindungi tikus remaja dari kebiasaan makan yang merusak dengan mengurangi hasrat mereka akan lemak. Meskipun pada usia dewasa kedua kelompok memiliki preferensi tinggi yang sama untuk lemak, tikus dari WD yang diberi makan bendungan menunjukkan renovasi besar-besaran pada sirkuit GABA. Apa konsekuensi dari keliatan abadi ini? Akankah asupan diet obesogenik yang berlebihan selama masa remaja mengaktifkan kembali sistem penghargaan tumpul ini? Pertanyaan-pertanyaan seperti itu mungkin relevan dalam tindak lanjut gizi bayi baru lahir dan anak-anak yang bangkit di negara-negara barat.
Pernyataan etika
Semua percobaan dilakukan sesuai dengan pedoman komite kesejahteraan hewan lokal, UE (arahan 2010 / 63 / EU), Institut National de la Recherche Agronomique (Paris, Prancis), dan Departemen Kedokteran Hewan Prancis (A44276). Protokol eksperimental telah disetujui oleh komite etik kelembagaan dan terdaftar di bawah referensi APAFIS 8666. Setiap tindakan pencegahan dilakukan untuk meminimalkan stres dan jumlah hewan yang digunakan dalam setiap rangkaian percobaan.
Kontribusi Penulis
JP dan PB melakukan percobaan dan berpartisipasi dalam diskusi dan penulisan. TM melakukan PCA dan berpartisipasi dalam diskusi dan penulisan. SN berkontribusi pada desain eksperimen dan berpartisipasi dalam diskusi. PP berkontribusi pada desain percobaan, berpartisipasi dalam diskusi, dan menulis naskah. VP merancang dan melakukan eksperimen, menganalisis data, dan menulis naskah.
Pernyataan Benturan Kepentingan
Para penulis menyatakan bahwa penelitian ini dilakukan tanpa adanya hubungan komersial atau keuangan yang dapat ditafsirkan sebagai potensi konflik kepentingan.
Ucapan Terima Kasih
Para penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada Guillaume Poupeau dan Blandine Castellano yang telah merawat hewan-hewan tersebut selama penelitian, Anthony Pagniez atas bantuannya dalam ekstraksi mRNA dan TLDA, Isabelle Grit atas bantuannya dalam analisis sampel plasma, dan Alexandre Benani dan Marie-Chantal Canivenc untuk diskusi bermanfaat dan desain TLDA mereka.
Catatan kaki
Pendanaan. Penelitian ini didukung oleh hibah des PaysMAD (VP) wilayah des pays de la Loire, hibah yayasan LCL (VP dan PP), yayasan SanteDige (VP) dan INRA Metaprogram DIDIT (SN, VP, PP).
Materi tambahan
Materi Tambahan untuk artikel ini dapat ditemukan online di http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fendo.2017.00216/full#supplementary-material.
Gambar S1
Asupan energi total dari botol yang mengandung minyak jagung. (A) Asupan kalori dari botol minyak jagung selama 24 jam di P25 pada anak anjing dari diet barat (WD) memberi makan bendungan dan anak anjing dari diet kontrol (CD) memberi makan bendungan. (B) Asupan kalori dari botol minyak jagung selama 24 jam di P45 (hari ketiga pengujian botol). (C) Asupan kalori dari botol minyak jagung selama 24 jam di P95 (hari ketiga pengujian botol). Untuk panel (A – C), data dinyatakan sebagai rata-rata ± SEM, tidak ada perbedaan statistik (p > 0.05) diamati, mengikuti uji non-parametrik Mann dan Whitney, pada semua usia. (D) Persentase asupan kalori dari botol minyak jagung dibandingkan dengan total asupan kalori (botol minyak jagung + diet standar chow) untuk 24 jam di P25 di WD pups dan CD pups. (E) Persentase asupan kalori dari botol minyak jagung dibandingkan dengan total asupan kalori (botol minyak jagung + diet standar chow) untuk 24 jam di P45 (hari ketiga tes botol) pada WD pups dan CD pups. (F) Persentase asupan kalori dari botol minyak jagung dibandingkan dengan total asupan kalori (botol minyak jagung + diet standar chow) untuk 24 h di P95 (hari ketiga uji botol) pada WD pups dan CD pups. Untuk panel (D, E), data dinyatakan dalam persen dari total asupan kalori tanpa perbedaan statistik (p > 0.05) diamati, mengikuti chi-square dengan koreksi Yates, pada semua usia.
Gambar S2
Photomicrographs representatif dari immunostaining TH dalam nucleus accumbens (NAc) dan ventral tegmental area (VTA) pada tiga titik waktu yang berbeda. (A) Photomicrograph TH / NeuN immunostaining pada level VTA, −5.30 mm dari Bregma. Pelabelan merah untuk NeuN, dan hijau untuk TH. Panah putih menunjukkan jalan keluar dari saraf ketiga. (B) Fotomikrograf imunostaining TH pada level NAc, + 1.70 mm dari Bregma. Pelabelan hijau untuk TH. Panah putih menunjukkan commissure anterior.
Tabel S1
Daftar gen array kepadatan rendah TaqMan dengan kode inventori teknologi kehidupan yang sesuai.
Tabel S2
Ringkasan data yang dipublikasikan tentang ekspresi transkrip jalur dopamin. Karakter merah sesuai dengan periode masa kanak-kanak, yang biru ke remaja, dan yang hitam ke dewasa. =: sesuai dengan ekspresi transkrip yang serupa antara kelompok, +: sesuai dengan ekspresi transkrip yang lebih tinggi pada anak anjing dari diet kalori tinggi [junk food, diet barat (WD), atau diet tinggi lemak (HFD)] makan bendungan, dan -: sesuai dengan ekspresi transkrip yang lebih rendah pada anak anjing dari diet tinggi kalori (junk food, WD atau HFD) yang diberi makan bendungan.
Referensi
;
