Nat Neurosci. 2011 1 월; 14 (1) : 22–24입니다.
온라인 2010 12 월 5 게시. 도이 : 10.1038 / nn.2703
추상
등쪽 선조는 약물 중독의 발달에 중요한 역할을합니다. 그러나 역할에 대한 정확한 이해 striatopallidal (간접적) 그리고 striatonigral (직접) 경로 행동 조절에 신경 세포는 애매 남아.
조작 된 GPCR (hM)의 바이러스 매개 표현에 의존하는 새로운 접근 방법 사용4D), 우리는 hM의 활성화가4클로자핀이있는 D 수용체N-옥 시드 (CNO)는 선조체 뉴런 흥분성을 강력하게 감소시켰다. 때 hM4D 수용체는 래트에서 직접 또는 간접 경로 뉴런에서 선택적으로 발현되었고, CNO는 암페타민에 대한 급성 운동 반응을 변화시키지 않았지만 반복 된 약물 치료와 관련된 행동 가소성을 변경시켰다. 구체적으로 일시적으로 striatopallidal 뉴런 활동을 방해하는 것은 행동 감작을 촉진하는 반면 striatonigral 뉴런의 흥분성을 줄이면 지속성이 손상됩니다. 이러한 연구 결과 반복 된 약물 노출과 관련된 행동 적응에서 급성 약물 효과를 파싱 할 수 있으며 증감과 같은 행동에 신경 경로 기여를 해체하는이 방법의 유틸리티를 강조 표시합니다.
약물 중독의 압도적 인 부정적인 결과에도 불구하고, 정신 자극제 사용 및 남용은 여전히 널리 퍼져 있습니다. 초기 약물 노출에서 규칙적인 사용 및 궁극적으로 강박 적, 습관적 행동 및 억제 조절의 상실로의 진행은 이산 신경 회로에서의 일련의 분자 적응을 포함한다1,2,3. 선조체는 중독을 매개하는 핵심 과정을 형성하는 것으로 생각되는 많은 행동 및 신경 생물학적 적응의 핵심 사이트로 확인되었습니다.1,2,3. 선조체 내의 뉴런의 대부분 (~ 95 %)은 GABAergic medium spiny projection 뉴런 (MSN)입니다. t모자는 그들의 신경 펩티드 발현이 다르고 두 가지 주요한 경로를 형성한다4.
- Striatopallidal MSN은 enkephalin (ENK)을 포함하고 간접 경로를 형성합니다
- 반면 striatonigral MSN은 dynorphin (DYN)과 물질 P를 포함하고 직접적인 경로를 형성합니다..
많은 개념 모델은 이러한 MSN 집단이 서로 기계적으로나 기능적으로 서로 반대한다고 가정합니다.5,6. 그러나, 이러한 세포 집단이 물리적으로 혼합되어 형태 학적으로 구분할 수 없기 때문에 선택적인 조작이 기술적으로 어려워지기 때문에 행동의 제어에있어서의 차별적 역할을지지하는 경험적 증거는 거의 없다.
남용 약물에 반복적으로 노출 된 후 발생하는 행동의 발달에서 이러한 선조 세포 집단의 역할을 조사하기 위해, 두 가지 새로운 전략을 결합했습니다. , 엔지니어링 GPCR (G내가 / O를결합 된 인간 무스 카린 M4 공포; 디자이너 약물에 의해 독점적으로 활성화되는 디자이너 수용체; hM4D)7 다른 약리학 적 불활성 리간드 인 클로자핀-에 의해 활성화되는N-산화물8,9 (CNO; 그림 1a, h). 배양 된 뉴런에서의 발현에 따라, CNO의 투여는 G를 자극한다내가 / O를커플 링 hM4따라서, D 수용체는 칼륨 3 (Kir3) 채널을 안쪽으로 정류하여 막 과분극 및 일시적 뉴런 침묵을 초래합니다.9.
바이러스 벡터의 세포 표현형 특이성을 테스트하기 위해, 우리는 바이러스의 등쪽 선조 주입 후 이중 라벨 면역 형광 현미경 법을 사용했습니다 (보충 그림 1) 헤 마글 루티 닌-태그 된 hM을 발현하는 것4ENK 프로모터의 제어하에 D 수용체 (pENK-hM4D) 또는 DYN 프로모터 (pDYN-hM4D). 우리는 그 p를 발견ENK-hM4D 발현은 주로 ENK- 함유 MSN에서였다 (헤 마글 루티 닌 세포의 90 %는 ENK +, 85에서 94; 헤 마글 루티 닌 세포의 6 %는 물질 P +, 4 세포에서 70 임); 그림 1b) 반면 pDYN-hM4D 발현은 주로 물질 P- 함유 MSN에서 (하마 글 루티 닌 세포의 95 %는 물질 P +, 109 세포에서 115; 5 %는 헤 마글 루티 닌 세포에서 ENK +, 5 세포에서 97 임); 그림 1i). 녹색 형광 단백질을 발현하는 프로모터-특이 적 바이러스의 주입 후 유사한 결과가 얻어졌다 (pENK-GFP 및 PDYN-GFP; 보충 2a 및 3a).
striatopallidal MSN이 주로 globus pallidus external (GPe)에 투영되고 striatonigral MSN이 substantia nigra pars reticulata (SNpr)에 주로 투영되는 것을 고려할 때, 우리는 역행 추적자 Fluoro-Gold를 이들 뇌 영역에 주입 한 후 이중 라벨 형광 면역 조직 화학을 사용했습니다. p를 확인하기 위해ENK 및 P다이 바이러스는 경로 특이 적 감염을 일으켰다. 우리는 pENK-GFP GPe에 주입 된 후 SNpr이 아닌 선조 형 플루오로-금 발현과 공동-국 재화 된 세포 (보충 그림 2b) 반면 pDYN-GFP SNpr에 주입 된 후 GPe가 아닌 선조 형 플루오로-금 발현과 공동-국 재화 된 세포 (보충 그림 3b). 바이러스 성 벡터의 발현은 바이러스 감염 영역에서 ENK + 또는 물질 P + 뉴런의 수를 변화시키지 않았으며, 이는 바이러스-매개 유전자 전달을위한 이들 프로모터의 사용이 내인성 뉴로 펩티드 수준을 방해하지 않음을 시사한다. 이 모든 결과는 p가ENK 및 P다이 바이러스 벡터는 적절하게 분리 된 선조 세포 집단에서 유전자를 발현한다.
hM이지만4D 수용체 기반 기술은 다른 뉴런 유형의 활동을 조절하는 것으로 입증되었습니다9, 선조 뉴런에 영향을 미치는 그들의 능력은 조사되지 않았다. 따라서, 우리는 hM에 striatal medium spiny neuron을 감염시켰다4단순 포진 바이러스 (HSV) 프로모터의 제어하에 D 수용체, 2 일 후 등쪽 선조체의 관상 슬라이스를 준비하고, hM이 어떻게4D- 발현 배지 가시 줄기 뉴런은 CNO에 반응한다. 본 발명자들은 CNO (10 μM)의 국소 적용이 막 전위 (~ 7 mV, 기준선 막 전위가 -80 mV로 조정 됨)의 과분극을 유도함을 관찰 하였다; 그림 1cCNO 적용 후 뉴런의 입력 저항 감소그림 1d, e), 칼륨 컨덕턴스 (즉, Kir3- 매개 전류)가 hM에서 CNO에 의해 활성화됨을 제안4D 수용체-발현 뉴런. 또한, CNO의 관류는 hM에서 유발 작용 전위의 수를 실질적으로 감소시켰다4D- 발현 뉴런, 그러나 대조군 세포에서는 그렇지 않음으로써, 바이러스 감염 뉴런의 기능적 출력을 효과적으로 억제 함 hM의 발현4D 수용체만으로는 입력 저항을 변경하지 않았습니다 (P = 0.84) 또는 활동 전위 발생 (P = 0.64). (그림 1f, g). 종합하면, 이러한 데이터는 해마 뉴런과 유사하게9, hM4D / CNO 기반 방법은 쥐 선조 뉴런의 흥분성을 효과적으로 감소시킬 수 있습니다.
추가 개념 증명으로 hM 여부를 테스트했습니다.4D 수용체는 신경 활동이 행동 관련 자극에 의해 예측 가능하게 유발되는 잘 확립 된 회로에서 신경 전달을 차단할 것이다. 따라서, 본 발명자들은 hM으로 복부 Tegmental Area (VTA) 뉴런을 감염시켰다4도파민 뉴런에서 강하게 발현하는 HSV 프로모터의 제어하에있는 D 수용체10패스트 스캔 순환 전압 전류 법을 사용하여 예상치 못한 식품 보상 제공 후 핵 축적에서 도파민 방출의 변화를 측정11. CNO의 투여는 비히클과 비교하여 핵 축적 체에서 식품 펠릿-유발 도파민 방출을 상당히 약화시켰다 (보충 그림 4). 마지막으로, 우리는 선조에서 특정 뉴런 세포 유형의 활동 감소 여부를 테스트 생체내에서 암페타민이 Fos 발현을 자극하는 능력을 변화시킬 수 있습니다. 암페타민과 같은 정신 자극제는 c-의 강력한 활성화 제입니다fos 선조에서12 그리고 c-를 증가시킬 것이다fos 우리의 실험 조건 하에서 striatonigral 및 striatopallidal 뉴런 모두에서13. 신경 활동의 마커로 사용되는 것 외에도 c-의 정신 자극제 유도fos 정신 운동 과민성과 관련된 신경 적응의 시작과 유지에 중요한 역할을하는 것으로 생각된다1,14. p의 CNO- 매개 활성화가 발견되었다ENK-hM4D 수용체는 선조체에서 암페타민으로 유도 된 c-Fos 세포의 총 수를 유의하게 감소시켰다 (그림 1k 및 보충 그림 5a). 이러한 감소는 둘 모두의 헤 마글 루티 닌 양성 뉴런 (즉, hM을 발현하는 뉴런)에서 발생 하였다4D 수용체) 및 헤 마글 루티 닌 음성 뉴런 (즉, hM을 발현하지 않는 뉴런)4D 수용체; 그림 1l), hM 간의 뉴런 크로스 토크 효과 제안4D- 발현 뉴런 및 감염되지 않은 뉴런. 암페타민-유발 c-Fos 세포의 총 수 및 헤 마글 루티 닌-양성 c-Fos 세포의 수의 현저한 감소가 또한 hM 일 때 관찰되었다4D 수용체는 직접 경로 뉴런에서 활성화되었다 (그림 1n, o 및 보충 그림 5b). 중요하게는, 이들 효과는 p의 발현 이후에 신규 수용체의 바이러스 발현에 의해 단순히 야기되는 것이 아니다ENK-hM4D 또는 pDYN-hM4D CNO 처리가없는 수용체는 암페타민-유발 Fos 세포의 수에 영향을 미치지 않았다 (보충 무화과 6 및 7). 따라서, 이러한 발견은 hM의 CNO- 매개 활성화가4D 수용체는 또한 신경 전달 물질 방출을 감소시키고 세포 내 신호 전달을 약화시킴으로써 뉴런 활성의 감소를 초래할 수있다.
중독성 약물에 반복적으로 노출되면 행동 민감성을 점진적으로 지속적으로 증가시킬 수 있으며 이는 종종 행동 감작이라고합니다. 중요하게도, 감작에는 인간 약물 중독의 발달에 연루된 동일한 신경 회로가 포함됩니다3. 여기 우리 암페타민 과민의 개발에 striatal 뉴런 활동의 회로 특정 감쇠의 효과 조사하기 위해 우리의 소설 도구를 사용합니다. 우리는 직접 및 간접 경로 뉴런 striatonigral 뉴런 sensitization을 촉진 하 고 striatopallidal 뉴런은 각각 행동 활성화 및 억제에 그들의 개념 제안 역할과 일치 sensitization을 억제하는 반대 역할을 가설을 세웠다5,6. 따라서, 우리는 striatopallidal 신경 세포의 생 화 학적 감소 신경 흥분 성 감응 임계 수준의 수준을 이끌어내는 암페타민 복용 요법에 감작을 유발하는지 여부 및 striatonigral 뉴런의 신경 흥분 감퇴가 일반적으로 강력한 sensitization을 생성하는 프로토콜에 감작을 방지하는지 여부를 테스트했습니다.
첫 번째 연구를 위해, 우리는 GFP 대조군 (4 가지 약물 노출)에서 운동 민감도의 역치 수준을 유도하는 치료 요법을 사용했다. 철수 기간 후, 중등도의 암페타민 용량 (2 mg / kg)을 신경 활성의 CNO- 유도 감쇠없이 투여하여 감작이 지속되는지를 결정 하였다. p의 CNO- 매개 활성화ENK-hM4D 암페타민 치료 동안 수용체는 암페타민에 대한 급성 운동 반응을 변화시키지 않았다 (그림 2a). 그러나, 간접 경로 뉴런에서 뉴런 활성의 CNO- 매개 붕괴는 GFP 대조군과 비교하여 훨씬 더 강력한 감작의 개발을 촉진시켰다 (그림 2b). 이러한 감작의 강화는 암페타민 챌린지에서 유지되었으며, 이는 CNO 처리가없는 상태에서 1 주일 후에 수행되었다 (그림 2c, d). 이러한 효과 hM에 의해 striatopallidal 뉴런의 활동의 CNO 종속 감소에 기인 할 수 있습니다4hM 때문에 D 수용체4CNO 처리없이 D 수용체 발현은 암페타민의이 약한 투약 요법에 대한 운동 민감성을 생성하지 않는다 (보충 그림 6).
striatonigral 신경 세포가 반대 방식으로 약물 반응을 조절할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 우리는 GFP 컨트롤 (6 약물 노출에 강력한 감작을 생성하는 암페타민의 약물 치료 요법 동안 dorsomedial striatum에서 striatonigral 신경 세포의 흥분성을 감소시키는 효과를 테스트했습니다. )뿐만 아니라 수용체-매개 성 뉴런 활성의 방해가없는 암페타민 (0.5 mg / kg)의 낮은 도전 용량 동안. 간접 경로 약화와 마찬가지로, 암페타민 치료 중 직접 경로 뉴런의 흥분성에 대한 CNO- 매개 감소는 암페타민에 대한 급성 운동 반응을 변화시키지 않았다 (그림 2e). 감작의 발달은 p의 CNO- 유도 된 활성화 후 GFP 대조군과 유사하게 보이지만DYN-hM4D 처리 단계 동안 수용체 (그림 2f), 감작이 p에서 지속되지 않았다DYN-hM4D 그룹이지만 여전히 GFP 컨트롤에서 강력하게 유지되었습니다 (그림 2g, h). 이러한 효과는 또한 hM에 의한 striatonigral neuron의 활동의 CNO 의존성 감소에 기인 할 수있다4hM 때문에 D 수용체4CNO 처리가 없을 때의 D 수용체 발현은 치료 단계 동안 및 약물 도전에서 감작이 관찰됨에 따라 운동 감작의 발달을 차단하지 않았다 (보충 그림 7). 이러한 데이터는 striatonigral neuron이 반복적 인 약물 사용의 결과 인 장기적인 행동 적응을 조절하는 데 특히 중요 할 수 있음을 시사합니다.
결론적으로, 이들 데이터는 약물 경험-의존적 거동 가소성의 조절에서 striatopallidal 및 striatonigral 뉴런의 중요하고 반대되는 역할에 대한 첫 번째 증거를 제공합니다.. 또한, 암페타민에 대한 급성 운동 반응에 대한 뉴런 억제 효과의 결여는 약물에 대한 급성 반응을 조절하는 메커니즘이 반복되는 약물 노출로 발생하는 지속적인 적응을 조절하는 메커니즘과는 다르다는 추가 증거를 제공한다. 마지막으로, 표현형-특이 적 바이러스 벡터를 세포 기능을 영구적으로 방해하지 않으면 서 뉴런 활성을 변경할 수있는 디자이너 수용체와 쌍을 이루는 것은 중독의 분자 적 기초를 해체하기위한 신규하고 강력한 접근법을 제공한다.
감사의
이 작품은 NIH 보조금 K99 DA024762 (SMF), T32 GM07266 및 T32 GM07108 (DE), T32 AA009455 및 F32 DA026273 (MJW), R21 DA021793 (PEMP), R01 DA023206 (YD), U19MH82441MH21MH021273MHXNUMX (NH) 보조금 지원 ), RXNUMX DAXNUMX (JFN), 대학 과학자 (DE)의 업적 보상 및 NARSAD Distinguished Investigator Award (BLR)
참고자료
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