Minimalizem
Psihostimulantom povzročena sprememba dendritičnih bodic na dopaminoceptivnih nevronih v nucleus accumbens (NAcc) je bila postavljena kot adaptivni nevronski odziv, ki je povezan z dolgotrajnim zasvojenim vedenjem. NAcc je večinoma sestavljen iz dveh ločenih subpopulacij srednje velikih nevronov, ki izražajo visoke ravni dopaminskih D1 ali D2 receptorjev. V tej študiji smo analizirali dendritično gostoto hrbtenice po kroničnem zdravljenju s kokainom v D1 ali D2 receptorjih, ki vsebujejo srednje velike spane nevrone v NAcc. Te študije so uporabile transgenske miši, ki so eksprimirale EGFP pod nadzorom bodisi promotorja D1 ali D2 receptorja (Drd1-EGFP ali Drd2-EGFP). Po 28 dneh zdravljenja s kokainom in 2 dnevi odtegnitve se je gostota hrbtenice povečala tako na Drd1-EGFP- kot tudi na Drd2-EGFP-pozitivne nevrone. Vendar pa se je povečanje gostote hrbtenice ohranilo le v Drd1-EGFP-pozitivnih nevronih 30 dni po odvzemu zdravila. Opazno je bilo, da je bila povečana ekspresija ΔFosB opažena tudi pri pozitivnih nevronih Drd1-EGFP- in Drd2-EGFP po 2 dneh odtegnitve zdravil, vendar le pri pozitivnih nevronih Drd1-EGFP po 30 dneh odtegnitve zdravila. Ti rezultati kažejo, da je povečana gostota hrbtenice, ugotovljena po kroničnem zdravljenju s kokainom, stabilna le pri nevronih, ki vsebujejo D1 receptorje in da je izražanje ΔFosB povezano z nastankom in / ali vzdrževanjem dendritičnih hrbtenic v D1 kot tudi z nevroni, ki vsebujejo receptor D2. v NAcc.
Mezolimbično dopaminergično pot sestavljajo nevroni v ventralnem tegmentalnem območju, ki inervirajo nucleus accumbens (NAcc), vohalne tuberkule, prefrontalni korteks in amigdalo (1), medtem ko nigrostriatalni dopaminergični nevroni v materialu nigra (pars compacta) zagotavljajo naraščajočo projekcijo hrbtnega striatuma (2). Psihostimulanti dvigujejo sinaptične koncentracije dopamina v NAcc: kokain, tako da preprečujejo prevzem dopamina iz sinaptične razpoke in amfetamin, s spodbujanjem sproščanja dopamina iz živčnih terminalov (3-5). Ponavljajoča se intermitentna uporaba psihostimulantov povzroči povečane vedenjske odzive (preobčutljivost) na akutne stimulativne učinke teh zdravil (6-8). Večina dokazov nakazuje, da so prilagoditvene spremembe v ventralnem tegmentalnem območju-NAcc dopaminergičnem sistemu osrednjega pomena za spremembe v plastičnosti, odvisni od izkušenj, ki je podlaga za obnašanje, ki ga povzroča zdravilo.
Poleg dopamina je glutamat potreben za razvoj vedenjske senzibilizacije kot odziv na psihostimulante (9, 10). Srednje velike kosti nevronov (MSN-ji) v ventralnem striatumu prejmejo ekscitatorne glutamatergične projekcije iz prefrontalnega korteksa, ki je sinapsa na glave dendritičnih bodic. MSN-ji so tudi glavna tarča dopaminergičnih aksonov, ki sinapso pripisujejo vratu hrbtenice (1, 11, 12). Zato dendritične bodice v MSN predstavljajo celični oddelek, kjer so na začetku integrirani dopaminergični in glutamatergični prenos.
Dopamin deluje na dve glavni podskupini receptorjev, podskupino D1 (podtipi D1 in D5) in poddružino D2 (podtipi D2, D3 in D4) (13). V dorzalnem striatumu so anatomske študije pokazale, da striatonigralske MSN vsebujejo visoke ravni D1 receptorjev (skupaj s snovjo P in dynorphin), medtem ko striatopalidne MSN številke izražajo D2 receptorje (skupaj z enkefalinom) (14-17). Projekcije iz NAcc so bolj zapletene kot v hrbtnem striatumu, kjer lupina in jedrni deli NAcc projicirajo v ločene podregije ventralnega palliduma in na ventralno tegmentalno področje in substantia nigra (18). Medtem ko so receptorji D2 in enkefalin izrazito izraženi v projekcijah na ventralni palidum, se D1 receptorji in snov P enako porazdeli v projekcijah na ventralno palidum in ventralno tegmentalno območje (19). Študije agonistov in antagonistov, selektivnih za receptorje D1 ali D2, so pokazale, da sta receptorja D1 in D2 potrebna za spremembe vedenjskih sprememb, odvisnih od psihostimulantov (20-25). Vendar se zdi, da so vloge teh receptorjev drugačne. Na primer, stimulacija receptorjev D1 zmanjšuje iskanje kokaina, ki ga povzročajo začetne injekcije kokaina in okoljski znaki, povezani s kokainom, medtem ko stimulacija receptorjev D2 olajša ponovno vzpostavitev kokaina (26-28).
Vedenjske anomalije, povezane s psihostimulacijsko odvisnostjo, so izredno dolgotrajne. Zato je bilo veliko zanimanja za prepoznavanje dolgotrajnih sprememb na molekularni in strukturni ravni, ki jih povzročajo zdravila, v nevronskih vezjih, ki jih regulirajo dopamin in glutamat (29-32). Ugotovljeno je bilo, da je dolgotrajna izpostavljenost kokainu ali amfetaminu povečala število dendritičnih vej in veje MSN-jev v NAcc (33-35). Pokazalo se je, da te strukturne spremembe trajajo do ≈1 – 3.5 mesecev po zadnji izpostavljenosti zdravilu (30, 35) in predlagano je, da so podlaga za dolgotrajne spremembe sinaptične plastičnosti, povezane z izpostavljenostjo psihostimulantom.
Cilj te študije je bil preučiti strukturne spremembe dendritičnih hrbtenic, ki jih povzročajo kokain, v subpopulacijah akumulatorskih MSN, ki izražajo bodisi D1 ali D2 receptorje. V teh študijah smo uporabili transgene miši bakterijskega umetnega kromosoma (BAC), ki eksprimirajo EGFP pod nadzorom bodisi D1 (Drd1-EGFP) ali D2 (Drd2-EGFP) promotorja dopaminskih receptorjev (36). Rezultati kažejo, da čeprav se povečana gostota hrbtenice najprej pojavlja v MSN-jih, ki vsebujejo D1 receptorje, in MSN-jih, ki vsebujejo D2 receptorje, je spremenjena gostota hrbtenice stabilna le pri nevronih, ki vsebujejo D1 receptorje. Še več, najdemo podobne spremembe v izražanju transkripcijskega faktorja ΔFosB, kar kaže, da je lahko ΔFosB vključen v tvorbo in / ali vzdrževanje dendritičnih hrbtenic v D1 kot tudi nevronov, ki vsebujejo D2 receptor v NAcc.
Rezultati
Analiza MSN-jev v transdermalnih miših Drd1-EGFP in Drd2-EGFP BAC.
Projekcijski vzorec MSN-jev iz hrbtnega in ventralnega striatuma v transgenih miših Drd1-EGFP ali Drd2-EGFP BAC smo označili z analizo izražanja GFP (36). Diferencialna ekspresija GFP v MSN hrbtnem striatumu ustreza v splošnem značilnostim endogenih D1 ali D2 receptorjev (36). Nadalje smo analizirali diferencialno izražanje GFP v NAcc v miših Drd1-EGFP ali Drd2-EGFP (Slika 1a in b). Čeprav je ≈58% nevronov v NAcc izražalo GFP v miših Drd1-EGFP (Slika 1a), ≈48% nevronov v NAcc izraženih GFP v miših Drd-2-EGFP (Slika 1b). MSN predstavljajo 90 – 95% vseh nevronov v NAcc (12, 37). D1 receptorji so izraženi samo v MSN, D2 receptorji pa so izraženi v MSN in holinergičnih interneuronih, ki predstavljajo 1 – 3% striatnih nevronov (37). Ob upoštevanju teh dejavnikov rezultati kažejo, da je minimalno ≈10 – 15% MSN-jev v NAcc verjetno izraženih tako D1 kot D2 receptorje.
Analiza dendritičnih hrbtenic v Drd1-EGFP in Drd2-EGFP miših.
Izražanje GFP v miših Drd1-EGFP in Drd2-EGFP je bilo koristno za obarvanje nevronskih celičnih teles. Vendar pa je bil GFP signal v dendritih in dendritičnih hrbtenicah prešibak, da bi omogočil njihovo analizo po imunostinaciji z anti-GFP protitelesi. Pred kratkim je bila za označevanje nevronskih populacij uporabljena balistična dostava fluorescenčnih barv, posredovana z delci.38). S to tehniko lahko označimo celotne nevrone, metoda pa se zdi primerljiva z Golgi-Coxovim barvanjem. Za analizo dendritične morfologije nevronov v NAcc, so bile fiksne rezine z akumulacijo označene z lipofilno fluorescenčno barvo 1,1′-diotadecil-3,3,3, 3′-tetrametilindokarbocijanin perklorat (DiI) z uporabo genske pištole. Primer DiI-obarvane MSN je prikazan v Slika 1c. Pod uporabljenimi pogoji smo na splošno opazili označene nevrone brez kakršnihkoli prekrivajočih se dendriti iz drugih označenih nevronov. Pri večji povečavi je mogoče opaziti podrobno dendritično morfologijo, vključno z dendritičnimi bodicami (Slika 1d).
Nato smo uporabili kombinacijo označevanja DiI in imunohistokemije za GFP bodisi v transgenih miših Drd1-EGFP ali Drd2-EGFP, kar je bilo mogoče z uporabo nizke koncentracije detergenta za permeabilizacijo tkiva (glej Metode). S skrbno primerjavo barve DiI in ekspresije GFP v celičnih telesih MSN smo lahko identificirali DiI- in GFP-pozitivne ali Di-pozitivne in GFP-negativne nevrone v Drd1-EGFP (Slika 2a) ali Drd2-EGFP (Slika 2b) miši. Za naslednje študije smo analizirali dendritično morfologijo le pri DiI- in GFP-pozitivnih nevronih iz miši Drd1-EGFP ali Drd2-EGFP.
Rezultati kroničnega zdravljenja kokaina pri povečani gostoti hrbtenice v naraščajočih MSN številkah, ki izražajo Drd1-EGFP ali Drd2-EGFP.
Mišicam Drd1-EGFP ali Drd2-EGFP so injicirali večkrat s kokainom (30 mg / kg) ali fiziološko raztopino štiri tedne zapored (glejte Metode). Dva dni (2WD) ali 30 dni (30WD) po zadnjem zdravljenju z zdravili so bili možgani obdelani za označevanje z diI in imunohistokemijo, kot je opisano zgoraj. Prejšnja študija je poročala, da je kronično zdravljenje z amfetaminom povečalo gostoto hrbtenice na distalnih, vendar ne proksimalnih dendritih MSN v NAcc (35). Zato smo analizo omejili na distalne dendrite (tj. Na tiste z vejami drugega ali tretjega reda), vključno s terminalnimi regijami. Pri analizi na 2WD se je ugotovilo, da se gostota hrbtenice povečuje v MSN-pozitivnih številkah Drd1-EGFP (128% slane skupine) (Slika 3a in c) in v manjši meri v Drd2-EGFP-pozitivnih nevronih (115% slane skupine) (Slika 3 b in d). Po 30WD se je povečala gostota hrbtenice v Drd1-EGFP-pozitivnih nevronih (118% nadzora slanice) (Slika 3 a in c), vendar ne v pozitivnih nevronih Drd2-EGFP (Slika 3 b in d).
Morfologija dendritičnih trnov je spremenljiva glede na njihovo dolžino in širino glave hrbtenice. Zato smo dendritične izbokline razvrstili v štiri razrede hrbtenice (hrbtenice, gobe, tanke in filopodije) pri 2WD iz kokaina (podatki niso prikazani). Gostota vrste gobe (119.7 ± 4.0%, P <0.01) in tanke bodice (120.0 ± 3.4%, P <0.01) se je povečala z zdravljenjem s kokainom pri Drd1-EGFP-pozitivnih MSN, medtem ko je gostota strmega (182.4 ± 21.6%, P <0.05) in bodice gob (122.5 ± 5.0%, P <0.01) se je povečalo pri Drd2-EGFP pozitivnih MSN. V Drd1-EGFP-pozitivnih nevronih ni prišlo do bistvenega povečanja trmastih bodic ali tankih bodic v Drd2-EGFP-pozitivnih nevronih.
Kronični kokain povzroča ΔFosB izraz v Drd1-EGFP- ali Drd2-EGFP-pozitivnih MSN-jih v NAcc.
ΔFosB je član Fosove družine transkripcijskih faktorjev. Medtem ko akutno dajanje kokaina povzroča hitro in prehodno indukcijo več izooblik Fos v NAcc, ponavljajoča se izpostavljenost kokainu poveča raven ΔFosB. Poleg tega je povečanje izražanja ΔFosB še vedno prisotno v NAcc nekaj tednov ali mesecih po prekinitvi izpostavljenosti zdravilu in je bilo predlagano, da sodeluje pri dolgotrajni regulaciji izražanja genov, tudi po prenehanju jemanja zdravila (29, 39, 40).
Za proučitev indukcije ΔFosB v NAcc iz Drd1-EGFP ali Drd2-EGFP miši po zdravljenju s kokainom smo analizirali izraz FosB in GFP z dvojnim označevanjem (Slika 4 in Tabela 1Anti-FosB protitelesa prepoznajo vse oblike FosB, vendar predpostavljamo, da povečana imunostain predstavlja ΔFosB (glej Metode za nadaljnjo razpravo). V miših, ki so jih zdravili s slanico, je 16% pozitivnih nevronov Drd1-EGFP in 15% pozitivnih nevronov Drd2-EGFP izražalo FosB imunoreaktivnost z relativno šibko intenzivnostjo (Slika 4 a in b in Tabela 1). Ponovno zdravljenje s kokainom, ki mu je sledil 2WD, je povzročilo znatno povečanje števila Drd1-EGFP-pozitivnih nevronov, ki so sooblikovali ΔFosB (55% GFP-pozitivnih nevronov) (Slika 4c in Tabela 1). Manjše, vendar še vedno znatno povečanje izražanja ΔFosB je bilo ugotovljeno pri pozitivnih nevronih Drd2-EGFP (25% GFP-pozitivnih nevronov) (Slika 4d in Tabela 1). Podobno kot pri spremembah gostote hrbtenice se je povečana izraženost ΔFosB ohranila v pozitivnih nevronih Drd1-EGFP (46% GFP-pozitivnih nevronov), ne pa tudi v pozitivnih nevronih Drd2-EGFP (15% GFP-pozitivnih nevronov). 30WD (Slika 4 e in f in Tabela 1). Upoštevajte, da je povečana izraženost ΔFosB, opažena v Slika 4f je prisoten v negativnih nevronih Drd2-EGFP.
Razprava
Dolgotrajne prilagoditve pri dopaminergičnih nevrotransmisijah naj bi temeljile na zasvojenosti, ki so povezane s psihostimulacijskimi zdravili. Predvidevali smo predvsem, da so povečanja gostote dendritičnih hrbtenic MSN-jev v NAcc, ki jih povzročajo psihostimulanti, povezana z reorganizacijo sinaptične povezljivosti (30). NAcc je večinoma sestavljen iz dveh ločenih subpopulacij MSN-jev, ki izražajo visoke ravni dopaminskih receptorjev D1 ali D2. V tej študiji smo analizirali gostoto hrbtenice v posameznih MSN D1 ali D2 receptorskih MSN-jih v NAcc po kroničnem zdravljenju kokaina. Dobljeni rezultati kažejo, da čeprav se povečana gostota hrbtenice najprej pojavlja v MSN-jih, ki vsebujejo D1 receptorje, in MSN, ki vsebujejo D2 receptorje, je spremenjena gostota hrbtenice stabilna le pri nevronih, ki vsebujejo D1-receptor. Še več, najdemo podoben vzorec sprememb izražanja transkripcijskega faktorja ΔFosB v MSN-jih, ki vsebujejo D1 in D2 receptorje.
V teh študijah so uporabili BAC transgene miši, ki izražajo GFP v specifičnih subpopulacijah MSN-jev pod nadzorom promotorja D1 ali D2 receptorjev. Poleg tega smo razvili metodo dvojnega označevanja, ki združuje imunohistokemijo za GFP z balističnim označevanjem nevronov z uporabo DiI. Prejšnje študije so uporabile metodo Golgi-Cox za analizo učinka psihostimulantov na gostoto hrbtenice (34), in uporabljena metoda DiI je dala rezultate, ki so bili kvantitativno primerljivi. Razvili smo metodo dvojnega označevanja, ker Golgijevo barvanje ni združljivo z imunohistokemijo. Imunsko barvanje običajno zahteva permeabilizacijo tkiva z detergenti, postopek, ki običajno vodi do solubilizacije lipofilnih barvil iz membrane (38). Vendar pa v naših trenutnih študijah imunobarvanje GFP ni zahtevalo visoke koncentracije detergenta za permeabilizacijo tkiva in se je zato lahko uporabljalo v povezavi z označevanjem lipofilnega barvila. Naša metoda dvojnega označevanja bi morala biti na splošno uporabna za študije strukturnih sprememb v dendritičnih hrbtenicah, na primer ko se uporabljajo za analizo BAC transgenih mišjih linij, kjer se GFP izraža v specifičnih populacijah nevronov v skorji (36).
Čeprav je še vedno nekoliko sporna, se domneva, da so receptorji D1 in D2 večinoma anatomsko ločeni od neposrednih (striatonigral) in posrednih (striatopalidnih) striatnih projekcijskih nevronov (17, 41). Začetna karakterizacija lokalizacije GFP v miših Drd1-EGFP in Drd2-EGFP je bila v skladu s tem sklepom (36). Poleg tega je naša analiza števila GFP-pozitivnih nevronov v NAcc iz miši Drd1-EGFP in Drd2-EGFP skladna z zaključkom, da ≈50% MSN izraža samo D1 receptorje, da ≈35 – 40% izražajo samo D2 receptorje, in da ≈10 – 15% izražata tako D1 kot D2 receptorje. Ta vrednost koekspresije je podobna tisti, ki jo predvidevajo študije dorzalnega striatuma, ki so združevale analizo z objemkami z objemkami posameznih striatnih nevronov s tehnikami RT-PCR za izolacijo in amplifikacijo mRNA (≈17% koekspresija enkefalina in snovi P) (42). Treba je opozoriti, da naše trenutne študije ne obravnavajo vprašanja izražanja D3, D4 in D5 receptorjev, niti ne obravnavajo vprašanja nizkih ravni izražanja D1 receptorjev v MSN, ki izražajo visoke ravni D2 receptorjev ali obratno.
Več predhodnih študij je preučilo lokalizacijo nevronske FOS ekspresije, ki jo povzroča psihostimulant, in vlogo receptorjev D1 in D2 (43-45). Te študije so podprle sklep, da indukcijo Fos in ΔFosB posredujeta aktivacija receptorjev D1. Vendar na celično lokalizacijo Fosove ekspresije vpliva okoljski kontekst, v katerem se dajejo psihostimulacijska zdravila (46, 47). Na primer, amfetamin ali kokain, ki ga daje domača kletka, prednostno inducira takojšnje zgodnje gene (vključno s Fosom) prednostno v celicah P-pozitivnih celic, ki soobstojajo receptorje D1. V nasprotju s tem lahko ta zdravila inducirajo ekspresijo Fos v MSN D1 in D2 receptorskih vsebnikih, ko se dajejo v novem okolju. Protokol, ki smo ga uporabili v naših trenutnih študijah, ni vključeval vbrizgavanja zdravil za seznanjanje z izpostavljenostjo novemu okolju. Vendar ne moremo izključiti neke vrste kontekstno odvisnega stresa, ki je odgovoren za izražanje ΔFosB v MSN-jih, ki vsebujejo D2 receptorje.
Pomembna značilnost sedanjih rezultatov je vzporedni vzorec povečane gostote hrbtenice in izražanja ΔFosB. Povečana gostota hrbtenice in izražanje ΔFosB sta se najprej pojavili v MSN, ki izražata Drd1-EGFP in Drd2-EGFP. Vendar so bile te spremembe stabilne le pri nevronih, ki vsebujejo D1 receptorje. Ena od možnih razlag za opažanje, da se je povečana gostota hrbtenice in ekspresija ΔFosB začasno našla v nevronih, ki vsebujejo D2 receptorje, je, da se je to zgodilo v majhnem delu MSN-jev, ki izražajo tako D1 kot D2 dopaminske receptorje. Zato je lahko prehodna narava teh povečanj povezana z antagonističnimi učinki aktivacije D2 receptorjev na signalne poti, odvisne od D1 (48). Zanimivo je, da so bile spremembe v gostoti hrbtenice in ekspresiji ΔFosB reverzibilne, kar lahko odraža sposobnost signalnih poti, odvisnih od D2 receptorja, da vplivajo na stabilnost ΔFosB.
Opazovanje, da obstajajo vzporedne spremembe v izražanju ΔFosB in gostote hrbtenice, je skladno z idejo, da je ΔFosB vključen v začetno tvorbo in nadaljnje vzdrževanje dendritičnih hrbtenic v nevronih, ki vsebujejo D1 receptorje v NAcc. Izraz ΔFosB je pod nadzorom signalne poti D1 / DARPP-32 / PP1 v MSN-jih (49). Več študij je pokazalo, da igra ΔFosB pomembno vlogo pri nagrajevanju in lokomotornem aktiviranju psihostimulantov (39), verjetno z vplivom na izražanje več genov, ki vključujejo receptorje nevrotransmiterjev, signalne beljakovine in beljakovine, ki sodelujejo pri regulaciji morfologije nevronov (50). Vendar pa specifični molekularni mehanizmi, vključeni v kronično kokainsko povzročeno tvorbo hrbtenice, trenutno niso znani. Naše prejšnje študije so pokazale, da intraokumalna infuzija inhibitorja Cdk5 roscovitin oslabi povečanje gostote hrbtenice, povzročeno s kokainom (51). Poleg tega je Cdk5 spodnji ciljni gen za ΔFosB in je bil vključen v kompenzacijske prilagoditvene spremembe, povezane s kroničnim zdravljenjem s kokainom (52). Zato je sprememba fosforilacije, odvisne od Cdk5, verjeten mehanizem, ki je podlaga za tvorbo hrbtenice, ki jo povzroča kokain, in / ali stabilnost hrbtenice. PAK (53), β-katenin (54), PSD-95 (55) in spinophilin (56) so substrati za Cdk5 in so vsi vključeni v regulacijo morfogeneze hrbtenice (57-60). Nadaljnja karakterizacija teh in drugih substratov Cdk5 v bodicah bo, upajmo, osvetlila mehanizme, ki sodelujejo pri uravnavanju tvorbe hrbtenice s psihostimulanti.
Metode
Živali.
Miši z EGFP transgenom pod nadzorom dopaminskih receptorjev D1 ali D2 so nastali s transgenskim projektom Gensat BAC (36). Transgenske miši, uporabljene v tej študiji, so bile stare 4 – 5 tedne in so bile na švicarsko-websterjevem ozadju. Miševe so vzdrževali v ciklu svetlobe / temne 12: 12-h in jih namestili v skupine 2-5 s hrano in vodo, ki je bila na voljo ad libitum. Vsi živalski protokoli so bili v skladu z navodili Nacionalnega inštituta za zdravje za oskrbo in uporabo laboratorijskih živali in jih je odobril Rockefeller University Institutional Animal Care in Use Odbor.
Zdravljenje z drogami.
Poročali so, da zdravljenje s kroničnim kokainom (30 mg / kg na dan) povzroči močno povečanje gostote hrbtenice MSN v jedru in lupini NAcc iz podgane, toda nižji odmerek (15 mg / kg) je povečal gostoto hrbtenice le v lupina (61). Zato smo uporabili višji odmerek kokaina za induciranje strukturne spremembe v obeh delih NAcc. Miši so prejele eno injekcijo (ip) 30 mg / kg kokain-HCl (ali fiziološke raztopine) vsak dan za 5 zaporednih dni, čemur so sledili dnevi brez injiciranja 2 in ta postopek se je ponovil za 4 zaporednih tednov. Injekcije so bile izvedene v domači kletki. 2WD ali 30WD, mišji možgani smo obdelali za označevanje DiI in / ali imunohistokemijo.
Balistično označevanje z fluorescentno barvilo DiI.
Miši smo anestezirali z 80 mg / kg natrijevega pentobarbitala in perfundirali transkardialno z 5 ml PBS, čemur je sledila hitra perfuzija z 40 ml 4% paraformaldehida v PBS (20 ml / min). Možgane so hitro odstranili iz lobanje in jih postavili v 4% paraformaldehid za 10 min. Rezine možganov (100 μm) so bile označene z balistično dostavo fluorescentnega barvila DiI (Molecular Probes), kot je opisano v ref. 38. Razvita je bila kombinirana metoda označevanja z imunohistokemijo z nizko koncentracijo detergenta. Di-označene sekcije so permeabilizirane z 0.01% Triton X-100 v PBS za 15 min in nato inkubirane v 0.01% Triton X-100 in 10% normalnem kozjem serumu v PBS za 1 h, da se zmanjša nespecifično označevanje. Tkivne dele nato inkubiramo z 1% normalnim kozjim serumom / 0.01% Triton X-100 in anti-GFP protitelesom (Abcam, Cambridge, MA) za 2 h pri sobni temperaturi, izperemo in inkubiramo v 1: 1,000 razredčini FITC- konjugiranih sekundarnih protiteles (Molecular Probes). Odseki so bili postavljeni na mikroskopska stekelca in prekrita z montažnim medijem. Metoda balističnega označevanja je omogočila podrobno analizo dendritične hrbtenične strukture, rezultati pa so bili kvalitativno in kvantitativno primerljivi s prejšnjimi študijami z impregnacijsko metodo Golgi-Cox v rezinah možganov podgan (34). V nasprotju s prejšnjimi raziskavami smo redko opazili dvoglave bodice v DiI-obarvanih nevronih. Ta razlika je lahko posledica občutljivosti metod obarvanja ali variabilnosti miši (ta študija) v primerjavi s tkivom podgan (34).
Imunohistokemija.
Živali smo anestezirali in perfuzirali, kot je opisano zgoraj. Mase so bile odstranjene in shranjene preko noči v 4% paraformaldehidu na 4 ° C. Možgane smo prenesli v 30% saharozo v PBS raztopini za krioprotekcijo. Koronalni odseki (12 μm) smo razrezali na zamrzovalni mikrotom (Leica) in nato obdelali za imunohistokemijo. Sekcije možganov smo nato permeabilizirali v 0.3% Triton X-100 v PBS za 15 min in splaknili dvakrat v PBS. Razdelki so bili predhodno inkubirani v serumu 10% normalnih koz v PBS za 1 h pri 37 ° C, izpostavljeni primarnim protitelesom (razredčenim v serumu 1% normalnih kozjih serumov v PBS) čez noč na 4 ° C in nato sprani v PBS in inkubirani s sekundarnimi \ t protiteles za 1 h pri 37 ° C. Uporabljena so bila naslednja protitelesa: kunčji anti-pan-FosB (SC-48, 1: 500; Biotehnologija Santa Cruz), mišji anti-NeuN (Chemicon), kunčji anti-GFP, FITC-konjugirani anti-kunčji IgG in rodamin- konjugiranih anti-mišjih IgG (Molecular Probes). Za trojno označevanje (ΔFosB, NeuN in GFP) so bili možganski odseki najprej imunsko obarvani z anti-pan FosB protitelesom in anti-NeuN protitelesom in nato inkubirani s sekundarnimi protitelesi (rhodamin-konjugiran anti-kunčji IgG in cian-konjugiran anti-mišji IgG). ). Dvojno obarvani možganski odseki so bili nadalje obdelani za GFP imunološko barvanje z Zenonovo tehnologijo označevanja (Zenon Alexa Fluor 488, Molecular Probes). Protitelo proti pan-FosB smo dvignili na N konec FosB in prepoznali ΔFosB in FosB polne dolžine (62). Na podlagi predhodnih študij, ki so pokazale, da se ΔFosB, ne pa FosB ali drugi antigeni, povezani s Fos, po kroničnem zdravljenju s kokainom stabilno izraža, predpostavljamo, da dolgotrajno povečanje imunoreaktivnosti predstavlja stabilno izražanje ΔFosB. Vendar identiteta imunoreaktivnega FosB signala, opaženega pri miših, ki so jih zdravili s slanico, ni znana. Statistična analiza v letu 2007. \ T Tabela 1 uporabil študentsko t test.
Analiza dendritične hrbtenice.
Posamezne MSN številke v NAcc so bile izbrane za analizo hrbtenice na podlagi več kriterijev. (i) Z drugimi označenimi celicami ni bilo prekrivanja z minimalnimi ali ničmi, kar bi zagotovilo, da procesi iz različnih celic ne bi bili zmedeni. (ii) Vsaj trije primarni dendriti morajo biti vidni, da se celice uporabijo za analizo. (iii) Preučeni so bili distalni dendriti (končni dendriti ali blizu končnega dendrita). Analizirani so bili dendriti obeh MSN v jedru in lupini NAcc. Čeprav smo opazovali redko trnjene MSN (bodicasti tip II), smo analizirali le gosto trnaste MSN (bodicasti tip I). Za izračun gostote hrbtenice smo z uporabo konfokalnega mikroskopa (Zeiss LSM 20) z oljno potopno lečo (× 510) izsledili dolžino dendrita (> 40 μm). Vse slike dendrita so bile posnete različno z (0.5 – 1 μm globinski intervali) za preučevanje morfologije dendritičnih bodic. Vse meritve so bile izvedene s programsko opremo za analizo metamorfnih slik (Universal Imaging, Downingtown, PA). Statistična analiza je uporabila Kolmogorov-Smirnov test.
Protrusi iz dendritov so bili razvrščeni v štiri vrste glede na njihovo dolžino, kot je opisano v ref. 63 in 64. Izrastki razreda 1, imenovani tudi trmaste izbokline, so bili dolgi <0.5 μm, niso imeli velike glave hrbtenice in niso imeli vratu; bodice razreda 2 ali gobe so bile dolge med 0.5 in 1.25 μm, značilni pa so bili kratki vrat in velika glava hrbtenice; razred 3 ali tanke bodice so se gibale med 1.25 in 3.0 μm in so imeli podolgovate hrbtenice z majhnimi glavami; razred 4 ali filopodialni podaljški so bili dolgi nitasti izrastki, v katerih ni bilo opazne glave hrbtenice.
Priznanja
To delo so podprli z donacijo DA10044 za javno zdravstvo Združenih držav (PG in ACN) ter fundacijo Simons, fundacijo Peter J. Sharp, fundacijo Picower in fundacijo FM Kirby.
Okrajšave
- NAcc
- nucleus accumbens
- MSN
- srednje velik kičasti nevron
- BAC
- bakterijski umetni kromosom
- Drd1
- pogonskega receptorja D1 dopaminskega receptorja
- Drd2
- pogonskega receptorja D2 dopaminskega receptorja
- DiI
- 1,1′-diotadecil-3,3,3 X, 3′-tetrametilindokarbocijanin perklorat
- 2WD
- 2 dni po zadnjem zdravljenju z zdravili
- 30WD
- 30 dni po zadnjem zdravljenju z zdravili.
Reference
;
