PMCID: PMC2820240
NIHMSID: NIHMS174679
Minimalizem
Kokainsko povzročene spremembe v izražanju genov povzročajo spremembe v nevronski morfologiji in obnašanju, ki so lahko podlaga za odvisnost od kokaina. Ugotovili smo bistveno vlogo za histon 3 lizin 9 (H3K9) dimetilacijo in lizin-dimetiltransferazo G9a pri kokainsko povzročeni strukturni in vedenjski plastičnosti. Ponovna uporaba kokaina je zmanjšala globalno raven dimetilacije H3K9 v nucleus accumbens. Tnjegovo zmanjšanje metilacije histona je bilo posredovano z zatiranjem G9a v tej možganski regiji, ki jo je reguliral kokain-induciran transkripcijski faktor ΔFosB. Z uporabo pogojne mutageneze in prenosa genov, posredovanih z virusi, smo ugotovili, da je znižanje G9a povečalo dendritično plastičnost hrbtenice nevronov nucleus accumbens in povečalo prednost kokaina, s čimer je bila ugotovljena ključna vloga metilacije histona pri dolgotrajnem delovanju kokaina.
Predstavitev
Za ponavljajočo se izpostavljenost kokainu so značilne trajne spremembe v izražanju genov in spremenjena morfologija nevronov v jedru nucleus accumbens (NAc), ki je ključna sestavina možganovih nagradnih vezij (1-2). Preoblikovanje kromatina je pomembno pri aberantnih transkripcijskih spremembah v tej možganski regiji, ki so lahko osnova za odvisnost od kokaina (3-9). Kokainska regulacija strukture kromatina v NAc povzroča deloma neposredne kokainsko inducirane modifikacije kromatinskega encimskega stroja, kar vodi do sprememb acetilacije in fosforilacije histona (4, 7-9); vendar pa vloga za encime, ki nadzorujejo metilacijo histona, še ni bila raziskana.
Nedavna genetsko-promotorska analiza z uporabo kromatinske imunoprecipitacije, združene z mikropostroji (ChIP-Chip), je odkrila spremenjene vzorce represije histonskega H3 lizina 9 (H3K9) in 27 (H3K27) metilacije na specifičnih promotorjih gena v NAc po večkratnem zdravljenju s kokainom (6). Zato smo profilirali številne lizin-metiltransferaze (KMT) in demetilaze (KDMs), za katere je znano, da nadzirajo metilacijo H3K9 ali H3K27 (Slika 1A). Samo dva encima, G9a in GLP, sta pokazala obstojno transkripcijsko regulacijo 24 ur po ponovni uporabi kokaina, ko je bila izraženost obeh genov znatno zmanjšana.. Ker G9a in GLP specifično katalizirata dimetilacijo H3K9 (H3K9me2), je njihova dolgotrajna regulacija s kokainom skladna z zmanjšanjem svetovnih ravni eukromatskega H3K9me2, opaženega v tej časovni točki (Slika 1B). Nasprotno pa so globalne ravni metilacije heteroksromatičnih H3K27 ostale nespremenjene zaradi ponavljajoče se izpostavljenosti kokainu (Slika S1 pri podpori spletnega gradiva). Zaradi visoke stopnje katalitične aktivnosti in vitro in vivo (10), smo se odločili, da bomo nadalje raziskali funkcionalni pomen represije G9a po večkratni izpostavljenosti kokainu v NAc. Ravni beljakovin G9a, podobno kot ravni njegove mRNA, so bile znatno zmanjšane za 24 ur po ponovni uporabi kokaina (Slika S2). Čeprav je bila ekspresija mRNA G9a v NAc zmanjšana za 35%, je imunohistokemijska analiza pokazala manjše zmanjšanje koncentracij G15a na beljakovine 9%, kar je v skladu z opaženim zmanjšanjem 21% H3K9me2 po večkratnem dajanju kokaina (Slika 1B). Izražanje mRNA G9a je bilo tudi v tej regiji možganov znižano z 20% po ponavljajočem se samoupravljanju kokaina (Slika S3).
Da bi ugotovili, ali spremembe v eukromatskem H3K9me2 korelirajo s spremembami genske ekspresije v NAc v celotnem genomu, smo uporabili mikromrežne analize za pregled profilov genske ekspresije, ki jih povzroča izzivna doza kokaina pri živalih s predhodno izpostavljenostjo kokainu ali brez nje seznamov genov v Tabele S1 – S3). Živali, ki so prejemale ponavljajoči se kokain, so pokazale izrazito povečano izražanje gena 1 uro po izzivu kokaina v primerjavi z akutno obdelanimi živalmi (Slika 1C). To povečano izražanje genov se je še vedno pojavilo kot odziv na izziv kokaina, ki je bil dan po 1 tednu umika iz ponovljenega kokaina. V skladu s prejšnjimi poročili je majhen odstotek genov (~ 10%) pokazal desenzibilizirane transkripcijske odzive po večkratni uporabi kokaina (Slika 1C; glej Tabela S1) (5). Da bi neposredno raziskali vlogo znižane regulacije G9a pri povečani genski ekspresiji, opaženi po večkratnem kokainu, so miši prejeli intra-NAc injekcije vektorjev Herpes simplex virusa (HSV), ki izražajo bodisi GFP ali G9a in so bili obdelani s fiziološko raztopino ali ponovljenim kokainom, da bi ugotovili, ali je G9a prekomerna ekspresija je zadostoval za blokiranje ponavljajočega povečanja izražanja genov, povzročenega s kokainom. Iz niza 12 naključno izbranih genov, ki kažejo povečano raven izražanja po ponovljenem kokainu, smo opazili, da je G9a znatno zmanjšala povečano izražanje 50% teh genov (Tabela S4).
Da bi identificirali dogodke v transkripciji, ki posredujejo v ponavljajoči se represiji G9a pri kokainu, smo raziskali možno vlogo ΔFosB, visoko stabilnega produkta spajanja iz zgodnjega zgodnjega gena. fosB. ΔFosB se kopiči v NAc po večkratni izpostavljenosti kokainu, kjer je bil povezan s povečano nagrado za kokain (11). ΔFosB lahko deluje bodisi kot transkripcijski aktivator ali represor, odvisno od zadevnega ciljnega gena (\ t3, 5, 6, 12). Uporaba bitransgeničnega NSE-TA × tetOP-ΔFosB miši, kjer lahko ekspresijo ΔFosB selektivno induciramo v NAc in dorzalni striatum odraslih živali (13) smo preučili vpliv izraza ΔFosB na regulacijo kokaina H3K9me2 in KMT v NAc. Prekomerna ekspresija ΔFosB je zadostovala za zmanjšanje ravni obeh H3K9me2 (Slika 1D) in izraz G9a (Slika 1E), s čimer posnema učinke ponovljenega kokaina. Nasprotno, ΔFosB ni zmanjšal ekspresije GLP v tej možganski regiji in ni vplival na SUV39H1 in EZH2, glavne trimetilirne encime za H3K9 oz. H3K27 (Slika S4). Za potrditev teh podatkov z uporabo neodvisnega sistema prekomerne ekspresije ΔFosB so odrasle miši divjega tipa prejele dvostranske intra-NAc injekcije vektorjev Adeno-povezanega virusa (AAV), ki izražajo bodisi GFP ali ΔFosB. Prekomerna ekspresija ΔFosB, ki jo povzroča virus, zmanjšuje izražanje G9a v tej možganski regiji (Slika 1E).
Takšna izrazita in specifična regulacija G9a nas je spodbudila, da smo raziskali, ali spreminjanje izražanja G9a posebej pri NAc nevronih uravnava vedenjske odzive na kokain. Wildpepe miši so prejele intra-NAc injekcije HSV vektorjev, ki izražajo GFP ali G9a, in so bile nato analizirane z uporabo nepristranske paradigme kokainsko pogojene lokacije, ki zagotavlja posredno merilo nagrajevanja z zdravili. Po vedenjskem testiranju je bila potrjena prekomerna ekspresija virusa G9a v nevronih NAc.Slika 2A). Prekomerna ekspresija G9a je znatno zmanjšala preferenco za kokain v primerjavi z živalmi, ki prekomerno izražajo GFP (Slika 2B) in povečali ravni H3K9me2 v NAc (Slika 2C). Prekomerna ekspresija katalitsko mrtvega mutanta G9a (G9aH1093K) (14) ni vplivala na prednost kokaina (Slika 2B) in ni vplivala na ravni H3K9me2 v tej regiji možganov (Slika 2C).
Za nadaljnjo študijo o vlogi G9a pri vedenjskih učinkih kokaina in natančneje na posnemanje ponavljajoče se zavrtja izražanja G9a pri kokainu v NAc, odrasli G9afl / fl miši (14) so prejeli intra-NAc injekcije AAV vektorjev, ki izražajo Cre rekombinazo ali GFP kot kontrolo. AAV-Cre, odpornost na G9a v NAc, ki je bila potrjena imunohistokemično (Slika S5), so znatno povečale učinke kokaina in kvantitativno zmanjšale koncentracije H3K9me2 v NAc (Slika 2D, E). Komercialno dostopen farmakološki zaviralec G9a in GLP, BIX01294 (15-16), je bila uporabljena za ugotavljanje, ali zaviranje encimov podobno vpliva na vedenjske odzive na kokain. Dejansko je farmakološka inhibicija G9a in GLP znatno povečala prednost kokaina in zmanjšala H3K9me2 v NAc (Slika 2F, G).
Ponavljajoče dajanje kokaina povečuje gostoto dendritičnih hrbtenic na srednjih živčevjah NAc (17), proces, povezan s funkcionalnimi spremembami pri ekscitatornih glutamatergičnih sinapsah na te nevrone (18-19) in senzibilizirane vedenjske odzive na zdravilo (17, 20). Tako smo domnevali, da lahko zmanjšanje aktivnosti G9a v NAc s ponavljajočim se kokainom posreduje zmožnosti kokaina, da uravnava dendritično gostoto hrbtenice NAc nevronov. Z uporabo imunoprecipitacije s kromatinom (ChIP) z anti-G9a protitelesom smo identificirali več domnevnih G9a genskih ciljev v NAc, od katerih je vsaka prej vključena v dendritično plastičnost, povzročeno s kokainom (Slika 3A) (20-26). Ugotovili smo, da ponavljajoča uporaba kokaina znatno zmanjša vezavo G9a, kot tudi ravni H3K9me2, pri teh genskih promotorjih (Slika 3B). V nasprotju s tem pa je akutna uporaba kokaina hitro vključila G9o v nekatere od teh istih promotorjev genov, kar je v skladu z večjo izraženostjo G9a, ki so jo opazili v NAc 1 uri po akutnem odmerku kokaina (Slika S6). Čeprav se G9a vezava na specifične promotorje gena korelira s spremembami v njeni ekspresiji, ostaja nejasno, ali so takšni dogodki posredovani s spremenjenimi globalnimi ravnmi G9a v NAc in / ali z razlikami v zaposlovanju G9a po akutnem vs kokaina.
Na podlagi G9a regulacije številnih genov, povezanih s plastičnostjo v NAc, smo neposredno preverili, ali je vzdrževanje izražanja G9a v tej možganski regiji po ponovljenem zdravljenju s kokainom zadostovalo za blokiranje dendritične hrbtenice, ki jo povzroča kokain. Uporaba protokola za zdravljenje kokaina, za katerega je bilo prej dokazano, da spodbuja dendritično indukcijo hrbtenice v NAc (20) smo pregledali gostoto hrbtenice pri živalih, ki so jim bile injicirane bodisi HSV-GFP ali HSV-G9a. V skladu s prejšnjimi ugotovitvami smo opazili znatno povečanje gostote dendritičnih hrbtenic v NAc po zdravljenju s kokainom, kar je bil učinek, ki ga je G9a prekomerno izražanje popolnoma blokirala (Slika 3C). Prekomerna ekspresija G9a sama po sebi ni bila dovolj za zmanjšanje gostote NAc dendritične hrbtenice v odsotnosti kokaina. Za dopolnitev teh podatkov, G9afl / fl miši, ki so prejele intra-NAc injekcije HSV-Cre, smo določili gostoto hrbtenice in jo primerjali z živalmi, ki so prejemale HSV-GFP v odsotnosti kokaina. Izločanje izražanja G9a je pomembno povečalo gostoto hrbtenice na NAc srednjih živčnih nevronih (Slika 3C).
Glede na dokaz, da je G9a navzdol v NAc po ponovljenem kokainu posredovan z ΔFosB, smo nato preverili, ali je ta transkripcijski faktor prav tako vključen v regulacijo NAc dendritičnih bodic. Čeprav ΔFosB prej ni bil vzročno povezan s takšno dendritično plastičnostjo, je bilo nekaj njegovih tarč, vključno s podenotami Cdk5 in NFκB, tako implicirane (20-23), in trajna ekspresija ΔFosB v NAc nevronih korelira s povečano gostoto dendritične hrbtenice po večkratnem zdravljenju s kokainom. (27). Najprej smo ugotovili, da indukcija ΔFosB v bitransgenskih miših v odsotnosti kokaina, ki je zmanjšala ekspresijo G9a in H3K9me2 (Slika 1D, E), zmanjšana vezava G9a na številne gene, povezane s plastičnostjo, od katerih so se mnoge pokazale tudi kot neposredne tarče samega ΔFosB (Slika 3D) (3, 6). V nadaljevanju smo pokazali, da je prekomerna ekspresija virusa ΔFosB v NAc bistveno povečala dendritično gostoto hrbtenice pri bazalnih pogojih, podobno kot pri večkratni uporabi kokaina (\ tSlika 3E). Nasprotno pa je prekomerna ekspresija v NAc ΔJunD, ki je dominantni negativni mutantni protein, ki antagonizira transkripcijsko aktivnost ΔFosB, blokirala sposobnost ponovljenega kokaina, da poveča nastanek dendritične hrbtenice v NAc. (Slika 3C).
Naše opazovanje, da ΔFosB uravnava izražanje G9a v NAc in da ΔFosB in G9a uravnavata nekatere iste ciljne gene, nas je pripeljalo do preučitve drugih interakcij med ΔFosB in G9a. Po akutnem kokainu, ko je bila koncentracija zdravila G9a povišana, se je G9a vezala na fosB gen, ki se je po ponovnem kokainu, ko je bila ekspresija G9a potlačena, G9a vezala na fosB gen zmanjšal (Slika 3A). Za tako zmanjšano vezavo G9a po ponovljenem kokainu niso opazili c-fos, kjer se vezava G9a poveča s ponovljenim kokainom (Slika S7). To je v skladu z dejstvom, da za razliko od tega fosB, c-fos kronična izpostavljenost psihostimulantom (\ t5). Prekomerna ekspresija ΔFosB pri bitransgenskih miših je bila zadostna za znatno zmanjšanje vezave G9a na fosb gen (Slika 3D). Poleg tega je bila prekomerna ekspresija G9a zadostna za zmanjšanje izražanja ΔFosB po ponavljajoči se uporabi kokaina (Tabela S4). Ti podatki kažejo na avtoregulacijsko zanko, pri kateri G9a na začetku omeji indukcijo ΔFosB z akutno uporabo kokaina. Ker se ΔFosB kopiči pri ponavljajoči se izpostavljenosti zdravilu, zavira G9a in s tem poveča svojo lastno nadaljnjo indukcijo.
V zaključku smo pokazali, da je metilacija histonskega lizina v NAc kritično vključena v uravnavanje izražanja nevronskih genov kot odziv na kokain. Represija G9a in H3K9me2 po ponavljajoči se aplikaciji kokaina delno spodbuja prednost kokaina s transkripcijsko aktivacijo številnih genov, za katere je znano, da regulirajo nenormalne oblike dendritične plastičnosti. Boljše razumevanje genov, ki jih urejajo takšni mehanizmi, bo izboljšalo naše znanje o kompleksnih bioloških osnovah odvisnosti od drog in bi lahko pripomoglo k razvoju učinkovitejših oblik zdravljenja zasvojenosti.
Materiali in metode
Živali in zdravljenje
Če ni drugače navedeno, so bile miši nameščene štiri do pet na kletko v koloniji s ciklom svetlobe / temne 12 ure (luči od 7: 00 AM do 7: 00 PM) pri konstantni temperaturi (23 ° C) s ad libitum dostop do vode in hrane. Vse živalske protokole je potrdil IACUC na UT Southwestern Medical Center in Medicinski fakulteti Mount Sinai.
Za eksperimente s kokainom [imunohistokemija, Western blotting, kvantitativna PCR (qPCR), analiza mikromrež in analiza kromatin imunoprecipitacije (ChIP)] so uporabili moške C8BL / 10J-57-tedenske moške C6BL / 7J. Živali so dnevno prejemale injekcije bodisi "fiziološke raztopine" (zdravljenje s fiziološko raztopino 6, ip), „akutnega“ kokaina (zdravljenje s snovjo 20 + eno zdravljenje 7 mg / kg kokain-HCl, ip) ali „ponavljajočega se kokaina“ (zdravljenje z zdravilom 20 mg / kg) kokain-HCl, ip). Miši smo žrtvovali bodisi po 1 uri bodisi po 24 urah po končni obdelavi. Pri študijah z mikromrežami so živali dnevno zdravili s "fiziološko raztopino" (zdravljenje s fiziološko raztopino 15, ip), "akutnim" kokainom (zdravljenje z zdravilom 14 slanina + zdravljenje z 1 20 mg / kg kokain-HCl, ip), "ponovljen + akutni" kokain ( Zdravljenje z zdravilom 7 fiziološka raztopina + zdravljenje z zdravilom 8 20 mg / kg kokain-HCl, ip) ali „ponavljajoče se odtegnitev + akutni“ kokain (zdravljenje z zdravilom 7 20 mg / kg kokain-HCl + zdravljenje z zdravilom 7 slanina + zdravljenje z 1 20 mg / kg kokain-HCl, ip) in so bili žrtvovani 1 uro po končni obdelavi. V vedenjskih poskusih smo miši posamično namestili po operaciji in jih zdravili z 10 mg / kg kokain-HCl, ip, kot je opisano spodaj. Za analizo dendritične hrbtenice in validacijo mikromrež po okužbi s HSV-GFP in HSV-G9a-GFP so miši zdravili s "fiziološko raztopino" (zdravljenje s fiziološko raztopino 5, ip) ali "ponavljajoč kokain" (zdravljenje z 5 20 mg / kg kokain-HCl, ip) ) v času 3 dni, ker je bilo dokazano, da ta injekcijski protokol povečuje gostoto hrbtenice na nevronih nucleus accumbens (NAc) v časovnem obdobju transgenske ekspresije Herpes simplex virusa (HSV) (Dodatni ref S1). Miši, uporabljene za analizo dendritične hrbtenice, so žrtvovali 4 ur po zadnjem zdravljenju.
Za induciranje lokalnega izbrisa transkripta G9a, omejenega na NAc nevrone, smo uporabili mutirane miši, homozigotne za flokiran alel G9a, ki so bile podrobno opisane drugje (S2). Cre-inducirana rekombinacija proizvaja ekson 22 za spajanje izven okvirja 25, kar vodi do nesmiselnega razpada mutiranega transkripta. Uporabili smo G9a plavajoče miši, ki so bile povsem prekrite z mišmi C57BL / 6J. Miši so bile sterotaksično vbrizgane v NAc z vektorji Adeno-povezanega virusa (AAV) (serotip 2), ki izražajo GFP ali Cre-GFP med starostjo 7 in 10 tednov. Imunohistokemično analizo smo uporabili za preverjanje učinkovitosti Cre-posredovane rekombinacije (glej Dodatna slika S5). Živali, ki so bile injicirane z zdravilom AAV, smo uporabili 21 dni po operaciji, ker je bila rekombinacija pri miših z gnojevko G9a stabilna in maksimalna na tej časovni točki, skladno z objavljenimi poročili (S3-S4). Podobno smo izvedli poskuse prekomerne ekspresije G9a in ΔJunD z uporabo HSV virusnih vektorjev, ki izražajo bodisi GFP, divji tip G9a-GFP, katalitsko mrtve G9aH1093K-GFP ali ΔJunD-GFP (glej S2 podrobnosti o razvoju konstruktov G9a). Uporabili smo 3 dni po operaciji prekomerno ekspresijo HSV, ker je bila prekomerna ekspresija na tej časovni točki maksimalna, kot smo opazili z imunohistokemijo. Zaradi prehodne narave izražanja HSV in bistveno bolj stabilne narave ekspresije AAV so bili HSV vektorji uporabljeni v poskusih, ki zahtevajo hitro, kratkotrajno transgensko ekspresijo, medtem ko so bili AAV vektorji uporabljeni v poskusih, ki so zahtevali daljša obdobja transgenske ekspresije. Oba vektorja sta v obsežnih predhodnih študijah pokazala, da okužita samo nevronska celična telesa znotraj injiciranega možganskega področja, brez kakršnekoli okužbe z aferentnimi ali eferentnimi nevroni.
Za vedenjske poskuse z uporabo farmakološkega inhibitorja G9a / GLP, BIX01294 (25 ng / μl), so miši sterotaksično vsadili z dvema podkožnima mini črpalkama, kot tudi dvostransko vodilno kanilo v NAc. Mini-črpalke so bile aktivirane 12 ur pred implantacijo, kar je sprožilo neprekinjeno dajanje (0.25 μl / uro) bodisi nosilca (5 hidroksipropil beta-ciklodekstrin) ali zdravila za 14 dni, v tem času pa so bile izvedene vedenjske ocene.
Za eksperimente s prekomerno ekspresijo ΔFosB [Western blotting, qPCR in ChIP], moški bitransgenični NSE-TA × tetOP-ΔFosB miši so bile uporabljene (tedensko stare 10), pri čemer je v odsotnosti tetraciklinskega derivata doksiciklina (8 tedni pred doksiciklinom) živali prikazale robustno striatno omejeno konstitutivno izražanje ΔFosB (S5). Prekomerno izražanje ΔFosB pri teh miših smo potrdili s pomočjo qPCR. Za potrditev ugotovitev z NSE-TA × tetOP-ΔFosB miši, moški divjih tipov 8-tedenskih C57BL / 6J moških miši, so bili sterotaksično injicirani intra-NAc z AAV vektorji, ki izražajo bodisi GFP ali ΔFosB-GFP. V tem primeru smo uporabili AAV vektorje, da zagotovimo maksimalno ekspresijo ΔFosB pri 8 tednih po operaciji, kar omogoča neposredno primerjavo med virusno okuženimi in bitransgenimi ΔFosB mišicami za prekomerno ekspresijo. Prekomerno izražanje virusov je bilo potrjeno z uporabo programa qPCR v tednih 8 po operaciji (na mestu injiciranja so bili izrezani luknjički NAc z merilom 15). AAV-GFP in AAV-ΔFosB-GFP prekomerno izražene miši, ki niso bile uporabljene za qPCR, so zdravili s fiziološko raztopino (zdravljenje s fiziološko raztopino 14, ip) ali ponavljajočim se kokainom (zdravljenje z 14 30 mg / kg kokain-HCl, ip), ki se je začelo z 6 tedni po operacija. 4 dni po končni obdelavi so bili možgani fiksirani z 4% paraformaldehidom, razrezani na vibratom in uporabljeni za analizo dendritične hrbtenice.
Western blot analiza
Nuklearne škarje 14-gauge so bile vzete iz koronalnih odsekov 1 mm, dobljenih z matriko možganskih mišic iz nerjavečega jekla in so bile ultrazvočne v 1 M pufru za lizo HEPES (1% SDS), ki je vsebovala inhibitorje proteaze in fosfataze. 10-30 μg vzorcev celotnih beljakovin smo elektroforezirali na 18% SDS gelih. Proteine prenesemo na PVDF membrane in inkubiramo bodisi z anti-H3K9me2 (mišjim monoklonskim, 1: 500), anti-p-tubulinom (mišjim monoklonalom, 1: 60,000), anti-totalnim histonom H3 (zajčji poliklonski, 1: 5,000), anti-GFP (ki se uporablja za preverjanje enakovredne virusne ekspresije v luknjanem tkivu) (kunčji poliklonski, 1: 1000), anti-H3K27me3 (kunčji poliklonalni, 1: 500) ali anti-aktinska protitelesa (mišja monoklonska, 1: 60,000) 4 ° C (vse membrane so blokirane v 5% mleku ali 5% govejem serumskem albuminu). Membrane smo nato inkubirali s sekundarnimi protitelesi, označenimi s peroksidazo (1: 15,000-1: 60,000, odvisno od uporabljenega primarnega protitelesa) in trakovi so bili vizualizirani s SuperSignal West Dura substratom. Trakovi so bili kvantificirani z NIH Image J Software in H3K9me2 pasovi so bili normalizirani na aktin ali β-tubulin in na totalni histon H3 za kontrolo enake obremenitve. Ponovljeni kokain ni vplival na ravni aktina (Slika S8) ali celotnega histona 3 (Slika S1) v NAc. Poleg tega okužba s HSV-G9a-GFP in HSV-G9aH1093K-GFP ni vplivala na skupno raven β-tubulina v NAc (Slika S8).
Imunohistokemija
Miši smo sedirali s smrtonosno dozo kloral hidrata in perfundirali z 4% paraformaldehidom, preden smo jih analizirali z eno ali dvojno imunohistokemijo, kot je opisano prej (S6). Na kratko, post-fiksni možgani so bili inkubirani pri sobni temperaturi preko noči v 30% saharozi, preden so bili razrezani na 35 μm (možgani, uporabljeni za analizo dendritične hrbtenice, so bili razdeljeni na vibratome na sekcijah 100 μm v odsotnosti 30% saharoze). Prosto plavajoče NAc sekcije so bile oprane z 1X PBS, blokirane (3% normalni oslični serum, 0.1% tritonX, 1X PBS) in kasneje inkubirane z anti-GFP (piščančjim poliklonalom, 1: 8000) in / ali anti-G9a (zajčji poliklonski , 1: 500) v blokirni raztopini. Razdelke, analizirane za dendritične bodice, smo inkubirali s kunčjim poliklonskim anti-GFP protitelesom pri 1: 200. Po inkubaciji čez noč so sekcije NAc sprane 3-krat za 10 minuto z 1X PBS, čemur sledi inkubacija s Cy2 in / ali Cy3 fluorescentno vezanimi sekundarnimi protitelesi v 1X PBS blokirni raztopini za 2 ure. Sekcije, uporabljene za morfološke študije, so bile inkubirane v sekundarnem protitelesu preko noči pri sobni temperaturi. Jedrsko ko-barvanje je bilo doseženo z inkubiranjem delov v 1X PBS, ki vsebujejo DAPI (1: 50,000) za 10 minut. Sekcije so bile spet sprane, sledila je dehidracija etanola in montaža z DPX. Vse sekcije smo posneli s konfokalno mikroskopijo.
Izolacija RNA in qPCR
Dvostranski štanci NAc s 14 merilci so bili homogenizirani v Trizolu in obdelani v skladu z navodili proizvajalca. RNA smo očistili s kolonami RNAesy Micro in spektroskopija je potrdila, da so bili obroki RNA 260/280 in 260/230> 1.8. Nato je bila RNA obrnjeno transkribirana z uporabo kompleta Bio-Rad iScript. cDNA je kvantificirala qPCR z uporabo SYBR Green. Vsako reakcijo smo izvedli v dvojniku ali v treh izvodih in analizirali po metodi ΔΔCt, kot je bila prej opisana, z uporabo gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH) kot normalizacijsko kontrolo (S7). Glej Dodatna tabela S5 za mRNA primerne sekvence.
Analiza mikromrež DNA
Štiri skupine (3 neodvisne biološke ponovitve na skupino) so bile uporabljene za študijo mikromrež, ki so vsebovale mikromreže 12. 1 uro po zadnji injekciji kokaina, so bile živali hitro iztrebljene, možgani pa so bili odstranjeni in položeni na led. Disekcije NAc so bile odvzete z uporabo 15-merilnega igelnega udarca in so bile hitro zamrznjene na suhem ledu, dokler ni bila ekstrahirana RNA. Dvostranski udarci so bili združeni iz štirih živali na ponovitev, kar je skupaj pomenilo 12 miši na skupino. Izolacijo RNA, obdelavo mikromrež in analizo podatkov smo izvedli, kot je opisano prej (S8). Na kratko smo RNA izolirali in očistili, kot je opisano zgoraj, in preverili kakovost z uporabo Agilentovega bioanalizatorja. Reverzna transkripcija, ojačanje, označevanje in hibridizacija v nizih Illumina MouseWG-6 v2.0 so bile izvedene po standardnih postopkih z jedrom mikromreže UT Southwestern. Surovi podatki so bili odšteti v ozadju in normalizirani v količini s pomočjo programske opreme Beadstudio. Normalizirani podatki so bili analizirani z uporabo programske opreme GeneSpring, genealni seznami pa so bili ustvarjeni z uporabo meril pomembnosti 1.3-kratne mejne vrednosti, povezane z nestrogimi mejnimi vrednostmi p <0.05.
V teh podatkih vzdržujemo visoko stopnjo zaupanja iz več razlogov. Najprej so z istimi pogoji ravnali, obdelovali in ubijali vse živali. Tudi vse RNA in matrične obdelave smo opravili istočasno. Drugič, izvedli smo trikratne nizove in združili več živali na vzorec niza, s čimer smo zmanjšali razlike zaradi individualne variabilnosti in povečanja statistične moči (S9). Tretjič, merila za analizo podatkov, ki se uporabljajo za našo študijo, so priporočena s projektom za nadzor kakovosti MicroArray, saj so bila ta merila potrjena, da bi zagotovila visoko stopnjo obnovljivosti v medmestih in med- in intraplatformno obnovljivost (S10-S11).
Konstrukcija virusnih vektorjev
Zaradi omejitev velikosti vnosa virusnega vektorja so bile kodirne sekvence za divji tip G9a (G9a) ali katalitsko mrtve G9a (G9aH1093K) subklonirane v bicistronski p1005 + HSV plazmid, ki izraža GFP pod nadzorom človeškega takojšnjega promotorja citomegalovirusa (CMV) (G9a velikost vstavitve je bila ~ 3.96 kb, kar presega največjo velikost vstavljanja za vektorje AAV-2). Promotor IE4 / 5 poganja izraz G9a. Fragmente smo subklonirali v bicistronski p1005 + HSV plazmid preko slepih končnih ligacij s Klenow zdravljenimi PmeI in EcoRI prebavljenim G9a (iz pcDNA3.1) in CIP obdelanim p1005 + po EcoRI digestiji. Za proizvodnjo HSV-ΔJunD-GFP je bila kodirna sekvenca ΔJunD, obdana z EcoRI restrikcijskimi mesti, generirana s PCR z uporabo temeljnih oligonukleotidov, ki vsebujejo mesto EcoRI. Produkt PCR smo nato povezali na EcoRI mesto p1005 + vektorja. Lokalno izražanje Cre rekombinaze v NAc nevronih je bilo doseženo z virusno posredovano dostavo genov z uporabo vektorja AAV, kot je opisano (S12). GFP ali N-terminalno fuzijo GFP proti Cre smo subklonirali v rekombinantni AAV-2 vektor, ki je vseboval promotor CMV s sekvenco akceptorja donorja spoja in poliadenilacijskim signalom. Vse vektorske insercije smo potrdili z dideoksi-sekvenciranjem. Virusni vektorji so bili proizvedeni z metodo trojne transfekcije, brez pomoči, kot je prej opisano (S13). Očiščeni virus smo shranili pri -80 ° C. Kakovost virusa je bila ocenjena z infekcijskim titrom, ovrednotenim v celicah HEK293. Podobno pripravimo viruse AAV-ΔFosB-GFP. Za HSV-Cre, je bila ekspresija Cre poganja IRES promotor, v nasprotju s promotorjem IE4 / 5, da bi zmanjšali izražanje Cre in preprečili toksičnost nevronov (glej S14 za gradnjo virusov). V vseh primerih je bila prekomerna ekspresija virusov potrjena in vitro in in vivo, s pomočjo qPCR, in virusi so bili imunohistokemično potrjeni za prikaz NAc-omejene ekspresije po operaciji.
Stereotaksična kirurgija
Pod anestezijo s ketaminom (100 mg / kg) / ksilazinom (10 mg / kg) so miši postavili v stereotaksični instrument z majhnimi živalmi in izpostavili površino lobanje. Za dvostransko infundiranje 0.5 μl virusa v NAc smo uporabili triintrideset igel z injekcijsko brizgo v kotu 10 ° (AP + 1.6; ML + 1.5; DV - 4.4) s hitrostjo 0.1 μl / min. Živalim, ki so prejemale HSV injekcije, je bilo dovoljeno, da si opomorejo po 2 dneh po operaciji, medtem ko so miši, uporabljene za vedenjsko testiranje, ki so prejemali AAV vektorje, pustili, da se opomorejo za 20 dni, preden so jih izpostavili kondicioniranju. Ti časi so skladni z obdobji maksimalne virusne posredovane transgenske ekspresije za dva vektorja. Za infuzije BIX01294 so bile vsaka od dveh mini črpalk nameščene subkutano na hrbet miške. Namestitve s kanilami so bile dosežene z vrtanjem dveh majhnih lobanj nad NAc in z dovajanjem kanile iz bregme (AP + 1.5; ML + 1.0; DV - 5.4). Mišem je bilo dovoljeno, da si opomorejo po operaciji za 4 do 5 dni pred začetkom postopka kondicioniranja kokaina, kot je opisano spodaj.
Kondicionalna prednostna izbira kraja
Postopek kondicioniranja je bil izveden, kot je opisano zgoraj, z naslednjimi modifikacijami (S7). Na kratko so bile tri dni po infuzijah HSV-G3a-GFP, HSV-G9aH9K-GFP ali HSV-GFP intra-NAc miši nameščene v komore za kondicioniranje, ki so sestavljene iz treh različnih okolij. Iz študije so bile izključene miši, ki so pokazale pomembno prednost za katero koli od obeh komora za kondicioniranje (<1093% vseh živali). Skupine za kondicioniranje so bile nato uravnotežene, da so se prilagodile morebitnim pristranskostim komore, ki še vedno obstajajo. V naslednjih dneh so živalim vbrizgali fiziološko raztopino in jih popoldne zaprli v eno komoro 10 minut, nato vbrizgali kokain (30 mg / kg, ip) in zaprli 10 minut v drugo komoro zvečer 30 dni (dve fiziološka raztopina in dve pari kokaina). Na dan preizkusa smo miši brez obdelave za 2 minut vrnili v aparat in jih preizkusili, da ocenimo, na kateri strani imajo prednost. Lokomotorični odzivi na kokain so bili ocenjeni s prekinitvami žarkov v komorah, seznanjenih s kokainom, da se zagotovi učinkovitost zdravljenja z zdravili. Za eksperimente AAV in BIX20 CPP je bil uporabljen nekoliko spremenjen protokol. Živalim so ponovno vbrizgali fiziološko raztopino ali kokain (01294 mg / kg, ip) in jih zaprli v določene komore za 10-minutne seanse, vendar so jih kondicionirali le enkrat na dan 30 dni, čemur je sledil test 4. dan (živali so bile kondicionirane zvečer so se izmenjevali tretmaji in kondicioniranje). Za vse skupine so ocenili izhodiščno gibanje kot odziv na fiziološko raztopino, da bi zagotovili, da zdravljenje z virusom ali zaviralci ne vpliva na gibanje.
Intravensko samo-dajanje kokaina
Pridobljene so bile samce podgane Long-Evans, ki so tehtale 230-250 g na začetku poskusa. Bili so nameščeni v okolju z nadzorovano vlago in temperaturo na obrnjenem ciklu svetlobe / temne 12 ure (luči pri 9: 00 am) ad libitum dostop do hrane in vode. Podganam je bilo dovoljeno, da se aklimatizirajo v svojem novem okolju in so bile obdelane vsak dan 1 teden pred začetkom poskusa. Vsi postopki so bili izvedeni v skladu z Vodnikom za nego in uporabo laboratorijskih živali Nacionalnega inštituta za zdravje in so bili odobreni s strani odbora za nego in uporabo živali Sinai. Oprema za samoupravo je bila opremljena z infrardečimi žarki za merjenje obnašanja lokomotorja. Samoupravljanje je bilo izvedeno, kot je opisano prej (S15-S16) s katetri, ki so bili implantirani v desno vratno veno pod anestezijo z izofluranom (2.4–2.7%). Katetre smo izprali z 0.1 ml fiziološke raztopine, ki vsebuje 10 U heparina in ampicilina (50 mg / kg). Po enem tednu okrevanja po operaciji se je v temni fazi cikla svetloba / tema začel trening samostojnega upravljanja. Živalim je bil dovoljen 3-urni dnevni dostop do kokaina (0.75 mg / kg / infuzija) po shemi okrepitve s fiksnim razmerjem 1 (FR1), pri čemer je 1 aktivna vzvodna stiskalnica povzročila eno samo infuzijo zdravila. Podgane so stabilizirale vnos kokaina po 6 dneh (<15% spremembe v stopnji odziva v treh zaporednih dneh, pri čemer se je vsaj 3% odzvalo na okrepljeni vzvod). 75 ur po zadnji seji samoupravljanja so podgane hitro odsekli glave, možgane hitro odstranili in obdelali za izolacijo RNA in qPCR.
Kromatinska imunoprecipitacija (ChIP)
Sveži NAc udarci so bili formaldehid, zamreženi in pripravljeni za ChIP, kot je opisano prej (S17-S18) z manjšimi spremembami. Na kratko, 4-14-merilne NAc-uganke na žival (5 živali, združene na vzorec) so bile zbrane, zamrežene z 1% formaldehidom in pogašene z 2 M glicinom pred zamrzovanjem pri -80 ° C. 1 dan pred ultrazvočnim ultrazvočnim vzorcem, ovčje anti-kunčje / miško (odvisno od padavinskega protitelesa) Magnetne kroglice IgG smo pripravili z inkubiranjem ustreznih magnetnih kroglic bodisi z anti-G9a (zajčja poliklonska ChIP stopnja) ali anti-H3K9me2 (mišja monoklonska ChIP stopnja) protiteles čez noč pri 4 ° C pod konstantno rotacijo v blokovni raztopini. Soniciranje tkiva in striženje kromatina sta potekali, kot je opisano prej (S17). Po soniciranju so enake koncentracije kromatina prenesli v nove epruvete in ~ 5% končnih produktov smo shranili, da bi služili kot "vhodne" kontrole. Po temeljitem pranju in resuspenziji konjugiranih zmesi kroglic / protiteles smo vsakemu vzorcu kromatina dodali enake količine zmesi protitelesa / kroglice (~ 7.5 μg protitelo / vzorec) in inkubirali ~ X NUMX ur pri konstantni rotaciji pri 16 ° C. Vzorce smo nadalje očistili in ponovno prekrili na 4 ° C čez noč pred čiščenjem DNA z uporabo kompleta za čiščenje PCR. Po čiščenju DNA smo vzorce izpostavili qPCR in jih normalizirali na njihove ustrezne "vhodne" kontrole, kot je prej opisano (S17). Normalno imunoprecipitacijo IgG miši z uporabo mišjega poliklonskega anti-IgG protitelesa izvedemo tudi za kontrolo za ustrezno obogatitev ojačanja signala. Adenin fosforiboziltransferazo (APRT) smo uporabili kot negativno kontrolo za preskuse prekomerne ekspresije kokaina in ΔFosB. Glej Dodatna tabela S5 za zaporedje promotorskih polimerov.
Analiza dendritične hrbtenice
Za preučevanje vloge G9a v regulaciji nevronske morfologije in vivo smo uporabili metode, ki so bile prej opisane z naslednjimi modifikacijami (S1). Tri dni po injekciji HSV-GFP, HSV-G9a-GFP, HSV-ΔJunD-GFP (vsi virusi so bili uporabljeni pri miših divjega tipa C57Bl / 6J) ali HSV-Cre-GFP (uporabljeni v G9a)fl / fl miši), ko je bila virusna ekspresija maksimalna, so bile miši perfuzirane, možgani so bili kriozaščiteni in kasneje razdeljeni na 100 μm na vibratom. Odseke smo nato imunsko obarvali z uporabo protitelesa proti GFP, kot je opisano zgoraj (glej Imunohistokemija). Da bi ocenili učinke prekomerne ekspresije G9a in izločitve na številke hrbtenice, pa tudi učinek prekomerne ekspresije ΔJunD smo izmerili število bodic na približno nevritih 1 – 2 na nevron, ki je znašal vsaj 299 μm sekundarnih dendritov iz GFP-izražajočega NAc medija živčni nevroni (MSN). Glede na to, da so MSN-ji morfološko različni od drugih nevronskih populacij v NAc, kot tudi prejšnja poročila, ki kažejo, da HSV primarno okuži DARPP-32, ki izražajo nevrone v tej možganski regiji (S19), prepričani smo, da so bile v teh študijah izključno ocenjene MSN številke. Za vsako žival smo pregledali nevrone 6 – 8 v živalih 3 – 4 na skupino (skupine 7), potem pa smo za vsako žival dobili statistično analizo povprečno vrednost. Eksperimenti, namenjeni preučevanju učinkov prekomerne ekspresije ΔFosB na gostoto hrbtenice NAc, so bili izvedeni podobno, kot je opisano zgoraj, z izjemo, da so bili AAV vektorji uporabljeni za ekspresijo GFP ali ΔFosB-GFP v daljših časovnih obdobjih (8 tednov). Vse slike HSV so bile zajete s konfokalnim mikroskopom z 100X oljnim potopnim ciljem (AAV slike so bile zajete z 63X oljnim potopnim ciljem). Slike so bile pridobljene z nastavitvijo pinhole na poljubni enoti 1 in velikostjo okvirja 1024 × 1024. Dendritično dolžino smo izmerili s programsko opremo NIH Image J, primarne eksperimentatorje pa smo številke hrbtenice šteli kot slepe, ker so bili preparati kodirani pred poskusnim skeniranjem. Izračunano je bilo povprečno število bodic na 10 μm dendrita.
Statistična analiza
Izvedli smo eno- in dvosmerno ANOVA, da smo določili pomen za kondicionirano preferenco prostora in analizo dendritične hrbtenice z več kot dvema skupinama. Študentski t testi so bili uporabljeni za druge primerjave, vključno z qPCR, Western blot, dendritična analiza hrbtenice, primerjanje HSV-GFP s HSV-Cre v G9afl / fl miši, analize mikromrež (glej zgoraj) in poskusi imunoprecipitacije kromatina. Načrtovani študentski t-testi so bili uporabljeni po dvosmerni ANOVA analizi dendritične gostote hrbtenice po prekomerni ekspresiji ΔFosB s potrditvijo pomembnih glavnih učinkov zdravljenja z zdravili in virusa. Vse vrednosti, vključene v legende slik, predstavljajo povprečje ± SEM (* p ≤ 0.05; ** p <0.001). Podrobne statistične analize za Sl. 1-3 v glavnem besedilu so podani v: Podrobnejše slike Legends Including Statistics.
Opombe
Potrjujem, da nobeden od materialov, vključenih v rokopis, ni upravičen Bistvena vloga histon-metiltransferaze G9a v plastičnosti, ki jo povzroča kokain so bili prej objavljeni ali so obravnavani drugje, tudi na internetu.
Vsa dela, ki vključujejo uporabo živali, so bila izvedena v skladu z institucionalnimi smernicami in smernicami IACUC na Univerzi v Teksasu, Southwestern Medical Center in Mount Sinai School of Medicine.
Reference in opombe
;
