Proc Natl Acad Sci ZDA A. 2005 februar 1; 102(5): 1737-1742.
Minimalizem
Kokain, droga proti zlorabi, povečuje sinaptični dopamin v striatumu, tako da blokira ponovno zajemanje dopamina na aksonskih terminalih. Za ciklično odvisno kinazo 5 (Cdk5) in njen aktivator p35, beljakovine, ki sodelujejo pri fosforilaciji substratov v postmitotičnih nevronih, je bilo ugotovljeno, da so po kronični izpostavljenosti kokainu nadzorovane. Za nadaljnjo preučitev učinkov indukcije Cdk5 in p35 na striatalno dopaminsko signalizacijo smo ustvarili dve neodvisni transgeni mišji liniji, v katerih je bilo Cdk5 ali p35 posebej izraženo v nevronih. Tu poročamo, da povečana aktivnost Cdk5 kot posledica p35, vendar ne prekomerne ekspresije Cdk5, vodi do slabljenja signala, ki ga posreduje kokain, dopamina. Povečano Cdk5 fosforilacijo dopamina in fosfoproteina, reguliranega s cAMP, z molekulsko maso 32 kDa (DARPP-32) pri Thr-75 je spremljalo zmanjšano fosforilacijo DARPP-32 pri Thr-34. Povečano Cdk5 fosforilacijo zunajcelične signalno regulirane kinaze kinaze 1 pri Thr-286 je spremljala zmanjšana aktivacija zunajcelične signalno regulirane kinaze 1 / 2. Ti učinki so prispevali k slabljenju fosforilacije proteina, ki veže elemente cAMP, in zmanjšanju indukcije c-fos v striatumu. Ti rezultati podpirajo idejo, da je aktivnost Cdk5 vključena v spremenjeno izražanje genov po kronični izpostavljenosti kokainu in s tem vpliva na dolgotrajne spremembe v funkciji nevronov, na katerih temelji odvisnost od kokaina.
Kokain povečuje sinaptične ravni dopamina v striatumu in spremeni gensko izražanje dopaminoceptivnih nevronov z aktiviranjem znotrajceličnih poti, ki širijo začetni signal iz dopaminskega receptorja D1 v jedro (1). Kronična izpostavljenost kokainu uravnava več faktorjev transkripcije, kar ima za posledico dolgotrajne spremembe izražanja genov, za katere se domneva, da so podlaga za nevronske prilagoditve v odvisnosti od kokaina (2). ΔFosB, identificiran kot tak faktor transkripcije (3), je dokazano, da povečuje vedenjsko odzivnost živali na kokain (4, 5). Zato naj bi prepoznavanje ciljnih genov, ki jih ureja indukcija ΔFosB, prispevalo k boljšemu razumevanju molekularnega mehanizma, na katerem temelji zasvojenost s kokainom. V zadnjem času se je pokazalo, da kronično zdravljenje živali s kokainom nadzira regulacijo izražanja ciklin odvisne kinaze 5 (Cdk5) in njenega aktivatorja p35 v striatumu z indukcijo ΔFosB (6, 7).
Cdk5 je član družine Cdk serin / treonin kinaz. Za razliko od drugih Cdks, ki so glavni regulatorji napredovanja celičnega cikla, Cdk5 sodeluje predvsem v fosforilaciji substratov v postmitotičnih nevronih (8). Nevronsko specifičnost aktivnosti Cdk5 dosežemo s povezavo z njenimi aktivatorji bodisi p35 bodisi p39, ki se pretežno izrazijo v postmitotičnih nevronih (8). Poleg bistvene vloge Cdk5 pri razvoju možganov (9, 10), jazt je bil vpleten tudi v dopaminergični prenos v poporodnih možganih (11, 12). Inhibicija aktivnosti Cdk5 povzroči povečano sproščanje dopamina v striatumu, kar kaže na presinaptično funkcijo Cdk5 kot negativnega regulatorja sproščanja dopamina (11). Poleg tega Cdk5 modulira učinkovitost postinaptične signalizacije dopamina s fosforiliranjem fosfoproteina, reguliranega z dopaminom in cAMP, z molekulsko maso 32 kDa (DARPP-32) pri Thr-75, ki pretvori DARPP-32 v zaviralec cKK-a (PKKina kinina) (12).
Ta opažanja kažejo, da sta Cdk5 in p35 regulatorja dolgotrajne aktivacije dopaminskega signalizacije po kronični izpostavljenosti kokainu in s tem v odvisnosti od kokaina. Za nadaljnjo obravnavo vloge Cdk5 pri strijatalni dopaminski signalizaciji smo ustvarili dve transgeni mišji liniji, v katerih je bilo Cdk5 ali p35 prekomerno izraženo v nevronih pod nadzorom p35 promotorja. Naše ugotovitve so pokazale, da je bila aktivnost Cdk5 nadzorovana s povečanimi nivoji beljakovin p35, ne pa tudi beljakovin Cdk5, kar kaže na to, da raven p35 proteina omejuje hitrost za aktivnost Cdk5. Ponujamo tukaj vivo dokazi, da povečana aktivnost Cdk5 kot posledica prekomerne ekspresije p35 vodi do slabljenja signala dopamina, posredovanega s kokainom, do jedra z inhibicijo kaskade PKA in zunajcelične signalno regulirane kinaze (ERK).
Materiali in metode
Protitelesa. Poliklonalna protitelesa proti Cdk5 (C-8) in p35 (C-19) so bila kupljena pri Biotehnologiji Santa Cruz. Fosforilacijsko odvisna in neodvisno odvisna protitelesa proti ERK kinazi (MEK) 1 / 2, ERK1 / 2 in cAMP-odzivnem elementu (CREB) so bila pridobljena iz Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Protitelesa proti fosfo-Thr-34 DARPP 32 (13), fosfo-Thr-75 DARPP-32 (12), skupaj DARPP-32 (12) in c-fos (14) so bili uporabljeni kot je opisano. Protitelo proti aktinu je bilo kupljeno pri Sigmi.
Poskusne živali. Prej smo klonirali mišjega gena p35 Cdk5r1, ki kodira p35 protein in značilno njegovo gensko strukturo (15). Za ustvarjanje transgene miške z nevronsko prekomerno ekspresijo p35 (Tgp35), 6-kb EkoRI-EkoFragment RI, ki vsebuje promocijsko območje 1.2-kb, je bil subkloniran v plazmid pGEM9Z (-), v mapo vstavljeno 45-bp oznako, pridobljeno iz SV40 KpnI spletno stran nizvodno od poli (A+) signal (Slika 1A). Oznaka je vsebovala SpeI spletno mesto za genotipizacijo živali. Fragment 6-kb smo izrezali iz plazmida in ga očistili, čemur je sledila pronuklearna injekcija transgena, da smo ustvarili transgene miši. Preučiti ekspresijski profil transgena pod regulativnim nadzorom 1.2-kb p35 promotorja vivo, dvojna transgena miška (Tgp35; p35 - / -) je bila nadalje ustvarjena z uporabo dvostopenjske vzrejne strategije, s katero smo miško Tgp35 regenerirali v endogenem p35-null ozadju. Drugi modeli mišk, uporabljeni v tej raziskavi, so vključevali p35 +/–, p35 - / -, Cdk5 +/– in transgeno miško s prekomerno izražanjem nevronov Cdk5 (TgCdk5) (9, 16, 17). Genotipe teh miši smo določili z analizo Southern blot ali PCR na genomsko DNK, izolirano iz repnih biopsij. Miške so bile nameščene pod temnim ciklom svetlobe 12-h / 12-h. Vsa oskrba je bila izvedena v skladu s smernicami Nacionalnega inštituta za zdravje o oskrbi in uporabi laboratorijskih in poskusnih živali.
Analiza južnega blota. Genomski DNK, odvzet iz repnih biopsij, smo prebavili z EkoRI in SpeJaz sem elektroforeziral na agaroznem gelu 0.9% in prenesel na najlonsko membrano. Membrana je bila hibridizirana z naključnim primerom 32Sonda z oznako P pri 42 ° C čez noč. Sonda 485-bp za genotipizacijo knockout p35 (p35 - / -) in Tgp35 miši je bila ustvarjena s PCR z uporabo naslednjih prajmov: 5 '-ACATCCTGCTGCCACGGTGAC-3' in 5 '-CACTATAAAGAG Hibridizirana membrana je bila dvakrat oprana v 3 × SSC / 2% SDS pri 0.1 ° C za 42 min in dvakrat v 10 × SSC / 0.1% SDS pri 0.1 ° C za 65 min in izpostavljena rentgenskemu filmu.
Zdravljenje z drogami. Kokain (Sigma) smo raztopili v sterilni fiziološki raztopini. Živalim so injicirali ikajno kokain (15 mg / kg) ali enak volumen fiziološke raztopine v starosti 3 mesecev in jih po injekciji usmrtili v različnih časovnih točkah (15, 30, 60 in 120 min). Možgani so bili hitro odstranjeni in ohlajeni v ledeno hladnem PBS-u. Striate so nato secirali in izvedli severno ali Western blotno analizo. Za imunohistokemijsko analizo smo od miši 2 h po injiciranju dobili odseke iz strij.
Analiza severnega blota. Skupna RNA je bila ekstrahirana iz striata z reagentom TRIzol (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) in podvržena analizi Northern blot, kot je opisano (18). Za odkrivanje mRNA c-fos smo uporabili fragment 189-bp mišjega c-fos cDNA kot sondo, kot je opisano (19). Ravni mRNA c-fos smo količinsko določili z merjenjem optične gostote določenega pasu z uporabo sistema za analizo slik s programsko opremo za slike, različice 1.62.
Analiza Western blota. Strikalna tkiva so sonicirana v 1% SDS in kuhala 10 min. Koncentracija beljakovin v vsakem vzorcu je bila določena z BCA testom proteina (Pierce). Enake količine beljakovin smo ločili s SDS / PAGE, preden smo jih prenesli na nitrocelulozno membrano. Membrane smo blokirali v 1 × PBS, ki je vseboval 5% obrabljenega mleka in 0.05% Tween 20 in inkubirali s primarnimi protitelesi čez noč pri 4 ° C. Inkubacijo s antimišjem ali zajecim IgG (Sigma), konjugiranim s peroksidazo, smo izvedli pri sobni temperaturi 60 min. Signal je bil zaznan z izboljšano kemiluminiscenco (Pierce), optične gostote pasov pa so bile količinsko opredeljene, kot je opisano zgoraj.
Cdk5 kinazni test. Strijatalni lizati so bili pripravljeni z pufrom za liziranje, ki ga sestavljajo 50 mM Tris · HCl, pH 7.4 / 50 mM NaCl / 5 mM EDTA / 1% Triton X-100 / 1mMDTT / 1 mM fenilmetilsulfonil fluor xNumX / XXNumXgumingumingilgilgilgnglglgNgXgNgXgumingilgilgilgnggngglgilgilgnglglglgilgilgilgilgilgilgilgilgilgilgilgilgilgilgilgilgilgilgilgilgilgilgilgilgilgilgilgilgilgilgilgilgilgilgilgilgilingil glikol fluor fluormilgil glikol fluor fluorid 7 / f ml zaviralcev levpeptina / fosfataze (zmesi zaviralcev fosfataze I in II, Sigma). Lizati so imunoprecipitirani bodisi s protitelesi proti Cdk1 (C-1) bodisi proti p5 (C-8). Imunoprecipitate Cdk35 smo pripravili z inkubacijo 19 μl lizata (ki ustreza 5 μg proteina) z anti-Cdk300 protitelesom (300 μg) čez noč pri 5 ° C, nato pa je nadaljevala inkubacija s 3 μl proteina A-agaroza zrnca % gnojevke v pufru za lizo; Santa Cruz Biotechnology) za 4 h pri 25 ° C. Za pripravo p50 imunoprecipitata smo 3 μl lizata (kar ustreza 4 mg proteina) inkubirali s protitelesom proti p35 (500 μg), kot je opisano zgoraj. Imunoprecipitate smo dvakrat sprali z pufrom za lizo in dvakrat s kinaznim pufrom, sestavljenim iz 1 mM Tris · HCl, pH 35 / 3 mM MgCl2/ 1 mM EDTA / 1 mM EGTA / 1 mM DTT, resuspendiran v 60 μl kinaznega pufra. Aktivnost kinaze smo merili z uporabo histona H1 kot substrata (18).
Imunohistokemija. Miše smo anestezirali z ip injekcijami avertina (250 mg / kg, Fluka) in perkardno perfuzirali s pufrom natrijevega fosfata 0.1 M, pH 7.4, zatem pa je s fiksativom tkiva Streck (Streck Laboratories, La Vista, NE), fiksirjem, ki ni navzkrižno povezan. Secirani možgani so bili še naprej pritrjeni v istem fiksatorju čez noč pri 37 ° C. Nato so možgane vdelali v parafin, razrezali na koronalne odseke debeline 5-μm in jih podvrgli imunohistokemiji z uporabo kompleksne tehnike avidin-biotin-peroksidaze (Vector Laboratories) z diaminobenzidinom kot substratom. Odseke smo inkubirali z afinitetno očiščenim poliklonskim protitelesom proti c-fos čez noč pri 4 ° C. Specifičnost obarvanja je bila ocenjena z izpustitvijo primarnega protitelesa.
Rezultati
Generacija transgenih miši z nevronsko prekomerno ekspresijo p35. Transgen, uporabljen za doseganje povečane nevronske ekspresije p35, je vseboval fragment 6-kb kloniranega mišjega gena p35, ki vsebuje promotor 1.2-kb in celotno kodirno zaporedje p35 (Slika 1 A). Genotipe miši smo določili z analizo Southern blot s pomočjo sonde, ki je bila zasnovana za razlikovanje p35 - / - in Tgp35 miši od miši divjega tipa (Slika 1 A in B). Za pregled ekspresije transgena pod nadzorom promotorja 1.2-kb p35 smo ustvarili dvojne transgene miši (Tgp35; p35 - / -), pri katerih je bila ekspresija p35 izključena samo iz transgena. Izražanje p35 pri miših Tgp35; p35 - / - opazili smo samo v možganih (Slika 1C), kjer je bil vzorec prostorskega izražanja podoben vzoru divjih miši (Slika 1D). Pokazalo se je, da pomanjkanje p35 povzroči nenormalno strukturo plastenja v možganski skorji in hipokampusu miši (10). Vendar so miške Tgp35; p35 - / - pokazale popolno reševanje fenotipa možganov p35 - / - (Slika 1E). Ti podatki kažejo, da promotor 1.2-kb p35 nadzira ekspresijo transgena s podobnim ekspresijskim profilom kot v p35 iz endogenega gena p35.
Raven beljakovin p35 je omejujoča za up-up regulacijo aktivnosti Cdk5. Preučili smo učinke genskega odmerjanja genov, ki kodirajo p35 in Cdk5 na ekspresijo beljakovin v strijatalnih izvlečkih iz p35 - / -, p35 +/–, divjega tipa, Tgp35, Cdk5 +/- in TgCdk5 miši pri starosti 3. Ravni p35 in Cdk5 beljakovin sta se dobro ujemali z odmerki genov (Slika 2 A in B). Tgp35 miši je pokazal ≈1.6-krat povečano raven beljakovin p35 v primerjavi z miši divjega tipa, medtem ko različne ravni beljakovin p5 niso vplivale na ravni beljakovin pxNUMX. Miševe TgCdk35 so pokazale ≈5-krat povečano raven beljakovin Cdk1.9 v primerjavi z miši divjega tipa, medtem ko različne ravni beljakovin Cdk5 niso vplivale na raven pxNUMX. Za proučitev učinkov različnih količin proteina p35 na aktivnost Cdk5 smo Cdk35 imunoprecipitirali iz strij ekstraktov z anti-Cdk5 protitelesom in izmerili aktivnost kinaze. Prav tako smo za proučitev učinkov različnih količin proteina Cdk5 na aktivnost kinaze p5 imunoprecipitirali iz strij ekstraktov z anti-p5 protitelesom in izmerili aktivnost kinaze. Aktivnost cdk35 je dobro povezana s stopnjo beljakovin p35, vendar ne z raven beljakovin Cdk5 (Slika 2 C in D). Ti rezultati kažejo, da je količina proteina p35 dejavnik, ki omejuje hitrost aktivnosti Cdk5. Zato smo s Tgp35 miši raziskali učinke povečane aktivnosti Cdk5 na striatalno dopaminsko signalizacijo.
Fosforilacija kokaina, ki jo povzroča DARPP-32 pri Thr-34, je oslabljena pri miših Tgp35. Funkcija DARPP-32 je odvisna od stanja fosforilacije na več mestih (20). PKA fosforilira DARPP-32 pri Thr-34, Cdk5 pa fosforilira DARPP-32 pri Thr-75. Tako smo preučili stanje fosforilacije DARPP-32 v strijatalnih ekstraktih divjih in Tgp35 miši. Raven fosfo-Thr-75 DARPP-32 je bila pri miših Tgp35 višja (Slika 3A; 1.6 ± 0.2 krat več kot vrednost miši divjih vrst). Nato smo ocenili učinke povečane aktivnosti Cdk5 na striatalno dopaminsko signalizacijo. Preučili smo aktiviranje PKA kokaina pri miših Tgp35 z analizo stanja fosforilacije DARPP-32 pri Thr-34. Raven fosfo-Thr-34 DARPP-32 se je pri miših divjega tipa 15 po injekciji kokaina zvišala (Slika 3B; 1.8 ± 0.2-krat nad bazalnim nivojem). Vendar je bil učinek kokaina na fosforilacijo DARPP-34 Thr-32 pri miših Tgp35 oslabljen (1.2 ± 0.3-krat nad bazalno raven). Ti rezultati kažejo, da je povečanje aktivnosti Cdk5 zmanjšalo aktivacijo PKA, ki jo povzroča kokain, verjetno s fosforilacijo DARPP-32 pri Thr-75 (6, 12). Možno je tudi, da povečanje presinaptične aktivnosti Cdk5 vodi do zmanjšanja sproščanja dopamina in da to prispeva k zmanjšanju učinka kokaina. Zlasti ena sama injekcija kokaina ni vplivala na ravni proteinov p35 in Cdk5, pa tudi na aktivnost kinaze (Slika 3 C in D). To je v nasprotju s prejšnjo študijo, v kateri je bilo dokazano, da kronična izpostavljenost kokainu nenehno uravnava izražanje p35 in Cdk5 (6).
Up-regulacija aktivnosti Cdk5 zmanjšuje aktivacijo ERK1 / 2, ki jo povzroča kokain. Nedavni dokazi kažejo, da aktiviranje dopaminskih receptorjev v striatumu aktivira tudi druge signalne kaskade, vključno s potjo ERK (21, 22), ki ima pomembno vlogo pri vedenjskem odzivu na kokain (23). Zato smo preučili, ali lahko aktivnost Cdk5 vpliva na aktiviranje kokaina na poti ERK. Aktiviranje poti ERK smo opazili po vbrizgavanju kokaina v strij izvlečke miši divjih vrst, kar je razvidno s povečano fosforilacijo MEK1 / 2 pri ser-217 in ser-221 (krat 1.5 ± 0.2 nad bazalno raven) in ERK1 / 2 pri Thr-202 in Tyr-204 (fosforilacija ERK2: 1.5 ± 0.2-krat nad bazalno raven) (Slika 4 A in B). Vendar je bila aktivirana s kokainom MEK1 / 2 (1.2 ± 0.2-krat nad bazalnim nivojem) in ERK1 / 2 (fosforilacija ERK2: kratica 1.2 ± 0.2 nad bazalno raven) je bila v TgpX (NMXX) zmanjšanaSlika 4 A in B). Poleg tega so bile bazne ravni fosfo-ERK1 / 2 pri miših Tgp35 (krat 0.8 ± 0.2 pod vrednostjo miši divjih vrst) nižje, medtem ko ta trend ni bil statistično pomemben. Ta slednji rezultat lahko pripišemo fosforilaciji MEK5 odvisne od Cdk1 pri Thr-286, kar povzroči zmanjšanje katalitične aktivnosti (24). Da bi ocenili to možnost, smo pregledali stanje fosforilacije MEK1 na Thr-286 in ugotovili, da so v strijalnih ekstraktih miši Tgp286 prisotne višje ravni fosfo-Thr-1 MEK35 (Slika 4C; 1.3 ± 0.1 krat več kot vrednost miši divjih vrst). Poleg tega stanje fosforilacije MEK1 pri Thr-286 ni bilo spremenjeno z eno samo injekcijo kokaina, kar je skladno z ugotovitvijo, da zdravljenje Cdk5 na zdravljenje ni vplivalo (Slika 3D).
Povečanje signala dopamina v jedro je oslabljeno s povečano aktivnostjo cdk5. Kokain povzroča aktiviranje več signalnih kaskad, ki vključujejo PKA in ERK, vodi do poznejše aktivacije transkripcijskega faktorja CREB v jedru s pomočjo njegove fosforilacije v Ser-133 (22, 25). Da bi raziskali, ali se lahko Cdk5 posredovani zaviralni učinki na PKA in aktivacijske kaskade konvergirajo na fosforilacijo CREB v jedru, smo preučili stanje fosforilacije CREB pri Ser-133 v progastih ekstraktih divjih vrst in Tgp35X miši. Bazalna raven fosfo-CREB je bila pri miših Tgp35 nižja (0.7 ± 0.1-krat vrednosti miši divjih vrst) (Slika 5). Kot odziv na injiciranje kokaina se je raven fosfo-CREB povečala v striatumu divjih miši (1.5 ± 0.1-krat nad bazalno raven), vendar je bil ta odziv na kokain pri miših Tgp35 oslabljen (1.2 ± 0.1- pregib nad bazalnim nivojem) (Slika 5).
Fosforilacija CREB v Ser-133 poveča svojo transkripcijsko aktivnost prek odzivnega elementa cAMP v promotorski regiji nekaterih genov, vključno z genom c-fos (26). Zato smo preučili indukcijo c-fos v striatumu divjega tipa in Tgp35 miši po injekciji kokaina. Pri miših divjega tipa se je raven mRNA c-fos dvignila na največjo vrednost (1.8 ± 0.2-krat nad bazalno raven) 30 min po injiciranju kokaina, nato pa se je 120 min po injiciranju vrnila na osnovno ravenSlika 6 A in B). Vendar pa so bile ravni mRNA c-fos ≈30% nižje pri miših Tgp35 kot pri miših divjega tipa do 30 min po injiciranju (Slika 6 A in B). Manjša indukcija c-fos pri miših Tgp35 je bila dodatno podkrepljena z imunohistokemijo (Slika 6 C-F). Dajanje kokaina je povečalo imunoreaktivnost c-fos, močno v dorsomedial-dorsocentralnih delih striatuma in šibko v stranskih delih, tako pri miših divjega tipa kot pri Tgp35. Povečanje števila c-fos-imunopozitivnih celic, ki jih povzroča kokain, pa je bilo v striatu Tgp35 miši občutno ublaženo (Slika 6G). Ti rezultati skupaj kažejo, da je bilo pri miših Tgp35 zavirano povečanje signala striatalnega dopamina v jedru, kar je verjetno posledica povečane aktivnosti Cdk5.
Razprava
Cdk5 in njegov aktivator p35 sta bila opredeljena kot ciljna gena, ki sta nadzorovana s kronično izpostavljenostjo kokainu (6). Tu navajamo dokaze, da povečana aktivnost Cdk5 kot posledica up-regulacije p35 namesto up-regulacije Cdk5 vodi v slabljenje signala dopamina, posredovanega s kokainom, v striatalnih nevronih. Za preučitev posledic nadzorovanega izražanja bodisi Cdk5 bodisi p35 na strijalno dopaminsko signalizacijo sta bili analizirani dve transgeni mišji liniji, miški TgCdk5 in Tgp35. Ugotovili smo, da je bila aktivnost Cdk5 nadzorovana sorazmerno s povečano raven beljakovin p35, vendar nanjo ni vplivala povečana raven beljakovin Cdk5. Naše prejšnje poročilo je tudi pokazalo, da je bila aktivnost Cdk5 v mišjih možganih TgCdk5 nižja kot pri mišjih možganih divjega tipa, ko smo aktivnost merili z uporabo imunoprecipitata Cdk5 (17), kar kaže, da prekomerna ekspresija Cdk5 povzroči povečano raven monomernega Cdk5, če raven p35 ne poveča. Ti rezultati kažejo, da je raven beljakovin p35 dejavnik, ki omejuje hitrost aktivnosti Cdk5.
Mišice Tgp35 so pokazale manjšo indukcijo fosforilacije CREB in c-fos v striatumu po akutni injekciji kokaina, kar kaže, da je bil povečan aktivnost Cdk5 zaviran strijski odziv na kokain. Slabljenje signala dopamina, posredovanega s kokainom, je bilo verjetno doseženo z zaviranjem večkratnih signalnih kaskad, ki vključujejo DARPP-35, PKA in ERK, posredovano s Cdk5. Dajanje kokaina je povečalo fosforilacijo PKA DARPP-32 pri Thr-32 pri miših divjega tipa, medtem ko je bil ta odziv pri miših Tgp34 oslabljen. PKA fosforilacija DARPP-35 pri Thr-32 kaže, da zavira aktivnost proteinske fosfataze 34 (PP1), encima, ki je odgovoren za defosforilacijo Ser-1 CREB (27). Tako aktivnost PP1 ne bi bila preprečena prek poti DARPP-32 / PP1 pri miših Tgp35.
Kokain-inducirana aktivacija ERK1 / 2 je bila oslabljena tudi pri miših Tgp35. Obstaja več različnih mehanizmov, s katerimi bi lahko Cdk5 zaviral aktiviranje ERK1 / 2, ki ga povzroča kokain. Prvič, fosforilacija DARPP-5, odvisna od Cdk32, pri Thr-75 lahko zavira PKA, kar vodi do poznejše inhibicije kakršne koli aktivacije MEK1 / 2, posredovane s PKA, ki je potrebna za aktiviranje ERK1 / 2. Nedavna raziskava je tudi ugotovila, da je fosforilacija DARPP-32 pri Thr-34 potrebna za kokainsko posredovano aktivacijo ERK1 / 2 z več poti, ki vključujejo posredno regulacijo aktivacije MEK kot tudi vključitev uravnavanja striatalno obogatene fosfataze, tirozina fosfataza, ki deluje neposredno na ERK1 / 2 (28). Podporo tej možnosti predlaga ugotovitev, da je bila pri miših Tgp1 odvzeta kokain fosforilacija MEK2 / 217 pri ser-221 in Ser-35. Druga verjetna pot je preko Cdk5 odvisne fosforilacije MEK1 pri Thr-286, kar bi povzročilo zmanjšanje njegove katalitične aktivnosti in vodi do inhibicije aktivnosti ERK1 / 2 (24).
Pokazalo se je, da zaviranje aktivnosti Cdk5 v striatumu potencira vedenjske učinke kroničnega zdravljenja s kokainom pri živalih (6). V skladu s hipotezo, da lahko uravnavanje aktivnosti Cdk5 prispeva k prilagajanju nevronov za preprečevanje učinkov ponavljajočega dajanja kokaina (6), smo ugotovili, da fosforilacija DARPP-5 in MEK32, posredovana s Cdk1, prispeva k slabljenju aktiviranja ERK1 / 2, ki ga povzroča kokain, kar ima za posledico manjšo indukcijo fosforilacije CREB in c-fos v striatumu. Naše ugotovitve podpirajo idejo, da lahko povečana aktivnost Cdk5, kot posledica up-regulacije p35, spremeni kroženje genov v striatumu po kronični izpostavljenosti kokainu. Do tega lahko pride zaradi sprememb v dejavnikih transkripcijskih faktorjev, kot sta CREB in c-fos. Tako lahko aktivator Cdk5 p35 zaradi svojih omejevalnih hitrosti na aktivnost Cdk5 lahko prispeva k dolgotrajnim spremembam v funkciji nevronov, na katerih temelji zasvojenost s kokainom..
Priznanja
Zahvaljujemo se dr. Mary Jo Danton, Philip Grant in Sashi Kesavapany za kritično branje rokopisa. To delo so podprli Nacionalni inštitut za zdravje Z01DE00664-05 (do ABK), ameriška služba za javno zdravje DA10044 in nepovratna sredstva Fundacije Simons, Fundacije Peter J. Sharp in Fundacije Picower (PG).
Opombe
Kratice: Cdk5, ciklin odvisna kinaza 5; ERK, zunajcelična signalno regulirana kinaza; DARPP-32, fosfoprotein z reguliranim dopaminom in cAMP, molekulska masa 32 kDa; PKA, cAMP-odvisna kinaza; MEK, ERK kinaza; CREB, protein, ki veže elemente cAMP.
Reference
;