vir
Inštitut Nathan Kline, Orangeburg, New York, 10962, ZDA. [e-pošta zaščitena]
Minimalizem
Otroci in mladostniki so vedno bolj izpostavljeni psihostimulantom, bodisi nezakonito ali za zdravljenje pogostih nevropsihiatričnih bolezni, kot so motnje pomanjkanja pozornosti s hiperaktivnostjo in brez nje. Kljub široki uporabi psihomotoričnih stimulansov v mlajših starostnih skupinah, je malo znanega v zvezi s kroničnimi molekularnimi nevroadaptivnimi odzivi na ta sredstva v nezrelih možganih. Tukaj smo pokazali, da po kroničnem dajanju psihostimulantov kokain in amfetamin, transkripcijski faktor DeltaFosB je reguliran v jedru. \ t periadolescent miši vendar ne v odraslih ali odraslih miši. Indukcija DeltaFosB pojavlja se tudi izključno v repnem putamenu periadolescent miši po amfetamin uprave. Ti rezultati dokazujejo edinstveno plastičnost kritične molekule v mladostniških možganih, ki uravnava delovanje psihostimulantov in kažejo, da so lahko te nevroadaptivne spremembe vključene v posredovanje okrepljeno odvisnost od adolescentov v primerjavi z odraslim.
Predstavitev
Psihostimulanti se uporabljajo pri zdravljenju pogostih otroških motenj, kot je motnja pomanjkanja pozornosti s hiperaktivnostjo. Poleg tega je zloraba stimulansov, vključno z amfetamini in kokainom, pogosta pri mladostnikih, starost, pri kateri obstajajo dokazi za povečane tendence do zasvojenosti v primerjavi z odraslimi (Estroff et al., 1989; Myers in Anderson, 1991). Kljub podatkom, ki kažejo razvojno regulirane vedenjske učinke, je malo znanega v zvezi z molekularnimi nevroadaptivnimi odzivi v nezrelih možganih, ki se pojavijo v času dajanja teh sredstev. Kokain in amfetamin lahko povzročita dolgotrajne vedenjske spremembe delno s stimulacijo dopamina D1receptorje in povečanje ravni transkripcijskih faktorjev, vključno z ΔFosB, v hrbtnem striatumu (tj. caudate putamen) in ventralnem striatumu (tj. nucleus accumbens) (Chen et al., 1997). Povečanje ravni ΔFosB, morda s stabilizacijo beljakovinskih produktov, se ohrani več tednov po kronični izpostavljenosti kokainu ali amfetaminu in je vsaj deloma urejeno s prenašanjem dopaminskega signala (Chen et al., 1997; Nestler et al., 2001).
Osrednji dopaminergični sistem pri mladih živalih se zelo spreminja zaradi spreminjajoče se ravni kritičnih molekul med normalnim razvojem, vključno z dopaminskim D.1receptor DARPP-32 (dopamin in cAMP reguliran fosfoprotein; Mr 32 kDa) in cAMP (Ehrlich et al., 1990;Teicher et al., 1993; Perrone-Capano et al., 1996; Tarazi et al., 1999;Andersen, 2002). Izpostavljenost v tem obdobju psihostimulantom, ki povečajo dopaminergično nevrotransmisijo, lahko zato povzroči kvantitativno in / ali kvalitativno različne molekularne odgovore, vključno s spremembami v izražanju ΔFosB. Za preizkus hipoteze, da ob neugodnem izpostavljanju psihostimulantom obstajajo nevradaptivni odzivi, ki so odvisni od starosti, so bile v serijskih poskusih analizirane tri skupine miši: odrasli (60 d stari na začetku injiciranja), periadolescent (33 d stari ob nastopu injekcij), in po odstavitvi (24 d star na začetku injiciranja). To je prva neposredna primerjava molekularnih nevraadaptivnih odzivov na kronično izpostavljenost psihostimulantom v teh treh starostnih skupinah. Ugotovili smo, da po enakih paradigmah zdravljenja periadolescentne miši kažejo izboljšano regulacijo ΔFosB kot odziv na kokain in amfetamin.
MATERIALI IN METODE
Živali in dajanje zdravil. Moški miši CD-1 (Charles River Laboratories, Kingston, NY) so bile nameščene na ciklu svetlobe / temne 12 hr (6: 00 AM do 6: 00 PM) z ad libitumdostop do hrane in vode. Živali so se lahko namestile v prostor za živali vsaj za 10 d pred začetkom injiciranja. Živali so obravnavali dva raziskovalca, ki sta izvedla vse injekcije v istem prostoru, v katerem so bile živali nameščene. Vse živali so bile odstavljene pri starosti 21 d. Injekcije so se začele pri zdravilih 24 (po odstavitvi), 33 (periadolescent) ali 60 (odrasli) d starosti. Živali so prejele 20 mg / kg kokaina (Sigma, St. Louis, MO), 5 mg / kg amfetamina (Sigma) ali enako količino slanice intraperitonealno med 4: 00 in 5: 00 PM dnevno za 7 d. Živali so ubijale z dekapitacijo po kratki izpostavljenosti CO2 10: 00 AM na dan po zadnjem injiciranju. Možgani so bili takoj odstranjeni iz lobanje in nagnjeni putamen in nucleus accumbens sta bili hitro razrezani na ledu. Vse disekcije so bile izvedene iz koronalnih možganskih rezov pri enem raziskovalcu in beljakovinski ekstrakti so bili pripravljeni iz svežega tkiva brez zamrzovanja. Vse postopke za živali je odobril Odbor za institucionalno oskrbo živali in uporabo in so bili v skladu z nacionalnimi inštituti za zdravje Priročnik za nego in uporabo laboratorijskih živali.
Western blot analiza. Za Western blot analize so bile v vsakem pasu 40% SDS-poliakrilamidnega gela naložene enake količine beljakovin (20 μg za kaudatni putamen in 10 μg za nucleus accumbens) iz vsakega vzorca po merjenju koncentracije proteina z analizo BCA (Pierce, Rockford, IL). Enako polnjenje beljakovin je bilo preverjeno tudi z vizualizacijo celotnega proteina s Ponceau Redom po prenosu na nitrocelulozo in / ali blotiranje s anti-aktinskim protitelesom (1: 500; Sigma). Antiserum, povezan s Fos (FRA), ki prepozna izoforme ΔFosB, je velikodušno zagotovil dr. M. Iadarola (Nacionalni inštituti za zdravje, Bethesda, MD) in uporabil pri koncentraciji 1: 4000. Prejšnje študije (Chen et al., 1997; Hiroi et al., 1997), vključno s preapsorpcijo antiseruma FRA z imunogenom M-peptida, je pokazala specifičnost tega antiseruma. Monoklonsko protitelo DARPP-32 5a, ki je bilo uporabljeno pri 1: 10,000, je bilo velikodušno zagotovljeno z Drs. Hugh Hemmings in Paul Greengard (Univerza Rockefeller, New York, NY). Antagonist transporterja dopamina (DAT) je bil iz Chemicon (Temecula, CA). Bloti so reagirali s kemoluminiscenčnim sistemom NEN-DuPont (Boston, MA) in izpostavili filmu. Denzitometrične vrednosti za ΔFosB imunoreaktivnost smo dobili z uporabo ScanAnaliza za Apple (Biosoft, Ferguson, MO). Statistično značilnost smo določili z enosmerno ANOVA, čemur sledi naknadnega Tukeyev večkratni primerjalni test ali neparni, dvostranski študentski test t kot je navedeno v legendah. Za eksperimente zdravljenja z zdravili je bila analiza vsake starostne skupine izvedena na ločenem blotu, zato je bila vsaka skupina fiziološke raztopine poljubno dodeljena vrednost 100% za primerjavo med starostnimi skupinami. Za študije ontogeneze so bili vzorci vseh starostnih skupin analizirani skupaj na enem samem blotu.
REZULTATI
Indukcija ΔFosB po pojavu kokaina in amfetamina v jedru accumbens samo periadolescentnih miši
Izražanje ΔFosB je bilo izmerjeno v nucleus accumbens in kaudatnem putamenu post-odrezanih, periadolescentnih in odraslih miši po uporabi 7 d amfetamina ali kokaina. Nucleus accumbens je možganska regija, za katero velja, da je najbolj kritična za posredovanje nagrajevalnih učinkov psihostimulantov. ΔFosB imunoreaktivnost (35 kDa) je bila selektivno inducirana v nukleus akumbensih periadolescentnih živali po kroničnem dajanju amfetamina (sl. 1 A) ali kokaina (sl. 1 B). Nasprotno pa se ravni ΔFosB (35 kDa) niso bistveno spremenile v nucleus accumbens post-odrezanih ali odraslih živali (sl.1 A,B). V caudatnem putamenu so bile vrednosti ΔFosB (35 kDa) po kronicni aplikaciji amfetamina bistveno povecane le pri periadolescentnih živalih (sl.2 A). Vse tri starostne skupine so pokazale izrazito povečanje izražanja ΔFosB (35 kDa) v kaudatnem putamenu po kroničnem dajanju kokaina (sl.2 B). Obseg indukcije pa je bil največji pri periadolescentnih živalih, zlasti v primerjavi s post-odstavitvijo (sl. 2 B). Druge izoforme FRA in Fos so bile nespremenjene v vseh starostnih skupinah (podatki niso prikazani).
ΔFosB imunoreaktivnost v nucleus accumbens po kronični uporabi psihostimulantov. CD-1 miši so bile injicirane enkrat dnevno s fiziološko raztopino, amfetaminom ali kokainom za 7 d, začenši na dan 24 (P24; post-weanling), dan 33 (P33; periadolescent) ali dan 60 (Izobraževanje odraslih). Ravni imunoreaktivnosti ΔFosB (35 kDa) v nucleus accumbens so prikazane po kroničnem amfetaminu (A) ali kokaina (B) uprava. Reprezentativne imunoblotice iz slanice (S), amfetamin- (A) in kokaina (C) vbrizgali po odstavitvi (P24), periadolescent (P33) in odrasle miši so prikazane v zgornje plošče. Spodnje plošče kažejo srednji ± SEM odstotek bazalne ΔFosB ekspresije. n vrednosti za vsako skupino so prikazane v bari. V jedru accumbens samo periadolescentnih miši so ugotovili pomembno povečanje ΔFosB. *p <0.05; **p <0.01 (Študentska t test; fiziološka raztopina proti zdravilu).
ΔFosB imunoreaktivnost v kaudatnem putamenu po kronični uporabi psihostimulantov. CD-1 miši so bile injicirane enkrat dnevno s fiziološko raztopino, amfetaminom ali kokainom za 7 d, začenši na dan 24 (P24; post-weanling), dan 33 (P33; periadolescent) ali dan 60 (Izobraževanje odraslih). Ravni imunoreaktivnosti ΔFosB (35 kDa) v kaudatnem putamenu so prikazane po kroničnem amfetaminu (A) ali kokaina (B) uprava. Reprezentativne imunoblotice iz slanice (S), amfetamin- (A) in kokaina (C) injicirane periadolescentne miši (P33) so prikazane vzgornje plošče. Spodnje plošče kažejo srednji ± SEM odstotek bazalne ΔFosB ekspresije. n vrednosti za vsako skupino so prikazane v bari. Znatno povečanje imunoreaktivnosti ΔFosB, inducirane z amfetaminom, je bilo ugotovljeno v poganjanju putamena samo pri periadolescentnih miših (A). Uporaba kroničnega kokaina je povzročila povečanje ΔFosB v vseh treh starostnih skupinah (\ tB). *p <0.05; **p <0.01 (Študentska t test; fiziološka raztopina proti zdravilu).
Ravni DAT in DARPP-32 se po kroničnem kokainu ali amfetaminu ne spreminjajo
Več ključnih molekul, izraženih z dopaminergičnimi in / ali dopaminoceptivnimi nevroni, vključno z DARPP-32, D1 dopaminskega receptorja in DAT prispevajo k akutnim in kroničnim odzivom na psihostimulante (\ tMoratalla et al., 1996; Fienberg et al., 1998; Sora et al., 1998; Gainetdinov et al., 2001). Podatki iz DARPP-32, D1 Receptor in DAT null in DAT knock-down miši kažejo na zapleteno razmerje med njihovimi ravnmi, regulacijo dopaminergične aktivnosti in odzivi na psihostimulante. Dejstvo je, da se indukcija ΔFosB ne pojavi pri miših z ničnimi vrednostmi DARPP-32, ki prejemajo kronični kokain (Fienberg et al., 1998). Pri odraslih miših pa izpostavljenost zdravilu 7 d k X-NUMX mg / kg kokaina ne spremeni celotne ravni DARPP-20 (Fienberg et al., 1998). Pri miših, izpostavljenih kronično psihostimulantom, še niso poročali o regulaciji beljakovin DAT, čeprav so pri nekaterih vrstah poročali o spremembah vezave radioliganda na transporterja dopamina po izpostavljenosti psihostimulantom (Letchworth et al., 2001). Tu smo izmerili nivoje DARPP-32 in DAT proteina, da bi ugotovili, ali je izražanje teh proteinov spremenjeno po kronični uporabi psihostimulantov v kateri koli od treh starosti miši. Naše ugotovitve kažejo, da ni prišlo do pomembnih sprememb v ravni skupnega DARPP-32 ali DAT v celotnem kaudatnem putamenu ali nucleus accumbens po kroničnem dajanju kokaina ali amfetamina v nobeni od treh starostnih skupin (tabela). 1).
Relativne denzitometrijske vrednosti za DARPP-32 in DAT v P24, P33 in odraslih miših, zdravljenih z amfetaminom in kokainom, glede na kontrolo, vrednosti soli, poljubno nastavljene na 100%
Osnovne ravni ΔFosB so regulirane razvojno
Pregledali smo ontogenijo ΔFosB, ker imajo odrasle miši z gensko spremenjenim povečanim izražanjem ΔFosB v striatumu povečan vedenjski odziv na psihostimulante (Kelz et al., 1999). Ugotovili smo, da so bile osnovne vrednosti ΔFosB pri mlajših živalih bistveno nižje kot pri odraslih v obeh repnih putamenih in nucleus accumbens (sl.3 A). Ravni funkcionalnih označevalcev dopaminskega sistema, vključno z DARPP-32 (Ehrlich et al., 1990), DAT (Perrone-Capano et al., 1996) in dopaminskih receptorjev (Teicher et al., 1993; Tarazi et al., 1999) prav tako razvojno urejene. Prejšnja poročila o miših CD-1 kažejo na vrh pri strinatem DARPP-32 v postnatalnem dnevu 28 (P28) (Ehrlich et al., 1990). V podganah nagnjenih putamena in nucleus accumbens, D1vrhovi receptorskih ravni od P28 do P40 (Teicher et al., 1993; Tarazi et al., 1999), vendar podobne študije pri miših niso bile izvedene. V nasprotju s tem smo ugotovili, da so bile ravni proteina DAT v repnem putamenu in nucleus accumbens konstantne med postnatalnim danom 24 in odraslostjo (sl. 3 B). Tako so relativna razmerja med D1 DAT, DARPP-32 in ΔFosB se med starostnimi skupinami razlikujejo, kar lahko povzroči razlike v D1 aktivnost receptorja, ki bi lahko vplivala na stopnjo indukcije ΔFosB.
Razvojna ekspresija ΔFosB in DAT. A, ΔFosB (35-37 kDa) imunoreaktivnost v kaudatnem putamenu in nukleus akumbensih naivnih miši CD-1 kot funkcijo starosti. Reprezentativne imunoblotice so prikazane v zgornje plošče.Spodnje plošče kažejo ± SEM treh miši na skupino. *p <0.05, odrasla oseba v primerjavi s P24; #p <0.05, za odrasle v primerjavi s P36 (Tukeyev večkratni primerjalni test po ANOVA). B, Denzitometrične vrednosti imunoreaktivnosti DAT v repnem putamenu in nucleus accumbens za naivne miške CD-1 kot funkcijo starosti. Ravni DAT se med tremi starostnimi skupinami niso razlikovale.
DISKUSIJA
Vedenjski učinki psihomotoričnih stimulansov so odvisni od starosti. Navdušujoče tendence so najvišje v adolescenci, ko se uporaba prepovedanih snovi poveča (Estroff et al., 1989; Myers in Anderson, 1991). Dejstvo je, da mlajši otroci pogosto postanejo disforični, kadar so izpostavljeni psihostimulantom, medtem ko mladostniki in odrasli doživljajo evforijo (Rapoport et al., 1980). Pri modelih glodalcev nekatere študije kažejo, da imajo periadolescentne živali višje izhodiščne ravni aktivnosti (Kopje in zavore, 1983) in spremenjene odzive na psihostimulante glede na mlajše in starejše živali. Tako kažejo manj stimulacije lokomotorja in novosti pri odzivanju na akutno uporabo nizkih odmerkov psihostimulantov glede na odstavitev in odrasle živali, vendar povečano hiperaktivnost po zdravljenju z visokim odmerkom. Pri kronični uporabi je preobčutljivost na lokomocijo, ki jo povzroča kokain, večja pri periadolescentnih podganah v primerjavi z odraslimi, medtem ko je preobčutljivost na stereotipno nižja. Podatki mikrodialize so pokazali tudi razlike med periadolescentnimi in odraslimi podganami v zvezi s preobčutljivostjo na amfetaminsko inducirano sproščanje dopamina (Laviola et al., 1995; Adriani et al., 1998; Adriani in Laviola, 2000;Laviola et al., 2001). Vendar pa obstajajo nasprotujoče si študije o dolgoročni reaktivnosti kokaina po uporabi metilfenidata pri mladostnikih podgan (Brandon et al., 2001; Andersen et al., 2002). Zadnja dva poročila poudarjata težave pri primerjanju študij, kadar se uporabljajo različne eksperimentalne paradigme. Poskusi za primerjavo vedenjskih študij pri mlajših živalih so dodatno zmedeni zaradi uporabe različnih vrst in sevov.
Miš postaja vse pomembnejši živalski model pri preučevanju uporabe in zlorabe psihostimulantov, in to je prva sistematična analiza molekularnih nevraadaptivnih odzivov v treh različnih starostnih obdobjih pri miših ali drugih posameznih vrstah. Prejšnje študije, iz katerih smo izpeljali naše paradigme zdravljenja, so pokazale povečanje ΔFosB v izoliranem dorzalnem in ventralnem striatumu divjih odraslih podgan po kronični uporabi kokaina in amfetamina (Hope et al., 1994; Nye et al., 1995; Turgeon et al., 1997), vendar le v kombiniranem hrbtnem in ventralnem striatumu ali izoliranem dorzalnem striatumu divjih odraslih miši po kroničnem kokainu (Fienberg et al., 1998; Zachariou et al., 2001).
Zdaj smo pokazali prostorsko in kvantitativno razliko v psihosimulantu induciranem ΔFosB v mišicah po odstavitvi, periadolescentu in odraslih. Opazovanje povečanega odziva pri periadolescentnih živalih v primerjavi z odraslimi in po odstavitvi je okrepljeno z dejstvom, da je odziv podoben pri miših, zdravljenih s kokainom in amfetaminom. Psihostimulanti kokain in amfetamin povečata sinaptični dopamin, pa tudi serotonin in norepinefrin, vendar z različnimi mehanizmi. Kokain se veže na transporterje plazmaleme za dopamin, serotonin in noradrenalin ter zavira njihovo ponovno prevzemanje v presinaptične terminale. Nasprotno pa amfetamin spodbuja sproščanje teh oddajnikov. Selektivna indukcija ΔFosB v jedru accumbens samo periadolescentne starostne skupine po dajanju stimulansov 7 d in relativno povečana indukcija ΔFosB v kaudatnem putamenu je lahko nevrobiološka reprezentacija ali vzrok za prej omenjeno povečano nagnjenost k zlorabi psihostimulantov v tem starostna skupina (Estroff et al., 1989; Myers in Anderson, 1991) in druge dolgoročne spremembe v izražanju genov, ki se razlikujejo med starostnimi \ tAndersen et al., 2002). Poleg tega lahko te razlike resnično regulirajo razvojne spremembe v nivojih ključnih molekul, vključno s samim ΔFosB. Možne posledice razlik v izhodiščnih vrednostih ΔFosB med starostnimi skupinami so podobne tistim, ki so bile predlagane glede razlik med sevi podgan (\ tHaile et al., 2001). Pravzaprav predvidevamo, da bodo podobne razlike v sevih odkrili tudi med inbred mišmi. Mogoče je tudi, da bodo miši različnih starosti pokazale različne molekularne prilagoditve na možganskih področjih, razen na nucleus accumbens. Dodatna analiza z uporabo periadolescentnih miši z gensko spremenjenimi spremembami v nivojih ključnih molekul in sočasnih vedenjskih opazovanjih bo nadalje preizkusila te hipoteze.
Opombe
- Prejeto April 8, 2002.
- Prejeta revizija Avgust 6, 2002.
- sprejeto Avgust 8, 2002.
To delo so podprli Nacionalni inštituti za zdravje / Nacionalni inštitut za nevrološke motnje in davek na možganske kapi NS41871 (MEE in EMU) in Nacionalni inštitut za zlorabo drog P30-DA13429 (EMU).
Korespondenco je treba nasloviti na dr. Michelle E. Ehrlich, Univerzo Thomas Jefferson, Curtis 310, 1025 Walnut Street, Philadelphia, PA 19107. E-naslov: [e-pošta zaščitena].
- Copyright © Družba za nevroznanost 2002
;
