Regulacija stabilnosti DeltaFosB s fosforilacijo (2006)

J Neurosci. 2006 May 10;26(19):5131-42.

Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ.

vir

Oddelek za psihiatrijo, Center za osnovno nevroznanost, Univerza Texas Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas 75390-9070, ZDA.

Minimalizem

Transkripcijski faktor DeltaFosB (imenovan tudi FosB2 ali FosB [kratka oblika]) je pomemben posrednik dolgoročne plastičnosti, povzročene v možganih s kronično izpostavljenostjo več vrstam psihoaktivnih dražljajev, vključno z zlorabami, stresom in elektro konvulzivnimi napadi. . Posebna značilnost zdravila DeltaFosB je, da ko je enkrat inducirana, vztraja v možganih razmeroma dolgo časa v odsotnosti nadaljnje stimulacije. Mehanizmi, na katerih temelji ta navidezna stabilnost, pa so ostali neznani. Tukaj dokazujemo, da je DeltaFosB relativno stabilen transkripcijski faktor s razpolovnim časom približno 10 h v celični kulturi. Poleg tega smo pokazali, da je DeltaFosB fosfoprotein v možganih in da ga fosforilacija visoko ohranjenega serinskega ostanka (Ser27) v DeltaFosB varuje pred proteasomalno razgradnjo. Ponujamo več vrstic dokazov, ki kažejo, da je ta fosforilacija posredovana s kazein kinazo 2. Te ugotovitve predstavljajo prvi dokaz, da je DeltaFosB fosforiliran in da fosforilacija prispeva k njeni stabilnosti, ki je v središču njene sposobnosti posredovanja dolgotrajnih prilagoditev v možganih.

Predstavitev

Transkripcijski faktor ΔFosB, ki je prav tako imenovan FosB2 ali FosB [kratka oblika], je C-terminalno skrajšana različica snopa neposrednega zgodnjega gena fosb (Dobrazanski et al., 1991; Nakabeppu in Nathans, 1991; Yen et al., 1991). Kot FosB polne dolžine, ima ΔFosB osnovno domeno, ki veže DNA, in levcinsko zadrgo, preko katere se dimerizira z Jun-proteini, da tvorijo kompleksi transkripcijskih faktorjev aktivatorskega proteina-1 (AP-1), ki uravnavajo izražanje mnogih genov (Morgan in Curran, 1995; Rylski in Kaczmarek, 2004). Kljub pomanjkanju dela transaktivacijske domene, ki jo najdemo v terminalu C FosB, ΔFosB deluje kot močan transkripcijski aktivator in represor v kultiviranih celicah in možganih (Dobrazanski et al., 1991; Nakabeppu in Nathans, 1991; Chen et al., 1997; McClung in Nestler, 2003; Kumar et al., 2005).

ΔFosB se v možganih po kronični, vendar ne akutni izpostavljenosti različnim psihoaktivnim dražljajem, vključno s stresom, določenimi lezijami, antipsihotičnimi in antidepresivnimi zdravili, zlorabami in naravnimi nagradami, na možgane po kronični, vendar ne akutni, inducira na visoke ravni. (Hope et al., 1994b; Hiroi in Graybiel, 1996; Moratalla et al., 1996; Bing et al., 1997; Mandelzys et al., 1997; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002; Andersson et al., 2003; Colby et al., 2003; Peakman et al., 2003; Perrotti et al., 2004; Zachariou et al., 2006). Indukcija ΔFosB je bila neposredno povezana s funkcionalnimi učinki več teh dražljajev na možgane. Vztrajnost ΔFosB tudi v odsotnosti dodatne stimulacije ga razlikuje od vseh drugih transkripcijskih faktorjev družine Fos, ki se hitro sprožijo kot odziv na akutne dražljaje, se v nekaj urah razpadejo do bazalnih ravni in na splošno pokažejo desenzibilizacijo po kronični stimulaciji (Hope et al., 1992; Daunais et al., 1993; Persico et al., 1993; Hiroi in Graybiel, 1996; Perrotti et al., 2004). Zaradi tega je ΔFosB privlačen kandidat za posredovanje nekaterih dolgotrajnih sprememb v izražanju genov, ki so osnova za stabilne nevronske prilagoditve, ki jih povzročajo nekateri kronični dražljaji.

Ker se podaljšana prisotnost ΔFosB pojavi v odsotnosti nadaljnje indukcije njegove mRNA (Chen et al., 1995), smo predvidevali, da je za razliko od polne dolžine FosB in vseh drugih beljakovin družine Fos, ki so resnično nestabilne, ΔFosB nenavadno stabilen transkripcijski faktor (Hope et al., 1994b; Chen et al., 1997; Nestler et al., 2001; McClung et al., 2004). Poleg tega je imunoblotting analiza akutnega in kronično stimuliranega možganskega tkiva pokazala, da se ΔFosB spremeni Mr (molekulska masa) od N33 kDa v akutnem stanju do N35 – 37 kDa med kroničnim zdravljenjem (Hope et al., 1994a; Chen et al., 1995). Ker ni dokazov za obstoj dodatnih mRNA, ki bi lahko kodirale te različne izoforme, smo nadalje domnevali, da je ΔFosB posttranslacijsko modificiran in da to morda prispeva k njegovi nenavadni stabilnosti. Do sedaj še niso poročali o biokemičnih analizah prometa ali posttranslacijskih spremembah ΔFosB. Cilj te študije je bil ugotoviti, ali je ΔFosB fosfoprotein in ali ima fosforilacija vlogo pri njegovi stabilnosti.

Prejšnji odsekNaslednji razdelek

Materiali in metode

Celične linije sesalcev in DNA konstrukti.

Celice PC12 (Clontech, Mountainview, CA) so gojili v DMEM z visoko vsebnostjo glukoze, ki je vseboval l-glutamin (L-Gln) in dopolnjeval z 5% fetalnim govejim serumom (FBS), konjskim serumom 10% (oba iz Invitrogen, Carlsbad, CA) , 100 U / ml penicilina in 100 μg / ml streptomicina (oba iz Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). HeLa celice (American Type Culture Collection, Manassas, VA) so gojili v DMEM z visoko glukozo, ki je vseboval L-Gln in dopolnili z 10% FBS, penicilinom in streptomicinom. Obe celični liniji smo vzdrževali pri 37 ° C v vlažnem 5% CO2 vzdušje.

Za prehodne transfekcije z DNA so PC12 ali HeLa celice zasejali na plošče s šestimi vdolbinami (prevlečene s kolagenom I za celice PC12), tako da so naslednji dan dosegle konfluenco 90-100% in jih nato transficirali z uporabo Lipofectamine 2000 (Invitrogen). V nekaterih poskusih (glej Sl. 1-7), Je bil ΔFosB prehodno izražen v celicah PC12 z okužbo z rekombinantnim virusom herpes simplex (HSV).

ΔFosB in FosB cDNA smo dobili iz lastnih pTetop-konstruktov (Chen et al., 1997in subkloniramo v vektor pcDNA3.1 (Invitrogen). Ti konstrukti pcDNA3.1-ΔFosB / FosB so bili uporabljeni za ekspresijo v celicah sesalcev in kot predlogo za lokalno usmerjeno mutagenezo. Rekombinantni HSV-ΔFosB smo pripravili, kot je opisano prej (Neve et al., 1997in pripravek je imel titer 1 × 108 pfu / ml.

Eksperimenti s pulznim lovom.

Približno 24 h po okužbi / transfekciji so celice (PC12 ali HeLa) v plošči s šestimi vdolbinicami 2 do 3-krat izprale z 2 ml PBS in inkubirale pri 37 ° C za 1 h v 2 ml Cys / Met-free DMEM (Invitrogen) z dodatkom 5% dializiranega FBS (Hyclone, Logan, UT), da se izčrpajo intracelularni bazeni Met in Cys. Ob koncu tega obdobja »lakote« so dodali zdravila (če bi se celice zdravile) in celice označili (pulz) z 12 – 25 μCi. 35M beljakovinska mešanica (PerkinElmer, Wellesley, MA) za 1 h pri 37 ° C za označevanje vseh novo sintetiziranih proteinov. Radioaktivno oznako smo nato odstranili z izpiranjem celic dva do trikrat z 2 ml PBS in 35Sledili so S-označeni proteini (chase) z zamenjavo medija s "hladnim" (nonradioactive) medijem, dopolnjenim z 5% FBS, in nabiranjem celic v različnih časovnih točkah. Celotno zdravljenje celic smo vzdrževali ves čas. Vse številke teh poskusov kažejo podobne začetne količine različnih beljakovin za optimizacijo primerjav njihovih stopenj prometa.

Živali in kronična terapija z elektro konvulzivi.

Odrasli samci podgan Sprague Dawley (200-300 g; Charles River Laboratories, Kingston, RI) so enkrat dnevno zdravljeni z elektro konvulzivnimi napadi (ECS) za 7-9 d. ECS je bila izvedena, kot je opisano prej (Hope et al., 1994a) z uporabo Ugo Basile (Comerio VA, Italija) Enota ECS z naslednjimi nastavitvami: frekvenca, impulzi 100; impulz z, 0.5 ms; trajanje šoka, 1.0 s; in toka, 75 mA. Simulirane kontrolne živali so bile obdelane vzporedno z nanašanjem elektrod za ušesne sponke brez električnega toka.

32 P presnovno označevanje.

Za označevanje možganskih rezin so podgane obglavili, možgane hitro razrezali in 300 μm sprednje kortikalne rezine smo pripravili z DSK mikroslikerjem (Ted Pella, Redding, CA). Rezine so bile inkubirane v plastičnih epruvetah v 2 ml umetne CSF (ACSF) s pomanjkanjem fosfatov in vzdrževane pri 30 ° C pod stalnim, nežnim mehurčenjem z O2/ CO2 mešanica (Hemmings et al., 1989). Rezine (dve rezini na epruveto) so bile označene z 1.3 mCi za 8-10 h v prisotnosti ali odsotnosti okadaične kisline (100 ng / ml). Na koncu te inkubacije so bile rezine vsaj trikrat sprane s hladnim ACSF in nato homogenizirane z ultrazvočno obdelavo v 250 μl hladnega radioimunoprecipitacijskega testa (RIPA) pufra [PBS, pH 7.4, 150 mm NaCl, 1% (v / v) ) Igepal, 0.5% (w / v) natrijev deoksiholat, 0.1% (w / v) SDS, 1 mm EDTA], dopolnjen pred uporabo s SDS do 0.6%, koktejl inhibitorja proteaz za sesalske celice (uporabljen pri 5 μl / ml; Sigma-Aldrich), koktajli za inhibitorje fosfataze I in II (uporabljeni pri 1: 100; Sigma-Aldrich), 1 mm PMSF in 2% glicerol. Homogenate smo nato kuhali za 15 min in očistili s centrifugiranjem pri 15,000 × g za 15 min. Koncentracijo proteina v nastalih supernatantih smo ocenili z uporabo BCA testa (Pierce, Holmdel, NJ).

Za 32P označevanje kultiviranih celic, 24 h po okužbi / transfekciji, smo celice izprali dva do trikrat z medijem brez fosfatov in inkubirali v tem mediju za 1 h. Po tem obdobju izgine 0.2 – 0.3 mCi od 32PH3PO4 (PerkinElmer) so bile dodane v vsako vdolbinico in celice so bile označene za 4 – 12 h, odvisno od vrste eksperimenta (glej slike 1 – 7 za specifikacije). Celice smo nato trikrat sprali s PBS in lizirali na ledu za 15 min z 50 μl dopolnjenega RIPA pufra. Lizate smo zbrali s strganjem in jih prenesli 10-krat skozi iglo 25 ga za strižno DNA, kuhali 10 min in centrifugirali pri 15,000 rpm za 15-30 min pri 4 ° C. Očiščene lizate (supernatante) prenesemo v novo epruveto in izvedemo BCA test (Pierce). Vse številke teh poskusov kažejo podobne količine skupnih divjih tipov (WT) in S27A ΔFosB proteinov za optimizacijo primerjav njihovih relativnih nivojev fosforilacije.

Kemikalije in obdelave celičnih kultur.

Okadaična kislina (OA; Sigma-Aldrich) je bila raztopljena v etanolu in uporabljena pri končni koncentraciji 100 ng / ml. 5,6-dikloro-1-p-d-ribofuranozil-benzimidazol (DRB; Biomol, Plymouth Meeting, PA) je bil raztopljen v dimetil sulfoksidu (DMSO; Sigma-Aldrich) in uporabljen v celični kulturi pri končni koncentraciji 50 μm. Spermine (Sigma-Aldrich) smo raztopili v vodi in uporabili pri končni koncentraciji 200 μm. Kalfostin-C (Biomol) smo raztopili v DMSO in uporabili pri 0.2 μm, medtem ko smo forbol 12-miristat 13-acetat (PMA; Promega, Madison, WI) raztopili v DMSO in uporabili pri 0.1 μm. inhibitorni peptid, povezan z miristoiliranim-autokamtid-2 (m-AIP; Biomol), je bil raztopljen v vodi in uporabljen pri končni koncentraciji 1 in 10 μm. Inhibitorji protein-kinaze širokega spektra H-7 in H-8 (Biomol) smo raztopili v vodi in uporabili pri končni koncentraciji 150 oz. 200 μm. MG132 (Calbiochem, San Diego, CA) in epoksimicin (Peptides International, Louisville, KY) sta bili raztopljeni v DMSO in uporabljeni pri končni koncentraciji 12.5 oz. 7.5 μm. V vseh eksperimentih smo dodali DMSO (vehikel) v celice, kot je potrebno za vzdrževanje konstantne količine DMSO med zdravljenjem. Za 32P preskusi označevanja so bila zdravila dodana tik pred etiketo in shranjena za preostalo obdobje označevanja. Za eksperimente s pulznim lovom smo dodali zdravila v času Cys / Met "stradanja", ki smo jih obdržali skozi obdobje označevanja, nato pa jih dodali nazaj v gojišče. Proteasomski inhibitorji so bili med vsakim lovom obogateni z vsakim 3-4 h, da bi kompenzirali hiter promet teh peptidov.

ΔFosB imunoprecipitacijo, imunoblotiranje in avtoradiografijo.

Za imunoprecipitacijo smo lizate razredčili z 1: 5 z navadnim RIPA, da smo koncentracijo SDS znižali na 0.1%, preden smo nadaljevali z imunoprecipitacijo (IP). Da bi omejili nespecifično vezavo, smo lizate najprej očistili z imunoprecipitacijo z neimunim IgG in proteinom G-Sepharose (Sigma-Aldrich) vsaj za 4 h. ΔFosB je bil nato imunoprecipitiran iz očiščenih lizatov z uporabo kozjega poliklonskega protitelesa, ki prepozna notranji epitop, prisoten v obeh FosB in ΔFosB (SC-48G; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) pri 0.5-1 μg IgG na 10 μg lizatnega proteina (50 – 300 μg skupnih beljakovin) v skupnem volumnu 0.5 ml. IP so se rahlo zmešali pri 4 ° C na rotorju vsaj za 8 h in nato smo dodali 15 μl proteina G-Sepharose in IP so bili pomešani vsaj še z 4 h. IP-ji so bili peletirani z vrtenjem na 3000 × g za 3 – 5 min pri 4 ° C, trikrat izperemo z 0.5 ml hladne RIPA in dvakrat s hladnim PBS, ki vsebuje 0.1% Tween 20. IP smo nato resuspendirali v 0.5 ml hladnega PBS, prenesli, peletirali v novo epruveto in imunoprecipitirane proteine ​​smo nato eluirali z dodatkom 15-25 μl 2 × reducirajočega Laemmli proteinskega puferja. Ta protokol IP je povzročil specifično in učinkovito obarjanje praktično vseh ΔFosB v lizatu. Imunoprecipitirane proteine ​​smo izpostavili SDS-PAGE z nalaganjem celotnega IP na 12.5% Tris-HCl kriterski gel (Bio-Rad, Hercules, CA) in nato prenesli na PVDF ali nitrocelulozo. Po prenosu smo membrano sušili na zraku in 32P- in 35S-radioaktivno označene proteinske pasove smo opazovali z avtoradiografijo z uporabo Kodadovega (Rochester, NY) avtoradiografskega filma, kot tudi s fosforimagingom z uporabo Storm (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) PhosphorImager. Skupni (nefosforilirani in fosforilirani) ΔFosB v celičnih lizatih ali možganskih homogenatih smo odkrili z imunoblotiranjem bodisi imunoprecipitiranega proteina (z uporabo iste membrane, uporabljene za odkrivanje 32P-označenega proteina), ali enakih količin lizat / homogenatnega proteina, izpostavljenega SDS-PAGE in prenesenega na PVDF ali nitrocelulozo. Membrano smo najprej blokirali z inkubiranjem z 1% (w / v) nemastnim suhim mlekom (Bio-Rad) v PBS, dopolnjenem z 0.1% (v / v) Tween 20 (Sigma) za 1 h pri 25 ° C. Membrana je bila nato preko noči imunoblotirana na 4 ° C z lastnim kunčjim anti-FosB poliklonskim protitelesom, proizvedenim proti amino kislinam 1-16 iz FosB / ΔFosB (uporabljenega pri 1: 10,000). Po primarni inkubaciji smo membrane očistili štirikrat za 5 min z blokirnim pufrom in nato inkubirali pri 25 ° C za 1 h z kozjim anti-kunčjim IgG, konjugiranim s hren peroksidazo (uporabljenim pri 1: 5000 v blokirnem pufru, iz X Laboratoriji, Burlingame, CA). Membrane smo nato sprali trikrat za 10 min z blokirnim pufrom in enkrat za 5 min s PBS. Celotne pasove ΔFosB proteina smo vizualizirali na Kodak MR filmu z izboljšano kemiluminescenco (Pierce) in / ali z detekcijo fluorescence z uporabo ECL-Plus reagentov (Amersham Biosciences) in Storm PhosphorImager.

Prekomerna ekspresija in čiščenje rekombinantnega ΔFosB iz celic insektov.

ΔFosB je bil prekomerno izražen v Sf9 celicah insektov kot N-terminalni heksa-His-označen protein (N-His (6) ΔFosB) z uporabo Bac-to-Bac baculovirusnega ekspresijskega sistema (Invitrogen) in po navodilih proizvajalca. Na kratko, cDNA ΔFosB (ostanki 2-237), ki ji sledi afinitetna N-terminalna oznaka MGHHHHHHAG, je bila subklonirana v vektor pFASTBacTM1, ki je bil uporabljen za generiranje rekombinantnega bakulovirusa. Celice Sf9 so bile okužene z rekombinantnim virusom in N-His (6) ΔFosB je bil očiščen iz celičnih lizatov z več kromatografskimi koraki, vključno z afinitetno kromatografijo z uporabo nikljeve kolone (Qiagen, Valencia, CA), anionska izmenjava z mono-Q kolono (Amersham) Biosciences) in izključitev velikosti z uporabo kolone za gelsko filtracijo (Amersham Biosciences).

In vitro študij fosforilacije.

In vitro Reakcije fosforilacije za časovni potek in stehiometrijsko analizo so bile izvedene v volumnu 30 μl, ki vsebuje 10 μm substrat (N-His (6) ΔFosB ali substrat pozitivne kontrole), 250 μm ATP in 1 μCi / μl [γ-32P] ATP, pufer, ki ga dobavlja proizvajalec kinaze, in ena od naslednjih kinaz: CK2 (20 ng / μl; upstate, Charlottesville, VA), CaMKII (10 ng / μl; upstate), PKC (1.6 ng / μl; Calbiochem) ali p70S6K (2.5 mU / μl; upstate). Časovne reakcije so bile izvedene z odstranitvijo alikvotov 5 μl iz reakcijske raztopine ob določenih časovnih točkah in dodajanje enakega volumna 4 × reducirajočega Laemmli proteinskega vzorca pufra. Michaelis-Mentenovi kinetični parametri za reakcijo CK2 so bili določeni v empirično določenih linearnih stacionarnih pogojih. Te reakcije so bile izvedene za 15 min v volumnu 10 μl, ki vsebuje encim 2 ng / μl, 250 μm ATP, 1 μCi / μl [γ-32P] ATP in N-His (6) ΔFosB koncentracije od 2.5-30 μm. Vse reakcije so bile izvedene pri 30 ° C v vodni kopeli. Po SDS-PAGE in obarvanju gela z Bio-Safe Coomassie (Bio-Rad) smo gel sušili in 32Vključitev P-fosfata je bila ocenjena s fosforimaging analizo (glej spodaj, Kvantifikacija podatkov, izračuni in statistika).

Dvodimenzionalna fosfopeptidna karta in analiza fosfamino aminokislin.

Obe analizi sta bili izvedeni, kot je opisano v Ploegh in Dunn (2000). Na kratko, suhi gelni fragmenti, ki vsebujejo 32P-označeno ΔFosB (od. \ T in vitro ali iz imunoprecipitatov presnovno označenih celic), so bili izrezani, rehidrirani, oprani in podvrženi triptični razgradnji. Supernatant, ki vsebuje triptične produkte za razgradnjo, je liofiliziran in liofilat večkrat spran in ponovno suspendiran v 10 μl elektroforeznega pufra, pH 1.9. Vzorec (3 μl) smo nanesli na celulozno tankoplastno kromatografijo (TLC) (Analtech, Newark, DE) in ločili v eni dimenziji z elektroforezo, druga pa z naraščajočo TLC. Nastale fosfopeptidne karte smo vizualizirali z avtoradiografijo in fosfornim slikanjem. Za analizo fosfamino aminokislin je 2 μl triptičnih digestijev, ki so bili ponovno suspendirani v elektroforeznem pufru, nadalje razcepljeni s hidrolizo HCl pri 105 ° C za 25 min v 3 m HCl pod N2 vzdušje. Reakcijo smo ustavili s šestkratnim razredčenjem v vodi in zmes liofilizirali. Liofilat smo resuspendirali v 5 μl elektroforeznega pufra, pH 1.9, in nanesli na celulozno TLC ploščo skupaj s fosfo-Ser, -Thr in -Tyr standardi. Elektroforezo izvedemo v eni polovici dolžine TLC plošče z elektroforeznim pufrom, pH 1.9 in nato plošco prenesemo v pufer pH 3.5 in izvedemo elektroforezo do konca. Standarde fosfamino aminokisline smo vizualizirali s pršenjem TLC plošče z raztopino 1% (v / v) ninhidrina v acetonu in 32P-označene aminokislinske vzorce smo vizualizirali z avtoradiografijo in fosfornim slikanjem.

siRNA-inducirana CK2α-knock-down.

Uporabili smo metodo interferenc RNA za selektivno znižanje ravni CK2 (Di Maira et al., 2005). Celice PC12 smo zasejali na kolagene I-obložene plošče s šestimi jamicami, da bi dosegli konfluenco N70 – 80% naslednji dan, ko so bili začasno transfektirani z 20 nm (končna koncentracija) bodisi nontargirajoče siRNA ali siRNA, usmerjene proti mRNA katalitičnega \ t α podenoto Rat CK2, z uporabo 5 μl transfekcijskega sredstva SilentFectin (Bio-Rad) in po navodilih proizvajalca. Približno 24 h kasneje, so bile celice začasno transfektirane z ΔFosB plazmidom, kot je navedeno zgoraj. Približno 24 h kasneje (N48 h po transfekciji siRNA) so bile celice izpostavljene bodisi 32P presnovno označevanje ali pulz-chase analiza, kot je opisano zgoraj. Uporabljene so bile naslednje štiri CK2a siRNA s podobnimi rezultati: 5′P-CAAACUAUAAUCGUACAUCUU3 UM, 5CAP-UAGUCAUAAAAUCUUCCGUU3 X (Dharmacon, Lafayette, CO). Kot negativno kontrolo smo uporabili Glušnik negativna kontrola #3 siRNA od Ambion (Austin, TX). Obseg izločanja CK2 smo spremljali z imunoblotiranjem z uporabo anti-CK2 poliklonskega protitelesa (katalog # 06-873 iz Upstate) preko noči pri razredčenju 1: 1000. P-Tubulin smo uporabili kot obremenitveno kontrolo in detektirali z monoklonskim protitelesom (katalog # 05-661 iz Upstate) preko noči pri razredčitvi 1: 20,000.

Site-usmerjena mutageneza.

Mutacija Ser27 v Ala ali Asp je bila izvedena z uporabo hitrega kompleta mutageneze, ki je usmerjen na spletno mesto (Stratagene, La Jolla, CA) in po navodilih proizvajalca. Za uvedbo mutacij Ser27 v mišjem ΔFosB proteinu so uporabili naslednje mutagenezne primerje. Ser27 do Ala: (vzvratni primer) 5′GCCGAAGGAGTCCACCGAAGCCAGGTACTGAGACTCGGCGGAGGG3 ′. Ser27 do Asp (prednji primer) 5′CCCTCCGCCGAGTCTCAGTACCTGGATTCGGTGGACTCCTTCGGC3 ′. Mutirane baze so v krepkem tisku, kodon Ser27 pa v poševnem tisku.

Bioinformatika.

Potencialna mesta fosforilacije in kinaze za ΔFosB so iskali s podajanjem proteinske mišje sekvence v specializirane baze podatkov, vključno s ProSite (http://www.expasy.org/prosite/), PredictProtein (Rost et al., 2004) in NetPhosK (Blom et al., 2004).

Kvantifikacija podatkov, izračuni in statistika.

Količina proteina, prisotne v PVDF ali nitrocelulozni membrani, je bila kvantificirana z uporabo Storm PhosphorImagerja in spremljajoče programske opreme ImageQuant (Amersham Biosciences / Molecular Dynamics). V študijah fosforilacije celične kulture in možganske rezine dobljene vrednosti za 32P-označene beljakovine so bile nato deljene z vrednostmi, dobljenimi za skupni ΔFosB, in izražene kot razmerje. V in vitro študij fosforilacije, količina 32P-označeno ΔFosB na mol ΔFosB (stehiometrija) je bilo izračunano, kot je opisano prej (Sahin et al., 2004). Vse meritve so bile izvedene v območju linearnosti uporabljenega instrumenta. Kinetični parametri so bili izračunani z uporabo Michaelis-Mentenovega modela, s čimer so V = Vmax[S] / ([S]+KM) in Vmax = k2[ESkupaj za plačilo]. Razpolovna doba (t1/2) ΔFosB in FosB smo ocenili na podlagi impulznih parcel (z uporabo nelinearne regresije, ki je najbolj ustrezala podatkovnim točkam) in ustrezala času, ko je količina preostalega proteina 50% od izvirnika. Na vseh podatkih so prikazani rezultati reprezentativni za vsaj dva do tri neodvisne poskuse. V vseh grafih so prikazani podatki povprečja ± SEM (3 ≤ n ≤16). Statistično značilnost razlik smo ocenili z uporabo neparnega t test, popravljen za večkratne primerjave, in označuje zvezdica p ≤ 0.05.

Prejšnji odsekNaslednji razdelek

Rezultati

ΔFosB je nenavadno stabilen transkripcijski faktor

Čeprav smo prej domnevali, da je ΔFosB relativno stabilen transkripcijski faktor (Nestler et al., 2001), do sedaj ni bila opravljena neposredna analiza profila prometa beljakovin. Za obravnavo tega vprašanja smo izvedli eksperimente s pulz-chase z uporabo celic PC12, ki smo jih v veliki meri uporabljali kot nevronsko podobne celične linije, v katerih je bil ΔFosB prehodno izražen z infekcijo z rekombinantnim virusom herpes simplex (HSV-ΔFosB). Novo sintetizirane beljakovine so bile presnovno označene 35S-Met / Cys in degradacijski vzorec 35S-označeno ΔFosB (35S-ΔFosB) smo spremljali z imunoprecipitacijo iz celičnih lizatov, pridobljenih v različnih časovnih točkah po odstranitvi radioaktivno označenih aminokislin. Analiza imunoprecipitatov s SDS-PAGE in avtoradiografijo je pokazala, da je razpolovni čas ΔFosB v celicah PC12 N10 h (Slika 1). Te ugotovitve kažejo, da je razpolovni čas ΔFosB višji od razpolovnega časa večine inducibilnih transkripcijskih faktorjev (glejte razpravo), vključno s FosB polno dolžino, za katero je bilo ugotovljeno, da znaša razpolovni čas v celični kulturi N90 min (Dobrazanski et al., 1991; Carle et al. 2004). Poleg tega je treba omeniti, da degradacija ΔFosB ne ustreza eksponentni krivulji upadanja prve stopnje, ampak je dvofazna, začenši s počasnejšo stopnjo razgradnje. To kaže na obstoj več kot ene vrste ΔFosB in / ali več kot ene poti razgradnje.

Slika 1.

Ogled večje različice:

Slika 1.

ΔFosB je nenavadno stabilen transkripcijski faktor. Razpolovna doba ΔFosB je N10 h v celični kulturi. ΔFosB je bil izražen v celicah PC12 bodisi z okužbo s HSV-ΔFosB bodisi s prehodno transfekcijo z ΔFosB-vsebujočim plazmidom, in celice so bile podvržene eksperimentom s pulziranjem, kot je opisano v Materialih in metodah. Enakovredni rezultati so bili pridobljeni ne glede na metodo, ki se uporablja za prekomerno izražanje ΔFosB. Slika prikazuje časovni potek (in reprezentativni autoradiogram) degradacije ΔFosB. Narisani podatki so povprečni ± SEM za posamezne podatkovne točke 15, pridobljene iz vsaj petih neodvisnih poskusov. Za primerjavo je naveden razpolovni čas celotnega FosB.

ΔFosB je fosfoprotein v možganih

Predpostavili smo, da posttranslacijska modifikacija ΔFosB lahko prispeva k njeni navidezni stabilnosti. Ker se je pokazalo, da fosforilacija modulira aktivnost transkripcijskih faktorjev na več načinov, vključno z njihovo stabilnostjo (za pregled, glej Desterro et al., 2000; Whitmarsh in Davis, 2000) smo raziskali, ali je ΔFosB fosfoprotein. V ta namen je bila ekspresija ΔFosB inducirana v možganih podgan s kronično ECS, zdravljenje za katero je znano, da inducira visoke ravni ΔFosB, zlasti v frontalnem korteksu (Hope et al., 1994a). En dan po zadnjem zdravljenju z ECS, ko vrednosti ΔFosB ostanejo visoke, pripravimo tanke frontalne kortikalne rezine in presnovno označimo z 32P-ortofosfat. Vzporedni niz rezin ni bil radioaktivno označen, in so bili uporabljeni za odkrivanje skupnih ravni ΔFosB. Po imunoprecipitaciji s specifičnim anti-FosB / ΔFosB protitelesom in ločitvijo imunoprecipitiranih beljakovin s SDS-PAGE, fosforiliranimi 32P-označeno ΔFosB smo odkrili z avtoradiografijo, skupni ΔFosB pa z imunoblotingom. Ta analiza je pokazala, da je ΔFosB fosforiliran v možganih, kar dokazuje specifična 32P-označen pas N35 kDa, prisoten v kronično obdelanih možganskih vzorcih, vendar praktično ni mogoče zaznati v kontroli, ki je predmet lažne obdelave (Slika 2A). To je v skladu z dejstvom, da so v odsotnosti kronične stimulacije bazalne ravni ΔFosB zelo nizke. Specifičnost imunoprecipitacijske reakcije je ponazorjena s pomanjkanjem signala v neimunski IgG oborini.

Slika 2.

Ogled večje različice:

Slika 2.

ΔFosB je fosfoprotein v možganih. AΔFosB je fosforiliran v možganih. Endogeni ΔFosB smo inducirali v možganih podgan s kronično obdelavo ECS, kot je opisano v Materialih in metodah. Frontalne kortikalne rezine so bile presnovno označene 32PH3PO4 več ur. Po homogenizaciji rezin je bil ΔFosB imunoprecipitiran in fosforiliran ΔFosB (32P-ΔFosB) smo odkrili z avtoradiografijo (zgornja plošča). Skupni ΔFosB v nonradioaktivnih imunoprecipitatih smo odkrili z imunoblotingom (spodnji del). Kot negativne kontrole so prikazani imunoprecipitat lažno obdelane živali in neimunih IgG. BKandidatna mesta fosforilacije in kinaze z ustreznimi ocenami napovedi za proteinsko sekvenco mišje ΔFosB smo dobili z bioinformatsko analizo. Mesta kandidatov z višjimi ocenami napovedi so poudarjena v zaporedju beljakovin in navedena v tabeli. DNA-vezavna (bazična) domena in levcinska zadrga sta v beli sekvenci krepki. C, DΔFosB fosforilacija se poveča z Ser / Thr fosfataznim inhibitorjem OA. C, 32Ravni P-ΔFosB v imunoprecipitatih s frontalnih kortikalnih rezin, označenih v odsotnosti (Ctr), ali prisotnost 100 ng / ml OA (graf in zgornja plošča) smo odkrili z avtoradiografijo. Na spodnji plošči je prikazan skupni ΔFosB, ugotovljen v imunoprecipitatih iz neoznačenih rezin z imunoblotingom. D, PC12 celice so bile okužene s HSV-ΔFosB ali HSV-LacZ (vektorjem) in metabolično označene z 32PH3PO4 v odsotnosti (Ctr) ali prisotnosti 100 ng / ml OA. 32Ravni P-ΔFosB v imunoprecipitatih smo odkrili z avtoradiografijo (graf, zgornja plošča). Na spodnji plošči je prikazan skupni ΔFosB, odkrit v celičnih lizatih z imunoblotingom.

Kot prvi korak k razjasnitvi, katere kinaze in mesta so vključene v fosforilacijo ΔFosB, smo njeno aminokislinsko sekvenco izpostavili več bioinformatskim analizam. To je pokazalo, da čeprav ΔFosB ne vsebuje Tyr fosforilacijskih kandidatnih mest, vsebuje več območij s konsenzom Ser / Thr kinaze, vključno s tremi CaMKII mesti, tremi CK2 lokacijami in dvema PKC mestoma z zelo visokimi rezultati za napovedovanje fosforilacije (Slika 2B). Če je, kot predvideva bioinformatika, ΔFosB samo fosforiliran na Ser ali Thr ostankih, potem mora biti njegova fosforilacija pomembno modulirana z aktivnostjo Ser / Thr fosfataz. Da bi preizkusili to hipotezo, smo označili frontalne kortikalne rezine 32P-ortofosfat v prisotnosti ali odsotnosti OA, inhibitorja Ser / Thr protein fosfataze. Kot je prikazano v Slika 2C, OA je povzročil veliko (N2.5-kratno) povečanje 32P-ΔFosB. Prav tako je povzročilo majhno povečanje skupnih koncentracij ΔFosB, kar je skladno s prejšnjimi poročili, ki povezujejo rakotvorne učinke OA z njegovo sposobnostjo, da inducira več takojšnjih zgodnjih genov, vključno s Fos proteini (Miller et al., 1998; Choe et al., 2004). Neto rezultat je znatno povečanje (N60%) fosforiliranih ravni ΔFosB.

Nato smo raziskali, ali je v celicah PC12, ki so bolj primerne za eksperimentalno manipulacijo, ΔFosB pokazal vzorec fosforilacije, podoben tistemu v možganih. Izražali smo ΔFosB v celicah PC12 z okužbo s HSV-ΔFosB in metabolično označili celice z \ t 32P-ortofosfat v prisotnosti ali odsotnosti OA. Uspešna ekspresija in imunoprecipitacija proteina iz celic, okuženih s HSV-ΔFosB, je prikazana s prisotnostjo obeh v imunoblotu (Slika 2Dspodnji del) in avtoradiograf (zgornja plošča) pasu 35 kDa, odsotnih v celicah, okuženih z vektorjem. Kot so opazili v možganih, je OA povzročil majhno povečanje skupnih koncentracij ΔFosB, vendar veliko večje (približno dvakrat) povečanje 32P-ΔFosB, kar ima za posledico pomembno (N50%) neto povečanje fosforilacije ΔFosB. Poleg tega zdravljenje celic PC12 z inhibitorjem fosfataze Tyr v skladu z bioinformatičnimi napovedmi ni povzročilo pomembnih sprememb v 32Ravni P-ΔFosB (podatki niso prikazani). Skupaj so te ugotovitve pokazale, da je ΔFosB fosforiliran na Ser in / ali Thr ostankih v možganih in v PC12 celicah in potrdil, da je to dober sistem celične kulture, v katerem je mogoče nadalje proučiti fosforilacijske in degradacijske profile ΔFosB.

CK2 vendar ne PKC ali CaMKII fosforilira ΔFosB in vitro

Kot je opisano zgoraj, je analiza aminokislinskega zaporedja ΔFosB pokazala visoke ocene napovedi za mesta fosforilacije CK2, PKC in CaMKII. Da bi ugotovili, katera od teh kinaz lahko fosforilira ΔFosB, smo izvedli serijo in vitro reakcije fosforilacije z uporabo očiščenih kinaz in očiščenega rekombinantnega ΔFosB. Kot je prikazano v Slika 3AOd treh kandidatnih kinaz je samo CK2 pomembno fosforiliral ΔFosB. Poleg tega so bile testirane še nekatere druge kinaze (npr. GSK3 in p70S6K), vendar niso bistveno fosforilirale ΔFosB (podatki niso prikazani). Dodatna karakterizacija analize reakcije CK2 s časovnim potekom je pokazala, da lahko ta kinaza katalizira vključitev N0.5 mol fosfata na mol ΔFosB (Slika 3B). Dejstvo, da lahko CK2 fosforilira ΔFosB in vitro do znatne stehiometrije (N50%) kaže na fiziološko pomembno reakcijo. Nato smo proučevali kinetiko te reakcije z inkubiranjem CK2 v prisotnosti povečanih količin prečiščenega ΔFosB in ugotovili, da CK2 fosforilira ΔFosB z Vmax 5.8 pmol · min-1 · Μg-1 encima, a KM 18.4 μm in a kmačka od 0.2 / s (Slika 3C). Vrednosti, dobljene za te kinetične parametre, dodatno podpirajo fiziološko pomembnost te reakcije. Na primer, KM CK2 za DARPP32, eden od njegovih najbolj znanih substratov, je 3.4 μm in kmačka je UM0.3 / s (Girault et al., 1989); KM za ATP sega od N10 – 40 μm (Cochet et al., 1983; Silva-Neto et al., 2002), in da se za kazein giblje od N10 – 50 μm (Meggio et al., 1977; Pyerin et al., 1987). Ti podatki skupaj kažejo, da je ΔFosB dobronamerni substrat za CK2 in vitro.

Slika 3.

Ogled večje različice:

Slika 3.

CK2 vendar ne PKC ali CaMKII fosforilira ΔFosB in vitro. Avtoradiograf (zgornja plošča) prikazuje fosforiliran produkt, Coomassie-obarvani gel (spodnji del) pa prikazuje celotni ΔFosB, prisoten v reakciji. APrečiščen rekombinantni ΔFosB je bil izpostavljen in vitro fosforilacijo z različnimi kandidatnimi kinazami (od katerih so prikazane trije). BČasovni potek in stehiometrične analize kažejo, da lahko CK2 fosforilira ΔFosB in vitro s stehiometrijo N50%. CKinetična analiza reakcije CK2 je pokazala, da je ΔFosB dobronamerna in vitro substrat. Linearizacija reakcije je prikazana v dvojno recipročni ploskvi (spodaj), kinetični parametri pa so bili izpeljani iz Michaelis-Mentenove krivulje (zgoraj).

CK2 modulira fosforilacijo in stabilnost ΔFosB v intaktnih celicah

Za oceno fiziološke pomembnosti fosforilacije ΔFosB, posredovanega s CK2, smo izvedli primerjalno preslikavo fosfopeptida z uporabo in vitro fosforilirani in PC12-celično fosforilirani ΔFosB. Po SDS-PAGE in gelnem eluiranju 32P-ΔFosB (od in vitro ali iz imunoprecipitata 32P-označene celice), beljakovino digeriramo s tripsinom in nastale fosfopeptide izpostavimo dvodimenzionalni ločitvi. Ta analiza je pokazala, da se glavni fosfopeptid iz reakcije CK2 kombirira z enim od dveh glavnih fosforptidov iz ΔFosB, fosforiliranih v celicah PC12 (Slika 4A), medtem ko fosforeptidi, ki izhajajo iz reakcije PKC ali CaMKII (podatki niso prikazani), niso. Na zemljevidu je bila prisotna druga ΔFosB fosfopeptida iz celic PC12, vendar zaradi nezmožnosti katere koli od kinaz, ki smo jih testirali, da bi ustvarili podoben fosfopeptid in vitrotrenutno ne vemo, ali ta drugi fosfopeptid vsebuje mesto fosforilacije, ki se razlikuje od drugega fosfopeptida ali pa predstavlja ločen triptični peptid, ki vsebuje isto mesto fosforilacije.

Slika 4.

Ogled večje različice:

Slika 4.

CK2 modulira fosforilacijo in stabilnost ΔFosB v intaktnih celicah. ACK2, vendar ne PKC, se zdi, da fosforilira ΔFosB v celicah. Dvodimenzionalne fosfopeptidne karte ΔFosB, fosforilirane s CK2 ali PKC in vitro ali z intaktnimi celicami PC12. Puščice kažejo kombinacijo CK2-fosforiliranega peptida, ne pa tudi PKC-fosforiliranega z enim od ΔFosB fosfopeptidov, pridobljenih iz celic PC12. BFosforilacija ΔFosB v celicah PC12 se poveča z zdravljenjem celic z močnim aktivatorjem CK2 (SP) in zmanjšanjem z zdravljenjem z inhibitorjem CK2 DRB. V nasprotju s tem, fosforilacija ΔFosB v celicah PC12 ni vplivala na zdravljenje z aktivatorjem PKC (PMA) ali PKC-specifičnim inhibitorjem calphostin-C (Calph). Prikazani so reprezentativni autoradiogram (zgornja plošča) in imunoblot (spodnja plošča). C – F, Učinek aktivnosti CK2 na stabilnost ΔFosB. Številke prikazujejo časovni potek (in reprezentativni autoradiogram) degradacije ΔFosB. Celice PC12, ki so začasno eksprimirale ΔFosB, so bile izpostavljene impulznim eksperimentom, izvedenim v odsotnosti ali prisotnosti inhibitorja CK2 DRB (C), aktivator CK2 spermin (D) ali inhibitor kinaze širokega spektra H-8 (E), ki je bila uporabljena za nadzor nespecifičnih učinkov DRB. F, Učinek porušitve katalitične podenote CK2 na stabilnost ΔFosB. Celice PC12 so bile transfektirane bodisi z ne-ciljno siRNA (Ctr) bodisi s siRNA, ki je ciljala na podgane CK2α in 24 h kasneje transficirane z ΔFosB plazmidom. Na zgornji plošči so prikazani imunoblotni celični lizati, ki kažejo učinek CK2 siRNA na nivoje CK2 in ΔFosB. Ustrezni imunoblot za β-tubulin je prikazan kot obremenitveni nadzor.

Za nadaljnjo obravnavo fiziološkega pomena CK2 kot kinaze ΔFosB smo zdravili ΔFosB-ekspresijske celice PC12 z dvema zdraviloma, ki modulirata aktivnost CK2. Kot je prikazano v Slika 4B, Fosforilacija ΔFosB je bila zmanjšana z obdelavo celic PC12 s celično prepustnim inhibitorjem CK2 DRB (Meggio et al., 1990; Szyszka et al., 1995) in povečano z zdravljenjem s poliaminskim sperminom, za katerega je znano, da je močan aktivator CK2 (Cochet in Chambaz, 1983; Meggio et al., 1983). V nasprotju s tem pa zdravljenje celic PC12 z zaviralcem PKC kalfostinom-C (Kobayashi et al., 1989; Tamaoki et al., 1990) ali aktivatorja PKC PMA (Schmidt in Hecker, 1975; Beh et al., 1989) ni povzročil pomembnih sprememb fosforilacije ΔFosB. V primeru PMA se rahlo (in ne znatno) povečanje. \ T 32P-ΔFosB je mogoče pripisati povečanju celotne ravni ΔFosB, ki jo povzroča to zdravilo; pravzaprav so poročali, da forbolni estri povzročajo ekspresijo več proteinov družine Fos, vključno s FosB (Yoza et al., 1992; Suh et al., 2004). Poleg tega obdelava celic s specifičnim celično prepustnim inhibitorjem CaMKII m-AIP (Ishida in Fujisawa, 1995; Stevens et al., 1999) tudi ni povzročilo zmanjšanja fosforilacije ΔFosB (podatki niso prikazani). Ti rezultati so skupaj z našimi in vitro ugotovitve in kažejo, da je v celih celicah ΔFosB verjetno fosforiliran s CK2, vendar ne s PKC ali CaMKII. Dejstvo, da inhibicija CK2 ne prepreči popolnoma fosforilacije ΔFosB, kaže na obstoj dodatnih mest fosforilacije v proteinu.

V nadaljevanju smo preverili, ali ima CK2 vlogo pri prometu ΔFosB in s tem v njegovi stabilnosti. V ta namen smo izvedli eksperimente s pulz-chase z uporabo ΔFosB-eksprimiranih celic PC12, obdelanih z inhibitorjem CK2 ali aktivatorjem CK2, uporabljenim v študiji fosforilacije. Kot je prikazano v Slika 4C, obdelava celic z inhibitorjem CK2 DRB je pomembno vplivala na stopnjo fluktuacije ΔFosB, kar dokazuje sprememba oblike njene krivulje degradacije, od dvofazne do krivulje, ki je bližja krivulji eksponencialnega razpada. Nasprotno pa je prisotnost aktivatorja CK2 spermina povzročila znatno zmanjšanje hitrosti razgradnje ΔFosB, kar je povzročilo kopičenje proteina v prvih urah chase (Slika 4D).

Kot pri mnogih aktivatorjih in zaviralcih kinaze, lahko spermin in DRB imata presnovne učinke zunaj modulacije aktivnosti CK2. Dejansko je bilo dokazano, da DRB zavira kinazo, povezano s transkripcijskim faktorjem IIH (TFIIH) (Yankulov et al., 1995), kar ima za posledico inhibicijo transkripcije, posredovane z RNA polimerazo II. Ker lahko ta učinek vpliva na stabilnost ΔFosB, smo analizirali učinek inhibitorja kinaze širokega spektra H-8 (Hidaka in Kobayashi, 1992) na obtoku ΔFosB pri koncentraciji (200 μm), za katero je znano, da zavira kinazo, povezano s TFIIH, vendar ne CK2 (Yankulov et al., 1995). Kot je prikazano v Slika 4E, obdelava s H-8 ni vplivala na hitrost prometa ΔFosB. Podobni rezultati so bili pridobljeni s H-7, drugim inhibitorjem kinaze širokega spektra, uporabljenim pri koncentraciji, ki inhibira TFIIH-povezano kinazo, ne pa tudi CK2 (podatki niso prikazani). Ti podatki nadalje podpirajo razlago, da je zmanjšanje stabilnosti ΔFosB, ki ga povzroča DRB, najverjetneje posledica zaviranja CK2.

Za nadaljnjo ugotovitev vloge CK2 v prometu ΔFosB smo raziskali posledice snemanja CK2a preko siRNA. Te poskuse smo izvedli z uporabo PC12 celic, ki so bile najprej transfektirane s kontrolno (nontargetsko) siRNA ali siRNA, ki je usmerjena na mRNA katalitične podenote podganjih CK2 (CK2α) in 24 h kasneje transficirane z ΔFosB. Kot je prikazano v Slika 4F, transfekcijo s CK2a siRNA učinkovito in specifično podrli nivoje CK2α proteinov brez vpliva na nivoje ΔFosB (zgornja plošča). Pulzna analiza je pokazala, da je podiranje CK2-a povzročilo znatno povečanje stopnje fluktuacije ΔFosB, kar dokazuje hitrejša razgradnja proteina. Dejstvo, da zaviranje aktivnosti CK2 (bodisi prek tretiranja DRB ali siRNA) poveča promet ΔFosB in povzroči izginotje počasne komponente bifazne krivulje, medtem ko aktivacija CK2 izboljša počasno fazo krivulje, zagotavlja močno podporo za idejo, da ima CK2 vlogo pri uravnavanju stabilnosti ΔFosB.

CK2 fosforilira ΔFosB na Ser27

Za začetek identifikacije mesta (-ov) na ΔFosB fosforiliranem s CK2, smo izvedli fosfo-aminokislinsko analizo rekombinantnega ΔFosB fosforiliranega s CK2. in vitro in ΔFosB fosforilirane v celicah PC12. Ti poskusi so pokazali, da je bila v obeh primerih odkrita samo fosfo-aminokislinska fosfo-ser (Slika 5A). Ta ugotovitev, skupaj s stehiometrijo, pridobljeno za CK2 in vitro reakcija fosforilacije (N50%) (Slika 3B) in prisotnost samo ene pomembne točke na karti CK2 fosfopeptida (Slika 4A), kaže, da je fosforilacija ΔFosB CK2 verjetno omejena na en sam serinski ostanek. Ta sklep je skladen s fosforilacijsko konsenzno analizo mesta (Slika 2B), ki predvideva samo en kandidat za serin, tj. Ser27, za CK2. Taksonomska analiza je pokazala, da je Ser27 visoko ohranjen z evolucijo med člani družine Fos (Slika 5B), kar kaže, da lahko nosi pomembno fiziološko funkcijo.

Slika 5.

Ogled večje različice:

Slika 5.

CK2 Fosforilati ΔFosB na Ser27. A, Analiza fosforaminske kisline fosforiliranega CK2 (in vitro) in PC12 celično fosforilirani ΔFosB, ki kaže, da je v obeh primerih glavni fosforiliran ostanek serin. B, Analiza med vrstami aminokislinskega zaporedja FosB / ΔFosB je pokazala visoko ohranitev Ser27 med člani družine Fos od človeka do zebrice (temna osvetlitev). Vendar kislinski ostanek na položaju + 3, ki je potreben za soglasno mesto CK2, se ne ohrani (svetloba je osvetljena). C, HeLa celice so bile začasno transficirane z divjim tipom ΔFosB (WT) ali ΔFosB, ki vsebujejo točkovno mutacijo, da nadomestijo Ser27 z Ala (S27A). Celice so bile metabolično označene z 32PH3PO4 in obdelamo z vehiklom ali s sperminom (SP), da aktiviramo CK2. Prikazani so reprezentativni autoradiogram (zgornja plošča) in imunoblot (spodnji del) pridobljenih imunoprecipitatov ΔFosB. Prikazan je imunoprecipitat lažno transfektiranih celic (vektor).

Da bi ugotovili, ali je Ser27 fosforiliran v ΔFosB, smo ta ostanek mutirali na Ala in analizirali posledice na status fosforilacije proteina. V ta namen smo uporabili celice HeLa (ki jih lahko transficiramo z večjo učinkovitostjo), da bi začasno ekspresirali bodisi WT ali S27A mutant ΔFosB. Približno 24 h po transfekciji so celice presnovno označene 32Pripravili smo P-ortofosfat in lizate celih celic. Po imunoprecipitaciji in SDS-PAGE, 32P-ΔFosB smo odkrili z avtoradiografijo in celotnim ΔFosB z imunoblotingom. Kot je prikazano v Slika 5C (spodnji panel), ΔFosB ni bil odkrit v celicah, transfektiranih z vektorji, medtem ko so celice, transfektirane z WT ali S27A mutantom ΔFosB, uspešno eksprimirale protein. Ugotovili smo, da je mutacija S27A povzročila znatno zmanjšanje (UM30%) 32Ravni P-ΔFosB (Slika 5C, zgornji plošči in graf), ki kaže, da je ΔFosB v živih celicah fosforiliran na Ser27. Da bi ugotovili, ali je v celicah Ser27 dejansko fosforiliran s CK2, smo primerjali sposobnost spermina aktivatorja CK2, da modulira fosforilacijo WT in S27A ΔFosB. Kot smo prej opazili v celicah PC12 (Slika 4B), zdravljenje celic HeLa s sperminom je znatno povečalo fosforilacijo proteina WT. Dejstvo, da se je ta učinek znatno zmanjšal zaradi mutacije S27A (Slika 5C) podpira razlago, da je Ser27 v ΔFosB fiziološki substrat za CK2.

Fosforilacija Ser27 uravnava stabilnost ΔFosB

Po ugotovitvi, da se stabilnost ΔFosB zmanjša, ko je CK2 blokiran in povečan, ko je aktiviran CK2 (Slika 4), in da CK2 fosforilira ΔFosB na Ser27 (Slika 5), smo napovedali, da bi preprečevanje fosforilacije tega mesta destabiliziralo protein. Eksperimenti s pulznim lovom, izvedeni s celicami HeLa, ki so začasno eksprimirali bodisi WT ali S27A mutant ΔFosB, so pokazali, da je mutacija S27A, kot je bilo predvideno, povzročila znatno povečanje stopnje razgradnje ΔFosB in hkratno zmanjšanje razpolovnega časa proteina (Slika 6A). Nato smo raziskali, ali se ta regulacijski mehanizem pojavlja tudi v bolj nevronski podobni celični liniji PC12. Ti poskusi so pokazali, da, kot smo opazili v celicah HeLa, točkovna mutacija S27A povzroči dramatično zmanjšanje razpolovnega časa ΔFosB v celicah PC12 (od N11 do N4 h) (Slika 6B). Dejstvo, da je ta destabilizacija podobna tisti, ki jo povzroča zaviranje CK2 ali zrušenje (Slika 4) zagotavlja nadaljnjo podporo ideji, da CK2-posredovana fosforilacija Ser27 uravnava stabilnost ΔFosB. Dodatni dokazi za regulativno vlogo fosforilacije Ser27 na prometu z beljakovinami ΔFosB so bili pridobljeni z uporabo fosfomimetične Ser27 do mutacije Asp (S27D). Mutacija S27D se šteje za fosfomimetično, ker postavi veliko negativno nabito (karboksilno) skupino na aminokislino 27 in tako delno posnema fosforilacijo Ser27. Kot je prikazano v Slika 6Cmutacija S27D je povzročila nasprotni učinek mutacije S27A in povzročila, da je protein bistveno stabilnejši od proteina WT. Podobno kot učinek, dobljen po aktivaciji CK2 (Slika 4D), je mutacija S27D povzročila kopičenje in tako povečala nivoje ΔFosB v prvih urah chase.

Slika 6.

Ogled večje različice:

Slika 6.

Fosforilacija Ser27 uravnava stabilnost ΔFosB. A, C, Puls-chase analiza, ki kaže učinek fosforilacije Ser27 na stopnjo fluktuacije ΔFosB. Prikazan je profil razgradnje in ocenjena razpolovna doba divjega tipa ΔFosB (WT), mutanta Ser27 do Ala (S27A) in fosfomimetičnega Ser27 do mutanta Asp (S27D). Iste ugotovitve so bile pridobljene v celicah HeLa (A) in celice PC12 (B, C).

Ser27 fosforilacija stabilizira ΔFosB s preprečevanjem njegove proteasomalne razgradnje

Da bi začeli pojasnjevati mehanizem, s katerim fosforilacija Ser27a stabilizira ΔFosB, smo preučili sposobnost proteazomskih inhibitorjev MG132 (Palombella et al., 1994; Tsubuki et al., 1996) in epoksomicin (Hanada et al., 1992; Kim et al., 1999) za modulacijo hitrosti razgradnje WT in S27A mutanta ΔFosB. Eksperimenti s pulznim sproženjem so bili izvedeni z uporabo PC12 celic, ki so bile okužene z rekombinantnim HSV, ki je izražal bodisi WT ali S27A ΔFosB in obdelane bodisi z DMSO bodisi z enim od dveh proteasomskih inhibitorjev. Ti poskusi so pokazali, da je stopnja razgradnje proteina WT sorazmerno neobčutljiva na prisotnost obeh inhibitorjev proteasoma (Slika 7A), da je mutant S27A občutljiv na ta zdravila (Slika 7B). To kaže, da je za razliko od proteina WT mutant S27A tarča proteasomalne razgradnje. Zdravljenje celic bodisi z MG132 bodisi z epoksimicinom je popolnoma spremenilo učinek mutacije S27A na hitrost razgradnje ΔFosB, kar dokazuje povečanje razpolovne dobe mutanta S27A od N4 do N9 h za MG132 in do 12 h za epoksomicin (Slika 7B). Te ugotovitve skupaj kažejo, da fosforilacija ΔFosB na Ser27 varuje beljakovino pred proteasomsko razgradnjo in je zato bistvena za njegovo nenavadno stabilnost.

Slika 7.

Ogled večje različice:

Slika 7.

Fosforilacija Ser27a stabilizira ΔFosB s preprečevanjem njegove proteasomalne razgradnje. A, B, Puls-chase analiza s celicami PC12, okuženimi s HSV, ki kažejo profil razgradnje in ocenjene razpolovne dobe divjega tipa ΔFosB (A) ali S27A ΔFosB (B) v odsotnosti ali prisotnosti obeh zaviralcev proteasoma [MG132 in epoksomicin (Epoxo)]. Upoštevajte dejstvo, da nobeno zdravilo nima pomembnega vpliva na promet divjega tipa ΔFosB, medtem ko je zdravljenje celic z bodisi zaviralcem proteasoma povzročilo stabilizacijo S27A ΔFosB. C, Model za vlogo fosforilacije Ser27 v sposobnosti ΔFosB, da posreduje dolgoročno plastičnost možganov. Ko je induciran, se del ΔFosB stabilizira v možganih s fosforilacijo S2, posredovano s CK27. Posledica tega je njegovo kopičenje, kar posledično vodi do dolgotrajnih sprememb v izražanju genov. Te stabilne spremembe v izražanju genov prispevajo k stabilnim vedenjskim prilagoditvam. Nasprotno pa defosforilacija S27a s Ser / Thr fosfatazami PP1 in / ali PP2A povzroči destabilizacijo proteina in njegovo obdelavo s proteasomalnimi stroji.

Prejšnji odsekNaslednji razdelek

Razprava

V tej študiji smo pokazali, da ima ΔFosB razpolovni čas N10 h v celični kulturi, zaradi česar je stabilen v primerjavi s FosB polno dolžino in večino drugih inducibilnih transkripcijskih faktorjev, katerih razpolovna doba v celični kulturi je lahko kratka. nekaj minut in redko presega 3 h (Hann in Eisenman, 1984; Dobrazanski et al., 1991; Roberts in Whitelaw, 1999; Ferrara et al., 2003; Hirata et al., 2004). Poleg tega ugotavljamo, da je ΔFosB fosforiliran v možganih in da je njegova fosforilacija občutljiva na oksadinski kislini, ki zavira PP1 / PP2A. Naše študije celične kulture so pokazale, da je stabilnost ΔFosB modulirana s CK2, z višjo aktivnostjo CK2, ki stabilizira protein. Naše ugotovitve kažejo, da CK2 fosforilira ΔFosB na visoko konzerviranem serinu N (S27) in dokazuje, da fosforilacija S27a ščiti ΔFosB pred proteasomsko razgradnjo. Zato predlagamo model, po katerem je fosforilacija ΔFosB na S27 s strani CK2 kritični regulativni mehanizem prometa ΔFosB (Slika 7C). Takšna stabilizacija ΔFosB, ki jo posreduje fosforilacija, je funkcionalno pomembna, ker je bilo dokazano, da povečane ravni ΔFosB v določenih regijah možganov neposredno regulirajo številne nevronske gene. vivo in izvajati močne vedenjske učinke pri živalskih modelih več nevropsihiatričnih motenj (glej uvod).

Čeprav je fosforilacija hiter in reverzibilen način regulacije transkripcijske aktivnosti določenih transkripcijskih faktorjev, kot je CREB (vezni protein za odziv cAMP) (Bohmann, 1990), modulacija degradacije transkripcijskih faktorjev zagotavlja še močnejšo (manj lahko reverzibilno) obliko regulacije (Desterro et al., 2000). Transkripcijski faktorji, katerih funkcionalna aktivnost je regulirana na ravni njihove degradacije, vključujejo NFkB (Desterro et al., 2000), c-Myc (Sears et al., 1999) in c-Fos (Ferrara et al., 2003), med ostalimi. V mnogih primerih je fosforilacija ključni regulator stabilnosti transkripcijskega faktorja, kot je bilo prikazano za c-Fos (Okazaki in Sagata, 1995; Tsurumi et al., 1995), Fos-povezani antigen-1 (Fra-1) (Viala in Marshall, 2003), Fra-2 (Manabe et al., 2001), c-Jun (Fuchs et al., 1996), JunB (Fuchs et al., 1997), ATF2 (Fuchs et al., 2000) in p53 (Buschmann et al., 2001). Naše študije tako dodajo ΔFosB na ta seznam transkripcijskih faktorjev, katerih funkcionalna aktivnost je regulirana s fosforilirano odvisno stabilnostjo.

CK2 je vseprisotna in konstitutivno aktivna Ser / Thr kinaza, ki ima do zdaj identificiranih 300 domnevnih substratov in je vpletena v več bioloških procesov, vključno s celično smrtjo in preživetjem (Litchfield, 2003; Unger et al., 2004), celični stresni odzivi (Yanagawa et al., 1997; Kato et al., 2003), ter popravilo DNA in preoblikovanje kromatina (Barz et al., 2003; Krohn et al., 2003). Več kot tretjina domnevnih substratov CK2 so proteini, ki sodelujejo pri regulaciji genske ekspresije (Meggio in Pinna, 2003). V resnici je bilo dokazano, da je CK2 vidna jedrska kinaza (Krek et al., 1992) (za pregled glej Yu et al., 2001) in interakcijo z bZIP domenami več transkripcijskih faktorjev (Yamaguchi et al., 1998). Pokazalo se je tudi, da fosforilacija, posredovana s CK2, modulira razgradnjo (ali povečanje ali zmanjšanje) mnogih proteinov, vključno z IkB (Schwarz et al., 1996), PTEN (Torres in Pulido, 2001), leče Connexin (Yin et al., 2000), HMG1, povezan s kromatinom (\ tWisniewski et al., 1999) in več transkripcijskih faktorjev, kot je HMGB (Stemmer et al., 2002), Myf-5 (Winter et al., 1997) in c-Myc (Channavajhala in Seldin, 2002). CK2 je najbolj razširjen v možganih (Alcazar et al., 1988; Girault et al., 1990), in njegova aktivnost je bila vključena v številne vidike delovanja možganov, vključno s preživetjem nevronov (Boehning et al., 2003), diferenciacija (Nuthall et al., 2004), funkcija ionskih kanalov (Jones in Yakel, 2003; Bildl et al., 2004) ter dolgoročno povečanje in plastičnost nevronov (Diaz-Nido et al., 1992; Lieberman in Mody, 1999; Reikhardt et al., 2003).

Kljub vse večjemu dokazu o vlogi CK2 v regulaciji nevronske funkcije, je malo znanega o tem, kaj nadzoruje njegovo aktivnost. CK2 naj bi bil konstitutivno aktiven, z regulacijo njegove sposobnosti, da fosforilira specifične substrate, pri čemer se opira predvsem na spremembe v njeni znotrajcelični lokalizaciji (npr. Citosol proti jedru) (Ahmed in Tawfic, 1994; Yu et al., 1999). Te informacije sprožajo pomembno vprašanje o tem, kateri signali so potrebni za indukcijo akumulacije ΔFosB v možganih po kronični stimulaciji (Slika 7C). Ena od zahtev je ponovna aktivacija fosB gen in indukcijo ΔFosB mRNA (Chen et al., 1995). Naši podatki kažejo, da je CK2 fosforilacija ΔFosB kritična za njeno stabilnost, kar kaže, da je lahko potreben drugi signal za dolgoročne učinke ΔFosB na gensko ekspresijo, to je signal, ki stimulira fosforilacijo beljakovin s CK2. To bi lahko vključevalo aktivacijo CK2 po nekem neznanem mehanizmu ali njegovo translokacijo v jedro. Alternativno je lahko CK2 fosforilacija ΔFosB konstitutivna, tako da se beljakovina ΔFosB prevede kot odziv na vsak dražljaj, da se del fosforilira in s tem stabilizira, tako da se z večkratno stimulacijo akumulira do visokih nivojev v prizadetih nevronih.

Naše ugotovitve kažejo, da CK2 in S27 verjetno nista edina kinaza in mesto, odgovorno za fosforilacijo ΔFosB, ker niti inhibicija CK2 niti mutacija S27A nista mogli popolnoma preprečiti fosforilacije ΔFosB. Podobno dejstvo, da mutacija S27A povzroči 30% zmanjšanje fosfo-ΔFosB, dokazuje, da je S27 glavno mesto fosforilacije na proteinu. Kljub temu raziskujemo druge domnevne kinaze in mesta fosforilacije na ΔFosB. Nenazadnje bo pomembno tudi, da analiziramo fosforilacijo S27 in vseh drugih mest fosforilacije v ΔFosB v možganih vivo po različnih vrstah kronične stimulacije, na primer z uporabo masne spektrometrije ali fosfospecifičnih protiteles.

Kot je omenjeno zgoraj, je S27 v ΔFosB zelo ohranjen v evoluciji in med drugimi beljakovinami družine Fos. Vendar pa soglasno mesto za CK2 ni: kot je prikazano v Slika 5B, samo FosB / ΔFosB (in xenolog zebrafis), vendar ne c-Fos ali Fra-2, imajo kislinski ostanek pri + 3, ključni dejavnik fosforilacije CK2 (Marin et al., 1986; Meggio et al., 1994). Tako lahko pomanjkanje fosforilacije CK2 na S27 pojasni, zakaj drugi proteini družine Fos niso tako stabilni kot ΔFosB. Vendar pa to ne pojasnjuje, zakaj FosB s polno dolžino, ki ima isto soglasno mesto CK2 kot ΔFosB, ni podobno stabiliziran. Ne vemo, ali je FosB s polno dolžino fosforiliran s CK2 na tem ohranjenem ostanku. Edina poročila FosB (Skinner et al., 1997) in c-Fos (Okazaki in Sagata, 1995; Chen et al., 1996) fosforilacija opisuje mesta v C-terminalni regiji teh proteinov, ki jih v ΔFosB ni. Potencialna fosforilacija FosB in drugih beljakovin družine Fos s CK2 zahteva neposredno preiskavo. Tudi če so fosforilirani, je znano, da druge beljakovine družine Fos vsebujejo motive na njihovih C koncih, ki ciljajo na beljakovine za hitro razgradnjo (Papavassiliou et al., 1992; Jariel-Encontre et al., 1997; Acquaviva et al., 2002). Na primer, dokazano je, da odsek N21 ostankov, prisotnih v C-terminalu vseh beljakovin družine Fos, vendar odsoten v ΔFosB, deluje kot destabilizirajoča domena za c-Fos (Acquaviva et al., 2001). Ugotovili smo, da čeprav to zaporedje enako destabilizira celotno dolžino FosB (Carle et al., 2004), odsotnost te domene v ΔFosB ne upošteva v celoti njegove stabilizacije. Namesto tega se zdi, da kombinacija odsotnosti te C terminus domene in Ser27 fosforilacije v celoti upošteva približno petkratno razliko v stabilnosti med ΔFosB in FosB.

Čeprav je razgradnja beljakovin družine Fos zapletena in ni povsem razumljiva, se zdi, da je glavna proteazomska razgradnja (Salvat et al., 1999; Acquaviva et al., 2002; Ferrara et al., 2003). Predstavljeni podatki, v katerih proteasomalni inhibitorji bistveno ne spreminjajo stopnje razgradnje ΔFosB, trdijo, da za razliko od drugih beljakovin družine Fos, ΔFosB izogne ​​proteazom 26S in to igra osrednjo vlogo pri njegovi stabilizaciji. Zato predlagamo shemo, po kateri se poveča stabilnost ΔFosB pripiše kombinaciji dveh glavnih dejavnikov: (1) odsotnosti destabilizirajoče C-terminalne domene in (2) fosforilacije S27 s CK2.

Če povzamemo, ta študija zagotavlja mehanistični vpogled v to, zakaj je ΔFosB, produkt takojšnjega zgodnjega gena fosBje, za razliko od vseh drugih družinskih članov Fosa, relativno dolgotrajni protein. Čeprav se domneva, da druge beljakovine družine Fos posredujejo hitro, vendar prehodno povezovanje dražljajev in transkripcij (Morgan in Curran, 1995), relativna stabilnost ΔFosB ji daje sposobnost posredovanja daljših transkripcijskih sprememb, ki jih povzroča kronična stimulacija. To podpira stališče, da ΔFosB deluje kot trajno molekularno stikalo v možganih, postopno spreminjanje akutnih odzivov v kronične prilagoditve. Identifikacija fosforilacije Ser27 kot osrednjega mehanizma za stabilnost ΔFosB odpira nove poti za razvoj sredstev za regulacijo funkcije ΔFosB in s tem modulira njegove dolgoročne učinke na živčno in vedenjsko plastičnost.

Prejšnji odsekNaslednji razdelek

Opombe

  • Prejeto november 21, 2005.
  • Revizija je prejela februar 21, 2006.
  • Sprejeta aprila 2, 2006.
  • To delo so podprli Nacionalna zveza za raziskave na področju shizofrenije in mladega raziskovalca depresije, ki je prejel nagrado PGU, Nacionalni inštitut za zlorabo drog (NIDA), nacionalno raziskovalno službo, PGU, in donacije Nacionalnega inštituta za duševno zdravje in NIDA za EJN. zahvalite se dr. Jamesu Bibbu za njegovo pomoč pri in vitro Ming-Hu Han za pomoč pri pripravi možganskih rezin, ki se uporabljajo za označevanje presnove, in dr. Rachael Neve za pomoč pri pakiranju rekombinantnih HSV.
  • Sedanji naslov G. Rudenka: Inštitut za znanosti o življenju in Oddelek za farmakologijo, Univerza v Michiganu, avenija Washtenaw 210 # 3163A, Ann Arbor, MI 48109-2216.
  • Korespondenco je treba nasloviti na Eric J. Nestler, 5323 Harry Hines Boulevard, Dallas, TX 75390-9070. E-naslov: [e-pošta zaščitena]

Prejšnji odsek

 

Reference

Acquaviva C, Brockly F, Ferrara P, Bossis G, Salvat C, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2001) Identifikacija C-terminalnega tripeptidnega motiva, vključenega v kontrolo hitre proteasomalne razgradnje pro-onkoproteina c-Fos med faznim prehodom G (0) -to-S. onkogena 20:7563–7572.

CrossRefMedline

Acquaviva C, Bossis G, Ferrara P, Brockly F, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2002) Večkratne poti razgradnje beljakovin družine Fos. Ann NY Acad Sci 973:426–434.

Medline

Ahmed K, Tawfic S (1994) Mehanizem znotrajcelične regulacije proteinske kinaze CK2: vloga podjednakih povezav, ki jih povzroča stimulans. Cell Mol Bio Res 40:539–545.

Medline

Alcazar A, Martin E, Lopez-Fando J, Salinas M (1988) Izboljšan postopek čiščenja in lastnosti kazein kinaze II iz možganov. Neurochem Res 13:829–836.

CrossRefMedline

Andersson M, Westin JE, Cenci MA (2003) Čas poteka imunske reakcije, podobne striptizmu DeltaFosB, in ravni prodronorfina mRNA po prekinitvi kroničnega dopaminomimetičnega zdravljenja. Eur J Neurosci 17:661–666.

CrossRefMedline

Barz T, Ackermann K, Dubois G, Eils R, Pyerin W. (2003) Ekrani ekspresije po celem genomu kažejo globalno vlogo proteinske kinaze CK2 pri preoblikovanju kromatina. J Cell Sci 116:1563–1577.

Povzetek / prosti tekst

Beh I, Schmidt R, Hecker E (1989) Dva izozima PKC, najdena v celicah HL-60, kažeta razliko v aktivaciji s forbolskim estrom TPA. FEBS Lett 249:264–266.

Medline

Bildl W, Strassmaier T, Thurm H, Andersen J, Eble S, Oliver D, Knipper M, Mann M, Schulte U, Adelman JP, Fakler B (2004) Proteinska kinaza CK2 je sestavljena z majhno prevodnostjo Ca (2 +) - aktiviranih K + kanalov in uravnava kanalsko vezavo. Nevron 43:847–858.

CrossRefMedline

Bing G, Wang W, Qi Q, Feng Z, Hudson P, Jin L, Zhang W, Bing R, Hong JS (1997) Dolgotrajna ekspresija antigena, povezanega s Fos, in prehodna ekspresija delta FosB, povezana z napadi v hipokampusu in striatumu podgan. J Neurochem 68:272–279.

Medline

Blom N, Sicheritz-Ponten T, Gupta R, Gammeltoft S, Brunak S (2004) Napovedovanje post-translacijske glikozilacije in fosforilacije proteinov iz aminokislinskega zaporedja. proteomika 4:1633–1649.

CrossRefMedline

Boehning D, Moon C, Sharma S, Hurt KJ, Hester LD, Ronnett GV, Shugar D, Snyder SH (2003) Nevrotransmisijo ogljikovega monoksida, ki ga aktivira fosforilacija CK2 heme oxygenase-2. Nevron 40:129–137.

CrossRefMedline

Bohmann D (1990) Fosforilacija transkripcijskega faktorja: povezava med signalno transdukcijo in regulacijo genske ekspresije. Celice raka 2:337–344.

Medline

Buschmann T, Potapova O, Bar-Shira A, Ivanov VN, Fuchs SY, Henderson S, Fried VA, Minamoto T, Alarcon-Vargas D, Pincus MR, Gaarde WA, Holbrook NJ, Shiloh Y, Ronai Z (2001) Junxna fosforilacija p2-a na terminalni kinazni pxNUMX na Thr-53 je pomembna za stabilizacijo p81 in transkripcijske aktivnosti kot odgovor na stres. Mol Cell Biol 21:2743–2754.

Povzetek / prosti tekst

Carle TL, Ulery PG, Nestler EJ (2004) Odsotnost ohranjene C-terminalne domene družine Fos prispeva k edinstveni stabilnosti deltaFosB. Soc Neurosci Abstr 30: 692.2.

Channavajhala P, Seldin DC (2002) Funkcionalna interakcija protein-kinaze CK2 in c-Myc v limfomagenezi. onkogena 21:5280–5288.

CrossRefMedline

Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Hope BT, Nestler EJ (1995) Regulacija delta FosB in FosB podobnih beljakovin z elektrokonvulzivnim napadom in zdravljenjem s kokainom. Mol Pharmacol 48:880–889.

Minimalizem

Chen J, Kelz MB, Hope BT, Nakabeppu Y, Nestler EJ (1997) Kronični antigeni, povezani s Fos: stabilne variante ΔFosB, inducirane v možganih s kroničnim zdravljenjem. J Neurosci 17:4933–4941.

Povzetek / prosti tekst

Chen RH, Juo PC, Curran T, Blenis J (1996) Fosforilacija c-Fos na C-terminalu poveča njeno transformacijsko aktivnost. onkogena 12:1493–1502.

Medline

Choe ES, Parelkar NK, Kim JY, Cho HW, Kang HS, Mao L, Wang JQ (2004) Okadaična kislina inhibitorja protein fosfataze 1 / 2A poveča ekspresijo fosforilacije in c-fos CREB in Elk-1 v striatumu podgane in vivo. J Neurochem 89:383–390.

CrossRefMedline

Cochet C, Chambaz EM (1983) Poliaminom posredovane beljakovinske fosforilacije: možna tarča za delovanje znotrajceličnega poliamina. Mol celica Endocrinol 30:247–266.

CrossRefMedline

Cochet C, Feige JJ, Chambaz EM (1983) Katalitske in molekularne lastnosti visoko prečiščene gineze kazeina iz govejega pljučnega tkiva. Biochim Biophys Acta 743:1–12.

Medline

Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW (2003) Steratalno specifična prekomerna ekspresija DeltaFosB-a povečuje spodbudo za kokain. J Neurosci 23:2488–2493.

Povzetek / prosti tekst

Daunais JB, Roberts DC, McGinty JF (1993) Samo-dajanje kokaina poveča preprodinorfin, vendar ne c-fos, mRNA v striatumu podgan. NeuroReport 4:543–546.

Medline

Desterro JM, Rodriguez MS, Hay RT (2000) Regulacija transkripcijskih faktorjev z razgradnjo beljakovin. Cell Mol Life Sci 57:1207–1219.

CrossRefMedline

Diaz-Nido J, Armas-Portela R, Avila J (1992) Povečanje aktivnosti citoplazmičnega kazein kinaze II spremlja nevritno izraščanje po inhibiciji sinteze DNA v NIA-103 celicah nevroblastoma. J Neurochem 58:1820–1828.

Medline

Di Maira G, Salvi M, Arrigoni G, Marin O, Sarno S, Brustolon F, Pinna LA, Ruzzene M (2005) Proteinska kinaza CK2 fosforilira in regulira Akt / PKB. Ćelijska smrt se razlikuje 12:668–677.

CrossRefMedline

Dobrazanski P, Noguchi T, Kovary K, Rizzo CA, Lazo PS, Bravo R (1991) Oba produkta gena fosB, FosB in njena kratka oblika, FosB / SF, sta transkripcijska aktivatorja v fibroblastih. Mol Cell Biol 11:5470–5478.

Povzetek / prosti tekst

Ferrara P, Andermarcher E, Bossis G, Acquaviva C, Brockly F, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2003) Strukturne determinante, ki so odgovorne za proteazomsko razgradnjo c-Fos proteina, se razlikujejo glede na pogoje izražanja. onkogena 22:1461–1474.

CrossRefMedline

Fuchs SY, Dolan L, Davis RJ, Ronai Z (1996) Fosforilacijsko odvisno ciljanje cb Jun ubikvitinacije z Jun N-kinazo. onkogena 13:1531–1535.

Medline

Fuchs SY, Xie B, Adler V, Fried VA, Davis RJ, Ronai Z (1997) c-Jun NH2-terminalne kinaze ciljajo na ubikvitinacijo njihovih povezanih transkripcijskih faktorjev. J Biol Chem 272:32163–32168.

Povzetek / prosti tekst

Fuchs SY, Tappin I, Ronai Z (2000) Stabilnost transkripcijskega faktorja ATF2 reguliramo s fosforilacijo in defosforilacijo. J Biol Chem 275:12560–12564.

Povzetek / prosti tekst

Girault JA, Hemmings HC Jr, Williams KR, Nairn AC, Greengard P (1989) Fosforilacija DARPP-32, fosfoproteina, reguliranega z dopaminom in cAMP, s kazein kinazo II. J Biol Chem 264:21748–21759.

Povzetek / prosti tekst

Girault JA, Hemmings HC Jr, Zorn SH, Gustafson EL, Greengard P (1990) Karakterizacija v možganih sesalcev serinske kinaze DARPP-32, identična kazein kinazi II. J Neurochem 55:1772–1783.

Medline

Hanada M, Sugawara K, Kaneta K, Toda S, Nishiyama Y, Tomita K, Yamamoto H, Konishi M, Oki T (1992) Epoksomicin, novo protitumorsko sredstvo mikrobnega izvora. J Antibiot (Tokio) 45:1746–1752.

Medline

Hann SR, Eisenman RN (1984) Proteini, kodirani s humanim c-myc onkogenom: diferencialna ekspresija v neoplastičnih celicah. Mol Cell Biol 4:2486–2497.

Povzetek / prosti tekst

Hemmings HC Jr, Girault JA, Williams KR, LoPresti MB, Greengard P (1989) ARPP-21, ciklični AMP-reguliran fosfoprotein (Mr = 21,000), obogaten z regijami možganov, ki jih prenašajo dopamini. Aminokislinsko zaporedje mesta, ki ga fosforiliramo s cikličnim AMP v intaktnih celicah in kinetične študije njegove fosforilacije in vitro. J Biol Chem 264:7726–7733.

Hidaka H, ​​Kobayashi R (1992) Farmakologija inhibitorjev protein kinaze. Annu Rev Pharmacol Toxicol 32:377–397.

CrossRefMedline

Hirata H, Bessho Y, Kokubu H, Masamizu Y, Yamada S, Lewis J, Kageyama R (2004) Nestabilnost proteina Hes7 je ključna za uro somitne segmentacije. Nat Genet 36:750–754.

CrossRefMedline

Hiroi N, Graybiel AM (1996) Atipična in tipična nevroleptična zdravljenja povzročajo različne programe izražanja transkripcijskega faktorja v striatumu. J Comp Neurol 374:70–83.

CrossRefMedline

Hope B, Kosofsky B, Hyman SE, Nestler EJ (1992) Regulacija neposredne zgodnje genske ekspresije in vezave AP-1 v podganah jedra accumbens s kroničnim kokainom. Proc Natl Acad Sci ZDA 89:5764–5768.

Povzetek / prosti tekst

Hope BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ (1994a) Kronična elektrokonvulzivna epileptična napadaja (ECS) povzroči izražanje dolgotrajnega kompleksa AP-1 v možganih s spremenjeno sestavo in značilnostmi. J Neurosci 14:4318–4328.

Minimalizem

Hope BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ (1994b) Indukcija dolgotrajnega kompleksa AP-1, ki ga sestavljajo spremenjeni Fos-podobni proteini v možganih s kroničnim kokainom in drugimi kroničnimi zdravljenji. Nevron 13:1235–1244.

CrossRefMedline

Ishida A, Fujisawa H (1995) Stabilizacija protein-kinaze II, odvisne od kalmodulina, preko avtoinhibitorne domene. J Biol Chem 270:2163–2170.

Povzetek / prosti tekst

Jariel-Encontre I, Salvat C, Steff AM, Pariat M, Acquaviva C, Furstoss O, Piechaczyk M (1997) Kompleksni mehanizmi za degradacijo c-fos in c-jun. Mol Biol Rep 24:51–56.

CrossRefMedline

Jones S, Yakel JL (2003) Kazein kinaza ii (protein kinaza ck2) regulira funkcijo kanala serotoninskega 5-ht (3) v celicah ng108-15. Nevroznanost 119:629–634.

CrossRefMedline

Kato T Jr., Delhase M, Hoffmann A, Karin M (2003) CK2 je C-terminalna IkappaB kinaza, odgovorna za aktivacijo NF-kappaB med UV odzivom. Mol Cell 12:829–839.

CrossRefMedline

Kelz MB, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ (1999) Izražanje transkripcijskega faktorja deltaFosB v možganih nadzoruje občutljivost na kokain. Narava 401:272–276.

CrossRefMedline

Kim KB, Myung J, Sin N, posadke CM (1999) Proteazomska inhibicija z naravnimi produkti epoksomicina in dihidroeponemicina: vpogled v specifičnost in moč. Bioorg Med Chem Lett 9:3335–3340.

CrossRefMedline

Kobayashi E, Nakano H, Morimoto M, Tamaoki T (1989) Kalfostin C (UCN-1028C), nova mikrobna spojina, je zelo močan in specifičen inhibitor protein-kinaze C. Biochem Biophys Res Commun 159:548–553.

CrossRefMedline

Krek W, Maridor G, Nigg EA (1992) Kazein kinaza II je pretežno jedrski encim. J Cell Biol 116:43–55.

Povzetek / prosti tekst

Krohn NM, Stemmer C, Fojan P, Grimm R, Grasser KD (2003) Proteinska kinaza CK2 fosforilira protein SSRP1 domene z visoko mobilnostjo in inducira prepoznavanje UV-poškodovane DNA. J Biol Chem 278:12710–12715.

Povzetek / prosti tekst

Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DEH, Truong HT, Russo SJ, LaPlant Q, Whistler K, Neve RL, Self DW, Nestler EJ (2005) Preoblikovanje kromatina je ključni mehanizem, ki je podlaga za plastičnost kokaina v striatumu. Nevron 48:303–314.

CrossRefMedline

Lieberman DN, Mody I (1999) Kazein kinaza-II uravnava funkcijo kanala NMDA v hipokampalnih nevronih. Nat Neurosci 2:125–132.

CrossRefMedline

Litchfield DW (2003) Proteinska kinaza CK2: struktura, regulacija in vloga pri celičnih odločitvah življenja in smrti. Biochem J 369:1–15.

CrossRefMedline

Manabe T, Kuramoto N, Nakamichi N, Aramachi K, Baba K, Hirai T, Yoneyama M, Yoneda Y (2001) Razgradnja proteina c-Fos, izražena z N-metil-d-aspartinska kislina v jedrskih frakcijah mišjega hipokampusa. Brain Res 905:34–43.

Medline

Mandelzys A, Gruda MA, Bravo R, Morgan JI (1997) Odsotnost vztrajno zvišane antigena, povezane z DNK 37 kDa, in AP-1 vezave DNA v možganih fosB miši, ki so jih zdravili s fosB kainsko kislino. J Neurosci 17:5407–5415.

Povzetek / prosti tekst

Marin O, Meggio F, Marchiori F, Borin G, Pinna LA (1986) Specifičnost mesta kazeina kinaze-2 (TS) iz citosola jeter podgan. Študija z modelnimi peptidnimi substrati. Eur J Biochem 160:239–244.

McClung CA, Nestler EJ (2003) Regulacija izražanja genov in kokainske nagrade s strani CREB in DeltaFosB. Nat Neurosci 6:1208–1215.

CrossRefMedline

McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ (2004) DeltaFosB: molekularno stikalo za dolgoročno prilagoditev v možganih. Brain Res Mol Brain Res 132:146–154.

Medline

Meggio F, Pinna LA (2003) 1. tisoč in en substrat protein kinaze CK2? FASEB J 17:349–368.

Povzetek / prosti tekst

Meggio F, Donella-Deana A, Pinna LA, Moret V (1977) Fosforilacija kazeinskih frakcij s „fosvitin kinazo jeter podgan“. FEBS Lett 75:192–196.

Medline

Meggio F, Brunati AM, Pinna LA (1983) Avtofosforilacija kazein kinaze tipa 2 TS na obeh njenih alfa- in beta-podenotah. Vpliv različnih efektorjev. FEBS Lett 160:203–208.

CrossRefMedline

Meggio F, Shugar D, Pinna LA (1990) Derivati ​​ribofuranozil-benzimidazola kot inhibitorji kazein-kinaze-2 in kazein-kinaze-1. Eur J Biochem 187:89–94.

Medline

Meggio F, Marin O, Pinna LA (1994) Specifičnost substratne proteinske kinaze CK2. Cell Mol Bio Res 40:401–409.

Medline

Miller C, Zhang M, He Y, Zhao J, Pelletier JP, Martel-Pelletier J, Di Battista JA (1998) Transkripcijska indukcija ciklooksigenazno-2 gena z okadaično kislinsko inhibicijo fosfatazne aktivnosti v človeških kondrocitih: ko-stimulacija AP-1 in CRE vezavnih proteinov. J Cell Biochem 69:392–413.

CrossRefMedline

Moratalla R, Elibol B, Vallejo M, Graybiel AM (1996) Spremembe na ravni mreže pri izražanju inducibilnih proteinov Fos-Jun v striatumu med kroničnim zdravljenjem in odvzemom kokaina. Nevron 17:147–156.

CrossRefMedline

Morgan JI, Curran T (1995) Takojšnji zgodnji geni: deset let pozneje. Trendi Neurosci 18:66–67.

CrossRefMedline

Nakabeppu Y, Nathans D (1991) Naravna prisotna oblika FosB, ki zavira transkripcijsko aktivnost Fos / Jun. Celica 64:751–759.

CrossRefMedline

Nestler EJ, Barrot M, Self DW (2001) Delta FosB: trajno molekularno stikalo za odvisnost. Proc Natl Acad Sci ZDA 98:11042–11046.

Povzetek / prosti tekst

Neve RL, Howe JR, Hong S, Kalb RG (1997) Uvedba podenote 1 glutamatnega receptorja v motorne nevrone in vitro in in vivo z uporabo rekombinantnega virusa herpes simplex. Nevroznanost 79:435–447.

CrossRefMedline

Nuthall HN, Joachim K, Stifani S (2004) Fosforilacija serina 239 iz skupine Groucho / TLE1 s proteinsko kinazo CK2 je pomembna za inhibicijo nevronske diferenciacije. Mol Cell Biol 24:8395–8407.

Povzetek / prosti tekst

Okazaki K, Sagata N (1995) Pot kinaze MM / MAP stabilizira c-Fos s fosforilacijo in poveča njeno transformacijsko aktivnost v celicah NIH 3T3. EMBO J 14:5048–5059.

Medline

Palombella VJ, Rando OJ, Goldberg AL, Maniatis T (1994) Ubiquitin-proteasomska pot je potrebna za obdelavo NF-kapa B1 prekurzorskega proteina in aktivacijo NF-kapa B. Celica 78:773–785.

CrossRefMedline

Papavassiliou AG, Treier M, Chavrier C, Bohmann D (1992) Ciljna razgradnja c-Fos, vendar ne v-Fos, s fosforilacijsko odvisnim signalom na c-Jun. Znanost 258:1941–1944.

Povzetek / prosti tekst

Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E (2003) Inducibilna ekspresija dominantnega negativnega mutanta c-Jun v transgenih miših na možgansko regijo zmanjša občutljivost na kokain. Brain Res 970:73–86.

CrossRefMedline

Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ (2004) Indukcija DeltaFosB v možganskih strukturah, povezanih z nagrajevanjem, po kroničnem stresu. J Neurosci 24:10594–10602.

Povzetek / prosti tekst

Persico AM, Schindler CW, O'Hara BF, Brannock MT, Uhl GR (1993) Izražanje transkripcijskega faktorja možganov: učinki akutnega in kroničnega amfetamina in stres injiciranja. Brain Res Mol Brain Res 20:91–100.

Medline

Ploegh HL, Dunn BM (2000) Post-translacijska modifikacija: fosforilacija in fosfataze. V: Aktualni protokoli v znanosti o proteinih (Dunn BM, ur.) Str. 13.01–13.02. New York: Wiley in Sons.

Pyerin W, Burow E, Michaely K, Kubler D, Kinzel V (1987) Katalitične in molekularne lastnosti visoko očiščene fosvitin / kazein kinaze tipa II iz človeških epitelnih celic v kulturi (HeLa) in povezave do ecto protein kinaze. Biol Chem Hoppe Seyler 368:215–227.

Medline

Reikhardt BA, Kulikova OG, Borisova GY, Aleksandrova IY, Sapronov NS (2003) Stanje sistema "protein kinaze CK2-HMG14" pri amneziji, povezani s starostjo pri podganah. Neurosci Behav Physiol 33:799–804.

Medline

Roberts BJ, Whitelaw ML (1999) Razgradnja bazičnega receptorja dioksinskega receptorja dioksina na domeni helix-loop-helix / Per-ARNT-Sim preko ubikvitin / proteasomske poti. J Biol Chem 274:36351–36356.

Povzetek / prosti tekst

Rost B, Yachdav G, Liu J (2004) Strežnik PredictProtein. Nucleic Acids Res 32:W321–W326.

Povzetek / prosti tekst

Rylski M, Kaczmarek L (2004) Cilji Ap-1 v možganih. Sprednji Biosci 9:8–23.

CrossRefMedline

Sahin B, Kansy JW, Nairn AC, Spychala J, Ealick SE, Fienberg AA, Greene RW, Bibb JA (2004) Molekularna karakterizacija rekombinantne mišje adenozin kinaze in vrednotenje kot tarče za fosforilacijo proteinov. Eur J Biochem 271:3547–3555.

Medline

Salvat C, Aquaviva C, Jariel-Encontre I, Ferrara P, Pariat M, Steff AM, Carillo S, Piechaczyk M (1999) Ali obstaja več proteolitičnih poti, ki prispevajo k razgradnji beljakovin c-Fos, c-Jun in p53 in vivo? Mol Biol Rep 26:45–51.

CrossRefMedline

Schmidt R, Hecker E (1975) Avtoksidacija forbolnih estrov v normalnih pogojih shranjevanja. Rak Res 35:1375–1377.

Brezplačno polno besedilo

Schwarz EM, Van Antwerp D, Verma IM (1996) Konstitutivna fosforilacija IkappaBalfe s kazein kinazo II se pojavi prednostno pri serin 293: zahteva za razgradnjo prostih IkappaBalfa. Mol Cell Biol 16:3554–3559.

Povzetek / prosti tekst

Sears R, Leone G, DeGregori J, Nevins JR (1999) Ras izboljša stabilnost proteina Myc. Mol Cell 3:169–179.

CrossRefMedline

Silva-Neto MA, Fialho E, Paes MC, Oliveira PL, Masuda H (2002) Ciklična nukleotidno neodvisna fosforilacija vitellina s kazein-kinazo II očiščena iz oocitov Rhodnius prolixus. Insect Biochem Mol Biol 32:847–857.

CrossRefMedline

Skinner M, Qu S, Moore C, Modrost R (1997) Transkripcijska aktivacija in transformacija s FosB proteinom zahtevata fosforilacijo karbonil-terminalne aktivacijske domene. Mol Cell Biol 17:2372–2380.

Povzetek / prosti tekst

Stemmer C, Schwander A, Bauw G, Fojan P, Grasser KD (2002) Proteinska kinaza CK2 različno fosforilira proteine ​​kromosomske skupine z visoko mobilnostjo B (HMGB), ki modulirajo njihovo stabilnost in interakcije DNA. J Biol Chem 277:1092–1098.

Povzetek / prosti tekst

Stevens I, Derua R, Rondelez E, Waelkens E, Merlevede W, Goris J (1999) Identifikacija cyk, ciklin B2 kinaze, kot novega proteina kinaze II, odvisne od kalcija / kalmodulina, in njegove vloge med zorenjem oocitov Xenopus laevis. Exp Cell Res 252:303–318.

CrossRefMedline

Suh HW, Choi SS, Lee JK, Lee HK, Han EJ, Lee J (2004) Regulacija izražanja c-fos in c-jun gena z lipopolisaharidi in citokini v primarno kultiviranih astrocitih: učinek PKA in PKC poti. Arch Pharm Res 27:396–401.

Medline

Szyszka R, Boguszewska A, Grankowski N, Ballesta JP (1995) Diferencialna fosforilacija ribosomskih kislih proteinov iz celic kvasovk z dvema endogenim proteinskim kinazama: kazein-kinaza-2 in kinazo 60S. Acta Biochim Pol 42:357–362.

Medline

Tamaoki T, Takahashi I, Kobayashi E, Nakano H, Akinaga S, Suzuki K (1990) Calphostin (UCN1028) in spojine, povezane z kalfostinom, nov razred specifičnih in močnih inhibitorjev protein-kinaze C. \ t Adv Second Messenger Fosfoprotein Res 24:497–501.

Medline

Torres J, Pulido R (2001) Tumor supresor PTEN je fosforiliran s proteinsko kinazo CK2 na svojem C terminalu. Posledice za stabilnost PTEN na proteasomsko posredovano razgradnjo. J Biol Chem 276:993–998.

Povzetek / prosti tekst

Tsubuki S, Saito Y, Tomioka M, Ito H, Kawashima S (1996) Diferencialna inhibicija aktivnosti kalpaina in proteasoma s peptidil aldehidi di-levcina in tri-levcina. J Biochem (Tokio) 119:572–576.

Povzetek / prosti tekst

Tsurumi C, Ishida N, Tamura T, Kakizuka A, Nishida E, Okumura E, Kishimoto T, Inagaki M, Okazaki K, Sagata N (1995) Razgradnja c-Fos z proteazom 26S se pospeši s c-Jun in več proteinskimi kinazami. Mol Cell Biol 15:5682–5687.

Povzetek / prosti tekst

Unger GM, Davis AT, Slaton JW, Ahmed K (2004) Proteinska kinaza CK2 kot regulator celičnega preživetja: posledice za zdravljenje raka. Curr Cilji za zdravljenje raka 4:77–84.

CrossRefMedline

Viala E, Marshall CJ (2003) Zvišana aktivnost ERK-MAP kinaze ščiti FOS-družinskega člana FRA-1 pred proteasomsko razgradnjo v celicah karcinoma kolona. J Cell Sci 116:4957–4963.

Povzetek / prosti tekst

Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S (2002) ΔFosB uravnava tek kolesa. J Neurosci 22:8133–8138.

Povzetek / prosti tekst

Whitmarsh AJ, Davis RJ (2000) Regulacija funkcije transkripcijskega faktorja s fosforilacijo. Cell Mol Life Sci 57:1172–1183.

CrossRefMedline

Winter B, Kautzner I, Issinger OG, Arnold HH (1997) Dve domnevni mesti fosforilacije proteinov kinaze CK2 sta pomembni za aktivnost Myf-5. Biol Chem 378:1445–1456.

Medline

Wisniewski JR, Szewczuk Z, Petry I, Schwanbeck R, Renner U (1999) Konstitutivna fosforilacija kislih repov beljakovin skupine 1 z visoko mobilnostjo s kazein kinazo II spremeni njihovo konformacijo, stabilnost in specifičnost vezave DNA. J Biol Chem 274:20116–20122.

Povzetek / prosti tekst

Yamaguchi Y, Wada T, Suzuki F, Takagi T, Hasegawa J, Handa H (1998) Kazein kinaza II medsebojno deluje z bZIP domenami več transkripcijskih faktorjev. Nucleic Acids Res 26:3854–3861.

Povzetek / prosti tekst

Yanagawa T, Yuki K, Yoshida H, Bannai S, Ishii T (1997) Fosforilacija stresnih beljakovin A170 z aktivnostjo, podobnim kazein kinazi II v makrofagih. Biochem Biophys Res Commun 241:157–163.

CrossRefMedline

Yankulov K, Yamashita K, Roy R, Egly JM, Bentley DL (1995) Inhibitor transkripcijskega raztezka 5,6-dikloro-1-beta-d-ribofuranozilbenzimidazol zavira protein-kinazo, povezano s transkripcijskim faktorjem IIH. J Biol Chem 270:23922–23925.

Povzetek / prosti tekst

Yen J, Modrost RM, Tratner I, Verma IM (1991) Druga alternativna oblika FosB je negativni regulator transkripcijske aktivacije in transformacije s Fos proteini. Proc Natl Acad Sci ZDA 88:5077–5081.

Povzetek / prosti tekst

Yin X, Jedrzejewski PT, Jiang JX (2000) Kazein kinaza II fosforilira vezni leč 45.6 in sodeluje pri njegovi razgradnji. J Biol Chem 275:6850–6856.

Povzetek / prosti tekst

Yoza BK, Brooks JW, Mizel SB (1992) Indukcija komponent transkripcijskega faktorja AP-1 med aktivacijo T-celic z interlevkinom 1 in estri forbola. Razlika v rasti celic 3:677–684.

Minimalizem

Yu S, Wang H, Davis A, Ahmed K (2001) Posledice signalizacije CK2 na jedrsko matrico. Mol Cell Biochem 227:67–71.

CrossRefMedline

Yu S, Davis AT, Guo C, Green JE, Ahmed K (1999) Diferencialno usmerjanje protein-kinaze CK2 na jedrski matriko ob prehodni prekomerni ekspresiji njenih podenot. J Cell Biochem 74:127–134.

CrossRefMedline

Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ (2006) ΔFosB: bistvena vloga ΔFosB v nucleus accumbens v delovanju morfina. Nat Neurosci 9:205–211.

CrossRefMedline

Členi, ki navajajo ta člen