Averzivno vedenje, inducirano z optogenetsko inaktivacijo ventralnega tegmentalnega območja, dopaminskih nevronov posredujejo receptorji dopamin D2 v nucleus accumbens (2014).

Proc Natl Acad Sci US A. apr 29, 2014; 111 (17): 6455 – 6460.

Objavljeno v spletu april 15, 2014. doi:  10.1073 / pnas.1404323111

PMCID: PMC4036004

Nevroznanost

Ta članek je bil citira drugi členi v PMC.

Pojdi na:

Pomen

Dopaminski (DA) nevroni v ventralnem tegmentalnem območju (VTA) reagirajo na averzivne dražljaje večinoma s prehodnim utišanjem. Nejasno je, ali ta reakcija neposredno sproži averzivne odzive pri obnašanju miši. To vprašanje smo preučili z optogenetskim nadzorom DA nevronov v VTA in ugotovili, da je inaktivacija DA nevronov povzročila averziven odziv in učenje. Za takšen odziv je veljalo, da je odgovorno za ta odgovor odgovorna jedrna jedra (NAc), glavna izhodna jedra nevronov VTA DA, zato smo preučili, kateri od temeljnih poti v NAc je bil kritičen do tega vedenja z uporabo knockdown D1 ali D2 receptorja, in ugotovili, da je pot, ki je specifična za receptorje D2, ključna za to vedenje.

Minimalizem

Prenos dopamina (DA) iz ventralnega tegmentalnega območja (VTA) je ključnega pomena za nadzor tako nagrajevalnega kot averzivnega vedenja. Prehodno utišanje nevronov DA je eden od odzivov na averzivne dražljaje, vendar so njegove posledice in nevronski mehanizmi v zvezi z averzivnimi odzivi in ​​učenjem večinoma ostali neizpolnjeni.. Tukaj, poročamo, da je optogenetska inaktivacija nevronov VTA DA hitro znižala nivo DA in povzročila up-regulacijo nevronske aktivnosti v jedru jedra (NAc), kot je ocenjeno z izražanjem Fos. Tnjegovo optogenetsko zatiranje streljanja nevronov DA je takoj vzbudilo averzivne odzive na prej želeno temno sobo in vodilo do averzivnega učenja proti optogenetsko pogojenemu kraju. Pomembno je, da je bila ta odbojnost na mestu odpravljena z rušenjem dopaminskih D2 receptorjev, ne pa z D1 receptorji v NAc. Utišanje DA nevronov v VTA je bilo zato nujno za sprožanje averzivnih odzivov in učenje prek dopaminskih D2 receptorjev v NAc.

Mezolimbični dopaminergični sistem ne igra samo ključne v širokem razponu motivacije in učenja (1-3), vendar je njegova disfunkcija vključena tudi v hude nevropsihiatrične motnje, kot so na primer pri Parkinsonovi bolezni, shizofreniji in odvisnosti od drog. Dopaminski (DA) nevroni v ventralnem tegmentalnem območju (VTA) reagirajo na nagrajevanje dražljajev s faznim odstranjevanjem, glavna funkcija tega streljanja pa je teoretizirana, da kodira "napako napovedi napovedi", razliko v vrednosti med predvideno nagrado in dejanska nagrada (4). V nasprotju z odzivom na nagrajevanje dražljajev njihove reakcije na averzivne dražljaje še zdaleč niso homologne; nekateri nevroni DA se aktivirajo kot odziv na averzivne dražljaje, medtem ko večina drugih reagira s prehodnim dušenjem streljanja (5-9). Pravzaprav so nedavne študije razkrile, da optogenetska aktivacija GABAergičnih nevronov in posledična inaktivacija DA nevronov zavirata porabo nagrade in sprožata averziven odziv (10, 11). Vendar pa je v veliki meri ostalo neizključno, kateri mehanizmi v nevronskih vezjih so bistveni za pridobitev averzivnega učenja po inaktivaciji DA nevronov v VTA in o tem, kako se vedenjski odzivi nadzorujejo pri zatiranju porabe nagrade in vzbujanju averzivnega vedenja.

Akumulirani dokazi so razkrili, da motivacijsko in kognitivno učenje kot odgovor na pozitivne in negativne dražljaje v veliki meri urejajo nevronski krogi, vključno z bazalnimi gangliji (12), ki prejemajo veliko količino dopaminergične projekcije iz srednjega mozga. V striatumu sta dva temeljna nevronska vezja sestavljena iz točno določenih srednje velikih bodičavih nevronov (MSN), pri čemer vsak izraža poseben tip DA-receptorja (13).

  • Eno vezje je direktna pot, ki jo sestavljajo MSN, ki neposredno štrlijo na izhodna jedra bazalnih ganglij, substantia nigra pars reticulata (SNr) in pretežno izražajo dopaminske D1 receptorje (D1R).
  • Druga je posredna pot, sestavljena iz MSN-jev, ki posredno štrlijo skozi globus pallidus do SNr in izražajo predvsem DpamNXX receptorje za dopamin (D2R).

DA signali iz srednjega mozga dinamično modulirajo ti dve vzporedni poti na nasprotni način preko D1R in D2R, ta modulacija pa naj bi olajšala motivacijsko učenje (3, 14).

  • Kar se tiče dražilnih dražljajev, se šteje, da nadzorovane ravni DA, ki jih povzročajo nagrajevalni signali, aktivirajo D1R in tako v glavnem olajšajo neposredno pot v jedru jedra (NAc).
  • Po drugi strani pa supresija izgorevanja nevronskih DA kot odgovor na averzivne dražljaje zniža raven DA v NAc; in ta reakcija naj bi posebej spodbujala prenos signala v posredni poti skozi aktivirane D2R.

Čeprav študije s farmakološkimi strategijami in reverzibilno zaporo nevrotransmisije (RNB) podpirajo ta mehanizem uravnavanja v NAc (15, 16), še vedno ni znano, ali je zatiranje streljanja nevronov DA zadostno za pospeševanje aktivnosti posredne poti in posledično induciranje izogibanja. V tej pričujoči študiji smo to vprašanje rešili tako, da selektivno inaktivirajo DA nevrone v VTA z optogenetsko manipulacijo membransko hiperpolarizirajočega Arch proteina (17) in izrecno dokazala, da je supresija DA nevronov v VTA pozneje znižala raven DA v NAc in sprožila averzivno reakcijo in učenje. Poleg tega smo raziskali mehanizme regulacije te reakcije in razkrili, da so to averzivno reakcijo posebej nadzirali D2R v NAc.

Rezultati

Optogenetska inaktivacija nevronov DA blokira nastavitev temne sobe.

Za selektivno inaktivacijo izgorevanja nevronov DA smo vbrizgali Cre-inducibilni adeno-povezani virusni konstrukt, ki kodira Arch-eGFP [AAV-in-obrnjen odprti bralni okvir (DIO) -Arch]17) enostransko v VTA miši odraslih tirozin hidroksilaza (TH) -Cre (18) in divjih (WT) steljarskih koleščkov in je nad VTA postavil optično vlakno (Slika S1 A in C). Dva tedna po operaciji je bil Arch-eGFP neomejeno odkrit v VTA (Slika S1B). Hiperpolarizirajoč učinek proteina Arch smo preizkusili z elektrofiziološkim snemanjem in izmerili učinek optične stimulacije mišic VTA TH-Cre, injicirane z AAV-DIO-Arch. Elektrofiziološki posnetki in vivo z anesteziranih TH-Cre miši iz anestezije so pokazali, da optična stimulacija domnevnih nevronov DA zavira njihovo streljanje (Slika S2), kar kaže, da je optična stimulacija dovolj hiperpolarizirala membranski potencial celic, ki ekspresirajo Arch, in tako zavirala njihovo spontano streljanje.

Z uporabo teh miši smo nato preučili, ali lahko optična inaktivacija DA nevronov v VTA služi kot averzivni signal za vedenjsko učenje. Miše imajo prirojeno nagnjenost k temu, da raje temno okolje (19). Zasnovali smo vedenjski aparat, v katerem so miši lahko prosto raziskovale temno sobo in odprli svetel prostor (Slika 1A). Po navadi so WT miši prednostno bivale v temni sobi z ali brez optične stimulacije v temni sobi (Slika S1D), kar zagotavlja, da optična stimulacija sama po sebi ni vplivala na njihovo vedenje v temni sobi. Načrtovali smo vedenjski eksperiment živali, da bi preizkusili učinek optične inaktivacije DA nevronov na njihovo vedenje (Slika S1E). Po navadi in predhodnem testiranju smo miši pogojili z optičnim stimuliranjem DA nevronov v VTA, ko so se zadrževali v temni sobi. TH-Cre miške so tudi med prvimi minami kondicioniranja 5 ostale zunaj prej želene temne sobe in so se med tem kondicioniranje izogibale temnemu prostoru (Slika 1B). Miševi TH-Cre niso preprečili izogibanja temni sobi, čeprav niso prejeli optične stimulacije ob naslednjem testiranju (Slika 1C). Ti podatki kažejo, da hiperpolarizacija nevronov DA ni le povzročila prehodnega averzivnega vedenja, ampak je bila tudi signal za averzivno učenje proti temni sobi in tudi kažejo, da je inaktivacija DA nevronov igrala vzročno vlogo tako pri prehodnem averzivnem vedenju kot pri dolgotrajnem averzivnem učenju.

Fig. 1.  

Optogenetska inaktivacija nevronov DA blokira prednost temnopoltih prosto delujočih miši. (A) Ponazoritev aparata, uporabljenega v testu preferenc v temni sobi. Miške so se lahko prosto gibale po temni sobi in svetlem prostoru. (B) Časovni potek ...

Optogenetska regulacija navzdol DA-ravni v NAc.

Nato smo raziskali, ali inaktivacija DA nevronov v VTA dejansko spreminja koncentracijo DA v njegovem glavnem ciljnem območju, NAc. Stopnje DA v NAc smo merili s hitro skeniranjem ciklične voltammetrije (FSCV) pri anesteziranih mišicah TH-Cre, ki so jim vbrizgali AAV-DIO-Arch v njihovo VTA. Ravni DA v NAc so bile takoj povišane z električno stimulacijo VTA, povzročeno sproščanje DA pa se je znatno zmanjšalo s sočasno optično stimulacijo VTA (Slika S3). Nato smo preizkusili, ali lahko optična stimulacija VTA zmanjša nivo tonika DA v NAc. V istih eksperimentalnih nastavitvah smo opazili, da se je raven DA v NAc prehodno znižala za 20 s optične stimulacije VTA (Slika 2), kar je skladno s poročano reakcijo FSCV proti averzivnim dražljajem (20). Ti podatki kažejo, da je bila optična stimulacija VTA dovolj učinkovita za inaktivacijo nevronov VTA DA in za zmanjšanje ravni DA v NAc med vedenjskim poskusom.

Fig. 2.  

Optična inaktivacija DA nevronov v VTA zmanjša raven DA v NAc. (A) Povprečni odzivi DA na optično stimulacijo v NAc, izmerjeni s FSCV. Zelena črta označuje trajanje optične stimulacije (n = Sled 7 – 11). (B) Povprečno ...

Izboljšanje ekspresije gena Fos z optično inaktivacijo DA nevronov v VTA.

Sprememba vedenja, ki jo je povzročila pogojna inaktivacija DA nevronov v VTA, je kazala, da je optična stimulacija neposredno spremenila nevronsko aktivnost in povzročila premik vedenjske uspešnosti. Nato smo nato raziskali področja, v katerih je bila nevronska aktivnost pogojena s kondicionirano inaktivacijo DA nevronov s preučevanjem ekspresije Fosa, neposrednega zgodnjega gena. Kmalu po izvedbi kondicioniranja v testu v temni sobi smo miši hitro obdelali, da smo določili količino Fos ekspresije s kvantitativno analizo in situ hibridizacije (Slika 3 in Slika S4). NAc, regija, ki od VTA prejme veliko količino dopaminergičnih projekcij, je v mišicah TH-Cre pokazala znatno povečano količino izražanja Fos (Slika 3). Ta upravna ureditev je bila zaznana tudi na kontralateralni strani optične stimulacije, ki naj bi jo povzročila majhna količina okužbe z virusom na to stran. Vendar je bila up-regulacija veliko višja na ipsilateralni strani kot na kontralateralni strani optične stimulacije, kar kaže, da optična inaktivacija DA nevronov neposredno uravnava nevronsko aktivnost NAc. Povečana ekspresija Fos je bila opažena tudi v drugih možganskih regijah, vključno s septumom, periventrikularnimi regijami striatuma, bazolateralno amigdalo (BLA) in lateralnim hipotalamusom, vendar ne v lateralni habenuli ali medialni prefrontalni skorji (mPFC; Slika S4). Ti rezultati kažejo, da regije, aktivirane z optično inaktivacijo DA nevronov, niso bile omejene na neposredno ciljna področja nevronov VTA DA, temveč so vključevale področja, ki bi jih bilo mogoče posredno aktivirati na način, ki je odvisen od nevronskega vezja. To opazovanje kaže, da je optična inaktivacija nevronov DA spremenila nevronske aktivnosti v celotnem krogu in ne bi smela samo sprožiti averzivne reakcije, ampak tudi sprožiti številne druge možganske funkcije, kot so anksioznost, strah in stresni odzivi (21).

Fig. 3.  

Aktivnostna ekspresija gena Fos, ki jo povzroči optogenetska inaktivacija nevrona DA. (A-C) Reprezentativne fotografije za Fosov izraz (rumena) v NAc. Narejene so bile slike stimulirane strani miške TH-Cre (A), nestimuliranih ...

DA signalizacija prek D2R je kritična za optogenetsko inducirano kondicijsko odpornost.

Večina dopaminergičnih signalov iz VTA se prenaša v MSN v NAc prek DA receptorjev, D1R in D2R. D1R se skoraj izključno izraža v snovi P (ki jo kodira Tac1 gen), ki izraža MSN, D2R pa je večinoma izražen v enkefalinu (kodiran s Penkovim genom), ki izraža MSN; vsaka vrsta MSN predstavlja neposredne in posredne poti v NAc (3). Ker je afiniteta za DA veliko višja za D2R (nM vrstni red) kot za D1R (µM vrstni red) (22, 23) naj bi zmanjšanje ravni DA povzročilo inaktivacijo Gi-seči D2R, vendar nima pomembnega učinka na D1R (3, 24), s čimer nadgradi nevronsko aktivnost posebej v posredni poti. Poleg tega je bila aktivacija Fos vidnejša v celicah, ki izražajo Penk ali Drd2 (D2R), kot v celicah, ki eksprimirajo Tac1 ali Drd1a (D1R) (Slika S5). Na podlagi teh opažanj smo domnevali, da bi DA-jeva signalizacija prek D2R lahko igrala pomembno vlogo pri opazovanem averzivnem kondicioniranju.

Da bi preizkusili to hipotezo, smo izvedli trkomorni test pogojene averzije mesta (CPA) (Slika S6). Pripravili smo vedenjski aparat, ki vsebuje dve komori s skoraj enakimi okoliščinami in en majhen hodnik. To nepristransko okoljsko stanje v testu CPA nam je omogočilo nadaljnjo preučitev, ali inaktivacija nevronov VTA DA lahko sproži averzivno reakcijo in učenje, poleg tega pa prepreči prednost temne sobe. Ko se je živalim dovolilo prosto gibanje po celotnem aparatu, je večina ostala v dveh komorah brez značilnih vedenjskih razlik ob predhodnem preizkusu. Optično kondicioniranje je bilo nato izvedeno s povezovanjem optične stimulacije z eno fiksno komoro. Tudi ko se je katera koli od sob uporabila za kondicioniranje, so TH-Cre miške vztrajno in znatno izogibale bivanju v optično kondicionirani komori med kondicioniranjem in po poizkusu (Slika S6 B-E). Statistična analiza je potrdila znatno zmanjšanje časa bivanja TH-Cre miši v optično kondicionirani komori v posttestu v primerjavi s časom bivanja WT miši (Slika S6F).

Nato smo poskušali določiti podtipe receptorjev DA, ki so vključeni v to averzivno vedenje, s specifičnim zatiranjem vsakega od DA receptorjev v NAc (Slika 4 in Slika S7). Zasnovali smo in potrdili lentivirusne vektorje, ki vsebujejo RNA s kratkimi lasmi (SHRNA), specifično za vsak receptor DA, s konstitutivnim izražanjem mCherry. Tri tedne po injiciranju lentivirusa v NAc je bil močan izraz mCherry lokaliziran v NAc (Slika 4B). Učinkovito znižanje mRNA izražanja vsakega receptorja je bilo potrjeno s kvantitativno PCR analizo v realnem času (sl. S7A). Merjenje ravni beljakovin z blottingom blota je tudi pokazalo, da injiciranje vsakega od lentivirusov selektivno zmanjša njegov ciljni protein in ne vpliva na izražanje drugega podtipa receptorja DA (Slika 4C in Slika S7 B-G). Lentivirusi, ki izražajo shD1R- in shD2R, so znižali ciljno raven beljakovin na 46.2 ± 1.1% in 38.4 ± 4.9% v primerjavi s stopnjo za kontrolni virus (Slika 4C). Ti rezultati so potrdili, da lentivirusni vektorji, ki izražajo šRNA, specifično za D1R in D2R, selektivno in dovolj zatirajo svoje ciljne RNA in znižujejo količino ustreznih beljakovinskih produktov. Potrdili smo tudi, da virusna posredovana ekspresija mCherry ni bila zaznana v VTA, izključujoč možnost, da je šRNA posredovana z lentivirusom neposredno vplivala na VTA.

Fig. 4.  

DA signalizacija prek D2R je kritična za optogenetsko inducirano CPA. (A) Slika, ki prikazuje kirurški poseg. Lentivirus, ki kodira shRNA, za D1R ali D2R je bil injiciran dvostransko v NAc. AAV-DIO-Arch so v enostransko injicirali enostransko ...

S temi lentivirusi, ki vsebujejo shRNA, smo preizkusili, kateri tip DA receptorja je odgovoren za averzivno vedenje, ki ga povzroča optogenetska inaktivacija DA nevronov. V dvostranski NAc smo vbrizgali lentivirus, ki vsebuje shRNA, ali kontrolni lentivirus skupaj z AAV-DIO-Archom v levo VTA miši TH-Cre. Optično vlakno je bilo vstavljeno tudi nad VTA (Slika 4A). Ko je bil v treh tednih po operaciji opravljen trikomorni CPA test, so TH-Cre miši, injicirane z lenti: shD1R-mCherry še vedno pokazale eksplicitni CPA proti komori z optično stimulacijsko kombinacijo, primerljivo s tistimi miši TH-Cre, injicirane z mišjo nadzor lentivirusa (lenti: mCherry). V nasprotju s tem, TH-Cre mišam, injiciranim z lenti: shD2R-mCherry med kondicioniranjem ni pokazal očitnega CPA (Slika 4D). Ekskluzivni primanjkljaj učenja TH-Cre miši, ki so mu injicirali lenti: shD2R-mCherry, smo nadalje utemeljili z analizo averzivnega učenja v posttestu (Slika 4E). Ti rezultati kažejo, da je bilo odporno vedenje do kraja, ki ga pogojuje inaktivacija nevrona DA, posebej izzvano s pomočjo D2R in ne preko D1R v NAc.

Razprava

V striatumu so študije razkrile, da je aktivacija Gs-povezani D1R olajša njegovo streljanje, medtem ko aktiviranje G-jai-povezani D2R povzroči zmanjšano učinkovitost streljanja (25). AcGlede na specifičnost izražanja receptorjev DA fazni izgorevanje DA nevronov v glavnem aktivira direktno pot skozi D1R, medtem ko prehodno zmanjšanje izgorevanja nevronov DA večinoma spodbuja kompetentnost indirektne poti skozi D2R (3, 26). Na podlagi tega mehanizma regulacije je bilo predlagano, da utišanje nevronov DA kot odziv na averzivne dražljaje pretežno poteka po posredni poti in povzroči averzivno vedenje (3). Nedavne študije so pokazale, da blokada sinaptičnega prenosa posredne poti poslabša pridobitev averzivnega vedenja, ki ga povzroči električni udar (15) in da to okvaro povzroči zaviranje prenosa signala, posredovanega z D2R (16). n poleg tega optogenetska up regulacija D2R-ekspresionirajočih MSN-jev v posredni poti izzove izogibanje vedenju (27). Ker pa nevroni DA kažejo tako okrepljeno kot potlačeno streljanje kot odziv na averzivne dražljaje in ker se druge možganske senzorične informacije hkrati obdelujejo v možganih, je še vedno treba razjasniti, ali bi utišanje nevronov DA lahko neposredno sprožilo averzivno reakcijo in učenje, in ali je ta reakcija regulirana z MSN-ji, ki izražajo D2R v posredni poti.

V tej raziskavi smo v dveh vedenjskih testih uporabili optogenetsko kontrolo streljanja nevronskih DA: dva testa preferenčnih preferenc in triskomorski CPA test. Naša optogenetska manipulacija je pokazala učinkovito zatiranje izgorevanja nevronskih DA v VTA in znižanje ravni DA v NAc. Naše natančno optogenetsko inaktiviranje nevronskih odstranjevanj DA samo v obdobju, ko so živali bivale v kondicionirani komori, je izrecno vzbudilo odporno reakcijo in učenje, s čimer je pokazalo, da je prehodno utišanje DA neposredno povzročilo pasivno izogibanje. Poleg tega je s to preiskavo razjasnjeno, da je obdelava signalov, ki jih posreduje D2R, ključna odločitev za indukcijo te averzivne reakcije in učenja.

Čeprav so naši podatki pokazali, da D1R ni vplival na vedenjske poskuse, da bi povzročil CPA, je več raziskav dokumentiralo, da je za odzivanje na strah in averzivno učenje potrebno fazno izstreljevanje DA nevronov (28, 29). Ta razlika je posledica eksperimentalne nastavitve; Naš optogeni pristop je izključil možnost signalizacije prek aktiviranih nevronov DA, da bi sprožil averzivno vedenje, kar kaže, da je inaktiviranje DA nevronov zadostno za sprožanje averzivnega vedenja in učenja. Funkcija in obdelava signalov aktiviranega streljanja DA, ki ga sprožijo averzivni dražljaji, bi prispevali k averzivnemu vedenju od tistih, ki smo jih preučili tukaj, in jih je treba v prihodnosti razjasniti.

DA nevroni štrlijo tudi v različne druge regije, vključno z mPFC, amigdalo in hipokampusom. Nedavna raziskava je to pokazala optogenetska aktivacija stranskih habenulskih nevronov, ki štrlijo na DA nevrone v VTA, lahko sproži averzivno vedenje in ti DA nevroni večinoma in posebej ciljajo na mPFC (30), čeprav se je njihovo optogenetsko kondicioniranje razlikovalo od tistega v naši trenutni študiji, saj se je njihova optogenetska stimulacija podaljšala za celotno kondicijsko sejo. Ker poročajo, da dopaminergični vnos v mPFC aktivira ne le averzivne dražljaje, temveč tudi kronični stres (31, 32) možno je, da bi njihova nenehna aktivacija nevronov DA, ki projicirajo mPFC, zaznana kot signali iz zelo stresnega okolja; in kot posledica kopičenja stresnega kondicioniranja bi živali pokazale averzivno vedenje do pogojene komore. Nasprotno pa smo zavirali streljanje nevronov DA samo, ko so živali bivale v kondicionirani komori. Rezultati naših vedenjskih poskusov, ki uporabljajo kondicioniranje, je pokazalo, da bo nenadno zatiranje DA-ja zaznalo kot nenadni averzivni vhod, kar je povzročilo njihov hiter averzivni odziv.

DA nevroni štrlijo tudi na amigdalo, regijo, ki v veliki meri prispeva k odzivu na strah. Dejansko je DA-jevo signaliziranje amigdali bilo vpleteno v odziv na strah in pridobivanje spomina na strah (33, 34). V naši raziskavi smo z označevanjem DA nevronov v VTA identificirali niz DA nevronov, ki štrlijo na BLA, vendar je bil obseg teh projekcij veliko manjši od tistega, ki štrli v NAc. Čeprav nismo mogli izključiti subtilnega učinka signalizacije DA, ki ga je načrtoval amigdala, na naše opaženo averzivno vedenje, bi moral biti glavni učinek naše optogenetske inaktivacije DA nevronov na NAc, ker so se naši poskusi s specifičnim padcem D2R v NAc dramatično zmanjšali averzivno vedenje. Prihodnje preiskave, ki se nanašajo na ciljno specifično signalizacijo DA, so potrebne za razjasnitev učinkov spreminjanja nevronov DA na averzivne dražljaje in kondicijo strahu.

Materiali in metode

Predmeti.

Tirozin hidroksilaza :: IRES-Cre (TH-Cre) miši, ki se pojavljajo (EM: 00254) (18) so bili pridobljeni iz evropskega Arhiva mišjih mutantov. Vse eksperimentalne živali so bile več kot 57 generacijam podvržene sevu C6BL / 10J. Miše smo parili z mišmi C57BL / 6J WT in jih namestili s standardnim ciklom svetlobe 12-h / 12-h in jim dali hrano in vodo ad libitum. Cre+ in Cre- miši iz istih legla (starost 3 – 6) so bili uporabljeni za poskuse. Vse poskuse na živalih je odobril odbor za živali na Inštitutu za bioznanost Osaka pod smernicami poskusov na živalih.

Vedenjski testi.

Med vsemi vedenjskimi testi smo miši povezali z optičnim vlaknom in jim omogočili gibanje po celotnem aparatu. Gibanje miši je bilo nadzorovano, da so se lahko brez ovir premikali, tudi ko so bili na glavi povezani z optičnim vlaknom. Položaj miške je zaznal video kamero, ki visi nad vedenjskim aparatom, in jo analiziral po meri narejen program s pomočjo programske opreme Labview.

Preferenčni test za temno sobo.

Po meri narejen vedenjski aparat, uporabljen v testu, je bil sestavljen iz temne sobe (15 × 9.5 cm) in svetlega odprtega prostora (15 × 11 cm). Temna soba je imela stene, tla in streho, ki so bili vsi obarvani v črno in so imeli vhod (dolg 4.5 cm) v odprt svetel prostor. Odprti svetel prostor je bil oblikovan kot elipsa in je imel kovinsko mrežno tla in prozorne stene brez strehe. Pred preskusom so bile vse miške naseljene v aparatu 10 min. Test je bil sestavljen iz treh sej: v zgodnji polovici dneva 1 (predhodni preskus: 5 min) so bile mišam dovoljene, da so raziskovale celotno napravo. Od pozne polovice dneva 1 do dneva 4 (kondicioniranje: skupaj skupaj 35 min) so miši prejemale optično stimulacijo, ko so bivale v temni sobi. Na dan 5 smo prednostno preizkusili v temni sobi brez optične stimulacije (posttest: 5 min; Slika S1E).

Trikomorni CPA test.

Po meri izdelana trikomorna naprava s kondicijsko nastavitvijo prostora / CPA, uporabljena v preskusu, je bila sestavljena iz dveh komor (10 × 17 cm) in povezovalnega hodnika. Test je bil sestavljen iz treh sej. Dan 1 (predhodni preizkus: 15 min): Miške so lahko prosto preiskovale celotno napravo. Iz testa so bile izključene miši, ki so v eni komori ostale 1.5 krat dlje kot v drugi. Dnevi 2 in 3 (kondicioniranje: 15 min vsak): Miši so prejele optično stimulacijo, ko so bivale v komori s svetlobo. Izbira svetlobne komore je bila izenačena. Dan 4 (posttest: 15 min): Test je bil izveden pod enakimi pogoji kot v predtestu (Slika S6A).

V seriji kondicioniranja se je optična stimulacija ustavila za 30 s, ko so miši nenehno bivale nad 30 s v temni sobi ali svetlobni komori, da se prepreči pregrevanje. V vseh vedenjskih testih je bila laserska moč nadzorovana na približno 5 mW na vrhu optičnega vlakna.

V vivo hitri skeniranju ciklične voltammetrije.

FSCV poskusi so bili izvedeni z uporabo metode, opisane v prejšnjih študijah (35-37). Miše smo anestezirali z mešanico ketamin / ksilazin, kot je opisano v SI Materiali in metode in postavljen v stereotaksičen okvir. Optično vlakno, ki se uporablja za stimulacijo Arch-ekspresionirajočih nevronov DA, je bilo nameščeno blizu spodbudne elektrode. Stimulirajoči optrod je bil nato nameščen v VTA (od bregme: spredaj-zadaj, −3.2 mm; bočno, 0.5 mm; hrbtno-ventralno, 3.5 mm) in spuščen v intervalih 0.25-mm. Mikroelektrod iz ogljikovih vlaken (dolžina 300 µm) za voltammetrično snemanje je bil spuščen v NAc (iz bregme: spredaj-zadaj, 1.0 mm; bočno, 1.0 mm; in dorzalno-ventralno, 3.5 mm). Voltammetrične meritve so bile narejene vsakih 100 ms z uporabo trikotne valovne oblike (–0.4 V do + 1.3 V do –0.4 V v primerjavi z Ag / AgCl, pri 400 V / s) na mikroelektronu iz ogljikovih vlaken. Za izolacijo valovnih oblik in ojačanje toka smo uporabili potenciostat po meri. Sprostitev DA je povzročila električna stimulacija nevronov DA z uporabo 24-impulzne stimulacije (100 µA, 5 ms trajanje, 30 Hz). Za 532 s začetkom 5 s pred začetkom električne stimulacije smo uporabili optično stimulacijo DA nevronov (10 nm, ∼5 mW moč na konici vlakna). Mikroelektrode iz ogljikovih vlaken smo umerili v raztopini z znanimi koncentracijami DA (0.2 µM, 0.5 µM ​​in 1.0 µM). Vse podatke o voltammetriji so analizirali po meri izdelani programi z uporabo programske opreme Labview in Matlab. Zmanjšanje ravni DA z optično stimulacijo smo rešili z analizo glavnih komponent z uporabo šablonskih DA-valovnih oblik, dobljenih z električnimi stimulacijami VTA, za ločevanje dopaminskih signalov (35, 36).

Statistična analiza.

Statistična analiza je bila izvedena z uporabo GraphPad PRISM 5.0 (GraphPad Software). Podatke smo analizirali s ponovljenimi ukrepi ANOVA (Sl. 1B, , 4D,4Din Slika S6 D in E) ali enosmerna ANOVA (Sl. 1C, , 3D,3D, 4 C in Ein Fige. S4 K-M, S6Fin S7A), post-hoc analize pa smo izvedli z uporabo Bonferronijevega testa. Vse znamke / stolpci in stolpci so predstavljali povprečno vrednost in ± SEM.

Drugi eksperimentalni postopki, vključno s pripravo in injiciranjem virusov, elektrofiziološkim snemanjem ter imunohistokemijsko in mRNA analizo, so podrobno opisani v SI Materiali in metode.

Dodatni material

Podporne informacije:  

Priznanja

Zahvaljujemo se E. Boydenu za konstrukcijo Arch, R. Matsui za tehnični nasvet pri proizvodnji in čiščenju lentivirusa in Y. Hayashi za tehnični nasvet pri programiranju analiz podatkov. To delo so podprli raziskovalni štipendije 22220005 (za SN), 23120011 (za SY in SN), 24700339 (za TD) in 25871080 (za SY) Ministrstva za izobraževanje, kulturo, šport, znanost in Japonska tehnologija in nepovratna sredstva Takeda Science Foundation (za SN).

Opombe

 

Avtorji ne izražajo navzkrižja interesov.

Ta članek vsebuje dodatne informacije na spletu www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1404323111/-/DCSupplemental.

Reference

1. Wise RA. Dopamin, učenje in motivacija. Nat Rev Neurosci. 2004; 5 (6): 483 – 494. [PubMed]
2. Schultz W. Več funkcij dopamina v različnih časovnih tečajih. Annu Rev Neurosci. 2007; 30: 259 – 288. [PubMed]
3. Bromberg-Martin ES, Matsumoto M, Hikosaka O. Dopamin v motivacijskem nadzoru: Nagrajevanje, averzija in budnost. Neuron. 2010; 68 (5): 815 – 834. [PMC brez članka] [PubMed]
4. Schultz W, Dayan P, Montague PR. Nevronski substrat napovedovanja in nagrajevanja. Znanost. 1997; 275 (5306): 1593 – 1599. [PubMed]
5. Schultz W, Romo R. Odzivi nigrostriatalnih dopaminskih nevronov na visokointenzivno somatosenzorično stimulacijo pri anestezirani opici. J Nevrofiziol. 1987; 57 (1): 201 – 217. [PubMed]
6. Ungless MA, Magill PJ, Bolam JP. Enakomerna inhibicija dopaminskih nevronov v ventralnem tegmentalnem območju z averzivnimi dražljaji. Znanost. 2004; 303 (5666): 2040 – 2042. [PubMed]
7. Brischoux F, Chakraborty S, Brierley DI, Ungless MA. Fazno vzbujanje dopaminskih nevronov v ventralni VTA s škodljivimi dražljaji. Proc Natl Acad Sci ZDA. 2009; 106 (12): 4894 – 4899. [PMC brez članka] [PubMed]
8. Matsumoto M, Hikosaka O. Dve vrsti dopaminskega nevrona izrazito prenašata pozitivne in negativne motivacijske signale. Narava. 2009; 459 (7248): 837 – 841. [PMC brez članka] [PubMed]
9. Cohen JY, Haesler S, Vong L, Lowell BB, Uchida N. Značilni za Neuron signale za nagrado in kazen v ventralnem tegmentalnem območju. Narava. 2012; 482 (7383): 85 – 88. [PMC brez članka] [PubMed]
10. Tan KR, et al. Nevroni GABA pogona VTA pogojujejo odpor do mesta. Neuron. 2012; 73 (6): 1173 – 1183. [PubMed]
11. van Zessen R, Phillips JL, Budygin EA, Stuber GD. Aktivacija nevronov VTA GABA prekine nagrajevanje. Neuron. 2012; 73 (6): 1184 – 1194. [PMC brez članka] [PubMed]
12. Packard MG, Knowlton BJ. Učne in spominske funkcije bazalnih ganglijev. Annu Rev Neurosci. 2002; 25: 563 – 593. [PubMed]
13. Surmeier DJ, Song WJ, Yan Z. Koordinirano izražanje dopaminskih receptorjev v neostriatalnih srednjih špičastih nevronih. J Nevrosci. 1996; 16 (20): 6579 – 6591. [PubMed]
14. Surmeier DJ, Plotkin J, Shen W. Dopamin in sinaptična plastičnost v dorzalnih progastih vezjih, ki nadzorujejo izbiro akcij. Curr mnenje Neurobiol. 2009; 19 (6): 621 – 628. [PMC brez članka] [PubMed]
15. Hikida T, Kimura K, Wada N, Funabiki K, Nakanishi S. Razločljive vloge sinaptičnega prenosa v neposrednih in posrednih poteznih poteh za nagrajevanje in averzivno vedenje. Neuron. 2010; 66 (6): 896 – 907. [PubMed]
16. Hikida T in sod. Modulacija jedra, specifična za pot, je nagrajena in odklonilna, s selektivnimi receptorji oddajnikov. Proc Natl Acad Sci ZDA. 2013; 110 (1): 342 – 347. [PMC brez članka] [PubMed]
17. Chow BY in sod. Visoko zmogljivo optično nevronsko utišanje z gensko tarčo, ki ga poganjajo lahke protonske črpalke. Narava. 2010; 463 (7277): 98 – 102. [PMC brez članka] [PubMed]
18. Lindeberg J in sod. Transgena ekspresija Cre rekombinaze iz lokusa tirozin hidroksilaze. Geneza. 2004; 40 (2): 67 – 73. [PubMed]
19. Bourin M, Hascoët M. Test miške svetlo / temno polje. Eur J Pharmacol. 2003; 463 (1 – 3): 55 – 65. [PubMed]
20. Roitman MF, Wheeler RA, Wightman RM, Carelli RM. Kemični odzivi v jedru v realnem času razlikujejo nagrajevalne in averzivne dražljaje. Nat Neurosci. 2008; 11 (12): 1376 – 1377. [PMC brez članka] [PubMed]
21. LeDoux JE. Čustvena vezja v možganih. Annu Rev Neurosci. 2000; 23: 155 – 184. [PubMed]
22. Maeno H. Dopaminski receptorji v jedru pasjega kaudata. Mol Cell Biochem. 1982; 43 (2): 65 – 80. [PubMed]
23. Richfield EK, Penney JB, Young AB. Primerjave anatomskega stanja in afinitete med receptorji za dopamin D1 in D2 v centralnem živčnem sistemu podgan. Nevroznanost. 1989; 30 (3): 767 – 777. [PubMed]
24. Hikosaka O. Bazalni ganglijski mehanizmi gibanja oči z orientacijo. Ann NY Acad Sci. 2007; 1104: 229 – 249. [PubMed]
25. Surmeier DJ, Ding J, Day M, Wang Z, Shen W. D1 in D2 modulacija dopaminskih receptorjev strijatalne glutamatergične signalizacije v striatalnih srednjih špičastih nevronih. Trendi Neurosci. 2007; 30 (5): 228 – 235. [PubMed]
26. Frank MJ. Dinamična modulacija dopamina v bazalnih ganglijih: Nevrokomputacijski prikaz kognitivnih primanjkljajev medikamentoznega parkirsonizma. J Cogn Neurosci. 2005; 17 (1): 51 – 72. [PubMed]
27. Kravitz AV, Tye LD, Kreitzer AC. Razločljive vloge za neposredne in indirektne prožne striatalne nevrone v okrepitvi. Nat Neurosci. 2012; 15 (6): 816 – 818. [PMC brez članka] [PubMed]
28. Fadok JP, Dickerson TM, Palmiter RD. Dopamin je nujen za kondicijo, ki je odvisna od strahu. J Nevrosci. 2009; 29 (36): 11089 – 11097. [PMC brez članka] [PubMed]
29. Zweifel LS, et al. Aktivacija dopaminskih nevronov je kritična za averzivno kondicioniranje in preprečevanje generalizirane tesnobe. Nat Neurosci. 2011; 14 (5): 620 – 626. [PMC brez članka] [PubMed]
30. Lammel S in sod. Vhodno specifični nadzor nad nagrajevanjem in odbojnostjo v ventralnem tegmentalnem območju. Narava. 2012; 491 (7423): 212 – 217. [PMC brez članka] [PubMed]
31. Mantz J, Thierry AM, Glowinski J. Vpliv škodljivega ščipanja repa na hitrost praznjenja mezokortikalnih in mezolimbičnih dopaminskih nevronov: selektivna aktivacija mezokortikalnega sistema. Možgani Res. 1989; 476 (2): 377 – 381. [PubMed]
32. Tidey JW, Miczek KA. Stres zaradi socialnega poraza selektivno spreminja sproščanje mezokortikolimbičnega dopamina: študija mikrodialize in vivo. Možgani Res. 1996; 721 (1 – 2): 140 – 149. [PubMed]
33. Pezze MA, Feldon J. Mesolimbic dopaminergične poti v kondicioniranju strahu. Prog Neurobiol. 2004; 74 (5): 301 – 320. [PubMed]
34. de la Mora MP, Gallegos-Cari A, Arizmendi-García Y, Marcellino D, Fuxe K. Vloga mehanizmov za receptorje dopamina v amigdaloidni modulaciji strahu in tesnobe: Strukturna in funkcionalna analiza. Prog Neurobiol. 2010; 90 (2): 198 – 216. [PubMed]
35. Heien ML, Johnson MA, Wightman RM. Ločljivost nevrotransmiterjev, odkrita s hitro skeniranjem ciklične voltammetrije. Analni kem. 2004; 76 (19): 5697 – 5704. [PubMed]
36. Heien ML, et al. Realno časovno merjenje nihanja dopamina po kokainu v možganih obnašanja podgan. Proc Natl Acad Sci ZDA. 2005; 102 (29): 10023 – 10028. [PMC brez članka] [PubMed]
37. Natori S in sod. Podsekundno sproščanje dopamina v mišjem hrbtnem striatumu. Neurosci Res. 2009; 63 (4): 267 – 272. [PubMed]