Zadostnost mezolimbične stimulacije nevrona z napredovalnim do zasvojenosti (2015)

Predstavitev

Zasvojenost je bolezen, ki se razvija v več korakih (Everitt et al., 2008, George et al., 2014). Diagnozo postavimo, ko rekreativna uporaba postane kompulzivna in vztraja kljub negativnim posledicam. Medtem ko vodilna hipoteza o zasvojenosti trdi, da zloraba drog povzroča bolezen, ker pretirano povečuje koncentracijo dopamina (DA) v možganih, ni jasno, ali je sprožitev tega sistema zadosten za prehod iz rekreacijske uporabe v odvisnost (Di Chiara in Bassareo, 2007, Volkow in Morales, 2015). Dokazi o hipotezi DA za okrepitev zdravil so se kopičili že več desetletij in temeljijo na začetnem učinku zdravil. Zdravila, ki povzročajo odvisnost, na primer zmanjšajo prag za intrakranialno samostimulacijo (ICSS) medialnega snopa prednjega možganov, vlaknenega trakta, ki med drugim vsebuje naraščajočo projekcijo DA iz srednjega možgana (Stein, 1964, Crow, 1970, Kornetsky et al., 1979). Študije farmakologije in lezij so nato identificirale mezokortikolimbični sistem DA kot izvor tega kroga (Wise in Bozarth, 1982). Konec osemdesetih let prejšnjega stoletja je neposredno merjenje koncentracije DA v zunajcelični z mikrodijalizo potrdilo, da imajo zasvojenost z drogami lastnost, da v NAc povzročajo val DA (Di Chiara in Imperato, 1980). To je privedlo do predloga mehaničistične klasifikacije zdravil, ki povzročajo odvisnost (Lüscher in Ungless, 1988).

Veliko manj je znano, kako ti začetni učinki uživanja drog olajšajo prehod v odvisnost. Upoštevani so bili mehanizmi, neodvisni od DA, ker imajo zdravila, ki povzročajo odvisnost, druge farmakološke cilje. Na primer, kokain se poleg zaviranja transporterja DA (DAT) veže tudi na SERT (transporter serotonina) in NET (transporter noradrenalina), da zmanjša ponovni privzem serotonina in noradrenalina, s čimer poveča koncentracijo vseh glavnih monoaminov (Han in Gu, 2006, Tassin, 2008). Podobni pomisleki se lahko nanašajo na druge psihostimulante. Poleg tega obstaja trditev, da so opiati vsaj v začetni fazi neodvisni od DA (Badiani et al., 2011, Ting-A-Kee in van der Kooy, 2012). Hipoteza DA je bila izpodbijana tudi na podlagi genetskih modelov miši, kjer so bile po vmešavanju v sistem DA še vedno očitne nekatere oblike vedenja, prilagojenega zdravilu. Na primer, miši, ki izločajo DAT, si sami dajejo kokain (Rocha et al., 1998) in odpravljajo sintezo DA bodisi farmakološko (Pettit et al., 1984) bodisi gensko (Hnasko et al., 2007) niso uspeli preprečiti samo-dajanja zdravil ali pogojeno prednostno mesto. Čeprav so boljša karakterizacija teh transgenih miši in generiranje dvojnih prenosnikov monoaminskih nosilcev rešili nekatera od teh vprašanj (Rocha, 2003, Thomsen in sod., 2009), zadostnost DA za sprožitev glavnih značilnosti odvisnosti ni znana. Da bi se izognili vprašanjem nespecifičnosti, smo se zato odločili, da miši omogočimo, da samo-stimulirajo nevrone VTA DA z uporabo optogenetskega pristopa.

Nedavne študije so pokazale, da lahko aktivacija DA nevronov v srednjem možganu povzroči preferenco do kraja (Tsai et al., 2009) ali okrepi instrumentalno vedenje (Adamantidis et al., 2011, Witten et al., 2011, Kim et al., 2012, Rossi et al., 2013, McDevitt et al., 2014, Ilango et al., 2014). Medtem ko ta selektivna aktivacija poti DA potrjuje študije intrakranialne samostimulacije (ICSS), opravljene pred več kot 30 leti pri določanju sistema nagrajevanja (Fouriezos et al., 1978), ne uspejo dokazati indukcije poznega stadija prilagodljivega vedenja, ki opredeljuje odvisnost, niti niso prepoznali osnovnih nevronskih prilagoditev. Tu nismo uporabili optogenetske manipulacije, da bi omogočili neposredno testiranje merila zadostnosti za fazno signalizacijo DA pri sprožitvi okrepitve, temveč tudi preizkus prehoda na zasvojenost.

Osupljivo opažanje poznejših faz bolezni je, da tudi pri najbolj odvisnih zdravilih postane odvisen le del uporabnikov (Warner in sod., 1995, O'Brien, 1997). Človeški odvisniki bodo kljub negativnim posledicam nadaljevali uživanje drog (glej "Definicija zasvojenosti" Ameriškega združenja za medicino odvisnosti, DSM5, Ameriško psihiatrično združenje, 2013), ki je običajno povezano s socialnimi in psihološkimi porazi, ki se pogosto zamujajo s časom. Podobno je pri glodalcih približno ena od petih živali, ki si pridobijo samokokain, sčasoma razvrščene kot odvisne (Deroche-Gamonet et al., 2004, Kasanetz et al., 2010; vendar glej George et al., 2014). Vztrajnost vnosa drog kljub negativnim posledicam lahko glodalci zgledujemo tudi z uvedbo preprostega averzivnega dražljaja v urnik uživanja. Čeprav je človeška bolezen bolj zapletena, je povezovanje kaznovanja s uživanjem neposreden model osrednje sestavine zasvojenosti.

Tu smo uporabili blag šok za stopalo, da smo ocenili njegovo posledico na samo dajanje kokaina, saharoze in optogenetsko samo-stimulacijo. Nadalje raziskujemo, ali lahko samo-stimulacija DA nevronov sproži dve odvisnostni vedenji - iskanje in nagrajevanje, ki sta povezana s potrošnjo, kljub negativnim posledicam - in označi nevronsko plastičnost, povezano s tem vedenjem.

Rezultati

Za nadzor nad nevronsko aktivnostjo DA smo vbrizgali Cre-inducibil adeno-pridruženi virus (AAV) z dvojno floksnim obrnjenim odprtim bralnim okvirom (DIO), ki vsebuje ChR2 spojen z izboljšanimi rumenimi fluorescentnimi beljakovinami (eYFP) (Atasoy et al., 2008, Brown et al., 2010) v VTA miši DAT-Cre. Poleg tega je bilo za usmerjanje VTA postavljeno optično vlakno (ChR2, Glej Eksperimentalni postopki). Posebnost ChR2 izražanje je bilo potrjeno s so-lokalizacijo eYFP s tirozin hidroksilazo (TH), encimom, potrebnim za sintezo DA (Slika 1A). 

Najprej so miši za vzpostavitev protokola laserske stimulacije postavili v operantno škatlo, kjer so lahko pritisnili aktivni vzvod, ki je sprožil številne laserske stimulacije, ki so bile različne (1, 2, 8, 32, 60 ali 120 izbruhov) vsako dve seji. Za posnemanje faznega vzorca streljanja (Hyland in sod., 2002, Mameli-Engvall in sod., 2006, Zhang in sod., 2009), ki ga običajno povzroča naravna nagrada (Schultz, 1998), smo uporabili rafalno stimulacijo. En izbruh je bil sestavljen iz petih laserskih impulzov 4 ms pri 20 Hz in je bil ponovljen dvakrat na sekundo. Ugotovili smo, da so miši svoje vedenje pritiska na ročico prilagodili v odvisnosti od izbruhov na lasersko stimulacijo in tako nadzorovali skupno število prejetih izbruhovSlika 1B). To vedenje je spominjalo na samostojno uporabo zdravil, ki povzročajo odvisnost, ko je bil odmerek na infuzijo različen (Piazza in sod., 2000). Za nadaljnje poskuse smo se odločili za 30 izbruhov na stiskalnico z ročico, s čimer smo dobili polovično največje število izbruhov (Slika 1B). Da bi posnemali zamudo pri povečanju DA, ki jo običajno opazimo pri intravenskem dajanju zdravil (Aragona in sod., 2008), smo lasersko stimulacijo odložili za 5 s in dodali utripajočo svetlobo za 10 s (Slika 1C).

V 12 zaporednih dneh so miši lahko samostimulirali največ 80-krat v 2 urah. Miši so hitro povečale hitrost laserske stimulacije in dosegle 80 laserskih stimulacij (LS) pred koncem prve ure seje (Številke 1D in 1E). Razlikovanje med aktivnim in neaktivnim vzvodom je bilo hitro pridobljeno in število aktivnih pritisk vzvodov se je s povečevanjem urnikov s fiksnim razmerjem (FR1, 2, 3) ustrezno povečalo (Številke 1F in 1G). V kontrolnih poskusih z mišmi ali mišmi DAT-Cre, ki so izrazili ChR2 v nevronih γ-aminobutirne kisline (GABA) (mišje GAD-Cre +, da ciljajo na zaviralne nevrone VTA), so bile stopnje samo-stimulacije nizke in se nenehno zmanjševale sej. To velja tudi za dve Cre + živali, kjer je post-hoc validacija pokazala, da VTA ni bil okužen s ChR2-eYFP (ni prikazan). Poleg tega ni bila zaznana nobena diskriminacija med aktivnim in neaktivnim vzvodom (Številke S1A in S1B).

Opazili smo, da miške DAT-Cre + pogosteje pritiskajo na aktivni vzvod, kot je potrebno za lasersko stimulacijo. Dejansko so takšne "jalovite" aktivne ročne stiskalnice predstavljale več kot 30% vseh aktivnih ročnih stiskalnic (Slika S2A) in se je zgodila - ko so seje napredovale - večinoma med nastopom iztočnice in lasersko stimulacijo (Številke S2B in S2C). To edinstveno vedenje se je razvilo med pridobitvijo in lahko odraža impulzivne odzive.

Skupaj aktivnost porušitve nevronov VTA DA močno okrepi odzivanje ročice.

Okluzija VTA DA Neurona-samo stimulacija s kokainom

Da bi preizkusili, ali je samostimulacija nevronov VTA DA odvisna od istih možganskih vezij, ki so namenjena odvisnostim zdravilom, da bi okrepili vedenje, smo injicirali kokain intraperitonealno (ip) neposredno pred samostimulacijskimi sejami (prost dostop do laserja 45 minut, Slika 2A). Na začetku so dobro izurjene živali pritisnile približno 400-krat, da so v 85 minutah po urniku FR45 prejele 3 LS. Po vbrizganju kokaina se je učinek občutno zmanjšal od odmerka na približno 30 LS za stiskalnice z 100 vzvodi z najvišjim odmerkom (Slika 2B). Ta okluzija je bila najbolj izrazita v prvih 30 minutah seje, kar je odražalo farmakokinetiko zdravila (Slika 2C). Ta poskus kaže, da je okrepitev z optogenetsko samo-stimulacijo in okrepitev z deležem kokaina, ki je podvrženo nevronskim vezjem.

Za nadaljnjo primerjavo optogenetske samostimulacije z zdravili, ki povzročajo odvisnost, smo nato vprašali, ali se miši po nekaj tednih umika ponovijo pri samostimulaciji nevronov VTA DA. Ker je iskanje drog, povezano z iztočnicami, uveljavljen model ponovitve bolezni (Epstein et al., 2006, Soria et al., 2008, Bossert et al., 2013), smo miši postavili nazaj v operantno komoro 30 dni po zadnji stimulacijsko sejo, kjer je aktivno pritiskanje vzvoda sprožilo signalno luč brez lasersko stimulacijo (Slika 3A). Trdno vedenje, povezano z izrezki, ki ga je pokazala visoka stopnja aktivnih pritisk na ročici, je bilo očitno le pri miših z izražanjem eYFP-ChR2 v nevronih VTA DA (miši DAT-Cre +, ne pa tudi miši DAT-Cre−, Slika 3B).

Prejšnje študije so pokazale vzročno zvezo med relapsom, povezanim z iztočnicami, in sinaptično plastičnostjo, ki jo povzroča kokain v podtipu NAc nevronov, ki izražajo DA D1R (Pascoli, Terrier et al., 2014). Zato smo za oceno te sinaptične plastičnosti ustvarili miške DAT-Cre, s katerimi smo križali Drd1a-tdTomato miši za identifikacijo podvrste spiny nevronov (MSNs) v NAc. Namesto iskalnega testa smo pripravili rezine NAc, kjer so bile D1R-MSN rdeče, v nasprotju z zelenimi vlakni nevronov VTA DA, okuženih s flox-ChR2-eYFP (Slika 3C). Posnetki vpenjalnih objemk celic ex vivo so pokazali razmerje napetosti popravljalnega toka za postsinaptične tokove, ki jih sproži AMPAR (AMPAR-EPSC), in povečano razmerje AMPAR / NMDAR (Številke 3D in 3E), v D1R-MSN, ne pa tudi v D2R-MSN. Pokazalo se je, da podobne ugotovitve, ki so bile prej pridobljene po umiku iz samokontrole kokaina, kažejo na kombinirano vstavljanje pomanjkanja GluA2 in GluA2, ki vsebuje AMPAR, na ločenih vhodih na D1R-MSN (Pascoli, Terrier et al., 2014).

Samopodžigo kljub kaznovanju

Uporaba snovi kljub negativnim posledicam je ključna značilnost zasvojenosti (glej opredelitev DSM5, Ameriško psihiatrično združenje, 2013). Vzpostavljeni so bili modeli podgan (Deroche-Gamonet et al., 2004, Pelloux et al., 2007, Pelloux et al., 2015, Chen et al., 2013), kjer električni šok, uveden v urnik samoupravljanja kokaina, zavira kokain poraba pri nekaterih živalih. Po 12 dneh od začetne izpostavljenosti (pridobivanja) so miši lahko imeli tri dodatne seje pri FR3, vendar z manjšim mejnim presekom (največ 60 minut ali 40 nagrad). Te tri seje so služile kot izhodišče za naslednje štiri seje, kjer je bila vsaka tretja laserska stimulacija seznanjena z udarcem stopala (500 ms; 0.2 mA), ki ga je napovedal nov znak (Slika 4A). Intenzivnost in trajanje udarca s stopalom sta bila prilagojena tako, da je v celoti zmanjšala pritisk vzvoda za nagrado saharoze (glejte tudi podatke spodaj). Kazenski načrt je privedel do dveh nasprotnih vedenjskih odzivov (Slika 4B). Nekatere miši so se ob uvedbi kazni (imenovane "občutljive") hitro odzvale, druge pa so se odzvale na največje število laserskih stimulacij in jih je mogoče šteti za "odporne" na kazen. Na koncu štirih kaznovalnih sej sta se v celoti pojavila dva grozda živali (Slika 4C). "Odporne miši" so ohranile število laserskih stimulacij (manj kot 20% zmanjšanje), medtem ko so "občutljive miši" zmanjšale samo-stimulacijo za več kot 80%. S temi merili ni bilo mogoče dodeliti samo ene živali (sive pike). To opazovanje kaže, da je prisilna rafalna aktivnost, ki jo povzroča samo stimuliranje nevronov VTA DA, dovolj, da sproži vztrajnost uživanja kljub negativnim posledicam v delu miši. Kot nadzor smo v neodvisni skupini miši, ki je vzpostavila odpornost ali občutljivost na kazen, povezano s samo-stimulacijo, ocenili z nocicepcijo z uporabo testa z repom. Zaznana ni bila razlika v zaostajanju za umik repa, potopljenega v vročo vodo med občutljivo in odporno (Slika S3).

Nato smo, poizkusno, povprašali, ali bi lahko kakšna posebnost v fazi pridobitve samo-stimulacije napovedala odpor do kazni. Občutljive in odporne miši so med osnovnimi sejami naredile identično število aktivnih in neaktivnih stiskalnic, vse miši pa so dosegle največ 80 LS (Številke S4A in S4B), v podobnem času (Številke S4A in S4C). Medtem ko se delež brezplodnih aktivnih stiskalnih ročic spet ni razlikoval v obeh podskupinah (Številke 4D in S4D) je število odpornih pritiskov na ročico pred začetkom laserske stimulacije pri koncu odpornih miši postalo bistveno večje (Številke 4E in S4E). Ker se je to vedenje razvilo med pridobivanjem, lahko skupaj z prirojeno impulzivnostjo (Economidou et al., 2009, Broos et al., 2012, Jentsch et al., 2014) prispeva k vzpostavljanju odpornosti proti kaznovanju. Poleg tega je bil 11. dan izveden preskus s progresivnim razmerjem, da bi opredelili motivacijo za optogenetsko stimulacijo (Richardson in Roberts, 1996). Odporne miši so pokazale mejno vrednost, ki se statistično ne razlikuje od občutljivih miši (Slika S4F).

Odpornost na kazen za kokain, vendar ne za saharozo

Da bi preizkusili, ali bi lahko paradigma uživanja kljub škodljivim posledicam skupaj z impulznim pritiskom na vzvod napovedovala tudi kompulzivni vnos odvisnosti, je bila nova kohorta miši 12 dni samoodpovedana s kokainom. Eksperimentalni parametri za pridobivanje kokaina za samostojno uporabo so bili določeni na največ 80 infuzij kokaina v 4 urah med pridobivanjem in na 40 infuzij v 2 urah med tremi izhodiščnimi sejami pred štirimi kazenskimi sejami (Številke 5A in S5A). Ponovno sta se po združitvi nagrade za kokain z električnimi sunki združili dve skupini. Dejansko je bil 5 iz mišk 22 razvrščen kot odporen (manj kot 20% zmanjšanje glede na izhodišče), medtem ko je 17 kvalificiran kot občutljiv (več kot 80% upad) in ena žival je padla med (13 infuzije na dan 19) (Slika 5B). Nato smo iskali vedenjske napovedovalce odpora kaznovanju. Med obema skupinama se število infuzij, hitrost infundiranja in število aktivnih ali neaktivnih stiskalnic ni razlikovalo (Številke S5B – S5D) in prelomni točki sta bili podobni (Slika S5E). Razlikovalo se je gibanje porazdelitve brezplodnih stiskalnic na aktivni ročici v času. V prvih štirih sejah so se brezčasne stiske z ročicami v časovnih omejitvah redno zmanjšale tako pri odpornih kot občutljivih miših, medtem ko so na koncu pridobitve to vedenje ohranile le občutljive miši (Številke 5C in 5D in S5F). Nasprotno pa so odporne miši ponavadi povečale svoje skupno število brezplodnih ročic (Številke 5C in S5D), zlasti v zadnjem četrtletju časovne omejitve (Slika 5D). Čeprav je bilo kvalitativno podobno opazovanju, ki je bilo prej opravljeno z optogenetsko stimulacijo nevronov DA (glejte zgoraj), kokain ni bil opažen v grozdnih stiskalnicah v zgodnjem časovnem obdobju, najverjetneje zaradi počasnejše kinetike, s katero je droga zvišane ravni DA. Kljub temu pa bi lahko podobne zaključke izpeljali na podlagi te edinstvene evolucije neplodne razporeditve potisnih ročic v kratkem času pred "notranjim odkrivanjem porasta DA". Naša opažanja tako kažejo, da porazdelitev brezplodnih aktivnih ročic predvideva uporabo drog kljub negativnim posledicam.

Končno smo ponovili poskus z mišmi, ki so bile hranjene z ad libitum, ki bi lahko pritisnili za nagrado saharoze. Ko je bila uvedena kazen, so vse miši prenehale s samo dajanjem saharoze (Slika 5E), ki dokazuje, da je ta urnik zaviral vnos nebistvene naravne nagrade, vendar je omogočil odkrivanje kompulzivnega vnosa odvisnika ali močne stimulacije nevrona DA.

Skupaj ti rezultati kažejo, da samostimulacija VTA DA zadostuje za spodbujanje kompulzivnosti, kar kažeta odpornost na kaznovanje pri podskupini miši (68%). Podobno so po kokainu SA nekatere miši postale odporne na kaznovanje (23%), kar pa po saharozi SA nikoli ni bilo (Slika 5F).

Da bi natančno določili področje možganov, ki lahko nadzoruje odločitev o vztrajanju pri samoupravljanju kljub negativnim posledicam, smo najprej spremljali generično "nevronsko aktivnost" s štetjem števila nevronov, v katerih je kaznovanje sprožilo izražanje takojšnjega zgodnjega genskega cFos v 15 letih. različnih regijah. Miši smo intrakardialno perfundirali s PFA 90 minut po koncu zadnjega kaznovanja. Kontrolne skupine so vključevale naivne živali, pa tudi miši, ki so jih vlekli na občutljive ali odporne miši, da bi nadzorovali morebiten moteč učinek števila prejetih šokov.

Medtem ko je bilo v večini izbranih regij število cFos pozitivnih nevronov najvišje pri rezinah odpornih miši v primerjavi z rezinami naivnih miši, sta se pojavili dve vrsti odgovorov, med katerimi sta primera prelimbična skorja (PL) in stranski OFC. V PL smo ugotovili podobno povečanje cFos-pozitivnih celic pri odpornih miših in njihovih zatiranih kontrolah, medtem ko je bilo pri OFC ta porast očiten le pri odpornih in ne v ustreznih potegnjenih miših (Številke 6A in 6B). Za količinsko opredelitev te razlike so bili vsi podatki najprej normalizirani na ravni izražanja pri naivnih živalih. Nato smo izračunali razmerje med odpornim in občutljivim, deljenim z nategnjenim proti odpornim nad privihanim do občutljivim (Razmerje)_cfos = (R / S) / (YR / YS), Slika 6B). Ta postopek je opredelil cingulatno skorjo, OFC in VTA kot regije, ki se aktivirajo pri odpornih, vendar ne pri občutljivih miših in kjer je bila majhna razlika v obeh skupinah vlečenih kontrol (podobni nizki cFos-pozitivni nevroni v vlečeni, pravzaprav) . Ugotovitev VTA ni presenetljivo, saj gre za področje lasersko stimuliranih nevronov. To je v skladu s prejšnjim poročilom, ki kaže, da stimulacija ChR2 sproži aktivacijo cFos (Lobo et al., 2010, Van den Oever et al., 2013). Nizko razmerje_cfos ugotovili smo v regijah, kjer je bila aktivacija podobna občutljivim in odpornim (na primer CeA in PAG). Razmerje_cfos je bil tudi nizek, ko je bila aktivacija vzporedna z veliko razliko v zvitimi krmilnimi elementi (na primer PL, Slika 6C za povzeto razmerje_cfos podatkov). Podoben izraz cFos pri odpornih miškah, ki so odporne na trganje, je zato najverjetneje vplival na število udarcev stopal in imel malo zveze z odpornostjo proti kaznovanju. Skupaj visoko razmerje_cfos v OFC predlagajo, da je nevronska aktivnost v tej regiji povezana z odpornostjo na kaznovanje, zato lahko daje prednost prehodu v odvisnost.

Da bi identificirali substrat povečane nevronske aktivnosti v OFC pri miših, ki se upirajo kazni, smo po zadnjem kazenskem zasedanju 24 ur pripravili rezine PL in L-OFC, da preizkusimo lastno razdražljivost. Obe regiji sta bili izbrani zaradi zelo različnega vzorca izražanja c-Fos v prejšnjih poskusih. Razdražljivost nevronov je bila kvantificirana s štetjem števila akcijskih potencialov (AP), ki jih je povzročilo vbrizgavanje naraščajočih količin toka (od 0 do 600 pA) v posnetke celotnih celic. Ti posnetki so pokazali trajno hipo-ekscitabilnost v piramidalnih nevronih PL odpornih miši (in njihov nadzor nad jarmom) v primerjavi z občutljivimi ali naivnimi miši (Slika 7A). Potencialni membranski potencial (RMP) posnetih nevronov se ni razlikoval med eksperimentalnimi skupinami (Slika 7B). Ti rezultati zagotovo kažejo, da je razburljivost nevronov v PL neposredno povezana s številom prejetih pretresov in morda ne z odločitvijo, da se uprejo kazni. To najverjetneje odraža prilagajanje negativne povratne informacije, ki jo sproži nevronsko vzbujanje, ki je povzročilo udarce stopala dan prej. Nasprotno pa so bili nevroni iz L-OFC bolj občutljivi samo pri odpornih miših. Razburljivost nevronov pri miših, ki so zvita, se ni razlikovala od vzbuljivosti nevronov naivnih miši, kar izključuje učinek udarca stopala (Številke 7C in 7D). Ta povečana aktivnost OFC nevronov verjetno temelji na izražanju cFos in lahko povzroči odpor do kazni.

Da bi preizkusili vzročnost med povečano razdražljivostjo nevronov OFC in odpornostjo na kaznovanje, smo izrazili inhibitorni DREADD (oblikovalski receptorji, ki jih aktivirajo izključno oblikovalska zdravila: CamKIIα-hM4D) v piramidnih nevronih miši OFC of DAT-Cre + (Slika 8A). Pri akutnih rezinah iz OFC je uporaba CNO (klozapin-N-oksida v kopeli) povzročila počasen zunanji tok, ki ga je najverjetneje posredoval kanal GIRK, ki ga je obrnil barijev (Ba²⁺), nespecifični zaviralec kalijevih kanalov (Slika 8B). CNO je tudi pomaknil krivuljo vhoda / izhoda v desno (Slika 8C). Miše DAT-Cre +, okužene z AAV1 / CamKIIα-hM4D-mCherry v OFC (Slika 8D) pridobila paradigmo samostimulacije DA nevronov, ki ji sledita dva zaporedna bloka s kazenskim načrtom, prvi v prisotnosti CNO in drugi brez CNO. Bloka sta prekinila 6 dni brez kazni (Slika 8E). Na koncu prvega bloka kazni je bil ob prisotnosti CNO odporen samo 5 mišk 16 (Slika 8F, leva plošča). Nasprotno, brez zaviranja OFC so bili v drugem kazenskem obdobju 14 iz 16 razvrščeni kot "odporni" (Številke 8F, desna plošča in 8G). Z drugimi besedami, delež odpornih miši je bil občutno manjši v prisotnosti CNO v primerjavi s prvo skupino mišk 34, predhodno testiranih v enakih pogojih (primerjava med skupinami, Slika 8H) in je postal podoben prvi skupini brez CNO (primerjava znotraj skupine). Končno, pri devetih miših, ki so se spremenile iz občutljivih v odporne, CNO pri potopitvi v vročo vodo ni spremenil latencije zamakanja repaSlika 8I).

Skupaj ta poskus dokazuje, da aktivnost piramidnih nevronov OFC vodi odločitev za nadaljevanje samopodražitve kljub negativnim posledicam, ki predstavljajo ključno značilnost prehoda na zasvojenost pri glodalcih.

Razprava 

Pred kratkim predlagani model zasvojenosti razlikuje tri korake v napredovanju bolezni: občasno rekreacijsko uživanje drog, čemur sledi intenzivirana, trajna, stopnjevana uporaba drog in sčasoma kompulzivna uporaba, povezana z izgubo nadzora (Piazza in Deroche-Gamonet, 2013; vendar glej George et al., 2014). Naša študija kaže, da je stimulacija nevronov VTA DA zadostna za vodenje tega napredovanja s sorazmerno hitrim časovnim potekom.

Z oponašanjem naravnega vzorca izstreljevanja se sproži učinkovito sproščanje DA v ciljnih regijah VTA, kot je NAc (Bass et al., 2010). Raven DA v NAc zato verjetno ureja samostimulacijo, tako kot glodalci sami dajejo naslednjo infuzijo kokaina ali heroina, ko koncentracija DA pade pod prag (Wise et al., 1995). To podpira tudi naše opažanje, da lahko kokain, injiciran ip, zapre samostimulacijo. Tako je samostimulacija nevronov DA zelo podobna samo-dajanju zdravil, čeprav je njegova kinetika zagotovo hitrejša od katere koli farmakološke snovi, vključno s kokainom, kot kaže različna stopnja odzivov, opažena v tej študiji.

Medtem ko smo selektivno ciljali DA nevrone VTA, so lahko pri njihovi optogenetski samostimulaciji aktivirane skupine celic z različnimi fiziološkimi funkcijami. Na primer, pred kratkim se predlaga, da nekateri DA nevroni kodirajo averzivne dražljaje (Lammel et al., 2012, Gunaydin et al., 2014). Te celice projicirajo na mPFC, medtem ko nevroni VTA DA, ki projicirajo na stransko lupino NAc, posredujejo pozitivno ojačitev (Lammel et al., 2012). Zanimivo bi bilo oceniti samostimulacijo in napredovanje s selektivnim ciljanjem (Gunaydin et al., 2014). Ker je naša manipulacija aktivirala vse nevrone VTA DA, tako kot kokain deluje na vse nevrone, ki izražajo DAT, je možno, da bi nekateri DA nevroni spodbujali učenje ojačitve, medtem ko bi drugi DA nevroni spodbujali učenje odpornosti. Neto učinek bi bil še vedno okrepitev vedenja; vendar bi lahko "averzijski nevroni" prispevali k indukciji nasprotnikovega procesa (Koob, 2013, Wise in Koob, 2014).

Po prisilni abstinenci, ponovnem izpostavljanju kontekstu, ki ga povzroči iskanje samostimulacije, uveljavljenega glodalskega modela ponovitve mamil. Izjemno osnovna nevronska plastičnost se ne razlikuje od tiste, ki jo opazimo po umiku iz samokontrole kokaina (Pascoli, Terrier et al., 2014). To prispeva k študiji, ki je prej poročala o enaki sinaptični plastičnosti nevronov VTA DA, ki jo je povzročila ena sama seja optične stimulacije ali prva injekcija zdravila, ki povzroča zasvojenost (Brown et al., 2010). Pojavlja se vzorec sinaptičnih prilagoditev, ki so prilagodljivo vedenje, ki je skupno vsem odvisnostim.

Osupljiva značilnost naše študije je dihotomija v odzivu na averzivni dražljaj, ki je dovolj močan, da pri vseh živalih moti uživanje nebistvene naravne nagrade. V našem okolju odporne miši niso pokazale bistveno večje motivacije za samorodonosno nagrado, kar je v nasprotju s študijo s kokainom pri podganah (Pelloux et al., 2007). Vedenjski napovedovalec odpornosti na kaznovanje pri miših pa je bil jalov pritisk vzvoda v 5 s pred začetkom stimulacije DA nevronov. Zmožnost čakanja na izročitev nagrade je zato mogoče razumeti kot oznako impulzivnosti (Dalley in sod., 2011, Olmstead, 2006, Everitt in sod., 2008, Winstanley, 2011, Leyton in Vezina, 2014). Zanimalo nas je opažanje, da se je impulzivno jemanje razvilo šele po več sejah samostimulacije. To odpira možnost, da odpornost na kaznovanje (in s tem tudi ranljivost na zasvojenost) morda ni povsem prirojena, ampak se razvije v začetnih fazah do zasvojenosti. V tem primeru dihotomije, ki smo jo opazovali mi in drugi (Deroche-Gamonet et al., 2004), morda ne bodo določali zgolj genetski dejavniki. To bi tudi pojasnilo, da podoben del posameznikov postane odvisen od genetsko razmeroma homogenih sevov miši in genetsko zagotovo bolj raznolikih človeških populacij.

Če odpornost na kaznovanje razkrije posamezno ranljivost za zasvojenost, za katero se ocenjuje, da pri ljudeh doseže 20% celo s kokainom (Warner in sod., 1995, O'Brien, 1997, George in drugi, 2014), potem je tu veliko večji delež lahko odraža moč neposredne in selektivne stimulacije DA nevronov. Z drugimi besedami, selektivna stimulacija DA nevronov je lahko veliko bolj odvisna od katerega koli zdravila. To je mogoče razložiti z neselektivnim delovanjem farmakoloških snovi. V primeru kokaina lahko na primer monoamini, ki niso DA, dejansko upočasnijo indukcijo odvisnosti. Dejansko lahko serotonin nasprotuje prilagodljivemu vedenju, odvisnemu od DA, kot je odziv na pogojeno nagrajevanje, samostimulacijo in pogojeno prednostno mesto (Wang et al., 1995, Fletcher in Korth, 1999, Fletcher et al., 2002), tako da olajša povezavo znakov za averzivne dražljaje (Bauer, 2015, Hindi Attar et al., 2012). Razlika je lahko tudi v razliki v kinetiki med optogenetsko samostimulacijo in farmakološko indukcijo povečanja zunajceličnega DA. Takšne razlike v moči zasvojenosti lahko obstajajo tudi med različnimi zlorabami drog (George et al., 2014).

Medtem ko formalno ne moremo izključiti razlik v sproščanju DA in / ali relativne signalizacije, da bi prispevali k vzpostavitvi kazenske odpornosti, je ta scenarij malo verjeten, ker je histološka potrditev okužbe živali, vključenih v študijo, pokazala eYFP-ChR2 izraz v celotni VTA. Še več, protokol optogenetske stimulacije, zasnovan za nasičenje sproščanja DA, je privedel do samo-stimulacije, ki je dosegla vrhunec v prelomni vrednosti, ki odraža spodbujevalno motivacijo.

Drug presenetljiv rezultat je, da je število električnih udarcev stopal koreliralo z razdražljivostjo nevronov v PL. Pri "odvisnih podganah" so opazili zmanjšano razdražljivost piramidnih nevronov in povečano razmerje AMPAR / NMDAR v piramidnih nevronih istih celic, vendar te študije niso nadzorovale učinka električnega udara samega po sebi (Kasanetz et al., 2010, Kasanetz et al., 2013, Chen et al., 2013). Nerazdružitev je torej mogoče razložiti z dvojno vlogo mPFC v procesih odločanja in vključevanju strahu (Peters et al., 2009). Nasprotno pa sprememba razdražljivosti piramidnih nevronov v infralimbični skorji korelira z udarci stopal (Santini et al., 2008). Ti dokazi ne izključujejo možnosti, da ima mPFC pomembno vlogo pri odločitvi o zasledovanju vnosa. Vendar pa naša analiza cFos in opazovanja notranje razdražljivosti kažejo na OFC in cingulatno skorjo. Poleg tega je zaviranje nevronske razdražljivosti v OFC z DREADD preprečilo odpornost na kaznovanje. Ta vzročna zveza predstavlja pomemben korak v razumevanju celičnih mehanizmov, ki so odgovorni za prehod v odvisnost. Za preverjanje, ali to velja tudi za celo vrsto odvisnosti, bodo potrebne prihodnje študije.

Naše ugotovitve so v skladu z opažanji, da lahko disfunkcija OFC poslabša odločanje glede stroškov in koristi (Seo in Lee, 2010, Walton in sod., 2010, Fellows, 2011) in lahko spodbudi kompulzivno vedenje (Burguière et al., 2013 ). Pri ljudeh je bila zloraba drog povezana z oslabljenim odločanjem in spremenjeno funkcijo OFC (Lucantonio et al., 2012, Gowin et al., 2013). Skupaj je aktivnost nevronov OFC ključni dejavnik za prehod na kompulzivno uporabo drog (Everitt et al., 2007). To ne izključuje vloge plastičnosti, ki jo povzročajo zdravila, pri ekscitacijskih aferentnih boleznih na MSN, opažene tukaj in v drugih študijah (Kasanetz et al., 2010). Zanimivo bo oceniti, ali manipulacije, katerih cilj je nadzor nad razdražljivostjo OFC, vplivajo na motivacijo odvisnikov.

Tu predlagamo samostimulacijo DA nevronov kot močan model za proučevanje faz, ki vodijo do zasvojenosti. Reproduciramo ključne sestavine odvisnosti od drog, kot so ponovitev bolezni, sinaptična plastičnost in vztrajnost uživanja kljub negativnim posledicam. Čeprav model zagotovo ni primeren za preučevanje učinkov, specifičnih za določeno zdravilo (npr. Primerjavo opioidov s psihostimulansi), ima več prednosti. Omogoča natančen časovni nadzor nad oddajo nagrad, zelo natančno aktivira le nevrone VTA DA in nenazadnje daje možnost preučevanja mišic veliko dlje časa kot pri samo-dajanju zdravil. Z osredotočanjem na določanje skupnosti zasvojenosti z drogami upamo, da bomo razkrili nevronske mehanizme, na katerih temeljijo tudi oblike odvisnosti, ki niso odvisne od snovi (Alavi et al., 2012, Robbins in Clark, 2015) in tako prispevali k splošni teoriji bolezen. Modeli optogenetskih bolezni tako omogočajo odločilen korak za temeljito razumevanje nevronske disfunkcije v poznih fazah odvisnosti in bodo vodili nova, racionalna zdravljenja bolezni, ki trenutno ni ozdravljena.

VP, JT in AH so izvedli vedenjske poskuse, medtem ko je VP naredil elektrofiziološke posnetke in koordiniral analizo. Študijo so zasnovali in napisali vsi avtorji.

Delo je bilo podprto s štipendijami Švicarske nacionalne fundacije in naprednimi nepovratnimi sredstvi ERC (MeSSI), Carigest SA, Ženevskega akademskega društva in Fondation Privée des Hopitaux Universitaires de Genève. JT je doktorica znanosti, ki jo plačuje Švicarska konfederacija.

Dokument S1. Dodatni eksperimentalni postopki in številke S1 – S6

Tabela S1. Statistične analize